FR2598430A1 - Nouveaux vecteurs d'expression, leur procede d'obtention et leur application pour exprimer une proteine quelconque dans escherichia coli - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE DE NOUVEAUX VECTEURS D'EXPRESSION PERMETTANT D'INTRODUIRE UN GENE ETRANGER D'ORIGINE PROCARYOTE OU EUCARYOTE DANS ESCHERICHIA COLI CONSTITUE DE MOLECULES D'ADN CIRCULAIRES CAPABLE DE SE REPLIQUER DE FACON AUTONOME DANS ESCHERICHIA COLI, CARACTERISES EN CE QU'ILS CONTIENNENT: UN SITE DE FIXATION DES RIBOSOMES (SEQUENCE DE SHINE ET DALGARNO) SEPARE D'UNE DISTANCE POUVANT VARIER DE 0 A 20NUCLEOTIDES DU CODON D'INITIATION ATG DE LA BIOSYNTHESE DES PROTEINES ET RENFERMANT UN OU PLUSIEURS SITES DE RECONNAISSANCE PAR UNE ENDONUCLEASE DE RESTRICTION PERMETTANT D'OUVRIR LES VECTEURS AU NIVEAU DU CODON D'INITIATION DE LA TRADUCTION, POUR INTRODUIRE DANS LESDITS VECTEURS N'IMPORTE QUELLE SEQUENCE NUCLEOTIDIQUE CODANT POUR UNE PROTEINE QUELCONQUE A EXPRIMER DANS ESCHERICHIA COLI; -UNE REGION PROMOTEUR-OPERATEUR DERIVANT DE L'OPERON LACTOSE D'E.COLI RECONNUE PAR LA MACHINERIE CELLULAIRE D'E-COLI, DONT LES REGIONS -35 ET -10 SONT SEPAREES DE 17NUCLEOTIDES. L'INVENTION A AUSSI POUR OBJET LE PROCEDE D'OBTENTION DE CES NOUVEAUX VECTEURS ET LEUR APPLICATION POUR EXPRIMER UNE PROTEINE QUELCONQUE DANS ESCHERICHIA COLI.
Description
L'invention concerne de nouveaux vecteurs d'expression, leur procédé d'obtention et leur application pour exprimer une protéine quelconque dans Escherichia coli.
La première des étapes conduisant à la synthèse d'une protéine à partir d'un gène dans une bactérie consiste en la transcription de ce gène depuis son promoteur par La RNA-polymérase cellulaire. L'ARN messager résultant de cette synthèse est un polyribonucléotide contenant une séquence codant pour ladite protéine, encadrée de certains signaux permettant son décodage et sa traduction en polypeptide par différents éléments de la machinerie cellulaire : ribosomes, tRNAS, facteurs d'initiation et d'élongation de la biosynthèse des protéines. La séquence codant débute genéralement par un codon d'initiation AUG et se termine par un codon stop UAA, UAG ou UGA.Le codon d'initiation est précédé par une région riche en purines, située 3 à 10 nucléotides avant cet AUG, et sur laquelle viennent de fixer Les ribosomes (sequence dite de Shine et Dalgarno) dans l'étape qui précède l'initiation de la biosynthèse des protéines. Ce site de fixation des ribosomes est relativement spécifique d'une espece donnée. Il existe en particulier de grandes différences entre les structures présentes sur les ARN m procaryotes et les ARN m eucaryotes. Ainsi,- pour tenter d'exprimer une protéine eucaryote dans une bactérie, il sera nécessaire de placer le segment d'ADN codant pour cette protéine derrière une région correspondant à un site de fixation des ribosomes spécifique de cette bactérie.De plus, il faudra faire en sorte que la longueur et la séquence nucléotidique du segment d'ADN séparant la séquence de Shine et Dalgarno de L'ATG initiateur soit identique ou très proche de ce qui existe dans Les gènes de la cellule hôte.
On peut donc envisager de modifier cette région de manière à introduire un ou plusieurs sites de restriction au niveau de l'ATG initiateur. Ceci aurait pour effet de positionner parfaitement toute séquence d'ADN codant pour une proteine donnée par rapport au site de fixation des ribosomes et par rapport à L'ATG initiateur.
Par aiLleurs, le fragment d'ADN à cloner doit être précédé par des signaux propres à la cellule procaryote qui permettent la transcription de cet ADN en ARN messager par la RNA polymérase cellulaire. Parmi ces signaux, la région dite "promoteur" qui fixe la RNA polymérase au debut du processus de transcription est essentielle. On a donc intérêt à insérer l'ADN que l'on veut exprimer derrière un promoteur fort, ceci pour obtenir une production élevee de la protéine recherchée.
L'utilisation d'un vecteur d'expression plasmidique permettra d'augmenter le nombre de copies du gène d'exprimer dans la bactérie.
Les observations faites sur les différents promoteurs d'E. Coli qui ont éte séquencés ont permis de proposer une structure consensus (Ann- Rev- Genet- 13 : 319-S3 1979). Deux régions sont relativement bien conservées dans les différents promoteurs : une région située à environ 10 paires de bases avant le point d'initiation de la transcription et appelée "Pribnow box" ou "TATA box" et une région située à environ 35 paires de bases du même point d'initation et appelée "région-35" ou région de reconnaissance.
Dans un tel promoteur consensus, la distance optimale entre la région-35 de séquence TTGACA et la région -10 de séquence TATAAT est de 17 paires de bases.
La présente invention concerne les nouveaux vecteurs appelés ci-apres vecteurs d'expression A qui possèdent donc à la fois un promoteur fort "idéal" issu de l'opéron tactose d'E-Coli et un codon d'initiation contenu à l'intérieur d'un ou plusieurs sites de reconnaissance par une endonucléase de restriction permettant l'insertion plus aisée de toute séquence codante que l'on cherche à exprimer.
La présente invention a donc pour objet de nouveaux vecteurs d'expression A permettant d'introduire un gène étranger d'origine procaryote ou eucaryote dans Escherichia Coli constitué de molécules d'ADN circulaires capables de se répliquer de façon autonome dans
Escherichia Coli, caractérisés en ce qu'ils contiennent - un site de fixation des ribosomes (séquence de Shine et Dalgarno) séparé d'une distance pouvant varier de O à 20 nucléotides du codon d'initiation ATG de la biosynthèse des protéines et renfermant un ou plusieurs sites de reconnaissance par une endonuctéase de restriction permettant d'ouvrir le vecteur au niveau du codon d'initiation de La traduction, pour introduire dans Lesdits vecteurs n'importe quelle séquence nucléotidique codant pour une protéine quelconque à exprimer dans Escherichia Coli ;; - une région promoteur-operateur dérivant de L'opéron Lactose d'E-CoLi reconnue par la machinerie cellulaire d'E.CoLi, dont Les régions -35 et -10 sont séparées de 17 nucléotides,
Les vecteurs A de L'invention portent un ou plusieurs gènes permettant de sélectionner Les bactéries transformées
A titre d'exemple, on peut citer un gène de résistance à un antibiotique, à une substance telLe que te mercure ou un gène permettant de complémenter une déficience enzymatique cellulaire
Dans les vecteurs A de la présente invention, te site de fixation des ribosomes placé au debut de la région transcrite par Le promoteur est séparé du codon d'initiation ATS par une séquence d'ADN dont la longueur peut varier de O à 20 nucléotides contenant préférentieLlement le site de reconnaissance de L'enzyme de restriction de Nde I qui coupe l'ADN au niveau de la séquence CATATG ou de enzyme de restriction NcoI reconnaissant la séquence CCATGG.
Escherichia Coli, caractérisés en ce qu'ils contiennent - un site de fixation des ribosomes (séquence de Shine et Dalgarno) séparé d'une distance pouvant varier de O à 20 nucléotides du codon d'initiation ATG de la biosynthèse des protéines et renfermant un ou plusieurs sites de reconnaissance par une endonuctéase de restriction permettant d'ouvrir le vecteur au niveau du codon d'initiation de La traduction, pour introduire dans Lesdits vecteurs n'importe quelle séquence nucléotidique codant pour une protéine quelconque à exprimer dans Escherichia Coli ;; - une région promoteur-operateur dérivant de L'opéron Lactose d'E-CoLi reconnue par la machinerie cellulaire d'E.CoLi, dont Les régions -35 et -10 sont séparées de 17 nucléotides,
Les vecteurs A de L'invention portent un ou plusieurs gènes permettant de sélectionner Les bactéries transformées
A titre d'exemple, on peut citer un gène de résistance à un antibiotique, à une substance telLe que te mercure ou un gène permettant de complémenter une déficience enzymatique cellulaire
Dans les vecteurs A de la présente invention, te site de fixation des ribosomes placé au debut de la région transcrite par Le promoteur est séparé du codon d'initiation ATS par une séquence d'ADN dont la longueur peut varier de O à 20 nucléotides contenant préférentieLlement le site de reconnaissance de L'enzyme de restriction de Nde I qui coupe l'ADN au niveau de la séquence CATATG ou de enzyme de restriction NcoI reconnaissant la séquence CCATGG.
