KR940011339B1 - 세린프로테아제억제제의 제조를 위한 dna 재조합 방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

세린프로테아제 억제제의 제조를 위한 DAN 재조합방법

제1도는 플라스미드 pSGE6의 도해.

제2도는 pGS185로 부터 유도된 플라스미드 pGS285의 도해.

제3도는 플라스미드 pSGE8의 도해.

제4도는 플라스미드 pGS485의 도해.

본 발명은 세린프로테아제 억제제의 제조를 위한 DNA 재조합 방법(recombinant DNA method)과 그에 유용한 DNA 씨퀀스(sequences)에 관한 것으로서, 특히 사람의 다형핵(PWN)-과립구 프로테아제 조정되어진 재조합억제제로서, 백혈구 에라스타제 및 트립신을 함유하는 사람의 세린프로테아제 억제제를 제조하기 위한 DNA 재조합방법에 관한 것이며, 또한 인스턴트 세린프로테아제 억제제 유사물과 DNA 재조합 방법에서 유용하게 사용되는 합성 및 천연 DNA 씨퀀스도 포함된다.

내인성(endogeneous)프로테아제(단백질 분해효소)는 침입한 생물이나 항원-항체 복합체 및 생물에 더이상 필요하지 않은 어떤 조직의 단백질을 분해시키는 작용을 하는데, 정상적으로 기능을 하는 생물에서는 이러한 프로테아제의 생성량이 한정되어 있으며 그 양은 프로테아제 억제제의 합성으로 일부분이 조절되어지게 된다.

다량의 천연 프로테아제 억제제는 내인성프로테아제의 반응을 국소적이면서 일시적으로 제한하여 조절을 하며, 감염 및 기생물질에 의해서 체내에서 유도되어지는 프로테아제를 억제시킬 수도 있고, 기도와 같이 단백질분해 공격 및 감염을 받기 쉬운 조직에는 프로테아제 억제제가 풍부하게 존재한다.

프로테아제 억제제는 사람의 혈장 단백질의 약 10%를 차지하고 있는바, 이로부터 적어도 8가지의 억제제가 분리되어지는데 문헌에 설명되어 있는 특징을 보면 α₂-마크로글로불린(α₂M), α₁-프로테아제 억제제(α₁PI), α₁-안티키모트립신(α₁Achy), β1-안티콜라게나제(β₂AC) 및 인터-α-트립신 억제제(IαI)가 있는 것으로 설명되어 있다.

만일 프로테아제/프로테아제 억제제의 균형이 깨지게 되면 기종, 관절염, 사구체신염, 치근막염, 근이영양, 종양침입 및 여러가지 병리학적 상황을 포함한 프로테아제가 중재하는 조직파괴를 일으키게 되며, 폐혈증이나 급성 백혈병 같은 심한 병리학적 과정의 어떤 상태에서는 분비세포로부터 효소를 방출시키게 되므로 유리되는 프로테아제의 양이 증가하게 될 뿐만 아니라 다른 상태에서는 생물의 감소되어진 억제제의 조절능력이 프로테아제/프로테아제 억제제의 균형을 변형시킬 수도 있는데, 그 예로는 α₁-프로테아제 억제제 부족으로 인한 폐기종 형성에의 영향을 들 수 있다.

이와 같은 이상이 있는 생물에서 프로테아제를 조절해 줄 수 있는 방법이 없는한은 생물에 심각한 손상을 줄 수 있으므로 프로테아제 억제제를 프로테아제를 조절하기 위해 생물에 투여시킬 수 있는 것으로 요구하여 왔다.

백혈구 에라스타제는 약리학적 견지에서 특히 주목을 끄는 세린프로테아제의 일종으로서, 이것이 세포외로 방출될때는 결합조직 및 다른 유용한 단백질을 분해시키고, 정상적으로 기능을 하는 생물에 있어서 일정량의 결합조직 및 그 외에 다른 단백질 기종이나 류머티스관절염같은 여러 병리학적 상태로 되게 된다.

정상치보다 과량으로 존재하는 백혈구 에라스타제가 미치는 영향에 대처하기 위한 것으로서, 프로테아제 억제제가 DNA 재결합 방법에 의해 정제된형태로 약리학적으로 유용할 정도의 양으로 제조될 수 있다면 상당히 유용할 것이다.

종래에, 2가지 이상의 백혈구 에라스타제 억제제가 문헌에 나타나 있는바, 그 중의 하나인 단백질(Schiessler et al., "Acid-Stable Inhibitors of Granulocyte Neutral Proteases in Human Mucous Secretions:Biochemistry and Possible Biological Function" in Neutral Proteases of Human Polymorphoneuclear Leucocytes, Havemann et al.(eds), Urban and Schwarzenberg, Inc. (1978)은 사람의 정액혈장 및 객담으로 부터 분리되어지며 N-종단 아미노산이 티로신인 11Kda 정도의 크기인 것으로 특징지워지는데 이와 같은 단백질의 문헌보고서에서는 단지 부분적인 아미노산 씨퀀스만을 제공하지만 이와 같은 부분적인 씨퀀스가 심지어는 이 단백질이 본 발명에 따른 단백질로부터 실질적으로 변형되어진 것임을 나타내며 이러한 단밸직의 씨퀀스에 대한 보고가 본 발명에 따른 단백질의 아미노산 씨퀀스와 결합하여 Schiessler et al.에 의해 조합된 생성물이 하나의 폴리펩타이드 사슬이 아닌 분해된 단백질일 수 있음을 나타내다.

상기의 또 다른 단백질은 사람의 혈장으로부터 분리되어지는바, α1-프로테아제 억제제라고 명명되어지고 이 단백질에 대한 연구는 Annual Review of Biochemistry 52(Travis and Salvesen, 655-709(1983)에 요약되어 있으며 이 단백질의 아미노산 씨퀀스는 본 발명에 따른 단백질과는 실질적으로 꽤 다르다는 것이 나타나 있다. 본 발명에 따른 하나의 폴립펩티드 사슬로 된 단백질과 종래의 하나인 폴리펩타이드 사슬로 된 세린프로테아제 억제제는 본 발명에 따른 단백질과 실질적으로 동종이 아니다.

