JP3277523B2 - 因子ＸａリンカーＤＮＡ - Google Patents

因子ＸａリンカーＤＮＡ

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、制限プロテアーゼ活性
を有する血液凝固因子Xaの認識アミノ酸配列に対応する
遺伝子、及び、それを含む融合遺伝子、発現ベクター、
該発現ベクターを保持する大腸菌とそれらの作製方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌等の宿主細胞に外来の遺伝子を導
入して蛋白質を発現させる遺伝子工学の手法において、
既存の高効率発現ベクター中の構造遺伝子の途中に目的
とする遺伝子を挿入し、大量に融合蛋白質を得る手法が
有効である（例えば、マニアティス（Maniatis）等、モ
レキュラークローニング（Molecular Cloning）: アラ
ボラトリ マニュアル（A Laboratory Manual）、第2
版、pp.17.3-17.9、コールド スプリング ハーバー
ラボラトリ プレス（Cold Spring HarborLaboratory P
ress）、1989）。その際、目的とする成熟型蛋白質を単
離するため、融合蛋白質の融合部位のみを特異的に切断
する、化学的あるいは酵素的なさまざまな手法が開発さ
れている（例えば、ディー ブイ ジョーデル（D.V. G
oeddel）編、メソッド イン エンザイモロジ（Method
s in Enzymology）, 185,129-143 (1990))。その中で、
アミノ酸配列Ile-Glu-Gly-Argを特異的に認識し、Argの
C末端側を切断するプロテアーゼ活性を有する血液凝固
因子Xaを利用する手法が注目されている。その代表例
は、既存の発現ベクターの構造遺伝子中の制限酵素Bam
HI開裂部位に、因子Xa認識アミノ酸配列に対応する塩基
配列を含むDNAリンカー(以後XaリンカーDNAと略記)を挿
入し、リンカー内部の制限酵素Stu I開裂部位に、5'末
端を平滑化した目的とする遺伝子を挿入し、発現した融
合蛋白質を因子Xaで処理することにより、目的とする成
熟型蛋白質を得るというものである（キヨシ ナガイ
他、特開昭61-135591)。その他、ヒトＢ細胞分化因子遺
伝子の上流にXaリンカーDNAを融合した例(浅越義弘他、
特開平2-2353)、ヒト生長ホルモン遺伝子の上流にXaリ
ンカーDNAを融合した例(ギート・グランディ他、特開平2
-2386)、XaリンカーDNAの前後にグリシン数残基分をコ
ードする遺伝子を連結した例（アンドレアス・ブリュッ
クトウーン、特開平2-5881）が開示されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】XaリンカーDNAと目的
とする外来遺伝子とを融合させる際、２つの課題が存在
する。一つは、コドンの読み枠が揃うように融合するこ
と、もう一つは、融合蛋白質を因子Xaで切断する際成熟
型の外来蛋白質を生成することである。上で挙げた開示
例の中で外来遺伝子との一般的な融合法を扱っているの
は特開昭61-135591である。この場合融合部位はXaリン
カーDNAの内部にある制限酵素Stu Iの認識配列AGGCCTで
あり、Stu Iによる開裂でArgコドンAGGが融合上流部分
の3'平滑末端を形成する。従って、この方法で上記２課
題を達成するためには、5'末端塩基が平滑化されてコド
ンの一文字目になるように外来遺伝子を調製する必要が
ある。
【０００４】しかし、一般的には融合すべき外来遺伝子
の5'末端をコドンの一文字目に対応させるように平滑化
することは難しく、確率的には３分の１である。それ以
外の場合上記代表例のベクターをそのまま用いることは
不可能である。
【０００５】本発明の１つの目的は、平滑化を行ってコ
ドンの読み枠に１ヌクレオチド付加された5'末端を生じ