L'invention concerne notamment des vecteurs d'expression caractérisés en ce que le segment d'ADN séparant le site de fixation des ribosomes du codon d'initiation ATG de La biosynthêse des proteines dont la Longueur varie de O à 20 nuctéotides, renferme un site de coupure par l'enzyme de restriction NcoI.
L'introduction d'un site de restriction au niveau de L'ATG initiateur et notamment d'une séquence reconnue par l'enzyme de restriction NcoI permet de positionner un segment d'ADN quelconque codant pour une protéine dans une phase de Lecture tette qu'il soit decode correctement par les différents éLéments de ta machinerie cellulaire nécessaires à la biosynthèse de protéines teLLes que Les ribosomes, les tRNAS.
Grâce à L'introduction d'un site de coupure par l'endonuclease de restriction NcoI au niveau du codon d'initiation, on peut rétablir la distance de 7 paires de bases existant dans l'opéron lactose naturel entre le site de fixation des ribosomes et l'ATG initiateur.
Les vecteurs A de l'invention permettent donc l'introduction derrière l'ATG initiateur de n'importe quel fragment d'ADN codant pour une protéine dans la bonne phase de lecture par rapport au codon d'initiation et sont de ce fait d'une grande facilité d'emploi pour l'expression dans E. Coli de protéines hétérologues.
L'invention concerne donc notamment de nouveaux vecteurs d'expression A caractérisés en ce que la distance séparant le site de fixation des ribosomes du codon d'initiation ATG de la biosynthèse des protéines est constitue de 7 nucléotides, à savoir est équivalente à ce qui existe dans les ARN messagers issus de la transcription de l'opéron lactose naturel de Escherichia Coli.
L'invention a tout particulièrement pour objet de nouveaux vecteurs d'expression A dans lesquels un site de coupure par L'enzyme de restriction NcoI est introduit au niveau de l'ATG initiateur et qui sont caractérisés en ce que la distance séparant le site de fixation des ribosomes et le codon d'initiation ATG possede la séquence nucléotidique suivante :
<tb> <SEP> 5' <SEP> 3'
<tb> <SEP> AGGAAACAGCCTG,
<tb> <SEP> y
<tb> <SEP> site <SEP> site <SEP> de <SEP> fixation <SEP> J <SEP> codon
<tb> des <SEP> des <SEP> riboso <SEP> es <SEP> |d'initiation
<tb>
Les vecteurs A de l'invention tels que définis ci-dessus ont tous une région promoteur-opérateur dérivant de l'opéron lactose d'E-Coli reconnue par la machinerie cellulaire d'E-Coli caractérisé en ce que les régions -35 et -10 sont séparées de 17 nucléotides.
<tb> <SEP> AGGAAACAGCCTG,
<tb> <SEP> y
<tb> <SEP> site <SEP> site <SEP> de <SEP> fixation <SEP> J <SEP> codon
<tb> des <SEP> des <SEP> riboso <SEP> es <SEP> |d'initiation
<tb>
Les vecteurs A de l'invention tels que définis ci-dessus ont tous une région promoteur-opérateur dérivant de l'opéron lactose d'E-Coli reconnue par la machinerie cellulaire d'E-Coli caractérisé en ce que les régions -35 et -10 sont séparées de 17 nucléotides.
Cette autre caractéristique des vecteurs A de L'invention permet d'obtenir une expression à haut niveau d'une protéine dans Escherichia
Coli.
Coli.
L'invention concerne particulièrement les vecteurs A caractérisés en ce que la region promoteur-opérateur dérivant de l'opéron lactose d'E-Coli a la séquence nucléotidique codante suivante : 5' 3'
L'invention a particulièrement pour objet des vecteurs d'expression A caractérisés en ce que - la distance séparant le site de fixation des ribosomes et le codon d'initiation ATG a la séquence nucléotidique suivante
5' 3'
5' 3'
<tb> <SEP> AGGAAACAGCC-G,
<tb> <SEP> M
<tb> site <SEP> de <SEP> fixation <SEP> codon <SEP> d'initiation::
<tb> des <SEP> ribosomes
<tb> et - la région promoteur a la séquence nucléotidique suivante 5' 3'
<tb> <SEP> M
<tb> site <SEP> de <SEP> fixation <SEP> codon <SEP> d'initiation::
<tb> des <SEP> ribosomes
<tb> et - la région promoteur a la séquence nucléotidique suivante 5' 3'
L'invention concerne tout particulièrement parmi tous les vecteurs d'expression A présentant les deux caractéristiques mentionnées ci-dessus, le vecteur d'expression pRU 222 dont la structure et le procédé d'obtention sont donnés plus loin à titre d'exemple dans la partie expérimentale.
La demanderesse décrit ci-apres un procédé général permettant d'obtenir des vecteurs d'expression A contenant - un site de fixation des ribosomes (séquence de Shine et Dalgarno) séparé d'une distance pouvant varier de O à 20 nucléotides du codon d'initiation ATG de la biosynthèse des protéines et renfermant un ou plusieurs sites de reconnaissance par une endonucléase de restriction permettant d'ouvrir le vecteur au niveau du codon d'initiation de la traduction, pour introduire dans ledit vecteur n'importe quelle séquence nucléotidique codant pour une protéine quelconque à exprimer dans
Escherichia Coli ; - une région promoteur-opérateur dérivant de l'opéron lactose d'E-Coli reconnue par la machinerie cellulaire d'E.Coli, dont les séquences -35 et -10 sont séparées de 17 nucléotides.
Escherichia Coli ; - une région promoteur-opérateur dérivant de l'opéron lactose d'E-Coli reconnue par la machinerie cellulaire d'E.Coli, dont les séquences -35 et -10 sont séparées de 17 nucléotides.
Ce procédé emploie deux types d'outils : - des vecteurs de clonage et des enzymes de restriction de L'ADN.
Les enzymes de restriction sont des endonucléases qui coupent l'ADN à des endroits précis appelés sites de restriction. De nombreux enzymes reconnaissant et coupant l'ADN à des endroits divers ont été purifiés et caractérisés. Les fragments d'ADN générés lors de la digestion par un enzyme de restriction peuvent avoir des extrêmités à bord franc ou des extrémités simple brin cohésives. L'insertion d'un segment d'ADN à extrêmités cohésives dans un plasmide ne peut se faire que si le plasmide a été linéarité par un enzyme de restriction générant le même type d'extrémités cohésives.L'introduction d'un fragment d'ADN à bords francs dans un vecteur peut s'effecteur à de multiples endroits pour peu que l'enzyme de restriction ayant servi à linéariser le vecteur, produise également des molécules ayant des extrêmités à bord francs. Si l'enzyme utilisé pour linéariser le plasmide est Le même que celui employé pour couper l'ADN à cloner, des sites de restriction seront recréés de chaque côté de l'insertion dans Les molécules recombinantes. Les récents développements dans La synthèse chimique de fragments d'ADN permettent virtuellement d'introduire n'importe quel site de restriction aux extrêmités ou à l'intérieur d'un fragment d'ADN.Ceci est réalisé en polymérisant un oligonucléotide autocomplémentaire contenant le site de restriction désiré aux extremités du fragment d'ADN, à l'ai de de la DNA ligase et en recoupant la molécule ainsi obtenue par l'enzyme de restriction adéquate. S'il s'agit de créer un site de restriction à l'intérieur d'un plasmide, il suffit alors de ligaturer la molecule à l'aide de la DNA ligase et d'introduire le plasmide dans une bactérie par transformation. S'il s'agit de cloner le fragment d'ADN, celui-ci est attaché à L'aide de la
DNA ligase à un plasmide qui aura été préalablement linearisé par un enzyme créant des extrêmités compatibles avec celles du segment d'ADN à cloner.
DNA ligase à un plasmide qui aura été préalablement linearisé par un enzyme créant des extrêmités compatibles avec celles du segment d'ADN à cloner.
Dans le procédé général de préparation des vecteurs d'expression
A, on prépare dans un premier temps un vecteur D contenant le promoteur lactose et possédant une séquence de Shine et Dalgarno séparé de O à 20 paires de bases du codon initiateur ATG, et dans un deuxième temps on obtient à partir du vecteur D, un vecteur A dans lequel le promoteur issu de l'opéron lactose est constitué d'une "région de reconnaissance1, (région - 35) de séquence TTGACA séparés de 17 paires de bases d'une "région de Pribnow" (région - 10) de séquence TATAAT.