약리학적 견지에서 특히 주목을 끄는 다른 프로테아제로는 트립신이 있는바, 췌장염같은 급성상태에서 췌장조직등의 연한 기관조직을 분해시키는 것으로 알려져 있으므로 이러한 트립신의 작용을 억제하도록 하는 단밸직을 사용하여 뚜렷한 성과없이 이러한 상태를 치료하기 위해 노력을 했으며 사람의 췌장염을 치료하는데 외인성(exogenous)소의 트립신 억제제를 사용하는 시도가 있었다. 유럽에서 이와 같은 기술을 시도하는 동안, 미국의 FDA에 의해 효과를 인정받지 못하게 되어 여러가지 급, 만성 상태에서 과량의 트립신을 중화시키는데 효과적인 프로테아제 억제제가 필요하게 되었다. 상기 백혈구 에라스타제 억제제의 경우에서와 같이 트립신억제제를 분리하여 DNA 재결합 바업에 의해 정제된 형태로 약리학적으로 충분한 양을 제조한다면 특히 유용할 것이다.

카텝신 G는 백혈구에 다량으로 존재하는 또다른 프로테아제로서, 보조단백질을 포함한 다양한 유효단백질을 생채외에서 분해시킬 수 있는 것으로 알려져 있으며, 췌장의 에라스타제는 췌장염에서 작용할 수 있는 또다른 프로테아제이므로 이러한 프로테아제에 대한 억제제는 약리학적으로 중요한 가치가 있게된다.

백혈구 에라스타제와 트립신, 카텝신 G 및 췌장 에라스타제는 세린프로테아제로 알려진 프로테아제의 한 분류로서 구조와 메타니즘의 요소가 일반적이긴 하나 다른 기질에 대한 그들 각각의 활성도와 다른 억제제에 대해 나타내는 감도는 그중 단지 몇개의 아미노산 부위가 다르기 때문인 것으로 믿어진다. 이러한 유사성에 의해 공통되는 요소로 된 구조와 메카니즘을 갖는 세린프로테아제 억제제의 한류를 고안하는 것이 가능하게 되며 상대적으로 몇몇 아미노산에 있어서의 변화가 다른 프로테아제 작용을 억제하며 이 분류의 적어도 하나가 종전의 분류의 모든 세린프로테아제를 억제할 수 있을 것이며, 이러한 세린프로테아제 억제제는 실질적으로 가치가 있을 것이다.

본 발명자들은 놀랍게도 세린프로테아제 억제제를 직접 합성할 수 있는 DNA 씨퀀스와 그 억제제가 귀밑샘 분비로 부터 분리해낸 것과 생물학적으로 같다는 것을 발견하였는데 본 발명에 따른 DNA 재결합 방법으로 제조된 프로테아제 억제제는 2개이상의 활성장소(active site)를 갖고 있는 것으로 여겨지는바, 한 장소는 백혈구 에라스타제에 대한 억제성질을 나타내며 다른 한 장소는 트립신에 대한 억제제활성을 나타낸다.

본 발명에 따라 제조된 재결합억제제는 열과 산에 의한 변성에 상당한 저항성을 나타내며 여러가지 프로테아제에 의한 분해에 저항성이 있는 것으로 여겨진다. 여기서 "재결합 억제제"란 DNA 재결합방법과 기술에 의해 제조되는 프로테아제 억제제를 말한다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따른 재결합억제제의 활성형태는 포유동물에서 세포외에서 일반적으로 접하게 되는 조건에서 열역학적으로 안정되고 재결합프로테아제 억제제의 변성된 형태는 디설파이드결합을 형성하고 있으며 생화학적 자극없이도 활성의 3차구조를 이루는데 필요한 비공유 결합을 형성시킬 수 있다.

본 발명에 따른 DNA 씨퀀스는 알려진 다른 백혈구 에라스타제 억제제의 씨퀀스와 상당히 다른 단백질을 직접 합성할 수 있어서, 본 발명에 따른 DNA 씨퀀스를 확인함으로써 여기서 소개한 신규한 재결합 프로테아제 억제제를 제조하는 DNA 재결합방법의 발명이 가능하게 된다.

이와 같은 재결합방법은 세린프로테아제 억제제의 활성을 가지며 경제적인 약리학적 조성물을 제공하기에 충분한 양과 순도를 갖는 억제제를 제조할 수 있게 할 것이며, DNA 씨퀀스를 확인하여 상기의 세린프로테아제 억제제와 유사한 것을 제조하는 DNA 재결합방법의 발명을 가능하게 만든다.

본 발명의 목적은 세린프로테아제 억제제의 재결합 DNA 합성방법을 제공하는데 있는바, 이 억제제는 세린프로테아제 억제제 활성을 나타내는 하나의 폴리펩타이드 사슬이고, 사람의 귀밑샘 분비로 부터 분리되어지는 천연의 백혈구 에라스타제나 트립신 억제제에 의해 나타내어지는 그 활성과 생물학적으로 같은 활성을 갖게 된다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 세린프로테아제 억제제의 다른 재결합 DNA 합성을 용이하게 하기 위해 같은 천연의 DNA 씨퀀스와 이러한 재결합 프로테아제 억제제를 직접 제조할 수 있는 합성 DNA 씨퀀스를 제공하는데에 있는바, 이러한 천연의 DNA 씨퀀스는 cDNA로부터 분리될 수 있거나 프로테아제 억제제를 직접 합성할 수 있는 유전자를 확인하여 분리될 수 있는 유전자 라이브러리(genomic library)로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 프로테아제 억제제와 유사한 것을 제조하는 재결합 DNA 방법과 그러한 방법에 의해 유용한 대응하는 유사한 DNA 씨퀀스를 제공하는데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적 및 잇점에 대해서는 다음에서 일부 설명되어지며 그 일부는 설명으로 명확해질 것이며 본 발명의 실시예로부터 알 수 있게 될 것이며 청구범위에서 특히 지적하고 있는 수단과 조화에 의해 실현되고 이루어질 수 있다.

