JPS61135591A - 組み換え融合タン白質 - Google Patents
組み換え融合タン白質Info
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- JPS61135591A JPS61135591A JP60104914A JP10491485A JPS61135591A JP S61135591 A JPS61135591 A JP S61135591A JP 60104914 A JP60104914 A JP 60104914A JP 10491485 A JP10491485 A JP 10491485A JP S61135591 A JPS61135591 A JP S61135591A
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- protein
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- vector
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12N9/1033—Chloramphenicol O-acetyltransferase (2.3.1.28)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/585—Calcitonins
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は組み換えＤＮＡ技術に関し、特に組み換え融合
タン白質およびそのような融合タン白質を切断して、天
然形の外来遺伝子産物を得る方法に関する。
タン白質およびそのような融合タン白質を切断して、天
然形の外来遺伝子産物を得る方法に関する。
近年、組み換えＤＮＡ技術の発展により、バクテリアや
酵母の如き宿主微生物に広範囲のクローン外来遺伝子を
発現できるよ５になった。２つの主な方法が使われてい
る。
酵母の如き宿主微生物に広範囲のクローン外来遺伝子を
発現できるよ５になった。２つの主な方法が使われてい
る。
１つの方法は、外来遺伝子の発現を大腸菌プロモーター
やシャイン・ダルがルノ配列の如き宿主発現コントロー
ル配列の直接コントロール下に行ない、非融合外来タン
白質およびポリペプチド産物を得る。しかし、この方法
はいろいろな欠点がある。
やシャイン・ダルがルノ配列の如き宿主発現コントロー
ル配列の直接コントロール下に行ない、非融合外来タン
白質およびポリペプチド産物を得る。しかし、この方法
はいろいろな欠点がある。
多くの真核遺伝子を大腸菌にて高レベルで発現させるの
は、大腸菌λＰＬ又はＴｒｐプロモーターの如き強力な
プロモーターおよび高度に発現させた大腸菌遺伝子由来
のシャイン・ダルがルノ配列を外来遺伝子配列の前に使
用した場合でも、難しかった。シャイン・ダルガルノ配
列の近くにｍＲＮＡの２次構造がリポソームに対するｍ
ＲＮＡの利用性に影響し、その結果翻訳効率に影響する
から、これらの困難が生じることは明白である。２次構
造は開始コげン即ち外来遺伝子配列に続く配列に依るか
ら、このような構築によりしばしば翻訳効率が劣るとと
Ｋなる。
は、大腸菌λＰＬ又はＴｒｐプロモーターの如き強力な
プロモーターおよび高度に発現させた大腸菌遺伝子由来
のシャイン・ダルがルノ配列を外来遺伝子配列の前に使
用した場合でも、難しかった。シャイン・ダルガルノ配
列の近くにｍＲＮＡの２次構造がリポソームに対するｍ
ＲＮＡの利用性に影響し、その結果翻訳効率に影響する
から、これらの困難が生じることは明白である。２次構
造は開始コげン即ち外来遺伝子配列に続く配列に依るか
ら、このような構築によりしばしば翻訳効率が劣るとと
Ｋなる。
また大腸菌で発現した多くのタン白質は七〇Ｎ−末端で
特別のメチオニンアミノ酸残基を有し、翻訳を開始する
のに必要な外来遺伝子の５′末端のＡＴＧ開始コドンか
ら生じる。この特別なＮ−末端メチオニンの存在は望ま
しくない。と言うのは、タン白質の安定性や活性忙影響
しがっそのタン白質を臨床的に使用する場合、抗原性の
問題をおこすからである。
特別のメチオニンアミノ酸残基を有し、翻訳を開始する
のに必要な外来遺伝子の５′末端のＡＴＧ開始コドンか
ら生じる。この特別なＮ−末端メチオニンの存在は望ま
しくない。と言うのは、タン白質の安定性や活性忙影響
しがっそのタン白質を臨床的に使用する場合、抗原性の
問題をおこすからである。
更に、直接発現させた外来遺伝子産物は特にあるホルモ
ンの如き比較的小さいポリペプチドである場合、宿主生
物体細胞内でしばしばタン自分解作用を受ける。このた
めに、宿主細胞内の外来遺伝子産物の蓄積は非常に低レ
ベルとなる。
ンの如き比較的小さいポリペプチドである場合、宿主生
物体細胞内でしばしばタン自分解作用を受ける。このた
めに、宿主細胞内の外来遺伝子産物の蓄積は非常に低レ
ベルとなる。
別の方法では、多くの真核タン白質は、高度に発現させ
た大腸菌遺伝子例えば１ａｃＺ 、 ｔｕｆＢ 。
た大腸菌遺伝子例えば１ａｃＺ 、 ｔｕｆＢ 。
ｂｌａ 、λＣ１１およびλＮ遺伝子のコード配列に外
来遺伝子配列を融合させて得たハイデリツＶ融合タン白
質の形で大腸菌に多量生産された。このような構築では
、バクテリア遺伝子からの翻訳の追加（ｒｕｎ−ｏｎ
）は高い翻訳効率を伴なう。更に、外来遺伝子産物に融
合したバクテリアタン白質が存在すると、融合タン白質
を耐タン自分解性にし、かつ宿主細胞内の融合タン白質
の区画分け（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｓａｔｉｏ
ｎ ）又はそこからの分泌を供する。融合タン白質発現
により、ペデテＶホルモンの如き潜在的に生物的危険の
ある物質が不活性の「前ｒ゛体」で生成し、ついでこれ
を特異的切断により試験管内で活性化し５る。
来遺伝子配列を融合させて得たハイデリツＶ融合タン白
質の形で大腸菌に多量生産された。このような構築では
、バクテリア遺伝子からの翻訳の追加（ｒｕｎ−ｏｎ
）は高い翻訳効率を伴なう。更に、外来遺伝子産物に融
合したバクテリアタン白質が存在すると、融合タン白質
を耐タン自分解性にし、かつ宿主細胞内の融合タン白質
の区画分け（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｓａｔｉｏ
ｎ ）又はそこからの分泌を供する。融合タン白質発現
により、ペデテＶホルモンの如き潜在的に生物的危険の
ある物質が不活性の「前ｒ゛体」で生成し、ついでこれ
を特異的切断により試験管内で活性化し５る。
しかし、このようなハイブリツー融合タン白自体は例え
ば臨床用の最終生成物として通常望ましくなく、融合タ
ン白質を特異的に切断して、天然形の外来遺伝子産物を
放出することが必要である。
ば臨床用の最終生成物として通常望ましくなく、融合タ
ン白質を特異的に切断して、天然形の外来遺伝子産物を
放出することが必要である。
特異的な単−又は二重アミノ酸切断部位は大腸菌タン白
質と真核タン白質間の接合点の融合タン白質内で供され
た。例えば、臭化シアンによる化学処理が単一メチオニ
ンアミノ酸切断部位で切断するために使われ、トリプシ
ン酵素処理は単一アルギニン又はリジン、あるいは二重
アルギニン／アルギニン又はリジン／リジン切断部位で
切断するために使われた。しかし、切断部位アミノ酸が
外来遺伝子産物アミノ酸配列内に存在するならば、この
ような単−又は二重繰り返しアミノ酸切断部位はほんの
わずか限られた利用性があるだけである。切断処理によ
り外来タン白質の望ましくない切断および融合タン白質
の結合部に切断を伴なう。
質と真核タン白質間の接合点の融合タン白質内で供され
た。例えば、臭化シアンによる化学処理が単一メチオニ
ンアミノ酸切断部位で切断するために使われ、トリプシ
ン酵素処理は単一アルギニン又はリジン、あるいは二重
アルギニン／アルギニン又はリジン／リジン切断部位で
切断するために使われた。しかし、切断部位アミノ酸が
外来遺伝子産物アミノ酸配列内に存在するならば、この
ような単−又は二重繰り返しアミノ酸切断部位はほんの
わずか限られた利用性があるだけである。切断処理によ
り外来タン白質の望ましくない切断および融合タン白質
の結合部に切断を伴なう。
ヨーロッパ特許出願第３５，３８４号（カリホルニア大
）ＶＣは、融合タン白質をコードする組み換えＤＮＡ配
列の構築において宿主と外来ＤＮＡ配列間の結合部に特
定の切断リンカ−を使うことが開示されている。これら
は、特定の酵素切断部位を供する少なくとも２つの異な
ったアミノ酸の配列から成る拡張した特定切断配列をコ
ー２する切断リンカ−を含む。特定切断配列中アミノ酸
残基の数が多い糧、外来遺伝子産物アミノ酸配列内に生
じる類似の配列の可能性は小さくなる。したがって、外
来タン白質の望ましくない切断がある危険も低い。ヨー
ロッパ特許出願第３５．３８４号には、配列ｘ −（Ａ
ＬＰ）ｎ−Ｌｙｓ −ｙ （ｎ ＝ ２−４ ）を有す
る切断リンカ−の使用が具体的に開示されている。
）ＶＣは、融合タン白質をコードする組み換えＤＮＡ配
列の構築において宿主と外来ＤＮＡ配列間の結合部に特
定の切断リンカ−を使うことが開示されている。これら
は、特定の酵素切断部位を供する少なくとも２つの異な
ったアミノ酸の配列から成る拡張した特定切断配列をコ
ー２する切断リンカ−を含む。特定切断配列中アミノ酸
残基の数が多い糧、外来遺伝子産物アミノ酸配列内に生
じる類似の配列の可能性は小さくなる。したがって、外
来タン白質の望ましくない切断がある危険も低い。ヨー
ロッパ特許出願第３５．３８４号には、配列ｘ −（Ａ
ＬＰ）ｎ−Ｌｙｓ −ｙ （ｎ ＝ ２−４ ）を有す
る切断リンカ−の使用が具体的に開示されている。
このリンカ−はエンテロキナーゼにより特異的ＫＬｙｓ
のカルボキシル側鎖について切断される。しかし、ヨー
ロッパ特許出願第３５．３８４号に記載される切断部位
は融合タン白質の切断に使用するには完全に満足すべき
ものではない。例えば、エンテロキナーゼはペプチド結
合部いて配列ＧＩＹ −Ｇｌｙ−Ｌｙｓのプロココナー
ゼを切断することが分っている（アンダーメン等、バイ
オケミストリイ、１ｂ、３３５４．１９７７）から、エ
ンテロキナーゼ切断は配列ｘ −（Ａｓｐ）ｎ−ｔｒｙ
ｓ−Ｙ Ｋ対しユニーク忙依存しない様である。
のカルボキシル側鎖について切断される。しかし、ヨー
ロッパ特許出願第３５．３８４号に記載される切断部位
は融合タン白質の切断に使用するには完全に満足すべき
ものではない。例えば、エンテロキナーゼはペプチド結