A, on prépare dans un premier temps un vecteur D contenant le promoteur lactose et possédant une séquence de Shine et Dalgarno séparé de O à 20 paires de bases du codon initiateur ATG, et dans un deuxième temps on obtient à partir du vecteur D, un vecteur A dans lequel le promoteur issu de l'opéron lactose est constitué d'une "région de reconnaissance1, (région - 35) de séquence TTGACA séparés de 17 paires de bases d'une "région de Pribnow" (région - 10) de séquence TATAAT.
Ce procédé de préparation des vecteurs d'expression A selon
L'invention est caractérisé en ce que : - on isole le fragment de l'opéron lactose contenant tout le promoteur
Lac d'un vecteur B de départ renfermant ledit promoteur et portant La mutation UV5 en digerant le vecteur B avec différentes enzymes de restriction adequates ;; - on digère ensuite le fragment précédemment obtenu par L'enzyme de restriction Alu I pour obtenir le fragment de 95 paires de bases contenant tout le promoteur de l'opéron lactose, - puis, à l'aide de DNA ligase et d'oligonucléotides de synthèse, on introduit aux extrémités du fragment de 95 paires de bases un ou plusieurs sites de coupure par une endonucléase de restriction au niveau du codon d'initiation de la biosynthèse des protéines ATG, et obtient ainsi une distance separant le site de fixation des ribosomes (séquence de Shine et Dalgarno) du codon d'initiation ATG pouvant varier de O à 20 nucléotides.
L'invention est caractérisé en ce que : - on isole le fragment de l'opéron lactose contenant tout le promoteur
Lac d'un vecteur B de départ renfermant ledit promoteur et portant La mutation UV5 en digerant le vecteur B avec différentes enzymes de restriction adequates ;; - on digère ensuite le fragment précédemment obtenu par L'enzyme de restriction Alu I pour obtenir le fragment de 95 paires de bases contenant tout le promoteur de l'opéron lactose, - puis, à l'aide de DNA ligase et d'oligonucléotides de synthèse, on introduit aux extrémités du fragment de 95 paires de bases un ou plusieurs sites de coupure par une endonucléase de restriction au niveau du codon d'initiation de la biosynthèse des protéines ATG, et obtient ainsi une distance separant le site de fixation des ribosomes (séquence de Shine et Dalgarno) du codon d'initiation ATG pouvant varier de O à 20 nucléotides.
- On clone le fragment ainsi obtenu dans un vecteur de type C1 permettant de reisoler le promoteur Lac sous forme d'un fragment d'ADN possedant à ses deux extrémités le site de restriction que l'on a introduit préalablement au niveau de l'ATG initiateur et obtient ainsi un vecteur D.
- On isole du vecteur D à l'aide d'enzymes de restriction adéquates un fragment de 90 à 130 paires de bases contenant le promoteur Lac.
- On isole à partir du fragment précédent un fragment de 50 à 80 paires de bases contenant la région -10 ou TATA box de séquence TATAAT, - puis à l'aide de deux oligonucléotides synthétiques complémentaires l'un de l'autre, on positionne la région -35, de séquence TTGACA de promoteurs connus d'E. Coli, à une distance de 17 paires de bases de la région -10.
- On clone le fragment ainsi obtenu dans un vecteur C2 permettant de reconstituer un ou plusieurs sites de restriction uniques au niveau du codon d'initiation ATG pour obtenir un vecteur d'expression A.
Dans le procédé précédemment décrit, le vecteur B de départ est de préférence le vecteur pOMPO - (Mercereau - Puijalon et al Nature 275 : 505.510, 1978).
La mutation UV5 affecte la "région -10" en créant la séquence consensus TATAAT au lieu de la séquence TATGTT présente dans le promoteur de l'opéron lactose naturel de E. Coli, (Arditi et al.
et al J. Mol. Biol 38 : 421-426, 1968).
Le fragment de 95 paires de bases peut être obtenu également par digestion par l'enzyme de restriction Alu I du fragment de 207 paires de bases de l'opéron lactose contenant tout le promoteur Lac (la séquence de 207 paires de bases est donnée dans la figure 1).
Les deux séquences de 90 à 430 paires de bases issue du vecteur D contenant le promoteur Lac et de 50 à 80 paires de bases contenant la region -10 ou TATA box, dépendent de L'oligonucléotide de synthese utilise pour faire varier de O à 20 paires de bases la taille du segment d'ADN séparant la séquence de Shine et Dalgarno du codon d'initation ATG.
L'invention concerne aussi le procédé de préparation du vecteur d'expression A préféré de L'invention précédemment mentionné, le pRU 222 dans lequel l'introduction d'un site de restriction NcoI au niveau du codon d'initiation a maintenu la distance de 7 paires de bases entre le site de fixation des ribosomes et l'ATG initiateur, comme c'est le cas dans l'opéron lactose naturel.
La séquence nucléotidique correspondant à cette région est la suivante 5' 3'
AGGAAACAGCCATG
Par ailleurs, comme il a déjà éte dit précédemment, le pRU 222 a aussi une region promoteur-opérateur dérivant de l'opéron lactose d'E-Coli et ayant la séquence nucléotidique suivante : 5' 3'
AGGAAACAGCCATG
Par ailleurs, comme il a déjà éte dit précédemment, le pRU 222 a aussi une region promoteur-opérateur dérivant de l'opéron lactose d'E-Coli et ayant la séquence nucléotidique suivante : 5' 3'
Dans le procédé de préparation du vecteur d'expression pRU 222, le vecteur intermédiaire correspondant au vecteur D utilisé dans le procédé général de préparation des vecteurs d'expression A décrit précédemment est le vecteur pRU 211.
Les vecteurs C1 et C2 sont confondus et correspondent au vecteur pRU 101.
Par ailleurs, ce procédé utilise un autre vecteur intermédiaire qui est le vecteur pRU 201.
L'invention concerne donc un procédé de préparation du vecteur pRU 222 caractérisé en ce que : a/. On prépare un vecteur appelé pRU 101 selon les étapes suivantes : - digestion d'un plasmide du type pBr322 par l'enzyme de restriction
HindIII, - remplissage des extrémités cohésives ainsi générées à l'aide de la
DNA polymérise de E. Coli, - création d'un site de restriction NcoI par addition d'un oligonucLéotide de synthèse dont la séquence est la suivante : 5' 3'
CCATGGCCATGG au site HindIIf rempli de pBR322 à l'aide de la DNA - ligase du bactériophage T4 et recoupure de
l'enzyme de restriction
Nco I reconnaisant la séquence - ligature de l'ADN par la DNA ligase et transformation de La souche MM294 de E.Coli (déposée à L'ATCC sous le numéro 33625), - recherche d'un plasmide issu de la transformation et possédant un site
Nco I.
HindIII, - remplissage des extrémités cohésives ainsi générées à l'aide de la
DNA polymérise de E. Coli, - création d'un site de restriction NcoI par addition d'un oligonucLéotide de synthèse dont la séquence est la suivante : 5' 3'
CCATGGCCATGG au site HindIIf rempli de pBR322 à l'aide de la DNA - ligase du bactériophage T4 et recoupure de
l'enzyme de restriction
Nco I reconnaisant la séquence - ligature de l'ADN par la DNA ligase et transformation de La souche MM294 de E.Coli (déposée à L'ATCC sous le numéro 33625), - recherche d'un plasmide issu de la transformation et possédant un site
Nco I.
b/. On prépare un vecteur pRU 201, selon les étapes suivantes - digestion d'un vecteur de type pOMPO par l'enzyme de restriction EcoR I, - remplissage des extrémités cohésives ainsi générées à l'ai de de la
DNA polymérase I de E. Coli (fragment de Klenow), - coupure de l'ADN par l'enzyme de restriction Hae III et isolement du fragment de 207 paires de bases contenant le promoteur Lac.
DNA polymérase I de E. Coli (fragment de Klenow), - coupure de l'ADN par l'enzyme de restriction Hae III et isolement du fragment de 207 paires de bases contenant le promoteur Lac.