본 발명의 목적을 따라 그 목적을 성취하게 위해, DNA 씨퀀스가 DNA 재결합방법에 의해 활성형태면에서 세린프로테아제 억제제 활성을 나타내는 하나의 폴리펩티드 사슬단백질인 프로테아제 억제제를 직접 생성할 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 재결합프로테아제 억제제는 열과 산에 의해 변성이 되지 않으며 키모트립신 같은 프로테아제와 생쥐의 하악골 프로테아제 및 클로트리페인에 노출시켜도 생물학적 활성을 유지한다.

상기 재결합 세린프로테아제 억제제를 직접 제조하는 것으로 알려진 DNA 씨퀀스의 유전정보스트랜드(coding strand)는 다음과 같은바,

상기 약자로 표시된 뉴클레오티드(nucleotide)는 다음에서 설명하겠다.

또한 재결합 세린프로테아제 억제제, 특히 본 발명에 따른 분비선 백혈구 프로테아제 억제제(SLPI)를 직접 제조하는 것으로 알려진 다른 DNA 씨퀀스의 유전정보 스트랜드는 다음과 같다.

본 발명의 목적에 따라 이를 수행하기 위해서는 DNA 재결합방법으로 상기의 천연이나 합성 DNA 시퀀스를 이용하는 인스턴트 세린프로테아제 억제제의 미생물제조가 이루어진다고 알려져 있으며 이러한 DNA 재결합방법은 다음과 같은 같은바,

(1) 숙주미생물이 세린프로테아제 억제제활성, 특히 백혈구 에라스타제 억제활성을 갖는 단백질을 생성할 수 있도록 DNA 씨퀀스를 얻어낸 다음,

(2) 상기 DNA 씨퀀스를 전이시킬 수 있으며 DNA 씨퀀스의 작용요소를 함유하고 있는 보균자(vector)에서 클로닝(cloning)시키고 숙주 미생물안에서 복제시키고,

(3) 상기 DNA 씨퀀스와 작용요소를 함유하고 있는 보균자를 프로테아제 억제단백질을 표현시킬 수 있는 숙주미생물에 전이시킨 후,

(4) 보균자를 확대시키고 억제제를 표현시킬 수 있는 조건하에서 미생물을 배양시키며,

(5) 억제제를 얻어낸 후,

(6) 그 억제제가 활성의 3차구조를 갖도록 하여 세린프로테아제 억제제활성을 갖도록 한다.

본 발명에서 이용되는 천연의 DNA 씨퀀스를 확인하여 분리시키기 위해서, 본 발명자들은 사람의 귀밑샘 조직의 cDNA 라이브러리(library)를 개발하였는데 이 라이브러리는 세포가 본 발명에 따른 세린프로테아제 억제제를 합성할 수 있도록 유전정보를 함유하고 있다.

또한 여기서 설명하고 있는 DNA 재결합방법에서 이용될 수 있는 또 다른 천연의 DNA 씨퀀스는 사람의 유전자 라이브러리로 부터 분리시킬 수 있다.

본 발명의 방법에서 이용될 수 있는 합성 DNA 씨퀀스는 폴리뉴클레오티드 합성과 종래기술인 시퀀싱기술로 제조할 수 있으며 상기 공정에서 이용할 수 있는 천연의 DNA 씨퀀스를 다음과 같은 방법에 의해 확인하여 분리시킬 수 있다.

(1) 세린프로테아제 억제제를 생성할 수 있는 귀밑샘 세포같은 세포로부터 사람의 cDNA 라이브러리를 얻어낸 다음,

(2) 상기의 사람 DNA 라이브러리를 프로테아제 억제제 유전자나 그의 단백질 생성물에 결합할, 수 있는 하나이상의 탐침(probe)으로 찾아내어,

(3) 유전자나 그의 단백질 생성물에 대한 하나이상의 탐침에 결합하는 클론(clone)의 능력에 의해 억제제의 유전자 코딩이 함유되어 있는 하나이상의 클론을 확인한 후,

(4) 확인된 클론으로 부터 억제되어 유전자코딩을 분리시키며,

(5) 숙주미생물내에서 유전자를 유지시키면서 표현하는데 필요한 작용요소에 상기 유전자나 그의 적당한 부분을 연결시킨다.

또한, 상기 방법에서 이용될 수 있는 천연의 DNA 씨퀀스를 다음과 같은 방법에 의해 확인하여 분리시킬 수도 있다.

(1) 사람의 유전자 DNA 라이브러리, 특히 recAredBCE.Coli 숙주에서 번식시킨 것을 얻어낸 다음,

(2) 세린프로테아제 억제제 유전자나 그의 단백질 생성물에 결합할 수 있는 하나이상의 탐침으로 사람의 유전자 DNA 라이브러리를 찾아내어,

(3) 그 유전자나 그의 단백질 생성물에 대한 하나이상의 탐침에 결합하는 클론의 능력에 의해 억제제의 유전자 코딩이 함유되어 있는 하나이상의 클론을 확인한 후,

(4) 확인된 클론으로 부터 억제제의 유전자 코딩을 분리시키며,

(5) 숙주미생물내에서 유전자를 유지시키면서 표현하는데 필요한 작용요소에 작용요소에 상기 유전자나 그의 적당한 부분을 연결시킨다.

더우기, 본 발명의 목적에 따라 이를 수행하기 위해서 약리학적으로 유용한 세린프로테아제 억제제 유사물을 상기 재결합 DNA 방법에 의해 재결합 DNA 기술을 따라 합성 DNA 씨퀀스나 천연분획을 변화시켜 적당한 보균자에게 클론시켜 적당한 숙주미생물로 전이시켰을때 원하는 유사물이 표현될 수 있는 유전자를 만들어냄으로써 제조할 수 있게 된다.