た挿入遺伝子に対して、その上流に因子Xa認識配列をコ
ードするDNAをコドンの読み枠を揃えて連結可能とする
リンカーDNAを提供することである。
【０００６】本発明の他の目的は、特異的な制限酵素部
位を有する任意の構造遺伝子に対し、XaリンカーDNAを
介して目的とする外来遺伝子を連結した融合遺伝子とそ
の作製方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、当該因
子XaリンカーDNAは制限酵素Nru Iの認識配列TCGCGAを含
んでおり、Nru Iによる切断によって因子Xaの認識アミ
ノ酸配列の４番目に当るArgのコドンを２文字目(CG)ま
で含む、平滑化された融合上流部分が得られる。従っ
て、融合すべき外来遺伝子の5'末端にコドンの読み枠よ
りもさらに１ヌクレオチド余分に5'側に付加した状態で
上流部分と連結することにより、読み枠の揃った融合遺
伝子が提供される。この場合のArgコドンの1、2文字目
はCGであるため、このコドンがArgをコードするための3
文字目のヌクレオチドはA,C,G,Tのいずれでもよく、融
合される外来遺伝子の5'末端に付加されているヌクレオ
チドも任意でよいことになる。
【０００８】一般的には、外来遺伝子の5'末端がコドン
の読み枠よりもさらに１ヌクレオチド余分に付加した状
態に平滑化される確率は３分の１である。しかし、最近
の遺伝子工学の進歩により、目的とする遺伝子の全体あ
るいは部分を化学合成する例が増えており、その場合遺
伝子の5'末端には制限酵素の認識部位を設けることが多
い。そこで、5'末端に制限酵素認識部位を持つ外来遺伝
子を、本発明が利用できる形状に修飾する方法について
例をあげて説明する。まず、外来遺伝子の最初のコドン
の直前に、Bam HI, Eco RI, Hind III, Pst I, Sac I等
に代表される6塩基を認識して開裂後4ヌクレオチド突出
末端を形成する制限酵素が存在する場合(図3a)、その制
限酵素で切断後、突出末端をMung Beanヌクレアーゼま
たはS1ヌクレアーゼで除去することにより、外来遺伝子
の最初のコドンの直前に1ヌクレオチドが付加された状
態で残り、これがArgの3文字目を構成することができ
る。
【０００９】次に、開始コドンATGを含んでいる制限酵
素Nde I認識配列CATATGあるいはNcoI認識配列CCATGGを
外来遺伝子の5'末端に有している場合(図3b)、その制限
酵素で切断後、突出末端をT4DNAポリメラーゼでフィル・
アップすることにより、開始コドンMetの直前に1ヌクレ
オチドが付加され5'末端が平滑な遺伝子を作製すること
ができる。この場合、融合蛋白質発現後の因子Xa切断に
より、N末端に開始コドンMetの付加された外来蛋白質が
得られることになる。本発明の適用範囲はここに挙げた
例に留まらず、多くの制限酵素を5'末端に持つ遺伝子に
応用可能である。
【００１０】さらに本発明では、2本鎖DNAの双方に因子
Xa認識配列の情報を与えるため、図１に示すような、Nr
u I認識部位を中心にした22塩基対の逆反復配列を内部
に含むXaリンカーDNAを提供している。さらに本発明に
よれば、因子XaリンカーDNAの両側に適当な制限酵素認
識配列あるいは制限酵素開裂配列を設けることにより、
特異的な制限酵素認識部位を有する任意の構造遺伝子の
内部に当該因子XaリンカーDNAを挿入することができ
る。例えば、図１に示したXaリンカーDNAでは、Xa認識
配列の外側にEco RIとBam HIの認識配列を付加してお
り、Eco RIとBam HIの認識部位を含む任意の構造遺伝子
中に当該リンカーを挿入することができる。この場合、
当該リンカーの逆反復性により、構造遺伝子中のEco RI
とBam HI認識部位の順序は問われないことになる。ま
た、Xa認識配列の外側両側にEco RIの認識配列を持つ構