- creation de sites BamHI aux deux extrémités de ce fragment par addition d'un oligonucléotide de synthèse de séquence 5 CCGGATCCGG3 à l'aide de la DNA ligase et recoupure par L'enzyme BamHI, - insertion du fragment au site BamHI de pBR 322 et transformation de la souche MM294 de E.Coli, - sélection des transformants sur milieu solide glucosé contenant du 5-bromo 4-chloro 3-indolyl p D-galactopyranoside (X-gal) et analyse des plasmides recombinants par mini lyse, c/. à partir du vecteur pRU 201 précédent, on prépare le vecteur pRU 211, selon les étapes suivantes :: - digestion de pRU 201 par l'enzyme de restriction BamHI et isolement du fragment de 221 paires de bases contenant le promoteur Lac, - digestion du fragment BamHI par l'enzyme de restriction AluI et isolement du fragment de 95 paires de bases contenant le promoteur
Lac, - creation d'un site NcoI aux deux extrémités de fragment AluI par addition d'un oligonucléotide de synthèse de séquence 5' 3'
CCATGGCCATGG et recoupure par l'enzyme NcoI, - insertion du fragment au site NcoI du vecteur pRU 101 et transformation dans la souche E.Coli MM 294, - sélection des transformantes sur milieu solide glucosé en présence de X-gal et analyse des vecteurs par mini lyse, d/. on prépare le vecteur d'expression pRU 222 à partir du vecteur pRU 211, selon les etapes suivantes : : - digestion du plasmide pRU2îî par l'enzyme de restricton Nco I et isolement du fragment de 105 paires de bases contenant le promoteur Lac, - digestion du fragment Nco I par l'enzyme de restriction HpaII et isolement du fragment HpaII-NcoI de 60 paires de bases contenant la "TATA-box", - ligation du fragment HpaII-NcoI avec les deux oligonucléotides complémentaires de séquence 5' 3' AATTC CTGTTGA CAATTTATCATC
3' 5'
GGACAACTGTTAAATAGTAGGC à l'aide de la DNA ligase et digestion des produits de la ligation par les enzymes de restriction EcoRI et Ncoi, - isolement du fragment EcoRI-NcoI de 84 paires de bases contenant le promoteur hybride et insertion de ce fragment entre les sites EcoRI et NcoI de pRU 101 avant transformation dans une souche MM294 d'E.Coli, - sélection des transformants sur milieu gélosé glucose en présence de
X-gal, analyse des transformants par mini lyse.
Lac, - creation d'un site NcoI aux deux extrémités de fragment AluI par addition d'un oligonucléotide de synthèse de séquence 5' 3'
CCATGGCCATGG et recoupure par l'enzyme NcoI, - insertion du fragment au site NcoI du vecteur pRU 101 et transformation dans la souche E.Coli MM 294, - sélection des transformantes sur milieu solide glucosé en présence de X-gal et analyse des vecteurs par mini lyse, d/. on prépare le vecteur d'expression pRU 222 à partir du vecteur pRU 211, selon les etapes suivantes : : - digestion du plasmide pRU2îî par l'enzyme de restricton Nco I et isolement du fragment de 105 paires de bases contenant le promoteur Lac, - digestion du fragment Nco I par l'enzyme de restriction HpaII et isolement du fragment HpaII-NcoI de 60 paires de bases contenant la "TATA-box", - ligation du fragment HpaII-NcoI avec les deux oligonucléotides complémentaires de séquence 5' 3' AATTC CTGTTGA CAATTTATCATC
3' 5'
GGACAACTGTTAAATAGTAGGC à l'aide de la DNA ligase et digestion des produits de la ligation par les enzymes de restriction EcoRI et Ncoi, - isolement du fragment EcoRI-NcoI de 84 paires de bases contenant le promoteur hybride et insertion de ce fragment entre les sites EcoRI et NcoI de pRU 101 avant transformation dans une souche MM294 d'E.Coli, - sélection des transformants sur milieu gélosé glucose en présence de
X-gal, analyse des transformants par mini lyse.
L'invention a aussi pour objet les vecteurs pRU 101, pRU 201, et pRU 211 utilisés pour préparer le vecteur pRU222. Elle concerne aussi un oligonucléotide contenant deux sites de restriction Ncoi, caractérise en ce qu'il a la séquence nucléotidique suivante : 5' 3'
CCATGGCCATGG ainsi que les deux oligonucléotides complémentaires reconstituant en s'appariant une région -35 idéale et permettant d'obtenir les vecteurs d'expression A, caractérisés en ce qu'ils ont les séquences nucleotidiques suivantes : 5' AAflCCTGTTGACAAflTATCATC 3'
3' GGACAACTGTTAAATAGTAGGC 5'
L'invention s'étend également à une bactérie hôte Escherichia
COli, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression A, par les vecteurs pRU 101, pRU 201, pRU 211 et par le vecteur d'expression pRU 222.
CCATGGCCATGG ainsi que les deux oligonucléotides complémentaires reconstituant en s'appariant une région -35 idéale et permettant d'obtenir les vecteurs d'expression A, caractérisés en ce qu'ils ont les séquences nucleotidiques suivantes : 5' AAflCCTGTTGACAAflTATCATC 3'
3' GGACAACTGTTAAATAGTAGGC 5'
L'invention s'étend également à une bactérie hôte Escherichia
COli, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression A, par les vecteurs pRU 101, pRU 201, pRU 211 et par le vecteur d'expression pRU 222.
N'importe quel fragment d' ADN codant pour une protéine peut être introduit dans les vecteurs d'expression A et notamment dans pRU 222.
L'invention concerne donc une bactérie hôte Escherichia Coli caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression A et notamment par pRU 222 renfermant un fragment d'ADN codant pour une protéine quelconque.
ELle concerne tout particulièrement une bacterie hôteEscherichia
Coli transformée par un vecteur d'expression A et notamment par pRU 222, dans Lequel est introduit un fragment d'ADN codant pour l'interféron humain.
Coli transformée par un vecteur d'expression A et notamment par pRU 222, dans Lequel est introduit un fragment d'ADN codant pour l'interféron humain.
Les exemples donnés ci-aprés illustrent L'invention sans toutefois
La limiter.
La limiter.
Exemple : construction du plasmide pRU 222 1/. Construction du pLasmide pRU 101 :
L'invention utilise comme matériel de base le plasmide d'Escherichia Coli pBR 322 (BOLIVAR et al, Gene 2 : 95-113, 1977) qui confère les résistances à l'ampicilline et à la tétracycline. 5 9 de DNA du plasmide pBR 322 sont digérés par 5 unités d'enzyme de restriction HindIII (Boerhinger) pendant une heure à 37nC dans un tampon "666" (6 mM Tris HCl pH 7.6, 6 mM MgCl2, 6 mMss mercaptoéthanol contenant 50 mM de NaCl.Après que l'enzyme ait ete inactive pendant 10 minutes à 65 C, les extrémités cohésives de L'ADN générées par l'enzyme HindIII sont remplies enzymatiquement à l'aide de la DNA polymérise I de E. Coli (fragment de Klenow). L'incubation s'effectue pendant 45 minutes à 20nC dans 100il d'un tampon "666", 75 mM NaCL contenant chaque désoxynucléotide triphosphate ( dXTP) à La concentration de 100 > & .Apres incubation, l'ADN plasmidique est traite par un volume égal de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25:24 : 1) saturé à l'aide Tris-HCl pH 8.0 0,1 M, puis par un volume de chloroforme : alcool isoamylique (24:1) avant d'entre précipité par deux volumes d'éthanol en présence d'acétate de sodium pH 5.0 0.2 M.
L'invention utilise comme matériel de base le plasmide d'Escherichia Coli pBR 322 (BOLIVAR et al, Gene 2 : 95-113, 1977) qui confère les résistances à l'ampicilline et à la tétracycline. 5 9 de DNA du plasmide pBR 322 sont digérés par 5 unités d'enzyme de restriction HindIII (Boerhinger) pendant une heure à 37nC dans un tampon "666" (6 mM Tris HCl pH 7.6, 6 mM MgCl2, 6 mMss mercaptoéthanol contenant 50 mM de NaCl.Après que l'enzyme ait ete inactive pendant 10 minutes à 65 C, les extrémités cohésives de L'ADN générées par l'enzyme HindIII sont remplies enzymatiquement à l'aide de la DNA polymérise I de E. Coli (fragment de Klenow). L'incubation s'effectue pendant 45 minutes à 20nC dans 100il d'un tampon "666", 75 mM NaCL contenant chaque désoxynucléotide triphosphate ( dXTP) à La concentration de 100 > & .Apres incubation, l'ADN plasmidique est traite par un volume égal de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25:24 : 1) saturé à l'aide Tris-HCl pH 8.0 0,1 M, puis par un volume de chloroforme : alcool isoamylique (24:1) avant d'entre précipité par deux volumes d'éthanol en présence d'acétate de sodium pH 5.0 0.2 M.