合部いて配列ＧＩＹ −Ｇｌｙ−Ｌｙｓのプロココナー
ゼを切断することが分っている（アンダーメン等、バイ
オケミストリイ、１ｂ、３３５４．１９７７）から、エ
ンテロキナーゼ切断は配列ｘ −（Ａｓｐ）ｎ−ｔｒｙ
ｓ−Ｙ Ｋ対しユニーク忙依存しない様である。
本発明者は融合タン白質をコードする組み換えＤＮＡ配
列の構築に使用するのく改良された切断リンカ−を考案
した。各リンカ−は４つの異なるアミノ酸配列から成る
酵素切断部位をコーＶする。
列の構築に使用するのく改良された切断リンカ−を考案
した。各リンカ−は４つの異なるアミノ酸配列から成る
酵素切断部位をコーＶする。
これらの切断配列は他のタン白配列にはめったにみられ
ないから、これらの切断部位は広範囲の組み換え融合タ
ン白質の切断に使用するのに適している。更に、これら
の部位で酵素による切断は、他の拡張された特異的切断
配列例えば前に堤案されたものであるが、厳密には特異
的配列であるものの場合にもよるが、全体の６次元タン
白構造に依存しない様である。
ないから、これらの切断部位は広範囲の組み換え融合タ
ン白質の切断に使用するのに適している。更に、これら
の部位で酵素による切断は、他の拡張された特異的切断
配列例えば前に堤案されたものであるが、厳密には特異
的配列であるものの場合にもよるが、全体の６次元タン
白構造に依存しない様である。
したがって、本発明は血液凝固Ｘａ因子により特異的に
切断される切断部位をコードするＤＮＡ配列を供する。
切断される切断部位をコードするＤＮＡ配列を供する。
本発明はまた血液凝固Ｘａ因子により特異的に切断され
る切断部位をコードするＤＮＡ配列から成るベクターお
よびこのベクターにより形質転換された宿主生物体を包
含する。
る切断部位をコードするＤＮＡ配列から成るベクターお
よびこのベクターにより形質転換された宿主生物体を包
含する。
更に本発明は外来メン白鷺産物をコードするＤＮＡ配列
および血液凝固Ｘａ因子により特異的に切断される少な
くとも１つの切断部位から成るベクターで宿主生物体を
形質転換させる、天然形の外来遺伝子産物の製造法を供
し、この外来遺伝子産物は形質転換生物体により融合タ
ン白質として発現されそして融合タン白質は活性化血液
凝固Ｘ因子で処理して切断され、天然形の外来遺伝子産
物を生ずる。
および血液凝固Ｘａ因子により特異的に切断される少な
くとも１つの切断部位から成るベクターで宿主生物体を
形質転換させる、天然形の外来遺伝子産物の製造法を供
し、この外来遺伝子産物は形質転換生物体により融合タ
ン白質として発現されそして融合タン白質は活性化血液
凝固Ｘ因子で処理して切断され、天然形の外来遺伝子産
物を生ずる。
本明細書において、「天然形」とは付加的なアミノ酸残
基がなく、例えばＮ−末端メチオニンアミノ酸残基又は
Ｎ−末端宿主タン白アミノ酸残基のない、そのアミノ酸
配列から成るＩリペデテド又はタン白質を意味する。
基がなく、例えばＮ−末端メチオニンアミノ酸残基又は
Ｎ−末端宿主タン白アミノ酸残基のない、そのアミノ酸
配列から成るＩリペデテド又はタン白質を意味する。
また、「血液凝固Ｘａ因子」とは、任意の哺乳動物又は
組み換え体温由来のＸａ因子を含む任意の活性化血液凝
固Ｘ因子を意味する。特に、これらにはウシＸＸａ因子
とウシｘ２因子を含む。
組み換え体温由来のＸａ因子を含む任意の活性化血液凝
固Ｘ因子を意味する。特に、これらにはウシＸＸａ因子
とウシｘ２因子を含む。
血液凝固Ｘ因子は、結合Ａｒｇ（２７４） −Ｔｈｒ（
２７５）およびＡｒｇ（３２３） −Ｉｌｅ（３２４）
で特異的に限られたタン自分解によりプロトロンビンを
トロンビンに活性化する、セリンプロテアーゼの酵素原
、Ｘａ因子（Ｅ、Ｃ，り、４．２１．６ ）”ｃ−アル
。プロトロンビンでは、両方の切断部位はＸａ因子基質
認識の決定子として提案された同じテトラベデ？ Ｙ、
ＩＩｓ−Ｇｌｕ−（１０）７−Ａｒｇの下流にある（マ
グナツメン番ニス等、プロテアーゼと生物学的コントロ
ール（Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌＣｏｎｔｒｏｌ ）、１２３−１４９、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラポラトリイ、ニューヨーク、
１９７５）。Ｘａ因子により切断されることが知られる
あるペプチド配列は表ＩＫ挙げである。
２７５）およびＡｒｇ（３２３） −Ｉｌｅ（３２４）
で特異的に限られたタン自分解によりプロトロンビンを
トロンビンに活性化する、セリンプロテアーゼの酵素原
、Ｘａ因子（Ｅ、Ｃ，り、４．２１．６ ）”ｃ−アル
。プロトロンビンでは、両方の切断部位はＸａ因子基質
認識の決定子として提案された同じテトラベデ？ Ｙ、
ＩＩｓ−Ｇｌｕ−（１０）７−Ａｒｇの下流にある（マ
グナツメン番ニス等、プロテアーゼと生物学的コントロ
ール（Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌＣｏｎｔｒｏｌ ）、１２３−１４９、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラポラトリイ、ニューヨーク、
１９７５）。Ｘａ因子により切断されることが知られる
あるペプチド配列は表ＩＫ挙げである。
表１．血液凝固Ｘａ因子により切断されることが知られ
【いるペプチド結合 ・・・Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１＝Ｐ工’−ｐ２’ −Ｐ
５ ’−Ｐ、’・・・基質＝ Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇ＝ＶａＬ−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−’Ｉｈｒ ・・・
ＣＩＩＦＸβグロビン・” Ｉｌｅ４１ｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−′Ｉｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−８ｅｒ ・”ヒトプ
ロトミツビン・・・工１ｅうｍうＩＹ−にｇｔうｒう１
ｕ櫃り・・・ウヅデロトロンビン・・・Ｉｌｅ−Ｍｐう
ＩＹ−Ａｒｇ＝：ＩＩｓ媚１う１ｕう琢・・・ヒトプロ
トロンビン・・・Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ＝Ｉ
ｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ・・・ ウクデロトロン
ビン・・・ＡＬａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ暢ηＦＡ叩−ｍｐう
Ｕヤ・・・ヒト抗トロンビン■血液凝固Ｘａ因子による
タン自分解切断はＰｌとＰ１′部位間でおきる。
【いるペプチド結合 ・・・Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１＝Ｐ工’−ｐ２’ −Ｐ
５ ’−Ｐ、’・・・基質＝ Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇ＝ＶａＬ−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−’Ｉｈｒ ・・・
ＣＩＩＦＸβグロビン・” Ｉｌｅ４１ｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−′Ｉｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−８ｅｒ ・”ヒトプ
ロトミツビン・・・工１ｅうｍうＩＹ−にｇｔうｒう１
ｕ櫃り・・・ウヅデロトロンビン・・・Ｉｌｅ−Ｍｐう
ＩＹ−Ａｒｇ＝：ＩＩｓ媚１う１ｕう琢・・・ヒトプロ
トロンビン・・・Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ＝Ｉ
ｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ・・・ ウクデロトロン
ビン・・・ＡＬａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ暢ηＦＡ叩−ｍｐう
Ｕヤ・・・ヒト抗トロンビン■血液凝固Ｘａ因子による
タン自分解切断はＰｌとＰ１′部位間でおきる。
天然のプロトロンビンのＸａ因子切断は表１で同定され
るペデテＶセグメントを含有するキモトリデシンペデテ
げの切断と同一である（マグナツメン等、仝上；マグナ
ツメン等、タン自分解および物理的調節（Ｐｒｏｔｅｏ
ｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅ
ｇｕｌａｔｉｏｎ ）、２０３−２３８、アカデミツク
出版、ニューヨーク、１９７６）。
るペデテＶセグメントを含有するキモトリデシンペデテ
げの切断と同一である（マグナツメン等、仝上；マグナ
ツメン等、タン自分解および物理的調節（Ｐｒｏｔｅｏ
ｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅ
ｇｕｌａｔｉｏｎ ）、２０３−２３８、アカデミツク
出版、ニューヨーク、１９７６）。
Ｘａ因子の測定に使用する発色性基質の製造について研
究も行なわれた。この点に、関しては、次の文献が参照
される。
究も行なわれた。この点に、関しては、次の文献が参照
される。
「Ｘａ因子活性の測定用に特に意図されるプロトロンビ
ンの一次格造に基づ、く発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｉｃＳｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ
Ｐｒｉｍａｒｙ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆＰｒｏｔ
ｈｒｏｍｂｉｎ−Ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ １ｎｔｅｎｄ
ｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ） Ｊ
、オーレル・エル等、ペデテＹ （Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
）、１９７６（第１４回欧州ペプチドシンポジウム会報
）、べＩ−、ウニピオン、１９７６年４月１１−１７日