造のXaリンカー AACGAATTCA TCGAGGGTCG CGACCCTCGA TGAATTCGTTでは 、Eco RIの認識部位は含むがBam HI の認識配列は
含まない任意の構造遺伝子中に当該リンカーを挿入する
ことができる。
【００１１】
【作用】本発明によれば、発現ベクター内の構造遺伝子
内に制限酵素等を用いてコドンの読み枠が揃うように該
因子XaリンカーDNAを連結し、続いてXaリンカーDNA内の
制限酵素Nru I認識部位に目的とする外来遺伝子をコド
ンの読み枠が揃うように連結することにより、Xaリンカ
ーDNAを介して目的とする外来遺伝子を連結した融合遺
伝子を含むベクターが得られる。さらに該発現ベクター
で形質転換した大腸菌を培養することにより該融合遺伝
子に対応する融合蛋白質が生産される。さらに、該融合
蛋白質を回収し、制限プロテアーゼ活性を有する因子Xa
で処理することにより、成熟型の外来遺伝子発現蛋白質
を得ることができる。
【００１２】
【実施例】以下、本発明の実施例を具体的に説明する
が、本発明はこれによりなんら限定されるものではな
い。なお、本実施例で用いた制限酵素は宝酒造(株)製の
ものであり、培地、緩衝液等の調製は前述したManiatis
等のマニュアル（MolecularCloning: A Laboratory Man
ual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1
989）に従った。
【００１３】実施例１ 血液凝固因子XaリンカーDNAの
合成とクローニング 図１に示す２本の40塩基長のオリゴヌクレオチドを、DN
Aシンセサイザー（アプライド バイオシステムズ社製、
モデル380B）を用いて、フォスフォアミダイト法で合成
した。アンモニア水を加えて55℃で12時間放置して保護
基の脱離を行なった後、OPC(oligonucleotide purifica
tion cartridge)カラムを用いて精製した。さらに、溶
媒を遠心減圧留去した後、固化した上記オリゴヌクレオ
チド2本をそれぞれTE緩衝液100μlに溶解し、260nmでの
吸光度を測定し濃度検定を行った。ついで、このように
精製、定量したオリゴヌクレオチドをそれぞれ0.1ナノ
モルずつ分取し、50mMトリス塩酸(pH8.0)、10mM MgC
l2、10mM2-メルカプトエタノール、1mM ATP、及びT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ(東洋紡績(株)製)20U中で5'末
端のリン酸化反応を37℃で1時間行った。その後両者を
混合してフェノール処理、エタノール沈殿を行い、回収
したDNAをライゲーション緩衝液(100mMトリス塩酸(pH7.
6)、6.5mM MgCl2)10μlに溶解し、70℃で15分おいた
後、ゆっくり室温までアニールした。以上の操作によ
り、10ng/μl程度の因子XaリンカーDNAを得た。
【００１４】続いて、図１に従って、上記リンカーDNA
を含むプラスミドの作製方法について述べる。まず、特
願平1-260261で開示されているプラスミドベクターpTRL
ORF1(微工研菌寄第11043号(FERM P-11043)として寄託
済)を、図１に示すように、trp P/O内と遺伝子ORF1内に
認識部位を持つ制限酵素HpaIで開裂させた。次いで、ベ
クターの自己連結を防ぐために、大腸菌のアルカリフォ
スファターゼ(東洋紡績(株)製)を用いて4.58キロ塩基対
(kb)のHpa I断片の5'末端脱リン酸化を行った後100ng相
当を分取し、ライゲーションキット(宝酒造(株)製)を用
いて上記因子XaリンカーDNA30ngとのライゲーション反
応を16℃で8時間行った。この反応液10μlを用いて、大
腸菌コンピテントセルDH5(東洋紡績(株)製)を形質転換
して組換え大腸菌DH5[pTRXa-1]及びDH5[pTRXa-2]を得