Parallèlement, 1 nmole de l'oligonucléotide synthétique
CCATGGCCATGG est phosphorylée à son extrémité 5' OH à L'aide de 5 unités de polynucléotide kinase de E. Coli (Boehringer) dans 50 xi d'un tampon 50 INTris HCl pH 7.6, 10 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol (DTT) et 100yuM ATP pendant 30' à 37nC. Cet oligonucléotide est autocomplésentaire et peut donc former des hybrides double-brin. il est alors polymérisé par la DNA ligase du phage T4 aux extrémités du plasmide pBR 322, préalablement linéarité par l'enzyme Hind III, et rempli par le DNA polymérase I de E. Coli (fragment de Klenow).Pour cela 5 reg du plasmide et 30 pmoles de l'oligonucléotide sont incubés dans 20 > ul d'un tampon 50 mM TrisHCl pH 7.8, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT et 1mM ATP pendant 12 heures à 4 C en présence de 1000 unités de DNA Ligase de T4 (Boehringer). Apres inactivation de la DNA ligase de T4 en portant le mélange réactionnel à 65nC pendant 15 minutes, le produit de la réaction est digéré par 20 unités de l'enzyme de restriction NcoI (New England Biolabs) qui reconnaSt la séquence
CCATGG pendant 3 heures à 37nC dans 50 ftl d'un tampon 1 x 666, 150 mM NaCl. Apres digestion l'ADN est séparé selon sa taille par électrophorèse dans un gel d'agarose à 0,8 % dans un tampon contenant, par litre 10,8 g deTris Base, 5,5 g d'acide borique et 0,93 g dÈDTA sous forme de sel disodique. Après incubation du gel dans une solution de bromure d'éthidium à 1 ALg par litre et visualisation sous lumière ultraviolette, la bande d'ADN correspondant au monomère de pBR322 est excisée et electroéluée dans un tampon Tris-Acétate 5 mM pH 7,6.. Après précipitation à l'éthanol comme décrit précédemment et centrifugation, l'ADN est redissous dans 50 l de tampon Tris HCl pH 7,5 10 mM, EDTA-Na2 1 mM. 100 ng du plasmide sont alors circularisés par 5 unités de DNA ligase de T4 dans 10 ALOI de tampon d'incubation et utilisés pour transformer la bactérie Escherichia Coli Mu294.
CCATGGCCATGG est phosphorylée à son extrémité 5' OH à L'aide de 5 unités de polynucléotide kinase de E. Coli (Boehringer) dans 50 xi d'un tampon 50 INTris HCl pH 7.6, 10 mM MgCl2, 5 mM dithiothreitol (DTT) et 100yuM ATP pendant 30' à 37nC. Cet oligonucléotide est autocomplésentaire et peut donc former des hybrides double-brin. il est alors polymérisé par la DNA ligase du phage T4 aux extrémités du plasmide pBR 322, préalablement linéarité par l'enzyme Hind III, et rempli par le DNA polymérase I de E. Coli (fragment de Klenow).Pour cela 5 reg du plasmide et 30 pmoles de l'oligonucléotide sont incubés dans 20 > ul d'un tampon 50 mM TrisHCl pH 7.8, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT et 1mM ATP pendant 12 heures à 4 C en présence de 1000 unités de DNA Ligase de T4 (Boehringer). Apres inactivation de la DNA ligase de T4 en portant le mélange réactionnel à 65nC pendant 15 minutes, le produit de la réaction est digéré par 20 unités de l'enzyme de restriction NcoI (New England Biolabs) qui reconnaSt la séquence
CCATGG pendant 3 heures à 37nC dans 50 ftl d'un tampon 1 x 666, 150 mM NaCl. Apres digestion l'ADN est séparé selon sa taille par électrophorèse dans un gel d'agarose à 0,8 % dans un tampon contenant, par litre 10,8 g deTris Base, 5,5 g d'acide borique et 0,93 g dÈDTA sous forme de sel disodique. Après incubation du gel dans une solution de bromure d'éthidium à 1 ALg par litre et visualisation sous lumière ultraviolette, la bande d'ADN correspondant au monomère de pBR322 est excisée et electroéluée dans un tampon Tris-Acétate 5 mM pH 7,6.. Après précipitation à l'éthanol comme décrit précédemment et centrifugation, l'ADN est redissous dans 50 l de tampon Tris HCl pH 7,5 10 mM, EDTA-Na2 1 mM. 100 ng du plasmide sont alors circularisés par 5 unités de DNA ligase de T4 dans 10 ALOI de tampon d'incubation et utilisés pour transformer la bactérie Escherichia Coli Mu294.
Les transformants sont sélectionnés sur milieu solide Luria-Broth (LB) en présence d'ampicilline à 50 bWg/ml. Douze colonies sont alors isolées et cultivées dans 2,5 ml de milieu LB contenant de L'ampicilline à 50rg/ml. L'ADN plasmidique présent dans les bactéries est purifié selon la technique des mini lyse décrite par Birnboim et Doly (Nucl. Ac.
7 : 1513-1529, 1979). La présence d'un site de restriction NcoI est vérifiée en incubant les plasmides ainsi obtenus avec l'enzyme de restriction approprié dans les conditions décrites précédemment en analysant les produits de digestion par electrophorèse sur gel d'agarose et révélation de l'ADN à L'aide du bromure d'éthidium.
Le plasmide pRU 101 ainsi créé confère toujours la résistance à l'ampicilline aux bactériens dans lesquelles il est introduit. Par contre, l'addition d'un site de restriction NcoI au niveau du site Hind
III inactive le promoteur du gène de résistance à la tétracycline.
III inactive le promoteur du gène de résistance à la tétracycline.
L'ensemble des opérations permettant d'aboutir au plasmide pRU 101 est résume dans la figure 2.
2/. Construction du plasmide pRU 201
Le plasmide pOMPO (Mercereau-Puijalon et al, Nature 275 : 505-510, 1978) qui avait été utilisé pour exprimer l'ovalbumine sous forme d'une protéine de fusion dans Escherichia Coli, constitue le matériel de départ pour la construction du plasmide pRU 201. Dans ce plasmide, le promoteur de l'opéron lactose (mutation L8-UV5) ainsi que le segment d'ADN codant pour les six premiers acides aminés de la È galactosidase sont encadrés par un site de restriction HaeIII situé en amont du promoteur et par un site de restriction EcoRI unique dans le vecteur situé après le fragment du gène de la /3 galactosidase.
Le plasmide pOMPO (Mercereau-Puijalon et al, Nature 275 : 505-510, 1978) qui avait été utilisé pour exprimer l'ovalbumine sous forme d'une protéine de fusion dans Escherichia Coli, constitue le matériel de départ pour la construction du plasmide pRU 201. Dans ce plasmide, le promoteur de l'opéron lactose (mutation L8-UV5) ainsi que le segment d'ADN codant pour les six premiers acides aminés de la È galactosidase sont encadrés par un site de restriction HaeIII situé en amont du promoteur et par un site de restriction EcoRI unique dans le vecteur situé après le fragment du gène de la /3 galactosidase.
Dix microgrammes du plasmide pOMPO sont digérés pendant une heure par dix unités de l'enzyme EcoRI (Boerhinger) dans 50 ,6 l d'un tampon "666" 150 mM NaCl. Après inactivation de l'enzyme selon le protocole décrit précédemment, les extrémités du fragment d'ADN linéaire généré par l'incubation sont remplies à l'ai de du fragment Klenow de la DNA polymérase I de E Coli dans un volume final de 100 dans les conditions décrites plus haut, en présence de dATP à La concentration de 100yuM et de 50JaCi de o < -32 P - dTTP (10 mCi/ml, 800 Ci/mM).Après 30 minutes d'incubation à 16m C, la réaction est poursuivie pendant un temps identique après addition de dTTP non radioactif à la concentration finale de 100 M.
Le produit de la réaction est alors digéré par 10 unités de l'enzyme de restriction HaeIII (Boerhinger), pendant 1 heure à 37 C dans 150 J4l d'un tampon "666" 50 mM NaCl. Les fragments d'ADN ainsi obtenus sont séparés selon leur taille par électrophosèse sur gel
d'acrylamide : bisacrylamide (19 : 1) à 6 X realisée dans un tampon TBE. Après autoradiographie du gel, le fragment de 207 paires de bases contenant le promoteur de l'opéron lactose rendu radioactif lors du remplissage du site EcoR I à l'aide de α α-32 P - dTTP, est excisé du gel, électroélué et précipité à l'éthanol selon les conditions décrites précédemment.Après centrifugation et redissolution du fragment d'ADN dans 10 )ul d'un tampon Tris HCl pH 7.5 10 mM, EDTA 1 mM, 30 pmoles d'un oligonucléotide de séquence CCGGATCCGG contenant un site de restriction par l'enzyme BamHI et préalablement phosphorylé à son extrémité 5' à l'aide de la polynucléotide kinase de E. Coli, sont ligaturés au dit fragment dans un volume final de 20 rl dans des conditions identiques à celles décrites plus haut.Après inactivation de la DNA ligase de T4, l'ensemble de la réaction est digéré par 20 unités d'enzyme de restriction BamHI pendant 3 heures à 37nC dans 50vjl d'un tampon "666", 150 mM NaCl. Le fragment d'ADN de 221 paires de bases est alors isolé par électrophosèse sur gel d'acrylamide à 6% et électroélution et inséré dans le plasmide pBR 322 préalablement linéarité par l'enzyme de restriction BamHI. Pour cela, 25 ng du fragment de 221 paires de bases sont incubés avec 100 ng de pBR322 - Bam
HI pendant 16 heures à 4"C dans 10 l d'un tampon de ligation contenant 5 unités de T4 DNA ligase.