、１９１−１９５、１９７６； ［Ｘａ因子の新規感受性と高度特異性発色ペプチド基質
（Ａ Ｎｅｗ ５ｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｈｉｇｈ
ｌｙ ＳｐｅｃｉｆｉｃＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ、Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ ５ｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏ
ｒ Ｘａ）ｊオーレル・エル等、「スロンざシス・リサ
ーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）
Ｊ、１１．５９５−６０９．１９７７； ’ Ｘａ因子の新規発色性ペプチド基質（ＮｅｗＣｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ ５ｕｂｓｔｒａｔ
ｅｓ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ）：オーレル・エル
等、「ヘモスタシス（Ｈａｅｍｏｓｔ、ａｓｉｓ）Ｊ、
７．９２−９４，１９７８および １＃固および繊維分解におけるプロテアーゼに親和性を
有する合成率ペプチド（Ｓｍａｌｌ ５ｙｎｔｈｅｔｉ
ｃＰｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆ
ｏｒ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎＣｏａｇｕｌａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌ、ｙｓｉｓ）″、クレツ
ンン・シーオヨヒオーレル・エル、「ニューヨーク科学
アカデミイ紀要（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ
ＹｏｒｋＡＣａｄｅｍ７ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ
） Ｊ、３７０．７９８−８１１．１９８１゜ この仕事で指摘されたことは、Ｐ３残基がＧｌｕよりＧ
ｌｎである場合、高割合で特異的切断が得られ、そして
Ｐ４残基がＩｌｅよりＬｅｕ又はＰｒｏであるか、ある
いはＰ３残基がＧｌｕよりＡｓｎである場合、低割合で
特異的切断が得られる。
ンの一次格造に基づ、く発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｉｃＳｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ
Ｐｒｉｍａｒｙ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆＰｒｏｔ
ｈｒｏｍｂｉｎ−Ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ １ｎｔｅｎｄ
ｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ） Ｊ
、オーレル・エル等、ペデテＹ （Ｐｅｐｔｉｄｅｓ
）、１９７６（第１４回欧州ペプチドシンポジウム会報
）、べＩ−、ウニピオン、１９７６年４月１１−１７日
、１９１−１９５、１９７６； ［Ｘａ因子の新規感受性と高度特異性発色ペプチド基質
（Ａ Ｎｅｗ ５ｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｈｉｇｈ
ｌｙ ＳｐｅｃｉｆｉｃＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ、Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ ５ｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏ
ｒ Ｘａ）ｊオーレル・エル等、「スロンざシス・リサ
ーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ）
Ｊ、１１．５９５−６０９．１９７７； ’ Ｘａ因子の新規発色性ペプチド基質（ＮｅｗＣｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ ５ｕｂｓｔｒａｔ
ｅｓ ｆｏｒ Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ）：オーレル・エル
等、「ヘモスタシス（Ｈａｅｍｏｓｔ、ａｓｉｓ）Ｊ、
７．９２−９４，１９７８および １＃固および繊維分解におけるプロテアーゼに親和性を
有する合成率ペプチド（Ｓｍａｌｌ ５ｙｎｔｈｅｔｉ
ｃＰｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆ
ｏｒ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎＣｏａｇｕｌａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌ、ｙｓｉｓ）″、クレツ
ンン・シーオヨヒオーレル・エル、「ニューヨーク科学
アカデミイ紀要（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ
ＹｏｒｋＡＣａｄｅｍ７ ｏｆ ５ｃｉｅｎｃｅｓ
） Ｊ、３７０．７９８−８１１．１９８１゜ この仕事で指摘されたことは、Ｐ３残基がＧｌｕよりＧ
ｌｎである場合、高割合で特異的切断が得られ、そして
Ｐ４残基がＩｌｅよりＬｅｕ又はＰｒｏであるか、ある
いはＰ３残基がＧｌｕよりＡｓｎである場合、低割合で
特異的切断が得られる。
抗トロンビン■からキモトリデシンベデテげにおいてＡ
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ Ｖｃ続くペプチド結合
はＸａ因子により切断されることも分った。
ｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ Ｖｃ続くペプチド結合
はＸａ因子により切断されることも分った。
したがって、Ｘａ因子による認識に必要な構造は切断部
位の局所的配列により決定されるようである。上記の各
配列はＰｌとＰ２部位にそれぞれアルギニンとグリシン
を含み、グルタミン酸又はアスパラギン酸又はグルタミ
ン又はアスパラギン残基はＰ３部位にある。Ｐ４部位の
インロイシンはヒトおよびウシゾロトロンぎンにおける
すべてのＸａ因子切断蔀位に維持されるが、他のデータ
では、切断の要件はＰ４部位の小さい疎水残基のための
ものである様である。
位の局所的配列により決定されるようである。上記の各
配列はＰｌとＰ２部位にそれぞれアルギニンとグリシン
を含み、グルタミン酸又はアスパラギン酸又はグルタミ
ン又はアスパラギン残基はＰ３部位にある。Ｐ４部位の
インロイシンはヒトおよびウシゾロトロンぎンにおける
すべてのＸａ因子切断蔀位に維持されるが、他のデータ
では、切断の要件はＰ４部位の小さい疎水残基のための
ものである様である。
本発明のＤＮＡ配列は上記した特定のｎ因子切断配列の
すべてを含む血液凝固Ｘａ因子により特異的に切断され
る任意の切断部位をコードすることができる。このＤＮ
Ａ配列はアミノ酸配列Ｘ −Ｙ −Ｇｌｙ −Ａｒｇ （ＸはＩＩｓ 、 Ｌｅｕ 、 Ｐｒｏ又はＡｌａであ
り、ＹはＧｌｕ 、 Ａｓｐ 、 Ｇｌｎ又はＡＳｎで
ある）をコードする配列であることが望ましい。更に望
ましくは、ＸはＩｌｅであり、ＹはＧｌｕ又はＧｌｎで
ある。最も望ましくは、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列Ｉｌ
ｅ −Ｇｌｕ −Ｇｌｙ ＋ Ａｒｇをコードする配列
である。
すべてを含む血液凝固Ｘａ因子により特異的に切断され
る任意の切断部位をコードすることができる。このＤＮ
Ａ配列はアミノ酸配列Ｘ −Ｙ −Ｇｌｙ −Ａｒｇ （ＸはＩＩｓ 、 Ｌｅｕ 、 Ｐｒｏ又はＡｌａであ
り、ＹはＧｌｕ 、 Ａｓｐ 、 Ｇｌｎ又はＡＳｎで
ある）をコードする配列であることが望ましい。更に望
ましくは、ＸはＩｌｅであり、ＹはＧｌｕ又はＧｌｎで
ある。最も望ましくは、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列Ｉｌ
ｅ −Ｇｌｕ −Ｇｌｙ ＋ Ａｒｇをコードする配列
である。
このＤＮＡに有する特定のヌクレオテＶは切断部位の特
定のアミノ酸配列および遺伝子、 ＋＋ ）？に依存す
る。したがって、余分の遺伝子コードからみて、複数の
各種ＤＮＡ配列は単一切断部位をコードするのに使うこ
とができる。特定のＤＮＡ配列は宿主コドン利用性の選
択に関して選ぶことができおよび／又はＤＮＡ操作を容
易にするため、例えば便利なエンド遣りレアーゼ制限部
位を供するために選択することができる。Ｉｌｅ −Ｇ
ｌｕ −Ｇｌｙ −Ａｒｇ切断部位をコードするＤＮＡ
配列の例は、ＡＴＣＣ）ＡＧ Ｃ）（）Ｔ Ａ（）（）
およびＡＴＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＧＴ である。
定のアミノ酸配列および遺伝子、 ＋＋ ）？に依存す
る。したがって、余分の遺伝子コードからみて、複数の
各種ＤＮＡ配列は単一切断部位をコードするのに使うこ
とができる。特定のＤＮＡ配列は宿主コドン利用性の選
択に関して選ぶことができおよび／又はＤＮＡ操作を容
易にするため、例えば便利なエンド遣りレアーゼ制限部
位を供するために選択することができる。Ｉｌｅ −Ｇ
ｌｕ −Ｇｌｙ −Ａｒｇ切断部位をコードするＤＮＡ
配列の例は、ＡＴＣＣ）ＡＧ Ｃ）（）Ｔ Ａ（）（）
およびＡＴＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＧＴ である。
上記第１配列は特忙、コドンＯＣＴがそれに付加される
場合、エンドメクレアーゼＢｔｕ １の制限部位が生成
され、ＡＧＧとＣＣＴコＶン藺に切断が生じる点で有用
である。
場合、エンドメクレアーゼＢｔｕ １の制限部位が生成
され、ＡＧＧとＣＣＴコＶン藺に切断が生じる点で有用
である。
本発明のベクターは、以下に具体的に記述するベクター
Ｍ １３ｍｐ １１ ＦＸの如き関連融合タン白コード
配列なしで、因子Ｘａ切断部位をコードするＤＮＡ配列
から成る。このようなベクターは切断部位をコーゾする