た。ここで、pTRXa-2とは、図１に示されているpTRXa-1
の[Hpa I-Hpa I]挿入断片の向きが逆転しているプラス
ミドである。なお、この大腸菌 E.coli DH5[pTRXa-1]は
工業技術院微生物工業技術研究所（以下、微工研と略
記）に微工研菌寄第 12501 号(FERM P-12501)として寄
託している。
【００１５】図１に示したリンカーDNAは、両末端がHpa
Iの開裂末端となるように設計してあるので、ここで作
製された組換え体ベクターpTRXa-1及びpTRXa-2は、Hpa
Iで再切断が可能であり、平滑末端を形成し得る他の任
意のベクターに該XaリンカーDNAを再クローニングでき
るという特徴を有している。
【００１６】続いて、図１に従って、上記XaリンカーDN
Aを既存の発現ベクターpGEMEX-1(プロメガ社)中に挿入
する方法について述べる。pGEMEX-1は、T7ファージ由来
のプロモータとT7の主要頭部蛋白質をコードしている第
10遺伝子を含み、遺伝子中に制限酵素のマルチクローニ
ングサイト(MCS)を持つ。このベクターをMCS内のEco RI
とBam HIで開裂させ、アルカリフォスファターゼを用い
て末端の脱リン酸化を行った。一方ベクターpTRXa-1をE
co RIとBam HIで開裂させてXaリンカーDNA断片を回収
し、上記ベクターとライゲーションキットを用いて連結
させた。そして、この反応液を用いて、大腸菌コンピテ
ントセルDH5を形質転換して組換え大腸菌DH5[pT7Xa]を
得た。
【００１７】実施例２ 因子XaリンカーDNAを介したT7
ファージ第10遺伝子とタコロドプシン断片遺伝子との融
合遺伝子の構築 実施例１で作製された発現ベクターpT7Xa内のXaリンカ
ー部分のNru I認識部位に目的とする外来遺伝子を挿入
することにより、因子XaリンカーDNAを介したT7第10遺
伝子と外来遺伝子との融合遺伝子を構築することができ
る。ここではその一例として、図２に従って特願平1-26
0261に開示されているタコロドプシン遺伝子の部分遺伝
子である第４断片遺伝子を該発現ベクターに融合する方
法について述べる。
【００１８】まず、タコロドプシン第４断片遺伝子を含
むベクターpTRLORF4をEco RIで切断し、続いてMung Bea
nヌクレアーゼ(宝酒造(株)製)を用いて5'突出部分(AAT
T)を除去して5'末端の平滑化を行った。フェノール処理
によってMung Beanヌクレアーゼを除去した後、Bam HI
によって切断し、第４断片遺伝子ORF4部分を回収した。
一方、発現ベクターpT7XaをNru IとBam HIで切断し、ア
ルカリフォスファターゼを用いて5'末端の脱リン酸化を
行った。両者をライゲーションキットを用いて連結さ
せ、その反応液で大腸菌DH5を形質転換して、組換え大
腸菌DH5[pT7XaoRh4]を得た。なお、この大腸菌 E.coliD
H5[pT7XaoRh4]は微工研に微工研菌寄第 12500 号(FERM
P-12500)として寄託している。
【００１９】図２に示す通り、Nru Iで切断されたベク
ターpT7Xa中のXaリンカーの3'末端はArgコドンの2文字
目にあたり、一方融合されるORF4の5'末端はコドンの読
み枠に１ヌクレオチド付加された形で平滑化を行ったの
で、これらを連結することにより読み枠の揃った融合遺
伝子が構築された。
【００２０】実施例３ 融合遺伝子の発現と因子Xaによ
る成熟型蛋白質の製造 まず、実施例２で作製した発現ベクターpT7XaoRh4で発
現用の宿主大腸菌JM109(DE3)を形質転換した。単一コロ
ニー化した組換え大腸菌JM109(DE3)[pT7XaoRh4]をアン
ピシリンを50μg/ml含むNZCYM培地10mlで37℃一晩培養
し、得られた培養液0.5mlをアンピシリン50μg/mlのNZC
YM培地100mlに加えて37℃で培養し、600nmの吸光度が0.