d'acrylamide : bisacrylamide (19 : 1) à 6 X realisée dans un tampon TBE. Après autoradiographie du gel, le fragment de 207 paires de bases contenant le promoteur de l'opéron lactose rendu radioactif lors du remplissage du site EcoR I à l'aide de α α-32 P - dTTP, est excisé du gel, électroélué et précipité à l'éthanol selon les conditions décrites précédemment.Après centrifugation et redissolution du fragment d'ADN dans 10 )ul d'un tampon Tris HCl pH 7.5 10 mM, EDTA 1 mM, 30 pmoles d'un oligonucléotide de séquence CCGGATCCGG contenant un site de restriction par l'enzyme BamHI et préalablement phosphorylé à son extrémité 5' à l'aide de la polynucléotide kinase de E. Coli, sont ligaturés au dit fragment dans un volume final de 20 rl dans des conditions identiques à celles décrites plus haut.Après inactivation de la DNA ligase de T4, l'ensemble de la réaction est digéré par 20 unités d'enzyme de restriction BamHI pendant 3 heures à 37nC dans 50vjl d'un tampon "666", 150 mM NaCl. Le fragment d'ADN de 221 paires de bases est alors isolé par électrophosèse sur gel d'acrylamide à 6% et électroélution et inséré dans le plasmide pBR 322 préalablement linéarité par l'enzyme de restriction BamHI. Pour cela, 25 ng du fragment de 221 paires de bases sont incubés avec 100 ng de pBR322 - Bam
HI pendant 16 heures à 4"C dans 10 l d'un tampon de ligation contenant 5 unités de T4 DNA ligase.
Après transformation de la bactérie E. Coli MM 294 pas le produit de la ligation, la sélection des transformants s'effectue sur milieu minimum solide M9 (Ref. T. Maniatis et al. Molecular cloning : a pratical approach CSli Laboratory, 1982) en présence d'ampicilline à 50 sg/ml, de 5-bromo 4-chloro 3-indolyl ss D-galactopyronoside, (X-gal) à 40 yug/ml et de 20 mg/ml de glucose comme source de carbone. Les colonies présentant une coloration bleue sont celles qui expriment la galactosidase et dans lesquelles l'opéron lactose n'est plus soumis au controle de son represseur du fait de la fixation de ce dernier sur l'opérateur de l'opéron lactose cloné dans pBR322.Après isolement et culture des colonies bleues, la présence du fragment de 221 paires s'effectue en réalisant des mini lyses sur les cultures bactériennes et en analysant l'ADN plasmidique obtenu par electrophorèse sur gel d'acrylamide à 6 X après digestion par l'enzyme de restriction BamijI, selon les protocoles experimentaux décrits plus haut.
Le plasmide pRU 201 contenant le promoteur de l'opéron lactose dans un fragment de restriction Banni de 221 paires de bases, est alors utilise pour construire le plasmide pRU 211. Les opérations effectuees lors de la construction du vecteur pRU 201 sont rapportées dans la figure 3.
3/. Construction du plasmide pRU 211 :
La séquence du fragment d'ADN HaeIII - EcoR I de 207 paires de bases contenant le promoteur Lac qui a été inséré dans Le plasmide pRU201 est présentée dans la figure 1. 20 g du plasmide pRU 201 sont digérés par 20 unités d'enzyme de restriction BamHI pendant 1 heure à 37 UC dans 100 l d'un tampon "666", ?Ct 150 m. Après isolement par électrophorèse et électroélution, 500 ng du fragment de DNA Bam HI de 221 paires de bases contenant le promoteur Lac sont digérés par 5 unites de l'enzyme de restriction Alul (Boerhinger) dans 50 l d'un tampon "666" NaCl 50 mM pendant 1 heure à 37 C.Cette incubation permet d'isoler, par électrophorèse sur gel d'acrylamide à 10 % et électroélution, un fragment d'ADN à extrémités franches de 95 paires de bases contenant tout le promoteur Lac et se terminant 2 nucléotides avant l'ATG initiateur de la ss galactosidase (voir figure 1). 200 ng du fragment Alul de 95 paires de bases sont ligaturés pendant 16 heures à 4UC avec 30 picomoles de l'oligonucléotide CCATGGCCATGG prealablement phosphorylé à son extremite 5' ou par la polynuctéotide kinase de E.
La séquence du fragment d'ADN HaeIII - EcoR I de 207 paires de bases contenant le promoteur Lac qui a été inséré dans Le plasmide pRU201 est présentée dans la figure 1. 20 g du plasmide pRU 201 sont digérés par 20 unités d'enzyme de restriction BamHI pendant 1 heure à 37 UC dans 100 l d'un tampon "666", ?Ct 150 m. Après isolement par électrophorèse et électroélution, 500 ng du fragment de DNA Bam HI de 221 paires de bases contenant le promoteur Lac sont digérés par 5 unites de l'enzyme de restriction Alul (Boerhinger) dans 50 l d'un tampon "666" NaCl 50 mM pendant 1 heure à 37 C.Cette incubation permet d'isoler, par électrophorèse sur gel d'acrylamide à 10 % et électroélution, un fragment d'ADN à extrémités franches de 95 paires de bases contenant tout le promoteur Lac et se terminant 2 nucléotides avant l'ATG initiateur de la ss galactosidase (voir figure 1). 200 ng du fragment Alul de 95 paires de bases sont ligaturés pendant 16 heures à 4UC avec 30 picomoles de l'oligonucléotide CCATGGCCATGG prealablement phosphorylé à son extremite 5' ou par la polynuctéotide kinase de E.
Coli, dans 20 l en présence 1000 unités de DNA ligase de T4 dans les conditions d'incubation decrites précédemment. après inactivation de l'enzyme pendant 15 minutes à 65 C, le produit de La ligation est digéré pendant 3 heures à 37 C par 20 unités de L'enzyme NcoI dans un volume final de 100 l selon les conditions décrites plus haut.
Apres séparation par électrophorèse sur gel d'acrylamide à 10 X, et electroélution le promoteur Lac flanqué d'un site de restriction
Nco I à chaque extrémité est inséré dans le vecteur pRU 101 prealablement linéarisé par l'enzyme de restriction NcoI.
Nco I à chaque extrémité est inséré dans le vecteur pRU 101 prealablement linéarisé par l'enzyme de restriction NcoI.
A cette fin 10 ng du fragment d'ADN contenant le promoteur Lac encadre par des sites de restriction Nco I sont ligaturés avec 100 ng du plasmide pRU 101 linéarité par l'enzyme NcoI, dans un volume final de 10 l en présence de 5 unités de T4 DNA ligase selon les conditions décrites précédemment. Le produit de la ligation est utilisé pour transformer des bactéries E. coli MM294. La sélection des transformants se fait sur milieu minimum solide M9 contenant 50 (cg/ml d'ampicilline en présence de glucose à 20 mg/ml comme source de carbone et de Xgal à 40 Ccg/ml.
Les colonies Lac+ présentant une coloration bleue sont isolées et cultivées en milieu liquide LB. L'analyse des plasmides obtenus lors de la réalisation de mini lyses à partir des cultures liquides, permet d'isoler les vecteurs pRU 211 et pRU 212 qui différent par ltorientation du promoteur Lac à l'intérieur du plasmide.
Le détail des expériences permettant de construire ces plasmides est présenté dans la figure 4 . La création de sites NcoI aux deux extrémités du fragment d'ADN contenant le promoteur Lac permet de recreer un codon d'initiation ATG distant de 7 paires de bases du site de fixation des ribosomes AGGA de l'opéron lactose, ici dont, et ceci est identique à ce qui existe dans I'opéron lactose naturel.
4/. Construction du plasmide pRU 222 :
Vingt microgrammes du plasmide pRU 211 sont incubés pendant 2 heures à 37uC avec 10 unités d'enzyme de restriction NcoI dans 100 > l d'un tampon "666", NaCl 150 mM.
Vingt microgrammes du plasmide pRU 211 sont incubés pendant 2 heures à 37uC avec 10 unités d'enzyme de restriction NcoI dans 100 > l d'un tampon "666", NaCl 150 mM.