ＤＮＡ配列源を供し、かつ一般には融合タン白ベクター
の構築のために、切断部位ツー２配列を切除させる、あ
るいは他のＤＮＡ配列例えば外来遺伝子配列をクローニ
ングさせる適当なエンドヌクレアーゼ制限部位から成る
。１例えば、Ｍ１３ｍｐ１１ＦＸのＳｔ、ｕＩ部位はコ
ー「配列のクローニングに適切な部位を供する。
Ｍ １３ｍｐ １１ ＦＸの如き関連融合タン白コード
配列なしで、因子Ｘａ切断部位をコードするＤＮＡ配列
から成る。このようなベクターは切断部位をコーゾする
ＤＮＡ配列源を供し、かつ一般には融合タン白ベクター
の構築のために、切断部位ツー２配列を切除させる、あ
るいは他のＤＮＡ配列例えば外来遺伝子配列をクローニ
ングさせる適当なエンドヌクレアーゼ制限部位から成る
。１例えば、Ｍ１３ｍｐ１１ＦＸのＳｔ、ｕＩ部位はコ
ー「配列のクローニングに適切な部位を供する。
しかし、望ましくは、本発明のベクターはＸ因子の切断
部位をコードするＤＮＡ配列に融合される外来遺伝子を
特長的に含む融合タン白発現ベクターから成る。したが
って、融合タン白質はＸａ因子切断配列を介して外来遺
伝子産物に結合されるＮ−末端メチオニンアミノ酸残基
から成る。しかし、更に一般的には、融合タン白質はＸ
ａ因子切断配列を介して外来遺伝子産物に融合される宿
主タン白配列から成り、相当するベクターはＸａ因子切
断部位コード配列を介して外来タン白コード配列に融合
される宿主タン白コード配列から成る。
部位をコードするＤＮＡ配列に融合される外来遺伝子を
特長的に含む融合タン白発現ベクターから成る。したが
って、融合タン白質はＸａ因子切断配列を介して外来遺
伝子産物に結合されるＮ−末端メチオニンアミノ酸残基
から成る。しかし、更に一般的には、融合タン白質はＸ
ａ因子切断配列を介して外来遺伝子産物に融合される宿
主タン白配列から成り、相当するベクターはＸａ因子切
断部位コード配列を介して外来タン白コード配列に融合
される宿主タン白コード配列から成る。
一般的には、宿主タン白および切断部位アミノ酸コーＶ
配列は外来タン白コード配列のＮ−末端に融合される。
配列は外来タン白コード配列のＮ−末端に融合される。
ベクターの開始コドンに関して、外来タン白配列を正し
い読み枠に入れるために、更にヌクレオチド残基をＸａ
因子切断配列に加えることが必要であることは理解され
よう。
い読み枠に入れるために、更にヌクレオチド残基をＸａ
因子切断配列に加えることが必要であることは理解され
よう。
本発明に係る融合タン白発現ベクターで形質転換させた
家主細胞中のタン白の発現により、Ｘａ因子切断配列を
連結した目的の外来タン白又はペプチドを少なくとも含
む融合タン白質を産生させる。一般に、融合タン白質は
Ｘａ因子切断配列を介して目的の外来タン白又はペプチ
ドに結合した少な（とも一部の宿主タン白から成る。Ｘ
ａａ子切断部位を含む融合タン白質は本発明の範囲に含
まれる。
家主細胞中のタン白の発現により、Ｘａ因子切断配列を
連結した目的の外来タン白又はペプチドを少なくとも含
む融合タン白質を産生させる。一般に、融合タン白質は
Ｘａ因子切断配列を介して目的の外来タン白又はペプチ
ドに結合した少な（とも一部の宿主タン白から成る。Ｘ
ａａ子切断部位を含む融合タン白質は本発明の範囲に含
まれる。
任意の外来遺伝子産物は本発明の融合タン白発現ベクタ
ーを使って製造することができる。このような生成物は
哺乳動物の如き真核ポリペプチド、および酵素、血清タ
ン白（例えばβ−グロビン）、ペプチドホルモンおよび
その前駆体（例えばカルシトニン−グリシン）を含むタ
ン白質を含みうる。
ーを使って製造することができる。このような生成物は
哺乳動物の如き真核ポリペプチド、および酵素、血清タ
ン白（例えばβ−グロビン）、ペプチドホルモンおよび
その前駆体（例えばカルシトニン−グリシン）を含むタ
ン白質を含みうる。
適当な宿主タン白又はその一部は融合タン白発現に使用
することができる。適当なバクテリア宿主タン白遺伝子
の例は１ａｃＺ、 ｔｕｆ Ｂ、 ｔｒｐ Ｅ。
することができる。適当なバクテリア宿主タン白遺伝子
の例は１ａｃＺ、 ｔｕｆ Ｂ、 ｔｒｐ Ｅ。
ｔｒｐ Ｄ 、 ｂｌａ 、λＣ’１１およびＣＡ’ｌ
’遺伝子である。
’遺伝子である。
本発明は一般に酵母や哺乳動物細胞を含む宿主体に組み
換え融合タン白質の生産に広く適用できる。しかし、本
発明はバチルス宿主細胞又は特に大腸菌宿主細胞を含む
バクテリア宿主細胞に特に適用できる。本発明のＤＮＡ
配列の製造に使用する方法および操作、例えばオリゴヌ
クレオチド合成、ベクターの製造、宿主体の形質転換お
よび融合タン白の発現は組み換えＤＭ核技術分野では公
知である。
換え融合タン白質の生産に広く適用できる。しかし、本
発明はバチルス宿主細胞又は特に大腸菌宿主細胞を含む
バクテリア宿主細胞に特に適用できる。本発明のＤＮＡ
配列の製造に使用する方法および操作、例えばオリゴヌ
クレオチド合成、ベクターの製造、宿主体の形質転換お
よび融合タン白の発現は組み換えＤＭ核技術分野では公
知である。
本発明の方法において、融合タン白発現ベクターで形質
転換された宿主細胞により発現された融合タン白質は活
性Ｘ因子で処理して切断され、天然形の外来遺伝子産物
を得る。適当な置数凝固Ｘａ因子はヒトｘａ因子又は望
ましくはクシＸａ因子を含め℃使用することができる。
転換された宿主細胞により発現された融合タン白質は活
性Ｘ因子で処理して切断され、天然形の外来遺伝子産物
を得る。適当な置数凝固Ｘａ因子はヒトｘａ因子又は望
ましくはクシＸａ因子を含め℃使用することができる。
酵素原、Ｘ因子はヒト、ウシ又はその他の哺乳動物血漿
から容易に製造することができる。例えば、Ｘ因子は、
不溶性バリウム塩にウシ血漿を吸着させ続いてクロマト
グラフ工程にかゆ（−フジカワ等、「バイオケミストリ
イ」、１１．４８８２−４８９１．１９７２）だ後、プ
ロテアーゼの汚染がなく、生物化学的に純粋な形で単離
することができる。酵素原をその活性形に即ちＸａ因子
に転換するために、ラッセルのパイパーベノムによる活
性化又は固定化トリプシン活性を含めて、任意の適当な
活性化を使用することができる。酵素／基質のモル比が
大体１：１００でウシ血漿から単離したＸａ因子を使っ
て、融合タン白消化は２時間以内に完了することが分っ
た。切断に続いて、外来遺伝子産物を回収し、必要に応
じて更に処理することができる。
から容易に製造することができる。例えば、Ｘ因子は、
不溶性バリウム塩にウシ血漿を吸着させ続いてクロマト
グラフ工程にかゆ（−フジカワ等、「バイオケミストリ
イ」、１１．４８８２−４８９１．１９７２）だ後、プ
ロテアーゼの汚染がなく、生物化学的に純粋な形で単離
することができる。酵素原をその活性形に即ちＸａ因子
に転換するために、ラッセルのパイパーベノムによる活
性化又は固定化トリプシン活性を含めて、任意の適当な
活性化を使用することができる。酵素／基質のモル比が
大体１：１００でウシ血漿から単離したＸａ因子を使っ
て、融合タン白消化は２時間以内に完了することが分っ
た。切断に続いて、外来遺伝子産物を回収し、必要に応
じて更に処理することができる。
一般に、外来遺伝子産物のアミノ酸配列は有意に切断効
率に影響しないことも分った。しかし、他のセリンプロ
テアーゼで得た結果からみて、プロリンアミノ酸残基が
因子Ｘａの切断部位のアルギニン残基の直ぐ後に続く場
合、Ｘａ因子は切断しないと考えられる。
率に影響しないことも分った。しかし、他のセリンプロ
テアーゼで得た結果からみて、プロリンアミノ酸残基が
因子Ｘａの切断部位のアルギニン残基の直ぐ後に続く場
合、Ｘａ因子は切断しないと考えられる。
活性化Ｘ因子による処理は、Ｘａａ子切断部位のアルイ
ニンアミノ酸残基に続くペプチド結合で実質的に本発明
の融合タン白質を切断し、天然形の外来遺伝子産物を遊
離する。したがって、活性Ｘ因子による処理は、外来遺
伝子産物アミノ酸配列由来のＸａ因子の切断部位アミノ
酸配列と共に、Ｎ−末端メチオニンアミノ酸残基又は宿
主タン白アミノ酸配列を切断するのに使５ことができる
。
ニンアミノ酸残基に続くペプチド結合で実質的に本発明
の融合タン白質を切断し、天然形の外来遺伝子産物を遊
離する。したがって、活性Ｘ因子による処理は、外来遺
伝子産物アミノ酸配列由来のＸａ因子の切断部位アミノ
酸配列と共に、Ｎ−末端メチオニンアミノ酸残基又は宿
主タン白アミノ酸配列を切断するのに使５ことができる
。
ある場合には、目的の外来タン白質はＸａ因因子上り切
断され易いアミノ酸配列を含むことが分つた。その様な
場合に、外来タン白を得るために、本発明方法を使用す
ることも可能である。例えば、外来タン白における影響
され易い配列は動力学的に余り望ましい配列ではなく、
例えばＰ４でＩｌｅの代りにＰｒｏを有するものであり
、又は外来タン白に「埋没」させることもできる。その
ような場合に、外来タン白の配列が切断される速度は、
リンカ−配列が切断される場合より有意に低い。したが
って、反応条件を調整するかあるいは切断を行な５時間
を制限することにより、外来タン白質に配列の有意な切
断がな（、リンカ−の実質的に完全な切断を得ることが
可能である。
断され易いアミノ酸配列を含むことが分つた。その様な
場合に、外来タン白を得るために、本発明方法を使用す
ることも可能である。例えば、外来タン白における影響
され易い配列は動力学的に余り望ましい配列ではなく、
例えばＰ４でＩｌｅの代りにＰｒｏを有するものであり
、又は外来タン白に「埋没」させることもできる。その
ような場合に、外来タン白の配列が切断される速度は、
リンカ−配列が切断される場合より有意に低い。したが
って、反応条件を調整するかあるいは切断を行な５時間
を制限することにより、外来タン白質に配列の有意な切
断がな（、リンカ−の実質的に完全な切断を得ることが
可能である。
以下の例により更に本発明を説明する。
例１
構築
Ｘａ因子のＩｌｅ −Ｇｌｕ −Ｇｌｙ −Ａｒｇ認識
部位をコードす°るＤＮＡ配列を含有するファージベク
ターＭ１３ｍｐ１１ＦＸを構築した。λＣ１１タン白質
の３１−アミノ酸末端残基とヒトβ−グロビンの完全ア
ミノ酸配列から成るハイブリッド融合タン白質の有効産
生を指向する２つのベクターｐＬｃＩＬＦＸ／とＤＬＣ
１１βを構築した。前者のベクターはまたλ１１とβ−
グロビンコード配列をリンクするＩｌｅ −Ｇｌｕ −
Ｇｌｙ −Ａｒｇ Ｘａ因子切断部位をコー１するＤＮ
Ａ配列を含む。
部位をコードす°るＤＮＡ配列を含有するファージベク
ターＭ１３ｍｐ１１ＦＸを構築した。λＣ１１タン白質
の３１−アミノ酸末端残基とヒトβ−グロビンの完全ア
ミノ酸配列から成るハイブリッド融合タン白質の有効産