뿐만 아니라 본 발명의 목적에 따라 이를 수행하기 위해서 활성인자로서 본 발명에 따른 재결합 프로테아제 억제제를 함유하는 약리학적 조성물이나 상기 DNA 재결합방법에 의해 얻어지는 그의 생물학적 활성 유사물도 알려져 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명을 정제된 형태로 분리되어지는 프로테아제로서 특히 본 발명에 따른 세린프로테아제 억제제는 사람의 귀밑샘 분비선으로부터 분리되어지는 세린프로테아제 억제제와 실질적으로 상동이며 생물학적으로 대등한 하나의 폴리펩타이드 사슬단백질이다.

이하 "생물학적으로 대등"이란 의미는 조성물이 천연의 프로테아제 억제제와 반드시 같은 정도는 아니지만 같은 유형으로서 단백질 분해에 의해 야기되는 조직손상을 막을 수 있는 것을 말한다. 그리고 "실질적으로 상동"이란 의미는 상기의 하나의 폴리펩타이드사슬 세린프로테아제 억제제 단백질에 의한 천연의 귀밑샘 억제제와 상동인 정도를 말한다. 바람직하기로는 상동의 정도가 40% 이상 내지 좋기로는 50% 이상이며 특히 단백질이 천연의 귀밑샘 억제제와 60%이상 상동인 것이 특히 좋다.

상기 백분율은 두개의 씨퀀스중 더 작은 부분에서 발견되면서 또한 두개의 씨퀀스중 더 큰 부분에서도 발견되어질 수 있는 성분의 비율로서 계산되어지며 그 성분이란 4개의 인접한 아미노산의 한 씨퀀스를 의미한다.

본 발명의 재결합 방법에 따라 제조된 프로테아제 억제제에 대해서는 1984년 12월 6일 출원한 "Serine Protease Inhibitors and Methods for Isolation of same"(미국출원번호 제678,823호, Robert C. Thompson et al.)과 같은날 출원한 "Serine Protease Inhibitors and Moethods for Isolation of same"(미국출원번호 제 호, Robert C. Thompson et al.)에 기술되어져 있는데, 이것은 열과 산에 의한 변성에 대해 상당한 저항성을 나타내며 키모트립신등의 프로테아제와 쥐의 하악골 프로테아제 및 클로스트리페인에 노출시켰을때 일어날 수 있는 불활성에 대한 저항성이 있을뿐만 아니라 필요한 디설파이드 결합을 형성할 수 있으며 생화학적인 자극없이 세린 프로테아제 억제제 활성을 나타낼 수 있는 활성의 3차구조를 이루도록 적당한 비공유결합을 형성할 수 있거나 또는 디설파이드 결합과 비공유결합이 깨질지라도 생화학적인 자극없이 활성의 3차 구조를 얻기 위해 이러한 결합들을 다시 형성시킬 수 있다. 상기와 같은 특징을 갖는 세린 프로테아제 억제제의 씨퀀스는 다음과 같다.

Ser-Gly-Lys-Ser-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-

Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-

Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-

Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-

Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-

Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-

Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-

Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-

Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Glu-Lus-

Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala.

상기 폴리 펩타이드에서 아미노산 부위에 사용된 약어는 다음과 같다,

이상과 같은 DNA 재결합 방법에 의해 제조된 프로테아제 억제제는 하나 이상의 독특한 영영을 갖고 있는 것이 밝혀져 있는바, 이는 그 단백질이 다른 효소에 대해 작용을 하는 여러개의 활성장소(active site)를 갖고 있다는 것을 의미하며 이러한 장소의 존재와 위치는 프로테아제 억제제의 적어도 두개 이상의 위치사이에 실질적으로 상동인 것을 밝혀냄으로써 결정되어지고 독특한 영역은 백혈구 에라스타제와 트립신 둘다를 포함한 광범위한 세린 프로테아제를 억제할 수 있는 능력의 인스턴트 프로테아제 억제제에 존재하는 것으로 믿어진다.

또한, 이와같은 프로테아제 억제제의 여러개의 독특한 영역때문에 프로테아제 억제제는 다양한 다른 활성 장소가 또다른 성질을 띠는 프로테아제 억제제를 형성하도록 하는 형태로서 제공될 수도 있음이 주지되어 왔다.

본 발명에서는 백혈구 에라스타제, 카텝신 C, 췌장의 에라스타제 및 트립신을 억제하는 프로테아제 억제제를 제조하는것도 포함하고 있는데 이와같은 효소는 하나의 공통된 메카니즘과 다양한 구조적인 면을 같이하는 일종의 프로테아제 구성원으로서, 본 발명에 의해 제조되는 프로테아제 억제제상의 몇개의 아미노산 측쇄를 조작하므로서 다양한 억제제가 얻어지게 되며 그 각각은 전(全) 세린 프로테아제의 하나 이상을 억제할 수 있을 뿐만아니라, 이와같은 측쇄변형으로 상기와 같은 세린 프로테아제류의 특정 구성원에 대해 억제제 특성이 증진된 다수의 억제제도 생성시킬 수 있는 것으로 기대되어진다.

이와같은 목적을 달성하기 위해 필요한 아미노산 측쇄변형은 본 발명에 따라 형성된 원하는 억제제와 그 중요부위가 X-선 결정학으로 명확히 드러나 있는 다른 세린 프로테아제 억제제와의 사이에서 구조적인 유사성을 갖는 부분에 의해 설명되어지는데 이와 같은 구조적인 유사성을 갖는 부분은 상기의 본 발명에 따른 원하는 프로테아제 억제제의 아미노산 17-29와 아미노산 70-83이며 트립신형의 세린 프로테아제에 대한 억제제의 활성을 양 또는 질적인 면에서 증진시키는 변형에의 아미노산 20의 Arg을 Lys으로, 아미노산 72나 74의 Leu을 Lys이나 Arg으로, 아미노산 73의 Met을 Lys이나 Arg으로 바꾸는 것이 있다.

또한 카텝신 G 같은 키모트립신형 세린 프로테아제에 대한 억제제의 활성을 양 또는 질적인 면에서 증진시키는 변형에는 아미노산 20의 Arg을 Phe, Tyr 또는 Trp으로, 아미노산 72나 74의 Leu을 Phe, Tyr 또는 Trp으로 아미노산 73의 Met을 Phe, Tyr 또는 Trp으로 바꾸는 것이 있고 췌장의 에라스타제형 세린프로테아제에 대한 억제제의 활성을 양 또는 질적인 면에서 증진시키는 변형에는 아미노산 20의 Arg을 Ala으로, 아미노산 72나 74의 Leu을 Ala으로, 아미노산 73의 Met을 Ala으로 바꾸는 것이 있다.