Le fragment d'ADN de 105 paires de bases contenant le promoteur
Lac est alors isolé par électrophorése sur gel d'acrymalide à 10 X et électroélution. Auprès précipitation à l'éthanol en présence d'acétate de sodium pH 5,0 0,3 M et centrifugation le fragment d'ADN est digéré par 2 unites d'enzyme de restriction Hpa Il dans 50 , & d'un tampon 10 mM
TrisHCl pH 7, 6, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT et 6 mM KCl pendant 1 heure à 37 C. Auprès électrophorèse sur gel d'acrylamide à 20 Z du produit de la réaction, le fragment d'ADN de 60 paires de bases contenant la TATA-box, ou région -10 et l'ATG initiateur est isolé par électroélution et précipatation à l'ethanol. 300 ng de ce fragment sont alors incubés avec 10 pMoles de chacun des oligonucléotides : 5 AATTCCTGTTGACAATTTATCACT et 5 CGGATGATAAATTGTCAACAGG préalablement phosphorylés à leur extrémité 5' par la polynucléotide kinase de E. Coli, pendant 16 heures à 4mC dans un volume final de 20 yl avec 10 unités de T4 DNA ligase dans les conditions décrites plus haut.Ces deux oligonuctéotides sont partiellement complémentaires et peuvent de ce fait former un hybride double brin de structure : 5 AATTCCTGTTGACAATTTATCATC
GGACAACTGTTAAATAGTAGGC5 qui possède à ses extrémités un site de coupure par l'enzyme de restriction EcoRI et un site de coupure par l'enzyme de restriction
HpaiI.
Lac est alors isolé par électrophorése sur gel d'acrymalide à 10 X et électroélution. Auprès précipitation à l'éthanol en présence d'acétate de sodium pH 5,0 0,3 M et centrifugation le fragment d'ADN est digéré par 2 unites d'enzyme de restriction Hpa Il dans 50 , & d'un tampon 10 mM
TrisHCl pH 7, 6, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT et 6 mM KCl pendant 1 heure à 37 C. Auprès électrophorèse sur gel d'acrylamide à 20 Z du produit de la réaction, le fragment d'ADN de 60 paires de bases contenant la TATA-box, ou région -10 et l'ATG initiateur est isolé par électroélution et précipatation à l'ethanol. 300 ng de ce fragment sont alors incubés avec 10 pMoles de chacun des oligonucléotides : 5 AATTCCTGTTGACAATTTATCACT et 5 CGGATGATAAATTGTCAACAGG préalablement phosphorylés à leur extrémité 5' par la polynucléotide kinase de E. Coli, pendant 16 heures à 4mC dans un volume final de 20 yl avec 10 unités de T4 DNA ligase dans les conditions décrites plus haut.Ces deux oligonuctéotides sont partiellement complémentaires et peuvent de ce fait former un hybride double brin de structure : 5 AATTCCTGTTGACAATTTATCATC
GGACAACTGTTAAATAGTAGGC5 qui possède à ses extrémités un site de coupure par l'enzyme de restriction EcoRI et un site de coupure par l'enzyme de restriction
HpaiI.
Auprès inactivation de L'enzyme pendant 15 minutes à 65 C, le produit de la reaction est digéré par les enzymes de restriction
EcoRI et NcoI dans 50 l d'un tampon 666, NaCI 150 yu M. Les produits de la digestion sont séparés par électrophorèse sur gel d'acrylamide à 10 X.
EcoRI et NcoI dans 50 l d'un tampon 666, NaCI 150 yu M. Les produits de la digestion sont séparés par électrophorèse sur gel d'acrylamide à 10 X.
Le fragment de 84 paires de bases correspondant à un promoteur ayant une TATA box issue de l'opéron Lac naturel et un "région -35" synthétique peut être isolé et électroélué. 15 ng de ce fragment d'ADN sont alors ligaturés avec 100 ng du plasmide pRU 101 préalablement digere par EcoRI et NcoI, pendant 16 heures à 4 C dans 20 > ul de tampon de ligation (utilisé precédemment) en présence de 10 unites de T4 DNA ligases.
Auprès transformation de la bactérie E. Coli MM294, les transformants sont isolés sur milieu minimum solide contenant l'ampicilline à 50 yug/ml du glucose à 20 mg/ml et du X Gal à 40 > ug/ml.
Les colonies bleues denotent la présence d'un promoteur de type
Lac sur un plasmide, ce qui aboutit à la séquestration du represseur en dehors de l'opérateur de l'opéron Lac chromosomal cellulaire.
Lac sur un plasmide, ce qui aboutit à la séquestration du represseur en dehors de l'opérateur de l'opéron Lac chromosomal cellulaire.
Après réalisation de mini lyse sur des cultures issues de colonies bleues, la présence d'un site NcoI et d'un site EcoRI est recherchée en incubant le plasmide avec lesdits enzymes.
Les étapes permettant d'aboutir au plasmide pRU222 qui répond aux differents critères sont decrites dans la figure 5.
Exemples d'application 1/. Test montrant que pRU 222 possède un gene fonctionnel de résistance à la tétracycline :
La creation du site NcoI dans le plasmide pRU101 se traduit par l'inactivation du promoteur du gene de résistance à la tétracycline de pBR322. Le remplacement du fragment EcoRI-NcoI de pRU101 par le promoteur hybride dans pRU222,restaure la capacité pour ce plasmide de conférer la resistance à la tétracycline. De plus le gène de la tétracycline devient alors soumis au même type de contr8le que l'opéron lactose. La transformation dans la souche de E.Coli D1210 (dérivé iq de E.Coli HB101) du plasmide pRU222, donne des colonies résistantes à
I'ampicilline et sensible à la tétracycline en absence d'IPTG et des colonies résistantes aux deux antibiotiques en présence d'IPTG.
La creation du site NcoI dans le plasmide pRU101 se traduit par l'inactivation du promoteur du gene de résistance à la tétracycline de pBR322. Le remplacement du fragment EcoRI-NcoI de pRU101 par le promoteur hybride dans pRU222,restaure la capacité pour ce plasmide de conférer la resistance à la tétracycline. De plus le gène de la tétracycline devient alors soumis au même type de contr8le que l'opéron lactose. La transformation dans la souche de E.Coli D1210 (dérivé iq de E.Coli HB101) du plasmide pRU222, donne des colonies résistantes à
I'ampicilline et sensible à la tétracycline en absence d'IPTG et des colonies résistantes aux deux antibiotiques en présence d'IPTG.
2/. Application de pRU222 à la synthèse de L'interféron humain dans
E. Coli.
E. Coli.
Le caractère fonctionnel du vecteur d'expression pRU222 a été vérifié en y insérant un segment d'ADN codant pour l'interféron \ humain ( g IFN humain). Le schéma expérimental est décrit dans la figure 6.
Un fragment de restriction Nde I - Sau3A de 607 paires de bases contenant la séquence codante du dIFN humain depuis le résidu Tyrosine (4eme acide aminé de la protéine mature) jusqu'à la fin, de la protéine a été isolé d'un plasmide contenant l'ADNC complet de La lymphokine. Un fragment d'ADN synthétique codant pour les trois premiers acides amines de l'interféron mature et pour un résidu methionine est ajouté au niveau du site Nde I du fragment de 607 paires de bases. L'ensemble est inséré entres les sites NcoI et Bam HI de pRU222 prealablement digéré par ces enzymes de restriction. Le produit de ligation est utilisé pour transformer Escherichia coli MM294. Les colonies contenant les plasmides recombinants sont sélectionnées en presence d'ampicilline. Afin d'augmenter le nombre de copies de plasmide dans Escherichia Coli, le segment d'ADN situé entre les sites de restriction Ava I et PvuII est déleté du plasmide pRU222-IFN. On obtient ainsi le plasmide pRU 222 a- IFN. La synthèse d'interféron peut être mesurée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dans des conditions denaturantes, des protéines extraites de cultures effectuées à partir de clones recombinants. Un exemple est présenté dans la figure 7.
Claims (15)
1/. Vecteurs d'expression A permettant d'introduire un gène étranger d'origine procaryote ou eucaryote dans Escherichia coli constitue d'une molécule d'ADN circulaire capable de se répliquer de façon autonome dans Escherichia coli, caractérisés en ce qu'ils contiennent - un site de fixation des ribosomes (séquence de Shine et Dalgarno) situé à d'une distance pouvant varier de O à 20 nucléotides du codon d'initiation ATG de la biosynthèse des protéines et renfermant un ou plusieurs sites de reconnaissance par une endonucléase de restriction permettant d'ouvrir le vecteur au niveau du codon d'initiation de la traduction, pour introduire dans ledit vecteur n'importe quelle séquence nucleotidique codant pour une protéine quelconque à exprimer dans
Escherichia Coli ;; - une région promoteur-operateur dérivant de I'opéron Lactose d'E-coli reconnue par la machinerie cellulaire d'E.coli, dont les séquences -35 et -10 sont separées de 17 nucléotides.
2/. Vecteurs d'expression À selon la revendication 1 caractérisés ence que le segment d'ADN separant le site de fixation des ribosomes du codon d'initiation ATG de la biosynthèse des protéines dont la longueur varie de O à 20 nucléotides, renferme un site de coupure par L'enzyme de restriction Nco I.
3/. Vecteurs d'expression A selon les revendications 1 et 2, caractérisés en ce que la distance séparant Le site de fixation des ribosomes du codon d'initiation ATG de la biosynthèse des protéines est de 7 nucléotides, à savoir est équivalente à ce qui existe dans les ARN messagers issus de la transcription de l'opéron lactose naturel de Escherichia coli.