生を指向する２つのベクターｐＬｃＩＬＦＸ／とＤＬＣ
１１βを構築した。前者のベクターはまたλ１１とβ−
グロビンコード配列をリンクするＩｌｅ −Ｇｌｕ −
Ｇｌｙ −Ａｒｇ Ｘａ因子切断部位をコー１するＤＮ
Ａ配列を含む。
方法
スヘてのＤＮＡ操作はマニアティス等の方法（モレキュ
ラー〇クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、コールげ・スプリング・ハーバ−、ニューヨー
ク、１９８２）Ｋより行なった。温度感受性溶原株ＭＺ
−１（ｇａｌ ｋａｍΔ８ａｔｔ ＬΔ Ｂａｎ Ｎ７
Ｎ５５ ｃＩ８５７ΔＨＴ、ｈｉｓ−１ｉｌｖ−１ｂ
ｉｏ−１Ｎ＋、ケイ・マッヶニイ博士より受領）をλＰ
Ｌプロモーター含有含有クラスミ宿主株として使用した
。形質転換はリモート等（ゾーン（Ｇｅｎｅ ）、１５
．８１−９６．１９８１）の方法により行なった。Ｔ
４ ＤＮＡ ！Ｊ 、？−ゼは株ＮＭ９８９（マレ−等
、ジャーナル・オプ・モレキュラー・バイオロジイ（Ｊ
、 Ｍｏ１ｅｃ。
ラー〇クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ）、コールげ・スプリング・ハーバ−、ニューヨー
ク、１９８２）Ｋより行なった。温度感受性溶原株ＭＺ
−１（ｇａｌ ｋａｍΔ８ａｔｔ ＬΔ Ｂａｎ Ｎ７
Ｎ５５ ｃＩ８５７ΔＨＴ、ｈｉｓ−１ｉｌｖ−１ｂ
ｉｏ−１Ｎ＋、ケイ・マッヶニイ博士より受領）をλＰ
Ｌプロモーター含有含有クラスミ宿主株として使用した
。形質転換はリモート等（ゾーン（Ｇｅｎｅ ）、１５
．８１−９６．１９８１）の方法により行なった。Ｔ
４ ＤＮＡ ！Ｊ 、？−ゼは株ＮＭ９８９（マレ−等
、ジャーナル・オプ・モレキュラー・バイオロジイ（Ｊ
、 Ｍｏ１ｅｃ。
Ｂｉｏｌ 、 ）、１６２，４９３−５０５，１９７９
＃よびティト等、ジャーナル・オデ・バイオロジカル・
ケミストリイ（Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）、
２５５．８１３−８１５．１９８０ ）から調製した。
＃よびティト等、ジャーナル・オデ・バイオロジカル・
ケミストリイ（Ｊ 、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）、
２５５．８１３−８１５．１９８０ ）から調製した。
制限酵素はニューイングランドｅバイオラゴから購入し
た。
た。
（ａ）ｕ１３ｍｐＨＦｘ
２つのオリゴヌクレオチドノＴＡＣＣＣＴＣＧＡＴＧＧ
ＡＴＣとｄＣＡＴＣＧＡＧＧＧＴＡＧＧＣＣは調整した
有孔ガラス支持体によるホスホトリエステル法（スデラ
ウト等、テトラヒドロン・レター（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ、 ） ２４．５７７１−５７７４゜１
９８３）により合成し、ＨＰＬＣにより精製（ディト等
、ヌクレイツク・アシツズのリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ） 、１０．６２４
５−６２５４．１９８２）した。２つのオリゴヌクレオ
チｒはＴ４ポリヌクレオテげキナーゼ（Ｐ−Ｌ、バイオ
ケミカルス）とｒ （ｒ−”１））ＡＴＰ（り、０００
Ｃ１／ ｍＭ、ア−ｒ −シャＡ ） テ！Ｊ ｙ
Ｍ 化機アニーリングし、連結して、コンカテマーを得
た。ついでこのＤＮＡをＢａｎ Ｈ１で消化し、Ｍ１３
ｍｐ１１の脱リン酸化部位建りａ−ンしくビエイラ等、
ジーン（Ｇｅｎｅ ）、１９．２５９−２６８．１９８
２）、第１図に示すＭ１３ｍｐＨＦｘを得た。このベク
ターはイソプロピル−β−Ｄ−チオＩラクトーピラノシ
ドと５〜ゾロモー４〜クロロ−３−イン「リルーβ−Ｚ
−ガラクトシド（シグマ）の存在下でブループラークを
形成する〇 （ｂ）ｐＬｃ １１βとｐＬｃ １１ ＦＸβ複数制限
部位を含むＥｃｏＲｌ −Ｈｉｎｄ ｍ断片をＭ １３
ｍｐ １Ｑから切断（ビエイラ等、同上）し、Ｅｃｏ
Ｒ１’ −Ｈｌｎｄ ｍ切断ｐＬｃ ２４５ Ｋ連結（
リモート等、同上）してｐＬｍｐ １０を得た。ｎｕｔ
Ｒ，ｔＢ１部位およびＣ１１遺伝子の一部を含有する
６１９ｂｐ ＡｌｕＩ断片をｐＫｏ １８０５から切断
（マツヶニイー・ケイ、学位論文、ジョンズ・ホデキン
ス大、１９８２）Ｌ、β−がラクトンダーゼα−ペプチ
ド遺伝子に対し同じ配向でＭｌ ３ ｍｐ １０の９ｍ
ａＩ部位にクローンした。ついでλＤＮＡ配列を含むＥ
ｃｏＲｌ −Ｈｉｎｄ ｍ断片を切断し、ｐＬｍｐ １
０のＥｃｏＲｌ −Ｈｉｎｄ ｍ部位にクローンして、
ｐＬｃ ＩＩを得た。完全ヒトβ−グロビンｃＤＮＡ配
列は不完全ｃＤＮＡクローン（ｐＪＷ １０２−ウィル
ソン等、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、５，５６
３−５８１．１９７８）および”’ ／ Ａ ＤＮＡ
りａ −７（ローン等、セｐｙ （Ｃｅ１ｌ ）、２１
．６４７−６５１．１９８０）から調製した制限断片を
結合して再構築し、Ｍ １３ ｍｐ ９中８ｍａＩ −
Ｈｌｎｄ ｍ部位にクローンした。こうして得たＭ １
５ ｆｌｌＢ） ９βｃＤＮＡは開始コーンに位置する
Ｎｅｏ １部位で開き、１００μＭ４ノＮＴＰの存在下
フレナラＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンが−・マンハイ
ム）で処理し、フラッシュ末端を形成した。β−グロビ
ンとｃＤＮＡ配列をＨｌｎｄ ｍで切り出し、ｐＬｃＩ
ＩのＢａｍＨＩ（フィルド・イン）−Ｈｌｎｄ ｍ部位
に挿入して、第１図に示すプラスミドｐＬｃ ＩＩβを
得た。ｐＬｃ ｎβでは、β−グロビン遺伝子はＭ １
３ ｍｐ １０由来の小さいリンカ−ＤＮＡを介して相
中λＣ１１遺伝子に融合させる。
ＡＴＣとｄＣＡＴＣＧＡＧＧＧＴＡＧＧＣＣは調整した
有孔ガラス支持体によるホスホトリエステル法（スデラ
ウト等、テトラヒドロン・レター（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ、 ） ２４．５７７１−５７７４゜１
９８３）により合成し、ＨＰＬＣにより精製（ディト等
、ヌクレイツク・アシツズのリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ） 、１０．６２４
５−６２５４．１９８２）した。２つのオリゴヌクレオ
チｒはＴ４ポリヌクレオテげキナーゼ（Ｐ−Ｌ、バイオ
ケミカルス）とｒ （ｒ−”１））ＡＴＰ（り、０００
Ｃ１／ ｍＭ、ア−ｒ −シャＡ ） テ！Ｊ ｙ
Ｍ 化機アニーリングし、連結して、コンカテマーを得
た。ついでこのＤＮＡをＢａｎ Ｈ１で消化し、Ｍ１３
ｍｐ１１の脱リン酸化部位建りａ−ンしくビエイラ等、
ジーン（Ｇｅｎｅ ）、１９．２５９−２６８．１９８
２）、第１図に示すＭ１３ｍｐＨＦｘを得た。このベク
ターはイソプロピル−β−Ｄ−チオＩラクトーピラノシ
ドと５〜ゾロモー４〜クロロ−３−イン「リルーβ−Ｚ
−ガラクトシド（シグマ）の存在下でブループラークを
形成する〇 （ｂ）ｐＬｃ １１βとｐＬｃ １１ ＦＸβ複数制限
部位を含むＥｃｏＲｌ −Ｈｉｎｄ ｍ断片をＭ １３
ｍｐ １Ｑから切断（ビエイラ等、同上）し、Ｅｃｏ
Ｒ１’ −Ｈｌｎｄ ｍ切断ｐＬｃ ２４５ Ｋ連結（
リモート等、同上）してｐＬｍｐ １０を得た。ｎｕｔ
Ｒ，ｔＢ１部位およびＣ１１遺伝子の一部を含有する
６１９ｂｐ ＡｌｕＩ断片をｐＫｏ １８０５から切断
（マツヶニイー・ケイ、学位論文、ジョンズ・ホデキン
ス大、１９８２）Ｌ、β−がラクトンダーゼα−ペプチ
ド遺伝子に対し同じ配向でＭｌ ３ ｍｐ １０の９ｍ
ａＩ部位にクローンした。ついでλＤＮＡ配列を含むＥ
ｃｏＲｌ −Ｈｉｎｄ ｍ断片を切断し、ｐＬｍｐ １
０のＥｃｏＲｌ −Ｈｉｎｄ ｍ部位にクローンして、
ｐＬｃ ＩＩを得た。完全ヒトβ−グロビンｃＤＮＡ配
列は不完全ｃＤＮＡクローン（ｐＪＷ １０２−ウィル
ソン等、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、５，５６
３−５８１．１９７８）および”’ ／ Ａ ＤＮＡ
りａ −７（ローン等、セｐｙ （Ｃｅ１ｌ ）、２１
．６４７−６５１．１９８０）から調製した制限断片を
結合して再構築し、Ｍ １３ ｍｐ ９中８ｍａＩ −
Ｈｌｎｄ ｍ部位にクローンした。こうして得たＭ １
５ ｆｌｌＢ） ９βｃＤＮＡは開始コーンに位置する
Ｎｅｏ １部位で開き、１００μＭ４ノＮＴＰの存在下
フレナラＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンが−・マンハイ
ム）で処理し、フラッシュ末端を形成した。β−グロビ
ンとｃＤＮＡ配列をＨｌｎｄ ｍで切り出し、ｐＬｃＩ
ＩのＢａｍＨＩ（フィルド・イン）−Ｈｌｎｄ ｍ部位
に挿入して、第１図に示すプラスミドｐＬｃ ＩＩβを
得た。ｐＬｃ ｎβでは、β−グロビン遺伝子はＭ １
３ ｍｐ １０由来の小さいリンカ−ＤＮＡを介して相
中λＣ１１遺伝子に融合させる。
ｐＬｃＩＩＦＸβを構築するために１Ｍ１３ｍｐ９βｃ
ＤＮＡｋｍｃｏ Ｉで開き、４０ ｔｓｌのＤＮＡは２
００ユ＝ツトの４ｔヌクレアーゼ（Ｐ−Ｌ、 バイオ
ケミカルス）で３０ ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４，６，
５０ｍＭ ＮａＣｊ、１ ｍＭＺｎｃｊ、、５％グリセ
ロール中０°Ｃ／１０分間処理して、５′突出末端を除
いた。β−グロビンｃＤＮＡ配列を）（ｉｎｄ ＩＩＩ
で切り出し、Ｓｔｕ Ｉ −Ｈｌｎｄ ｍ切断Ｍ１３ｍ
ｐ１１ＦＸにクローンした。ＤＮＡ配列はジデオキシ鎖
末端法（シンが−等、ＰＮＡＳ。
ＤＮＡｋｍｃｏ Ｉで開き、４０ ｔｓｌのＤＮＡは２
００ユ＝ツトの４ｔヌクレアーゼ（Ｐ−Ｌ、 バイオ
ケミカルス）で３０ ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４，６，
５０ｍＭ ＮａＣｊ、１ ｍＭＺｎｃｊ、、５％グリセ
ロール中０°Ｃ／１０分間処理して、５′突出末端を除
いた。β−グロビンｃＤＮＡ配列を）（ｉｎｄ ＩＩＩ
で切り出し、Ｓｔｕ Ｉ −Ｈｌｎｄ ｍ切断Ｍ１３ｍ
ｐ１１ＦＸにクローンした。ＤＮＡ配列はジデオキシ鎖
末端法（シンが−等、ＰＮＡＳ。
７４．５４６５−５４６７．１９７７ ）により測定シ
て、β−グロビン遺伝子の第１バリン コｒンはＩｌｅ
−Ｇｌｕ −Ｇｌｙ −ＡｒｇをコーダするＤＮＡ配
列より下流であった。ついでβ−グロビン配列の一部を