본 발명의 단백질에 신규한 프로테아제 억제특성을 주는 아미노산 씨퀀스에 있어서의 변화는 백혈구 에라스타제나 프립신에 대한 억제제의 활성을 방해할 수도 있다는 것을 본 발명을 실시함에 있어서 유의해야 하는바, 이러한 영향은 본 발명의 기술을 여러차례 실험함으로써 결정할 수 있을 것이다.

또한, 상기와 같이 각각의 아미노산이나 각각의 아미노산 씨퀀스를 치환하게 되면 백혈구 에라스타제 억제특성이나 약간 불활성화된 본 발명에 따른 프로테아제 억제제의 트립신 억제 특성이 증진될 수 있다고 여겨지는바, 억제제 단백질 내의 어떤 부위에서 그 활성이 적당한 아미노산의 치환에 의해 전부 제거되어 그 단백질이 정상적인 활성을 나타낸 하나이상의 효소에 대해 독특한 억제 단백질을 제조할 수도 있게 되어, 예를들면 20위치에서 Gly이 Arg으로 치환되면 트립신 억제제 작용부위가 불활성화되고 73위치에서 Gly이 Met으로 치환되거나 72나 74위치에서 Gly이 Leu으로 치환되면 백혈구 에라스타제 억제제 작용부위가 불활성화되게 된다. 또한, 그 작용부위들은 각각의 단백질로 분리될 수도 있으며 그 각각은 원하는 억제제 기능을 유지하고 있으므로 본 발명의 첨구범위에서는 확대시키고 있다.

본 발명자들은 상기 단백질 억제제를 직접 세포내에서 생성시킬 수 있는 합성 DNA 씨퀀스를 밝혀낸 바, 이 씨퀀스는 다음과 같고,

상기 뉴클레오티드는 다음과 같은 약자로 표시되어져 있다.

또한, 본 발명자들은 상기 단백질 억제제, 그중에서도 특히 상기 분비선 백혈구 단백질억제제(SLPI)를 직접 세포외에서 생성시킬 수 있는 두번째 합성 DNA 씨퀀스를 밝혀낸바, 이 씨퀀스는 다음과 같다.

이상과 같은 인스턴트 프로테아제 억제제에 있어서, 여러개의 작용부위의 구조때문에 상기와 같이 세린프로테아제 억제제를 직접 제조할 수 있는 DNA 씨퀀스를 얻게되는, 여기서 명시한 합성 DNA 씨퀀스에 있어서의 여러가지 변형이 고려되어지는데 특히, 본 발명에 따른 DNA 재결합 기술에 의해 제조되는 세린프로테아제 억제제의 유사물의 아미노산 씨퀀스는 다음과 같은 것들이 바람직하고,

R₁-Gly-Lys-Ser-Phe-Lye-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-

Pro-Lys-Lys-Ser-Ala-Gln-Cys-Leu-R₂-Tyr-Lys-

Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-

Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-

Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-

Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-

Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-R₈-R₃-R₉-Asn-Pro-Pro-

Asn-Phe-Cys-Glu-R₄-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-

Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-R₅-Gly-R₆-Cys-Gly-Lys-

Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-R₇,

이때 R₁과 R₇는 같거나 다르며, 치환되거나 비치환된 아미노산 부위 또는 그들의 유도체중에서 선택되며, R₂, R3_,R₄, R₅, R₆, R₈및 R₉은 같거나 다르며, Met, Val, Ala, Phe, Tyr, Trp, Lys, Gly 및 Arg중에서 선택된다.

상기 DNA 씨퀀스는 본 발명에서 바람직한 것이라는 점을 유의해야 하고, 유전자 코드의 변형으로 인스턴트 프로테아제 억제제나 그의 유사물을 직접 생성시킬 수 있는 DNA 씨퀀스를 얻기 위해 뉴클레오티드를 다양하게 선택할 수 있다고 여겨지며, 상기와 같은 씨퀀스와 기능적으로 대등하거나 또는 상기 아미노산 씨퀀스에 따라 제조된 프로테아제 억제제의 유사물을 직접 생산할 수 있는 씨퀀스와 기능적으로 대등한 DNA 씨퀀스도 본 발명의 범위내에 포함되어 있다. 변형된 유전자 코드로 여겨지는 코드 치환의 예로써 본 발명의 범위내에 상기의 바람직한 아미노산 씨퀀스를 제조하는 방법을 포함하려 하는 또다른 DNA 씨퀀스 도해를 나타내면 다음과 같고 이 단백질을 제조하기 위한 등가의 DNA 씨퀀스를 결정하기 위한 예를 따름으로써 통상의 지식을 가진 자가 바람직한 아미노산 씨퀀스의 유사물을 제조하기 위한 등가의 DNA 씨퀀스를 결정할 수 있게 될 것이며,

상기 씨퀀스에서 사용된 약자는 다음의 뉴클레오티드를 나타내다.

상기의 것들은 포함한 본 발명에 따른 합성 DNA 씨퀀스에 이용되는 코돈(codon)을 선택할 때 특정 아미노산을 표현하는 코돈은 고도로 표현된 단백질과 결합되어진 것이 좋고 이와같은 코돈의 예는 "Codon Catalog Usage Is a Genome Strategy Modulated For Gene Expressivity"(Nucleic Acids Research 9:r43(1981), Grantham, R. et al.)에 일부 나와 있고 본 발명의 DNA 씨퀀스는 어떠한 변형된 씨퀀스에 대해서는 Escherichia coli 씨퀀스 고돈을 선택하는 것이 좋다.