9になった時点でイソプロピルーベーターディーテイオ
ーガラクトピラノシド(Isopropyl-β-D-thio-Galactopy
ranoside(IPTG、和光純薬工業(株)製))を終濃度1mMにな
るように添加して、一晩培養した。培養終了後培養液を
遠心して集菌し、150mM塩化ナトリウムと0.02%(W/V)ア
ジ化ナトリウムを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.0)10mlに再懸濁してフレンチプレスを用いて細胞を破
砕した。破砕液を3,000Gで15分遠心して上清と沈殿(画
分1)に分け、上清をさらに180,000Gで1時間遠心し、上
清(画分2)と沈殿(画分3)に分けた。画分1、2、3は、そ
れぞれ不溶性顆粒蛋白質、細胞質蛋白質、膜蛋白質に対
応している。これらの画分をそれぞれサンプリングし、
ゲル濃度16.5%のエスディエス-ポリアクリルアミドゲル
電気泳動(SDS-PAGE)にかけたところ、画分1に分子量約4
万のバンドを検出した。従って、Xa認識配列を介した、
T7主要頭部蛋白質とタコロドプシン第4断片蛋白質との
融合蛋白質は、大腸菌内では不溶性顆粒として蓄積され
ていることが分かった。
【００２１】画分1を0.5% Triton X-100、1mM EDTA溶液
で5回リンスした後、8M尿素、1mM EDTA、1mMジチオスレ
イトールを含む50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)5mlに溶解
させ、続いて100mM塩化ナトリウム、50mMトリス塩酸緩
衝液(pH8.0)で18時間透析した。透析内液を遠心したと
ころ沈殿は見出されなかった。この融合蛋白質の粗精製
溶液の濃度は、ブラッドフォード定量法(アナリティカ
ル バイオケミストリー(Anal. Biochem.) 72, 248(197
6))によって約10mg/mlと評価した。
【００２２】該融合蛋白質粗精製液1μlに反応緩衝液(1
00mMNaCl、50mMトリス塩酸(pH8.0)、1mM CaCl2)8.5μl
を加え、制限プロテアーゼ因子Xa(1μg/μl、宝酒造
(株)製)を0.5μl添加して25℃で24時間反応させた。反
応液を前述のゲル濃度16.5%のSDS-PAGEにかけたとこ
ろ、大部分の切断反応は進行しており、7キロダルトン
付近に成熟型タコロドプシン第4断片とに対応するバン
ドを検出した。このバンドをクリアブロット-P膜（アト
ー（株）製)にブロッティングして、プロティンシーケ
ンサー(アプライド バイオシステムズ社、モデル477A)
を用いてN末端10残基のアミノ酸配列が成熟型タコロド
プシン第4断片蛋白質と一致することを確認した。
【００２３】
【発明の効果】本発明により、高発現効率を有するプロ
モータ/構造遺伝子を含む発現ベクター中の構造遺伝子
内に当該XaリンカーDNAを介して外来の遺伝子を融合さ
せることが可能になった。外来遺伝子、特に高等動植物
の遺伝子はプロモータ/シャイン・ダルガルノ（SD）配
列の下流に直接連結したベクターでは高い発現効率を望
めない場合が多いため、本発明に従って融合遺伝子を作
製し、大腸菌内で大量に融合蛋白質として発現させ、因
子Xaで切断して成熟型蛋白質を得る本手法は、遺伝子工
学の対象拡大に大きな寄与をもたらす有効な手段とな
る。
【００２４】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：4..9 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：18..23 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：32..37 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 AACGAATTCA TCGAGGGTCG CGACCCTCGA TGGATCCGTT 40 配列番号：２ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：4..9 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：18..23 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：32..37 特徴を決定した方法：S 配列 AACGAATTCA TCGAGGGTCG CGACCCTCGA TGAATTCGTT 40 配列番号：３ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例を表す、XaリンカーDNAの塩