含むＢａｍ Ｈ１断片を切り出し、Ｂａｎ＋ ＩＩＩ消
化ｐＬＣＩＩＩにクローンし、第１図に示すｐＬｃ Ｉ
Ｆ Ｆ Ｘβを得た。
て、β−グロビン遺伝子の第１バリン コｒンはＩｌｅ
−Ｇｌｕ −Ｇｌｙ −ＡｒｇをコーダするＤＮＡ配
列より下流であった。ついでβ−グロビン配列の一部を
含むＢａｍ Ｈ１断片を切り出し、Ｂａｎ＋ ＩＩＩ消
化ｐＬＣＩＩＩにクローンし、第１図に示すｐＬｃ Ｉ
Ｆ Ｆ Ｘβを得た。
（Ｃ）大腸菌中λＣＩＩ／β−グロビンハイブリッド融
合タン白質の発現 ２時間の誘導でおよび誘導なしで、ｐＬｃ ＩＩ、ｐＬ
ｃ ＵβおよびｐＬｃ ＩＩ Ｆ Ｘβを含むＨｚ−１
由来の全細胞タン白質を１８％ポリアクリルアミド５Ｄ
Ｓｒルで分析し、クーマシイプルーが現われた。生成ゲ
ルは第２図に示す。レーンは次の様なＭＺ−１細胞な含
むプラスミドと同定される。
合タン白質の発現 ２時間の誘導でおよび誘導なしで、ｐＬｃ ＩＩ、ｐＬ
ｃ ＵβおよびｐＬｃ ＩＩ Ｆ Ｘβを含むＨｚ−１
由来の全細胞タン白質を１８％ポリアクリルアミド５Ｄ
Ｓｒルで分析し、クーマシイプルーが現われた。生成ゲ
ルは第２図に示す。レーンは次の様なＭＺ−１細胞な含
むプラスミドと同定される。
（ａ） ｐＬｃＩＩ 、 ３０°Ｃ（ｂ）
ｐＬｃ Ｋ 、 ４２℃（ｃ） ｐＬｃ
ＩＩＩ、 ３０℃（ｄ）ｐＬｃ ＩＩＩ、
４２°Ｃ（ｅ） ｐＬｃ ＩＩ Ｆ Ｘβ、 ３
０°Ｃおよび（ｆ） ｐＬｃ ＩＩ Ｆ Ｘβ、 ４
２℃方法 ＭＺ−１含有発現プラスミドｐＬｃ ＩＩ、ｐＬｃ Ｉ
ＩＩおよびｐＬｃＩＩＦＸβを２ Ｘ’ｒＹ培地（トリ
プトン’＋６１゜酵母エキス１０１． ＮａＣｊ５ＪＦ
／ ｌ ）中Ａ６００＝０．７に３０℃で生育させ、培
養物を２分し、各培養物の職を予め６５°ＯＫ加熱した
２ＸＴＹ等量と混合し、４２℃に生育させた。全細胞タ
ン白質を等量のフェノールで抽出し、５容のエタノール
で沈澱させた後スピンさせた（リモート等、同上）。ペ
レツ） ｋ ＳＤ８サンプルバッファーに溶解し、リム
リイの方法（ネイチャー、２２７，６８０−６８５．１
９７０）を使って上記通り１８％ポリアクリルアミドＳ
ＤＳデルで分析した。
ｐＬｃ Ｋ 、 ４２℃（ｃ） ｐＬｃ
ＩＩＩ、 ３０℃（ｄ）ｐＬｃ ＩＩＩ、
４２°Ｃ（ｅ） ｐＬｃ ＩＩ Ｆ Ｘβ、 ３
０°Ｃおよび（ｆ） ｐＬｃ ＩＩ Ｆ Ｘβ、 ４
２℃方法 ＭＺ−１含有発現プラスミドｐＬｃ ＩＩ、ｐＬｃ Ｉ
ＩＩおよびｐＬｃＩＩＦＸβを２ Ｘ’ｒＹ培地（トリ
プトン’＋６１゜酵母エキス１０１． ＮａＣｊ５ＪＦ
／ ｌ ）中Ａ６００＝０．７に３０℃で生育させ、培
養物を２分し、各培養物の職を予め６５°ＯＫ加熱した
２ＸＴＹ等量と混合し、４２℃に生育させた。全細胞タ
ン白質を等量のフェノールで抽出し、５容のエタノール
で沈澱させた後スピンさせた（リモート等、同上）。ペ
レツ） ｋ ＳＤ８サンプルバッファーに溶解し、リム
リイの方法（ネイチャー、２２７，６８０−６８５．１
９７０）を使って上記通り１８％ポリアクリルアミドＳ
ＤＳデルで分析した。
（ｄ）ウシ血液凝固Ｘａ因子によるＣＩ［ＦＸβ−グロ
ビン融合タン白質の消化。
ビン融合タン白質の消化。
ＣｎＦＸβ−グロビン融合タン白質サンプルは各種時間
酵素／基質１ ：１００の割合で２５℃で消化し、生成
物を１８％ポリアクリルアミ）−’ ＳＤ８ ゲル（レ
ムリイ、同上）で分析した。得たケ９ルは第６図に示す
。各神レーンのＸａ因子添加後の消化時間は次の通りで
ある。
酵素／基質１ ：１００の割合で２５℃で消化し、生成
物を１８％ポリアクリルアミ）−’ ＳＤ８ ゲル（レ
ムリイ、同上）で分析した。得たケ９ルは第６図に示す
。各神レーンのＸａ因子添加後の消化時間は次の通りで
ある。
（ｂ）５分、
（ｃ） １５分、
（ｄ） ３０分、
（ｅ） ６０分、
（ｆ）１２０分、
レーン（ａ）＆！未消化ＣＩＩＦＸβ−グロビンについ
て得た結果であり、レーン（ｇ）はα（ファーストパン
Ｉ″）とβ（スローパンＶ）から成るヒト成人ヘモグロ
ビンである。比較のために、第３図はＣＩＩβ−グロビ
ン融合タン白質の結果を含み、未処理（レーン（ｉ））
又は上記の（レーン（ｈ））のようにＸａ因子で１２０
分処理後のＸａ因子切断部位を欠いている。結果によれ
ば、ＣＩＩＦＸβ−グロビンは特異的にＸａ因子処理に
より切断され、経時的に蓄積する真のヒトβ−グロビン
と同じ大きさのタン白質を生成しかつＣＩ［β−グロビ
ンの切断はない。
て得た結果であり、レーン（ｇ）はα（ファーストパン
Ｉ″）とβ（スローパンＶ）から成るヒト成人ヘモグロ
ビンである。比較のために、第３図はＣＩＩβ−グロビ
ン融合タン白質の結果を含み、未処理（レーン（ｉ））
又は上記の（レーン（ｈ））のようにＸａ因子で１２０
分処理後のＸａ因子切断部位を欠いている。結果によれ
ば、ＣＩＩＦＸβ−グロビンは特異的にＸａ因子処理に
より切断され、経時的に蓄積する真のヒトβ−グロビン
と同じ大きさのタン白質を生成しかつＣＩ［β−グロビ
ンの切断はない。
方法
ＭＺ −１含有ｐＬｃｆｆＦＸβを２ＸＴＹ培地に生育
させたｏ Ａ６００ ＝ ０．７では、培養物を６５°
Ｃに予熱した５００ｍＡ！２ｘＴＹと混合し、４２℃で
生育させた。
させたｏ Ａ６００ ＝ ０．７では、培養物を６５°
Ｃに予熱した５００ｍＡ！２ｘＴＹと混合し、４２℃で
生育させた。
２時間後、細胞を回収し、高塩沈澱物を調製した（ギル
マー等、ＰＮＡＳ、７９．２１５２−２１５６．１９８
２）。ベレットを６０プＩＱｍＭリン酸ナトリウムＰ）
１４．１％８Ｄ８ （ＢＤＨ）、１％β−メルカプトエ
タノールに溶解し、沸騰浴中で５分間培養した。このサ
ンプルは１０ｍＭリン酸ナトリウムＰＨ６，０，１ｍＭ
ジテオスレイトール、０．１％ＳＤＳ忙対し透析し、ヒ
ドロキシアパタイト（バイオ轡ラッド、ＤＮＡグレーｒ
）カラムで精製した（モス等、ジャーナル・オプ・バイ
オロジイ書ケミストリ イ 、 ２ ４ ７ 、
５１９４−５１９８ 、 １９７２） 。
マー等、ＰＮＡＳ、７９．２１５２−２１５６．１９８
２）。ベレットを６０プＩＱｍＭリン酸ナトリウムＰ）
１４．１％８Ｄ８ （ＢＤＨ）、１％β−メルカプトエ
タノールに溶解し、沸騰浴中で５分間培養した。このサ
ンプルは１０ｍＭリン酸ナトリウムＰＨ６，０，１ｍＭ
ジテオスレイトール、０．１％ＳＤＳ忙対し透析し、ヒ
ドロキシアパタイト（バイオ轡ラッド、ＤＮＡグレーｒ
）カラムで精製した（モス等、ジャーナル・オプ・バイ
オロジイ書ケミストリ イ 、 ２ ４ ７ 、
５１９４−５１９８ 、 １９７２） 。
ＣＩＩＦＸβ−グロビンハイブリッドタン白質を限外［
過（アミコン、ＰＭ−１０膜）により濃縮し、アセトン
０．１／ＮＨＣＪ＜５容で沈澱させて、ＳＤＳを除いた
。沈澱物を風乾し、８Ｍ尿素に溶解し、１００ｍＭＮ
ａ Ｃｊ、５０ ｍＭ ）リスａｃＪ、ｐＨ８，０およ
び１ｍＭＣａＣｆ２に対し透析した。ウシ血液凝固Ｘ因
子（エムービー〇エスナフ博士より受領）はラッセルの
パイパーベノムで因子Ｘａに活性化させた（フジカワ等
、バイオケミストリイ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）
、１１．４８９２−４８９８．１９７２ ）。
過（アミコン、ＰＭ−１０膜）により濃縮し、アセトン
０．１／ＮＨＣＪ＜５容で沈澱させて、ＳＤＳを除いた
。沈澱物を風乾し、８Ｍ尿素に溶解し、１００ｍＭＮ
ａ Ｃｊ、５０ ｍＭ ）リスａｃＪ、ｐＨ８，０およ
び１ｍＭＣａＣｆ２に対し透析した。ウシ血液凝固Ｘ因
子（エムービー〇エスナフ博士より受領）はラッセルの
パイパーベノムで因子Ｘａに活性化させた（フジカワ等
、バイオケミストリイ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ）
、１１．４８９２−４８９８．１９７２ ）。
例２
Ｘａ因子の狭い基質特異性の実験的証拠を得るために、
多（のタン白質を変性し、各々は、Ｘａ因子で消化する
前に、例１に示したように得た、ＣＩＩＦＸβ−グロビ
ン融合タン白質に別々に加えた。
多（のタン白質を変性し、各々は、Ｘａ因子で消化する
前に、例１に示したように得た、ＣＩＩＦＸβ−グロビ
ン融合タン白質に別々に加えた。
消化は例１のように行なった。消化の時間コースはＳＤ
８ポリアクリルアミドゲル電気泳動に従った。
８ポリアクリルアミドゲル電気泳動に従った。
各実験では、殆んどすべてのβ−グロビンはハイブリッ
ドタン白質から切断された時まで、変性タンーーの≧７
０％は未消化のま〜であった。これらの各ペデテ）’（
＞１０００全体のアミノ酸残基）はＸａ因子切断可能な
リンカ−を含むハイブリッドタン白質から真のタン白質
として回収したことを示す。
ドタン白質から切断された時まで、変性タンーーの≧７
０％は未消化のま〜であった。これらの各ペデテ）’（
＞１０００全体のアミノ酸残基）はＸａ因子切断可能な
リンカ−を含むハイブリッドタン白質から真のタン白質
として回収したことを示す。
方法
ウシ血清アルブミン、ヒトデラスミノ−ｒン、ウシパン
クレアチントリデシンインヒーターおよびすざヌクレア
ーゼＡを減らし、５Ｍグアニジン塩酸塩の存在下ヨード
酢酸でアルキル化し、そしてチキンコアヒストンＨ２ａ
−Ｈ２ｂダイマーをＩＭａｃｚにさらして変性させた。
クレアチントリデシンインヒーターおよびすざヌクレア
ーゼＡを減らし、５Ｍグアニジン塩酸塩の存在下ヨード
酢酸でアルキル化し、そしてチキンコアヒストンＨ２ａ
−Ｈ２ｂダイマーをＩＭａｃｚにさらして変性させた。
すべて６つのタン白質を急速にトリプシンで消化し、Ｃ
ＩＩＦＸβ−グロビン融合タン白質とＸａ因子で培養の
ために使う条件下で部分的又は完全に変性させた。各タ
ン白質は例１（ｃ）のよう゛に調製しかっ例１（ｄ）の
ように消化した等量のＣｎＦＸβ−グロビン融合タン白
質に混合した。
ＩＩＦＸβ−グロビン融合タン白質とＸａ因子で培養の
ために使う条件下で部分的又は完全に変性させた。各タ
ン白質は例１（ｃ）のよう゛に調製しかっ例１（ｄ）の
ように消化した等量のＣｎＦＸβ−グロビン融合タン白
質に混合した。
例３
ベクターｐＣＴ ２０２１０を構築し、ＣＡＴとｈＣＴ
−（１０）７ポリペデテド配列間のＸａ因子切断配列（
ｒ １ｅ−Ｇｌｕ−ｏｉｙ−Ａｒｇ）を含有するクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ
）ヒトカルシトニングリシン（ｈｃｒ−Ｇｌｙ）融合タ
ン白質の発現のためにコードした。上記例の様に、 Ｄ
ＮＡ操作は本質的にマニアテイス等（モレキュラー・ク
ローニング、コールド・スプリング・ハ、−バー、ニュ
ーヨーク、１９８２）の方法により行なった。