또한 본 발명의 프로테아제 억제제의 유사물을 직접 생성할 수 있는 또다른 합성 DNA 씨퀀스를 변화시키기 쉬운 코돈을 선택하는 것이 좋은데, 특히 또다른 코돈을 삽입시킬 수 있는 합성 DNA 씨퀀스의 부분이나 그 부위 또는 유사물이 얻어질 수 있도록 코돈을 치환시킬 수 있는 위치에서, 가능하다면 제한 헥산중간분해효소(restriction endo-nu-clease)위치를 만드는 뉴클레오티드 씨퀀스를 선태갛는 것이 좋다.

본 발명의 DNA 씨퀀스에서 제한위치는 상기 뉴클레오티드 시퀀스 밑에 표시되어 있다.

여기서 다루고 있는 합성 DNA 씨퀀스를 제조하는 방법은 일반적으로 통상의 지식을 가진자에 의해 반복해서 실험된 범위내로 드는 것으로서 상기의 합성 DNA 씨퀀스를 얻는데 이용될 수 있는 적당한 방법은 J. Am. Chem. Soc. 103:3185(1981)(Matteacci, M. D. and Caruthers, M. H.)와 Tetrahedron Lett. 22:1859(1981)(Beaucage, S.L. and Caruthers, M.H.)에 설명되어 있다.

또한, 본 발명에서는 본 발명의 얻고자 하는 분비선 백혈구 단백질 분해 억제제(SLPI)를 이루는 사람의 유전자 라이브러리로 부터 DNA 씨퀀스를 분리시키는데 이 씨퀀스는 인트론(Intron)이 포함되어 있으며 4번째 코돈으로부터 코드화되는 것으로서 다음과 같고,

이 씨퀀스에서 아미노산부위에 사용된 약자는 Biochemistry(A.L. Lehninger, 2nd ed., worth Publishers, Inc., New York, New York(1976). pg(72)등에서 흔히 볼 수 있는 한글자로된 약자이다.

상기와 같은 씨퀀스와 아미노산 씨퀀스 데이타를 이용하여, 상기 유전자 씨퀀스에 부가될때 전(全) 단백질 분해 억제제를 코드하는 유전자로 되는 합성 DNA 씨퀀스르 ㄹ얻을 수 있게 될 뿐만 아니라 상기 DNA 씨퀀스를 이용하여 탐침을 만들수도 있고 첫번째의 3개의 아미노산을 코드한 사람의 유저자 라이브러리로 부터 DNA 분획을 재생하기 위해 탐침을사용할 수도 있게 된다.

또한 이러한 탐침은 적당한 리더씨퀀스(leader sequence)가 들어있는 사람의 유전자 씨퀀스를 확인하기 위해서도 사용할 수 있는 바 이러한 리더씨퀀스 또는 적당한 어떠한 다른 리더씨퀀스를 포유동물의 표현계(expression system)에서 유전자 DNA 시퀀스와 함께 이용할 수 있다.

뿐만아니라 본 발명에서는 본 발명에 따른 바람직한 분비선 백혈구 단백질 분해억제제를 세포내에서 직접 생성할 수 있는 DNA 씨퀀스를 코드화 시키는 귀밑샘 라이브러리로부터 cDNA를 분리시켰는데 이 클론은 American Type Culture collection(Rockville, Maryland)기탁 장소에 있다.

세린 프로테아제 억제제 활성을 갖는 하나이상의 활성장소가 있는 하나의 폴리펩타이드 사슬로된 프로테아제 억제제를 제조하기 위한 DNA 재결합 방법에 대해서도 알려져 있는바, 본 발명에서는 사람의 귀밑샘 분비선으로 부터 분리한 천연의 백혈구에 라스타제 억제제의 것과 생물학적으로 대등하게 활성장소가 기능을 하며, 천연이나 합성DNA 씨퀀스는 프로테아제 억제제를 직접 형성시키기 위해 사용될 수 있는바 그 방법은 다음과 같다,

(1) 숙주미생물이 세린프로테아제 억제제활성을 갖는 단백질을 형성할 수 있도록 DNA 씨퀀스를 얻어낸 다음,

(2) 상기 DNA 씨퀀스를 전이시켜 숙주미생물안에서 복제시킬 수 있는 보균자에 클로닝하는데 이때 보균자는 DNA 씨퀀스의 작용요소를 함유하고 있으며,

(3) 합성 DNA 씨퀀스와 작용요소를 함유하고 있는 보균자를 프로테아제 억제제를 표현할 수 있는 숙주 미생물로 전이시킨후,

(4) 보균자를 확대시키고 억제제를 표현시킬 수 있는 조건하에서 미생물을 배양시키며,

(5) 억제제를 얻어내어,

(6) 억제제가 활성의 3차구조를 갖도록 하여 세린프로테아제 억제제 활성을 갖도록 한다,

상기 방법에 이용한 합성 DNA 씨퀀스는 상기에서 논의되었으며 천연 DNA 씨퀀스가 본 방법에서도 사용될 수 있는 것으로 여겨지는데 이와같은 씨퀀스에는 cDNA나 유전자 DNA 분획이 있으며 천연의 DNA 씨퀀스가 다음의 방법에 의해 얻어질 수 있다.

(1) 세린프로테아제 억제제를 생성할 수 있는 귀밑샘세포같은 세포로부터 사람의 cDNA 라이브러리를 얻어낸 다음,

(2) 상기의 사람 DNA 라이브러리를 프로테아제 억제제 유전자나 그의 단백질 생성물에 결합할 수 있는 하나이상의 탐침으로 찾아내어,

(3) 유전자나 그의 단백질 생성물에 대한 하나이상의 탐침에 결합하는 클론의 능력에 의해 억제제의 유전자 코팅을 함유하는 하나이상의 클론을 확인한 후,

(4) 확인된 클론으로부터 억제제의 유전자 코팅을 분리시키며,

(5) 숙주미생물내에서 유전자를 유지시키면서 표현하는데 필요한 작용요소에 상기 유전자나 그의 적당한 부분을 연결시킨다.

또한 상기 방법에서 이용될 수 있는 천연의 DNA 씨퀀스를 다음과 같은 방법에 의해 확인하여 분리시킬 수도 있다.