4/. Vecteurs d'expression A selon les revendication 2 à 4, caractérisés en ce que la région séparant le site de fixation des ribosomes et le codon d'initiation ATG possède la séquence nucléotidique suivante :
site de codon fixation d'initiation des ribosomes 5/. Vecteurs d'expression A selon les revendications 1 à 4, caractérisés en ce que La region promoteur-opérateur dérivant de
L'opéron lactose d'E-Coli a la séquence nucléotidique suivante 5' 3'
6/.Vecteurs d'expression A selon les revendications 2 à 5, caractérises en ce que : -le segment d'ADN contenant le site de fixation des ribosomes et Le codon d'initiation ATG a la séquence nucléotidique suivante : 5' 3' AGGAAACAGCCATG site codon d'initiation fixation des ribosomes et - la région promoteur a la séquence nucléotidique suivante : 5' 3'
7/. Le vecteur d'expression A : pRU222.
8/. Procédé de préparation des vecteurs d'expression A tels que définis aux revendications 1 à 6, caractérisé en ce que : - on isole le fragment de l'opéron lactose contenant tout le promoteur
Lac d'un vecteur B de départ renfermant ledit promoteur et portant la mutation UV5 en digérant le vecteur B avec differentes enzymes de restriction adéquates ;; - on digère ensuite le fragment précédemment obtenu par L'enzyme de restriction AluI pour obtenir le fragment de 95 paires de bases contenant tout Le promoteur de l'opéron lactose, - puis, à L'aide de DNA ligase et d'oligonucléotides de synthèse, on introduit aux extrémités du fragment de 95 paires de bases un ou plusieurs sites de coupure par une endonuclease de restriction au niveau du codon d'initiation de la biosynthese des protéines, ATG, et obtient ainsi un segment d'ADN séparant le site de fixation des ribosomes (séquence de Shine et Dalgarno) du codon d'initiation ATG dont la longueur peut varier de O à 20 nucléotides.
- On clone le fragment ainsi obtenu dans un vecteur de type C1 permettant de reisoler le promoteur Lac sous forme d'un fragment d'ADN possedant à ses deux extrémités Le site de restriction que l'on a introduit préalablement au niveau de L'ATG initiateur et obtient ainsi un vecteur D.
- On isole du vecteur D à l'aide d'enzymes de restriction adéquates un fragment de 90 à 130 paires de bases contenant le promoteur Lac.
- On isole à partir du fragment précédent un fragment de 50 à 80 paires de bases contenant la région -10 ou TATA box de séquence TATAAT, - puis à L'aide de deux oligonucléotides synthétiques complémentaires l'un de l'autre, on positionne la région -35, de séquence TTGACA de promoteurs connus d'E. Coli, à une distance de 17 paires de bases de la région -10.
- On clone le fragment ainsi obtenu dans un vecteur C2 permettant de reconstituer un ou plusieurs sites de restriction uniques au niveau du codon d'initiation ATG pour obtenir un vecteur d'expression A.
9/. Procédé de préparation du vecteur d'expression A pRU 222, caractérisé en ce que a. on prepare un vecteur appelé pRU 101 selon les étapes suivantes : - digestion d'un plasmide du type pBr322 par l'enzyme de restriction
Hind III, - remplissage des extrémités cohésives ainsi générées à l'aide de la
DNA polymérise I de E.Coli, - creation d'un site de restriction NcoI par addition d'un oligonucléotide de synthese dont la séquence est la suivante : 5' 3'
CCATGGCCATGG au site Hind III rempli de pBR322 à l'aide de la DNA - ligase du bactériophage T4 et recoupure de L'ADN par L'enzyme de restriction
NcoI reconnaisant la séquence CCATGG, - ligature de L'ADN par la DNA ligase et transformation de E. coli de souche MM294 (déposée à L'ATCC sous le numéro 33625), - recherche d'un plasmide issu de la transformation et possédant un site
NcoI.
b/. On prepare un vecteur pRU 201, selon les étapes suivantes : - digestion d'un vecteur de type pOMPO par l'enzyme de restriction
EcoRI, - remplissage des extrémités cohésives ainsi générées à l'aide de la
DNA polymérase I de E. Coli (fragment de Klenow), - coupure de l'ADN par l'enzyme de restriction HaeIII et isolement du fragment de 207 paires de bases contenant le promoteur Lac.
- création de sites BamHI aux deux extrémités de ce fragment par addition d'un oligonucleotide de synthese de séquence 5 CCGGATCCGG3, à l'ai de de La DNA ligase et recoupure par L'enzyme BamNI, - insertion du fragment au site BamHI de pBR 322 et transformation de la souche Mu294 de E. coli, - sélection des transformants sur milieu solide glucosé contenant du 5-bromo 4-chloro 3-indolyl ,5 D-galactopyranoside (X-gal) et analyse des plasmides recombinants par mini Lyse ; c/. à partir du vecteur pRU 201 précédent, on prépare le vecteur pRU 211, selon les étapes suivantes - digestion de pRU 201 par L'enzyme de restriction BamHI et isolement du fragment de 221 paires de bases contenant le promoteur Lac, - digestion du fragment BamHI par l'enzyme de restriction AluI et isolement du fragment de 95 paires de bases contenant le promoteur
Lac, - création d'un site NcoI aux deux extrémités de fragment Alu par addition d'un oligonucléotide de synthese de séquence 5' 3'
CCATGGCCATGG et recoupure par l'enzyme NcoI, - insertion du fragment au site NcoI du vecteur pRU 101 et transformation dans la souche E. coli MM 294, - sélection des transformants sur milieu solide glucosé en présence de X-gal et analyse des vecteurs par mini lys ; d. on prépare le vecteur d'expression pRU 222 à partir du vecteur pRU 211, selon les étapes suivantes : - digestion du plasmide pRU 211 par l'enzyme de restriction NcoI et isolement du fragment de 10S paires de bases contenant le promoteur
Lac, - digestion du fragment NcoI par l'enzyme de restriction HpaII et isolement du fragment HpaII-NcoI de 60 paires de bases contenant la
TATA-box, - ligation du fragment HpaII-NcoI avec les deux oligonucléotides complémentaires de séquence : 5' AATTC CTGTTGA CAATTTAT CATC
5'
GGA CAACT GTT AAATAGT AGGC à L'aide de la DNA ligase et digestion des produits de ta ligation par les enzymes de restriction EcoRI et NcoI, - Isolement du fragment EcoRI-NcoI de 84 paires de bases contenant le promoteur hybride et insertion de ce fragment entre les sites EcoRI et NcoI de pRU 101 avant transformation dans une souche MM294 d'E. coli, - sélection des transformants sur milieu gélosé glucosé en presence de Xgal, analyse des transformants par mini lyse.
10/. Vecteurs nécessaires pour préparer le vecteur pRU 222 : pRU 101, pRU 201, pRU 211.
11/. Oligonucleotide contenant deux sites de restriction de l'enzyme de restriction NcoI, caractérisé en ce qu'il a la séquence nucléotidique suivante 5' 3'
CCATGGCCATGG 12/. Oligonucléotides complémentaires reconstituant une région -35 idéale en s'appariant et permettant d'obtenir les vecteurs d'expression
A tels que definis aux revendications 5 et 6, caractérisés en ce qu'ils ont les sequences nucléotidiques suivantes : 5' AATTCCTGTTGACAATTTATCATC
GGACAACTGTTAAATAGTAGGC 5' 13/. Bactérie hôte Escherichia CoLi, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression A.
14/. Bactérie hôte Escherichia Coli, caractérisée en ce qu'elle est transformée par les vecteurs pRU 101, pRU 201, pRU 271.
15/. Bactérie hôte Escherichia Coli, caractérisée en ce qu'eLle est transformée par le vecteur d'expression pRU 222.
16/. Bacterie hôte Escherichia Coli, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur d'expression A renfermant un fragment d'ADN codant pour une proteine quelconque.
17/. Bacterie hôte Escherichia Coli, caractérisée en ce qu'elle est transformée par le vecteur d'expression pRU 222 renfermant un fragment d'ADN codant pour une protéine quelconque.
18/. Bactérie hôte transformée telle que définie aux revendications 16 et 17 caractérisée en ce que le fragment d'ADN code pour t'interféron humain.
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| EP0415296A2 (fr) * | 1989-08-31 | 1991-03-06 | Solvay Enzymes GmbH & Co. KG | Protéases particulièrement alcalines |
| WO1995009914A1 (fr) * | 1993-10-05 | 1995-04-13 | Asahi Glass Company Ltd. | Vecteur de multiclonage, vecteur d'expression, et production d'une proteine exogene au moyen dudit vecteur d'expression |
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Legal Events
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| TP | Transmission of property | ||
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