−（１０）７ポリペデテド配列間のＸａ因子切断配列（
ｒ １ｅ−Ｇｌｕ−ｏｉｙ−Ａｒｇ）を含有するクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ
）ヒトカルシトニングリシン（ｈｃｒ−Ｇｌｙ）融合タ
ン白質の発現のためにコードした。上記例の様に、 Ｄ
ＮＡ操作は本質的にマニアテイス等（モレキュラー・ク
ローニング、コールド・スプリング・ハ、−バー、ニュ
ーヨーク、１９８２）の方法により行なった。
ベクター２０２１０の構築のための出発点は、ＣＡＴＩ
−Ｇｌｕ−ｈＣＴ−Ｇｌｙ融合タン白質の発現をコード
するベクターｐＣＴ ２０２６であった。ベクター１）
ＣＴ ２０２６の構築は英国特許第２，１０４．８１０
号明細ｔＫ詳述されており、その開示を参照する。
−Ｇｌｕ−ｈＣＴ−Ｇｌｙ融合タン白質の発現をコード
するベクターｐＣＴ ２０２６であった。ベクター１）
ＣＴ ２０２６の構築は英国特許第２，１０４．８１０
号明細ｔＫ詳述されており、その開示を参照する。
第４図については、ベクター１）ＣＴ ２０２６はｋｃ
ｃｒとＢｇＩ ＩＩで消化し、ＧｌｕとｈＣＴのアミノ
酸残基１−４個をコードするＤＮＡ配列を摘出した。
ｃｒとＢｇＩ ＩＩで消化し、ＧｌｕとｈＣＴのアミノ
酸残基１−４個をコードするＤＮＡ配列を摘出した。
生成したプラスミドＤＮＡを単離し、次の過量のオリが
ヌクレオチドで連結した。
ヌクレオチドで連結した。
Ｒ２７６５’ −ＧＡＴＣＴ ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＧＴ
ＣＧＴ ＴＣ）Ｔ ＧＧＴＡＡＣＣＴＧ Ｔ−３’お
よび Ｒ２７５５’ −ＡＧＡ ＣＡＧ （）ＴＴ ＡＣＣＡ
ＣＡ ＡＣ（） ＡＣＣ’ｒ’ｌ”ｃ ＡＴＴ Ａ−３
’。
ＣＧＴ ＴＣ）Ｔ ＧＧＴＡＡＣＣＴＧ Ｔ−３’お
よび Ｒ２７５５’ −ＡＧＡ ＣＡＧ （）ＴＴ ＡＣＣＡ
ＣＡ ＡＣ（） ＡＣＣ’ｒ’ｌ”ｃ ＡＴＴ Ａ−３
’。
生成したプラスミド分子を大腸菌ＨＢ １０１細胞に形
質転換し、その形質転換細胞をアンピシリン（１００μ
Ｉ ／ ｍｅ ）含有培地忙生育させて選択した。形質
転換と還択は生成する耐アンピシリンコロニーよりの小
規模プラスミド調製とこれらのＤＮＡ分子のＢｓｔＥｉ
ＩＩ Ｋよる消化に従った。Ｂｓｔ Ｅ ＩＩ部部位含
有シラスミＦ、ｐｃＴ２０２１０を単離し、そのＩ）Ｎ
ＡはＣＡＴとｈＣ”Ｉ’ポリペプチドをコーマする配列
結合領域にて配列させた。測定したＤＮＡ配列は相当す
るアミノ酸配列（トップライン）と共に以下忙示す。Ｅ
）ＣＴ ２０２１０はｃＡＴとｈＣＴ−Ｇｌｙボる配列
間の因子Ｘａｍ断配列配列ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
をコードする正しい配列を含むことを確認する。
質転換し、その形質転換細胞をアンピシリン（１００μ
Ｉ ／ ｍｅ ）含有培地忙生育させて選択した。形質
転換と還択は生成する耐アンピシリンコロニーよりの小
規模プラスミド調製とこれらのＤＮＡ分子のＢｓｔＥｉ
ＩＩ Ｋよる消化に従った。Ｂｓｔ Ｅ ＩＩ部部位含
有シラスミＦ、ｐｃＴ２０２１０を単離し、そのＩ）Ｎ
ＡはＣＡＴとｈＣ”Ｉ’ポリペプチドをコーマする配列
結合領域にて配列させた。測定したＤＮＡ配列は相当す
るアミノ酸配列（トップライン）と共に以下忙示す。Ｅ
）ＣＴ ２０２１０はｃＡＴとｈＣＴ−Ｇｌｙボる配列
間の因子Ｘａｍ断配列配列ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
をコードする正しい配列を含むことを確認する。
（ｂ） ＣＡＴ Ｉ ＸａｈＣＴ Ｇｌｙ融合タン白質
の調製プラスミドｐＣＴ ２０２１０を含有する大腸菌
ＨＢ １０１ 細胞は２０μＩ／−クロラムフェニコー
ルを含有する補充無機塩培地にて４１発酵槽中後期指数
増殖期１２３７℃で培養した。細胞を遠心分離（ＬＯＯ
Ｏｒｐｍｘｌ［］分）により回収した。
の調製プラスミドｐＣＴ ２０２１０を含有する大腸菌
ＨＢ １０１ 細胞は２０μＩ／−クロラムフェニコー
ルを含有する補充無機塩培地にて４１発酵槽中後期指数
増殖期１２３７℃で培養した。細胞を遠心分離（ＬＯＯ
Ｏｒｐｍｘｌ［］分）により回収した。
この細胞を１００ ｍＭＮｉｉと１ ｍＭＥＤＴＡ Ｏ
，２ｍｌＰＭＳ（）溶液（エタノール中３．３■／ｄ）
を含有する５ Ｑ ｍＭ ）リスＩ（（Ｊバッファー、
ｐＨ８，０，６０１ｒＬｌに再懸濁させ、リゾチーム２
１．４１Ｖをサスペンションに加えた。２５分後、４％
（ｗ／′ｖ）？オキシコレート２ＷＬｔを加え、生成し
た粘稠サスぜンジョンを更に１０分間放置した。ＤＮア
ーゼ１ ０．６Ｆｎ９を加え、サスペンションを室温で
放置し、粘度を顕著に低下させた。この段階の終りに、
サスＲンジョンを遠心分離（１１，０００ｒｐｍｘ ５
分）した。
，２ｍｌＰＭＳ（）溶液（エタノール中３．３■／ｄ）
を含有する５ Ｑ ｍＭ ）リスＩ（（Ｊバッファー、
ｐＨ８，０，６０１ｒＬｌに再懸濁させ、リゾチーム２
１．４１Ｖをサスペンションに加えた。２５分後、４％
（ｗ／′ｖ）？オキシコレート２ＷＬｔを加え、生成し
た粘稠サスぜンジョンを更に１０分間放置した。ＤＮア
ーゼ１ ０．６Ｆｎ９を加え、サスペンションを室温で
放置し、粘度を顕著に低下させた。この段階の終りに、
サスＲンジョンを遠心分離（１１，０００ｒｐｍｘ ５
分）した。
融合タン白質は不溶性ペレットフラクションに主として
存在することが分った。
存在することが分った。
しかし、不溶性フラクションに存在する若干のＣＡＴ−
Ｘａ−ｈＣＴ−Ｇｌｙ融合タン白質は、ＣＡＴ １−
Ｇｌｕ −ｈＣＴ−Ｇｌｙ ノ精製ニツいテ英国特許第
２，１０４，８１０号明細書に記載されるＣＡ’Ｉ’基
質アフィニティクロマトゲラフイにより精製した。
Ｘａ−ｈＣＴ−Ｇｌｙ融合タン白質は、ＣＡＴ １−
Ｇｌｕ −ｈＣＴ−Ｇｌｙ ノ精製ニツいテ英国特許第
２，１０４，８１０号明細書に記載されるＣＡ’Ｉ’基
質アフィニティクロマトゲラフイにより精製した。
更に、主にＣＡＴ−Ｘａ−ｈＣＴ−Ｇｌｙ Ｍ４！合タ
ン白質を含有するペレットをさらに次の様に精製した。
ン白質を含有するペレットをさらに次の様に精製した。
ペレットを９容の冷、バッファートリトンＸ１００溶液
（５０ｍＭ ）リス−■、ｐＨ８，０，１０ｍＭｉｉｉ
ＤＴ八０．５ へ ＣＶ／へｒ） ト リ
ト ン Ｘ １ （１０，１００ｍＭＮａｃｊ
）で洗い、遠心分離（１１，０００ｒｐｍｘ ５分）
ＩＣ，ｌ：り回収した。この洗浄操作を２度繰り返した
。生成ペレットを上記のｐ）（８，０トリス−Ｈ（Ｊサ
スペンションバッファー５−に再懸濁させた。融合タン
白質を精製のためにＳＤＳポリアクリルアミｖｒル電気
泳動によりチェックし、へりのサスペンジョ／を一２０
℃に貯蔵した。
（５０ｍＭ ）リス−■、ｐＨ８，０，１０ｍＭｉｉｉ
ＤＴ八０．５ へ ＣＶ／へｒ） ト リ
ト ン Ｘ １ （１０，１００ｍＭＮａｃｊ
）で洗い、遠心分離（１１，０００ｒｐｍｘ ５分）
ＩＣ，ｌ：り回収した。この洗浄操作を２度繰り返した
。生成ペレットを上記のｐ）（８，０トリス−Ｈ（Ｊサ
スペンションバッファー５−に再懸濁させた。融合タン
白質を精製のためにＳＤＳポリアクリルアミｖｒル電気
泳動によりチェックし、へりのサスペンジョ／を一２０
℃に貯蔵した。
上記のように、可溶性又は不溶性フラクションから精製
したＣＡＴ Ｘａ ｈＣＴ Ｇｌｙ融合タン白質を、例
１（Ｃ）の方法により牛血液凝固Ｘａ因子で処理し、ｈ
ＣＴ ＧＩＹを得た。
したＣＡＴ Ｘａ ｈＣＴ Ｇｌｙ融合タン白質を、例
１（Ｃ）の方法により牛血液凝固Ｘａ因子で処理し、ｈ
ＣＴ ＧＩＹを得た。
例４
チキンミオシン軽鎖ｃ ＤＮＡをＳａｕ ９６で消化し
、フレナラポリメラーゼでフィルダーインし、そしてＭ
Ｐ１３ｍｐ１１ＦＸ（例１の通り製造）の５ｔｕＩ部位
にクローンし、Ｍｌ ３ｍｐｌ ＩＦＸ−ＭＬｃを得た
。すべてのＤＮＡ操作は本質的にマニアナイス等（上記
引用）の方法で行なった。このＭ１３誘導物では、ミオ
シンＬ＃の第１アミノ酸コダンは下記のＩＩｓ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−ＡｒｇテトラペデテダをコードするＤＮＡ配
列より下流にある。
、フレナラポリメラーゼでフィルダーインし、そしてＭ
Ｐ１３ｍｐ１１ＦＸ（例１の通り製造）の５ｔｕＩ部位
にクローンし、Ｍｌ ３ｍｐｌ ＩＦＸ−ＭＬｃを得た
。すべてのＤＮＡ操作は本質的にマニアナイス等（上記
引用）の方法で行なった。このＭ１３誘導物では、ミオ
シンＬ＃の第１アミノ酸コダンは下記のＩＩｓ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−ＡｒｇテトラペデテダをコードするＤＮＡ配
列より下流にある。
ｄ 、♂
Ｂａｎ ＨＩ
ミオシンＬ鎖ｃ ＤＮＡ配列を、Ｘａ因子切断配列と共
にＭ １３ ｍｐ １１ＦＸ −）ａＣから切り出し、
例１のように、ｐＬｃ ＩＩにクローンし、ｐＬＣＩＩ
ＦＸ−ＭＬｃ’を得た。
にＭ １３ ｍｐ １１ＦＸ −）ａＣから切り出し、
例１のように、ｐＬｃ ＩＩにクローンし、ｐＬＣＩＩ
ＦＸ−ＭＬｃ’を得た。
ＣＩＩＦＸ−ＭＬｃ融合タン白質は大腸菌中高レベルで
産生され、均質精製した。ついで融合タン白質をペデテ
ｒ結合続いてＩ ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇテトラ
ペデテｒのところで因子Ｘａにより切断し、真のミオシ
ンＬ鎖が遊離した。これらの操作は例１のように行なっ
た。
産生され、均質精製した。ついで融合タン白質をペデテ
ｒ結合続いてＩ ｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇテトラ
ペデテｒのところで因子Ｘａにより切断し、真のミオシ
ンＬ鎖が遊離した。これらの操作は例１のように行なっ
た。
チキンミオシンＬ鎖ｃＤＮＡはライナツバとフィッシュ
マン、ジャーナル・オデ・モレキュラー・バイオロジイ
、１８１．１９８５に記載されているように得た。
マン、ジャーナル・オデ・モレキュラー・バイオロジイ
、１８１．１９８５に記載されているように得た。
第１図はヒトβ−グロビンをコードする配列に結合した
Ｘａ因子の切断部位をコードする配列を含む本発明に係
るベクターの構築の態様を示すＤＮＡ配列および酵素制
限マツプを示す。 第２図は第１図忙示すベクターを使って融合タン白質発
現の結果を示すポリアクリルアミｙ ＳＤ８ゲルを示す
。 第３図は第２図に示す融合タン白質の活性化ウシＸａ因