(1) 사람의 유전자 DNA 라이브러리, 특히 recArecBC E. coli 숙주에서 번식시킨 것을 얻어낸 다음

(2) 세린단백질 억제제 유전자나 그의 단백질 생성물에 결합할 수 있는 하나이상의 탐침으로 사람의 유전자 DNA 라이브러리를 찾아내어,

(3) 그 유전자나 그의 단백질 생성물에 대한 하나이상의 탐침에 결합하는 30클론의 능력에 의해 억제제의 유전자 코딩을 함유하는 하나이상의 클론을 확인한 후,

(4) 확인된 클론으로부터 억제제의 유전자 코딩을 분리시키며,

(5) 숙주미생물로부터 유전자를 유리시키면서 표현하는데 필요한 작용요소에 상기 유전자나 그의 적당한 부분을 연결시킨다.

상기 방법에 사용하기에 적당한 천연의 DNA 씨퀀스를 분리시키는데, 적당한 유전자나 유전자의 분획의 끝부분내에 또는 그 부위에 두개의 제한장소가 있다는 것을 확인한 다음, 적당한 유전자가 포함되어 있는 DNA 분획을 적당한 제한 핵산중간분해효소를 이용하는 유전자 물질 잔유물로부터 제거시켜 잘라낸 다음, 세린프로테아제 억제제 단백질의 N-과 C-말단을 코딩할 수 있고, DNA 씨퀀스를 그의 작용요소와 융합시킬 수 있는 적당한 DNA 씨퀀스를 제공하기 위해 DNA 씨퀀스의 3'와 5' 말단을 재구성시킨다.

본 발명에서 이용된 보균자로는 상기 DNA 씨퀀스가 어떤 바람직한 또는 필요한 작용요소와 함께 삽입될 수 있는 것이면 되고 그 다음에 실질적으로 그 보균자가 숙주 미생물에 전이되어 그 안에서 복제될 수 있으면 되는바, 제한장소가 잘 제공되어 있으며 DNA 씨퀀스의 전사(Transcription)에 필요하거나 좋은 작용요소를 함유한 것이면 좋다. 여기서 "작용요소"란 하나이상의 촉진제, 하나이상의 작용제, 하나이상의 리더씨퀀스, 하나이상의 shine-Dalagrno 씨퀀스, 하나이상의 터미네이터 코돈 및 전사 및 보균자 DNA의 해독(translation)에 좋거나 필요한 어떠한 다른 DNA 씨퀀스를 포함한다. 특히 이러한 보균자는 합성 DNA씨퀀스의 전사를 시작할 수 있는 적어도 하나의 뽑아낼 수 있는 마커(marker)와 하나이상의 촉진제 시퀀스와 함께 숙주미생물에 의해 인식되어지는 적어도 하나의 복제 근원을 갖고 있는 것으로 여겨지며, 조절자로서 작용할 수 있는 어떠한 DNA 씨퀀스와 조절자 단백질을 코딩할 수 있는 다른 DNA 씨퀀스를 갖고 있는 것이면 좋은바 이러한 조절자는 어떠한 환경조건하에서는 합성 DNA 씨퀀스의 표현을 억제시키며, 다른 환경조건에서는 합성 DNA 씨퀀스에 의해 코드화 된 단백질을 전사한 후 표현하게 하는 것으로서 예를들어 이소프로필티오- -d-갈락토시드 같은 것이 없을때 합성 DNA의 표현이 일어나지 않도록 보균자로 조절자분획이 삽입되는 것이 좋고 이때, 합성 DNA를 함유한 변형된 미생물은 프로테아제 억제제의 표현을 시작하기에 앞서서 원하는 밀도로 자랄 수 있게 된다. 여기서, 원하는 단백질 분해요소 억제제의 표현은 원하는 밀도가 된 후에 DNA 씨퀀스의 표현을 일으킬 수 있는 미생물환경에 물질을 첨가시킴으로서 일어나게 된다.

또한, 적당한 분비선 리더씨퀀스가 보균자내에나 합성 DNA 씨퀀스의 5-말단에 존재하는 것이 좋은데 리더씨퀀스는 어떠한 중간의 해독종료신호없이 프로테아제 억제제를 직접 표현할 수 있는 뉴클레오티드 씨퀀스의 존재는 다음과 같은 이유 때문에 필요하게 되는 바,

(1) 리더씨퀀스의 존재로 초기생성물의 숙주진행과정이 재결합 프로테아제 억제제를 용이하게 성숙시키도록 하고,

(2) 리더씨퀀스의 존재로 프로테아제 억제제를 세포질 밖으로 향하게 함으로써 재결합 프로테아제 억제제의 정제가 용이하게 되며,

(3) 리더씨퀀스의 존재로 프로테아제 억제제를 세포질 밖으로 향하게 함으로써 재결합 프로테아제 억제제가 그 활성구조로 되도록 할 수 있도록 영향을 줄 수 있게 된다. 특히, 리더씨퀀스는 리더펩티다제에 의해 초기 해독 생성물을 잘라낼 수 있도록 하여 리더씨퀀스를 제거하고 잠재하는 세린프로테아제 억제제활성을 갖는 바람직한 아미노산 씨퀀스로 된 폴리펩타이드를 이루게 된다. 몇 종류의 미생물에서 적당한 리더씨퀀스의 존재로 완전한 단백질이 E. coli 경우에서와 같이 주변원형질의 공간으로 들어가도록 할것이며 어떤 효모나 Bacilli 및 Psendomonas종의 경우에서는 적당한 리더씨퀀스가 세포막을 따라 세포의 매체로 단백질을 전달하도록 할 것이며 이때 단백질은 세포의 단백질로부터 정제될 수 있다.

그리고 본 발명에 따른 몇몇 프로테아제 억제제의 경우에는 리더씨퀀스의 존재가 그 활성구조로 되도록 하는 환경에 완성된 단백질이 위치하도록 하는 데 필요하며 그 활성구조는 적당한 에라스타제-억제제 활성을 갖는 것이다.