基配列と該リンカーを融合した発現ベクターの作製手順
を示す図である。
【図２】本発明の一実施例を表す、XaリンカーDNAを含
む発現ベクターに外来遺伝子としてタコロドプシン第４
断片遺伝子を融合した発現ベクターの作製手順を示す図
である。
【図３】XaリンカーDNAを含む発現ベクターに融合する
外来遺伝子の5'末端調製手順を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 原田 義則 埼玉県比企郡鳩山町赤沼2520番地 株式 会社日立製作所基礎研究所内 (56)参考文献 特開 昭61−135591（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−2386（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−5881（ＪＰ，Ａ) 「ＴａＫａＲａ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ ｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，日本, 1990年，28頁 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】血液凝固因子Ｘａが認識するアミノ酸配列
    Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇをコードし、前記アミ
    ノ酸配列のＧｌｙ−Ａｒｇ部分のコドンが配列ＧＧＴＣ
    ＧＣであり、前記配列ＧＧＴＣＧＣの３’末端の直後に
    付加された配列ＧＡを有し、制限酵素Ｎｒｕ Ｉの認識
    部位ＴＣＧＣＧＡが形成された１４塩基対を有し、前記
    制限酵素Ｎｒｕ Ｉによる開裂により３’末端に配列Ｃ
    Ｇを有する平滑端が形成されることを特徴とするＸａリ
    ンカーＤＮＡ。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の因子ＸａリンカーＤＮＡ
    の前記アミノ酸配列のＡｒｇ部分のコドンの２文字目ま
    での前記配列ＣＧを有する前記平滑端に、外来遺伝子の
    ５’末端の平滑端がＡとＴの塩基対又はＧとＣの塩基対
    を介して連結されることを特徴とするＸａリンカーＤＮ
    Ａ。
  3. 【請求項３】請求項１に記載の因子ＸａリンカーＤＮＡ
    を含み、前記因子ＸａリンカーＤＮＡの両側に制限酵素
    の認識配列又は制限酵素による開裂末端を有することを
    特徴とする因子ＸａリンカーＤＮＡ。
  4. 【請求項４】請求項１に記載の因子ＸａリンカーＤＮＡ
    を含み、前記因子ＸａリンカーＤＮＡの両側に制限酵素
    の認識配列又は制限酵素による開裂末端を有する因子Ｘ
    ａリンカーＤＮＡが発現ベクターの構造遺伝子内に挿入
    され、ＡとＴの塩基対又はＧとＣの塩基対が外来遺伝子
    の最初のコドンの直前に付加されて形成された前記外来
    遺伝子の５’末端の平滑端が、あるいは、ＡとＴの塩基
    対又はＧとＣの塩基対が前記外来遺伝子の５’末端の平
    滑端に付加された開始コドンＭｅｔの直前に付加されて
    形成された５’末端の平滑端が、前記因子Ｘａリンカー
    ＤＮＡの前記制限酵素Ｎｒｕ Ｉによる開裂末端に連結
    された融合遺伝子を有することを特徴とする発現ベクタ
    ー。
  5. 【請求項５】請求項１に記載の因子ＸａリンカーＤＮＡ
    を含み、前記因子ＸａリンカーＤＮ Ａの両側に制限酵素
    の認識配列又は制限酵素による開裂末端を有する因子Ｘ
    ａリンカーＤＮＡを発現ベクターの構造遺伝子内に挿入
    し、前記因子ＸａリンカーＤＮＡを前記制限酵素Ｎｒｕ
    Ｉにより開裂し、ＡとＴの塩基対又はＧとＣの塩基対
    が外来遺伝子の最初のコドンの直前に付加されて形成さ
    れた前記外来遺伝子の５’末端の平滑端を、あるいは、
    ＡとＴの塩基対又はＧとＣの塩基対が前記外来遺伝子の
    ５’末端の平滑端に付加された開始コドンＭｅｔの直前
    に付加されて形成された５’末端の平滑端を、前記制限
    酵素Ｎｒｕ Ｉによる開裂末端に連結することを特徴と
    する融合遺伝子の作製方法。
  6. 【請求項６】請求項４に記載の発現ベクターにより形質
    転換されたことを特徴とする宿主生細胞。