子による切断の結果を示すポリアクリルアミ）Ｆ ＳＤ
８ ’ｒルを示す。 第４図はＣＡＴ−Ｘａ因子切断部位−ヒトカルシトニン
−グリシン融合タン白質をコー２する配列を含む本発明
に係るベクターの酵素制限マツプを示す。
Ｘａ因子の切断部位をコードする配列を含む本発明に係
るベクターの構築の態様を示すＤＮＡ配列および酵素制
限マツプを示す。 第２図は第１図忙示すベクターを使って融合タン白質発
現の結果を示すポリアクリルアミｙ ＳＤ８ゲルを示す
。 第３図は第２図に示す融合タン白質の活性化ウシＸａ因
子による切断の結果を示すポリアクリルアミ）Ｆ ＳＤ
８ ’ｒルを示す。 第４図はＣＡＴ−Ｘａ因子切断部位−ヒトカルシトニン
−グリシン融合タン白質をコー２する配列を含む本発明
に係るベクターの酵素制限マツプを示す。
Claims (23)
- （１）血液凝固Ｘａ因子により特異的に切断される切断
部位をコードするＤＮＡ配列。 - （２）アミノ酸配列Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＸはＩｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ又はＡｌａであり、ＹはＧｌｕ、Ａ
ｓｐ、Ｇｌｎ又はＡｓｎである）をコードする、特許請
求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 - （３）ＸはＩｌｅであり、ＹはＧｌｕ又はＧｌｎである
、特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ配列。 - （４）アミノ酸配列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを
コードする、特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡ配列。 - （５）配列ＡＴＣ ＧＡＧ ＧＧＴ ＡＧＧを含有する
、特許請求の範囲第４項記載のＤＮＡ配列。 - （６）配列ＡＴＣ ＧＡＧ ＧＧＴ ＡＧＧ ＣＣＴを
含有する、特許請求の範囲第５項記載のＤＮＡ配列。 - （７）配列ＡＴＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＧＴを含有する
、特許請求の範囲第４項記載のＤＮＡ配列。 - （８）特許請求の範囲第１項から第７項のいずれか１項
に記載のＤＮＡコード配列を含むベクター。 - （９）Ｍ１３ｍｐ１１ＦＸ、Ｍ１３ｍｐ１１ＦＸ−ＭＣ
Ｌ、ｐＬｃ１１ＦＸβ、ｐＬｃ１１ＦＸ−ＭＬｃおよび
ｐＣＴ２０２１０ベクター。 - （１０）血液凝固Ｘａ因子により特異的に切断される切
断部位をコードするＤＮＡ配列を、目的のタン白質又は
ペプチド産物をコードするＤＮＡ配列に融合する、特許
請求の範囲第８項記載のベクター。 - （１１）Ｘａ因子切断部位をコードするＤＮＡ配列をＡ
ＴＧコドンに融合させる、特許請求の範囲第１０項記載
のベクター。 - （１２）Ｘａ因子切断部位をコードするＤＮＡ配列を、
宿主タン白質の少なくとも一部をコードする配列に融合
させる、特許請求の範囲第１０項記載のベクター。 - （１３）宿主タン白質はｌａｃＺ、ｔｕｆＢ、ｔｒｐＥ
、ｔｒｐＤ、ｂｌａ、λＣ１１、又はＣＡＴである、特
許請求の範囲第１２項記載のベクター。 - （１４）Ｘａ因子切断部位をコードするＤＮＡ配列を、
目的のタン白質又はペプチド産物をコードするＤＮＡ配
列のＮ−末端に融合させる、特許請求の範囲第１０項か
ら第１３項のいずれか１項に記載のベクター。 - （１５）目的のタン白質又はペプチド産物は酵素、血清
タン白、ペプチドホルモン又はその前駆物質である、特
許請求の範囲第１０項から第１４項のいずれか１項に記
載のベクター。 - （１６）目的のタン白質又はペプチド産物はβ−グロビ
ン、カルシトニン−グリシン又はミオグロビンＬ鎖であ
る、特許請求の範囲第１５項記載のベクター。 - （１７）特許請求の範囲第８項から第１６項のいずれか
１項に記載のベクターで形質転換した宿主生物体。 - （１８）特許請求の範囲第８項から第１６項のいずれか
１項に記載のベクターで形質転換させた大腸菌又はバチ
ルス細胞。 - （１９）特許請求の範囲第８項から第１６項のいずれか
１項に記載のベクターで形質転換させたＭＺ−１又は大
腸菌ＨＢ１０１細胞。 - （２０）天然形のタン白質又はペプチド産物の製造法に
おいて、特許請求の範囲第１０項から第１６項のいずれ
か１項に記載のベクターで宿主生物体を形質転換させ、
Ｘａ因子切断部位に融合させた目的のタン白質又はペプ
チド産物をから成る融合タン白質として目的のタン白質
又はペプチド産物を発現させついで融合タン白質をＸａ
因子で切断して、天然形の外来遺伝子産物を得ることを
特徴とする、上記方法。 - （２１）Ｘａ因子はＸ因子を活性化させて得る、特許請
求の範囲第２０項記載の方法。 - （２２）Ｘ因子はウシＸ＿１又はＸ＿２因子である、特
許請求の範囲第２０項又は第２１項記載の方法。 - （２３）融合タン白質はＸａ因子切断部位に結合させた
宿主タン白質の少なくとも一部から成り、宿主タン白質
はアフィニティ クロマトグラフィにより精製でき、切
断工程前に宿主タン白質に特異的なアフィニティ クロ
マトグラフィ媒体を使って融合タン白質を精製する工程
を含む、特許請求の範囲第２０項から第２２項のいずれ
か１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB848412517A GB8412517D0 (en) | 1984-05-16 | 1984-05-16 | Recombinant fusion proteins |
| GB8412517 | 1984-05-16 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPH074253B2 JPH074253B2 (ja) | 1995-01-25 |
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ID=10561052
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| JP60104914A Expired - Lifetime JPH074253B2 (ja) | 1984-05-16 | 1985-05-16 | 組み換え融合タン白質 |
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| EP (1) | EP0161937B1 (ja) |
| JP (1) | JPH074253B2 (ja) |
| AT (1) | ATE81529T1 (ja) |
| AU (1) | AU585857B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340381C (ja) |
| DE (1) | DE3586750T2 (ja) |
| DK (1) | DK171278B1 (ja) |
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| US5411873A (en) * | 1984-05-29 | 1995-05-02 | Genencor, Inc. | Process for producing heterologous polypeptides |
| US5087564A (en) * | 1985-06-20 | 1992-02-11 | Monsanto Company | Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase |
| EP0207044A1 (en) * | 1985-06-20 | 1986-12-30 | Monsanto Company | Release of peptides from polypeptides |
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| DE3636903A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-02 | Hoechst Ag | Fusionsproteine mit eukaryotischem ballastanteil |
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| US5013653A (en) | 1987-03-20 | 1991-05-07 | Creative Biomolecules, Inc. | Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage |
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| ES2204926T3 (es) | 1989-05-10 | 2004-05-01 | Baxter Biotech Technology S. .R.L. | Procedimiento de preparacion de hemoglobina y derivados de hemoglobina a partir de manipulacion de bacterias y levaduras. |
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| KR100310739B1 (ko) * | 1993-02-04 | 2002-05-30 | 알란 스코브 | 단백질재생을위한개선된방법 |
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| DE10122140A1 (de) * | 2001-05-08 | 2002-11-28 | Apotech Res & Dev Ltd | Rekombinante Fusionsproteine und deren Trimere |
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-
1984
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-
1985
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