  7. 【請求項７】請求項４に記載の発現ベクターにより形質
    転換されたことを特徴とする大腸菌。
  8. 【請求項８】血液凝固因子Ｘａが認識するアミノ酸配列
    Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇをコードし、前記アミ
    ノ酸配列のＧｌｙ−Ａｒｇ部分のコドンが配列ＧＧＴＣ
    ＧＣであり、前記配列ＧＧＴＣＧＣの３’末端の直後に
    付加された配列ＧＡを有し、制限酵素Ｎｒｕ Ｉの認識
    部位ＴＣＧＣＧＡが形成された１４塩基対を有し、前記
    制限酵素Ｎｒｕ Ｉによる開裂により前記アミノ酸配列
    のＡｒｇ部分のコドンの２文字目までの配列ＣＧを有す
    る３’末端の平滑端に、ＡとＴの塩基対又はＧとＣの塩
    基対が外来遺伝子の最初のコドンの直前に付加されて形
    成された前記外来遺伝子の５’末端の平滑端が、あるい
    は、ＡとＴの塩基対又はＧとＣの塩基対が前記外来遺伝
    子の５’末端の平滑端に付加された開始コドンＭｅｔの
    直前に付加されて形成された５’末端の平滑端が連結さ
    れることを特徴とするＸａリンカーＤＮＡ。
  9. 【請求項９】血液凝固因子Ｘａが認識するアミノ酸配列
    Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇをコードし、前記アミ
    ノ酸配列のＧｌｙ−Ａｒｇ部分のコドンが配列ＧＧＴＣ
    ＧＣ であり、前記配列ＧＧＴＣＧＣの３’末端の直後に
    付加された配列ＧＡを有し、制限酵素Ｎｒｕ Ｉの認識
    部位ＴＣＧＣＧＡが形成された１４塩基対を有するＸａ
    リンカーＤＮＡが、発現ベクターの構造遺伝子内に挿入
    され、前記因子ＸａリンカーＤＮＡの前記制限酵素Ｎｒ
    ｕ Ｉによる開裂により形成され、前記アミノ酸配列の
    Ａｒｇ部分のコドンの２文字目までの配列ＣＧを有する
    ３’末端の平滑端に、ＡとＴの塩基対又はＧとＣの塩基
    対が外来遺伝子の最初のコドンの直前に付加されて形成
    された前記外来遺伝子の５’末端の平滑端、あるいは、
    ＡとＴの塩基対又はＧとＣの塩基対が前記外来遺伝子の
    ５’末端の平滑端に付加された開始コドンＭｅｔの直前
    に付加されて形成された５’末端の平滑端が連結された
    融合遺伝子を有し、前記アミノ酸配列のＡｒｇ部分のコ
    ドンの３文字目の塩基が、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの何れかであ
    ることを特徴とする発現ベクター。
  10. 【請求項１０】請求項９に記載の発現ベクターにより形
    質転換されたことを特徴とする宿主生細胞。
  11. 【請求項１１】請求項９に記載の発現ベクターにより形
    質転換されたことを特徴とする大腸菌。
  12. 【請求項１２】血液凝固因子Ｘａが認識するアミノ酸配
    列Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇをコードし、前記ア
    ミノ酸配列のＧｌｙ−Ａｒｇ部分のコドンが配列ＧＧＴ
    ＣＧＣであり、前記ＧＧＴＣＧＣの３’末端の直後に付
    加された配列ＧＡを有し、制限酵素Ｎｒｕ Ｉの認識部
    位ＴＣＧＣＧＡが形成された１４塩基対を有する前記Ｘ
    ａリンカーＤＮＡを、発現ベクターの構造遺伝子内に挿
    入し、前記因子ＸａリンカーＤＮＡを前記制限酵素Ｎｒ
    ｕ Ｉにより開裂して、前記アミノ酸配列のＡｒｇ部分
    のコドンの２文字目までの配列ＣＧを有する平滑端を
    ３’末端に形成し、ＡとＴの塩基対又はＧとＣの塩基対
    が外来遺伝子の最初のコドンの直前に付加されて形成さ
    れた前記外来遺伝子の５’末端の平滑端を、あるいは、
    ＡとＴの塩基対又はＧとＣの塩基対が前記外来遺伝子の
    ５’末端の平滑端に付加された開始コドンＭｅｔの直前
    に付加されて形成された５’末端の平滑端を、前記配列
    ＣＧを 有する前記平滑端に連結して融合遺伝子を作製
    し、前記アミノ酸配列のＡｒｇ部分のコドンの３文字目
    の塩基が、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃの何れかであることを特徴と
    する融合遺伝子の作製方法。
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