제한되어 있지는 않으나 또다른 작용요소에는 리보솜 결합장소와 다른 단백질의 미생물 표현에 필요한 다른 DNA 씨퀀스가 있는바, 본 발명에서는 GAGGCGCAAAAA(ATG) 씨퀀스가 리보솜 결합장소로 이용되며, 이외에 통상의 지식을 가진자가 종래 문헌 및 기술을 통해 선택할 수 있어서 이러한 작용요소의 예로써는 Genes(B. Lewin, Wiley & Sons, New York(1983)에 기재되어 있고 참고로 여기서 독특하게 조합시키고 있으며, 보균자는 플라스미드_PBR322나_PIQ 부위로부터 일부 형성시킬 수 있다.

본 발명에서 또 다른 DNA 씨퀀스는 단백질 분해효소 억제제를 코드하는 합성 DNA 씨퀀스 바로 앞에 위치하며 해독결합기(translational coupler)로서 작용하는데 즉, 이는 연속되는 단백질 분해효소 억제제 RNA의 리보솜 결합장소 바로옆에 리보솜이 위치하도록한 RNA를 코드화 시키는 DNA 씨퀀스를 말한다. 본 발명에서 해독결합기는 TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAG CTATCGCGATCGGAGTGTAAGAATG DNA 씨퀀스를 이용하여 이 분야에서 통상의 지식을 가진자에게 흔히 알려진 방법에 의해 유도될 수 있으며,

TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAAATG DNA 씨퀀스가 좋다.

상기 보균자의 모두 필요한 성분을 합성하고 분리할때 이분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 널리 알려진 방법에 의해 보균자를 수집할 수 있고 이것은 통상의 지식을 가진자에 의해 수행되는 실험내에 포함되어 있는 것으로 대단한 실험없이도 가능한 것으로 여겨지는바, 예를들어 유사한 DNA 씨퀀스를 Proceeding of the National Academy of Science(Schoner et al., U.S.A., 81 ; 5403-5407(1984))에서와 같은 적당한 클로닝 보균자에 묶는 것이다.

본 발명에 따른 클로닝보균자를 만들때 합성 DNA 씨퀀스의 다수복제와 그의 부수되는 작용요소를 각 보균자에 삽입시킬 수 있음을 유의해야 하는데, 숙주생물은 얻고자하는 프로테아제 억제제의 보균자당 더 많은 양을 생성한 것이며 보균자로 삽입될 수 있는 DNA 씨퀀스의 다수복제의 수는 그 크기 때문에 적당한 숙주미생물내로 전이되어 복제되고 전사되는 보균자의 능력에 의해서만 제한을 받게 된다.

또한, 보균자는 약물저항마커나 숙주미생물에 의해 선택할 수 있는 특성을 표현하도록 하는 다른 마커와 같은 선택할 수 있는 마커를 포함하고 있고 특히, 테트라싸이클린 저항 유전자가 클로닝보균자에 포함되어 있는 것이 좋다.

이러한 약물저항이나 다른 선택할 수 있는 마커는 변환자(transformants)를 선택하는데 용이하게 하고 클로닝보균자상에 이러한 선택할 수 있는 마커가 존재하면 미생물이 배양매체내에서 번식하여 오염되지 않도록 하여 변환된 숙주미생물의 정제된 배양은 미생물을 유도된 표현형에 필요한 조건하에서 배양함으로써 얻어진게 된다.

이와 같이 하여 얻어진 보균자를 적절한 숙주미생물에 전이시키는데 외인성 DNA를 취해 그 유전자와 부수되는 작용요소를 표현할 수 있는 어떠한 미생물을 선택하여도 좋은 것으로 여겨지며, 숙주미생물은 산소나 무산소 생성물인 것이좋고, 이방법에서 사용될 수 있는 숙주에는 효모와 박테리아가 좋으며, Saccharomyces류, 특히 Saccharomyces cerevisiae 같은 효모와 Bacillus, Escherichia 및 Pseudomonas류, 특히 Bacillus Subtilis 및 Escherichia coli 같은 박테리아가 있다.

숙주생물을 선택한 후에는 통상의 방법으로 숙주생물내로 보균자를 전이시키는데 Advanced Bacterial Genetics(R.W. Davis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1980))에서 그 예를 찾아볼 수 있으며 온도조절이 상기 작용요소의 이용에 따라 유전자 표현을 조절하는 수단으로서 여겨지는 바와같이 변환은 낮은 온도에서 일어나는 것이 좋고, 삼투압 조절자를 보균자에 삽입시키면 변환이 되는 동안 염의 농도의 조절이 합성유전자의 적당한 조절이 가능하도록 하기 위해 필요하게 될 것이다.

재결합 세린프로테아제 억제제가 효모내에서 결국 표현된다고 가정한다면, 일단 클로닝보균자를 Escherichia coli에 전이시켜 보균자가 복제되도록하여 이로부터 보균자를 얻어내고 번식시킨다음 정제시킨다. 그 다음에 그 보균자를 효모에 전이시켜 세린프로테아제 억제제를 표현시킨다. 세린프로테아제 억제제의 표현에 적절한 조건하에서 숙주미생물을 배양시키는바 이러한 조건은 일반적으로 숙주생물에 따라 독특하며 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology(8th Ed., Williams & Wilkins Company. Baltimore, Maryland)와 같은 문헌에 의해 쉽게 결정되어진다.

삽입되거나 보균자에 들어있는 어떠한 작용요소에 따라 DNA 시퀀스를 표현하는데 있어서의 조절에 필요한 조건은 변환과 배양단계에 영향을 줄 것이며 세포는 DNA 씨퀀스의 표현을 방해하는 적당한 조절조건에서 고밀도로 자라게 되며 적정밀도에 다다를때 합성 DNA 씨퀀스의 표현에 적당한 것으로 환경조건을 바꾸어서 단백질 분해효소 억제제의 제조가 최적밀도까지 숙주세포의 성장을 일으킬 시간내에 이루어져 결과적으로 생긴 프로테아제 억제제가 그 표현에 필요한 조절조건이 유도된 후 얼마후에 얻어지게 된다.

본 발명에서, 재결합 프로테아제 억제제를 얻어낸 다음 그 활성구조를 가정하기전에 정제시키고 그 단백질이 일단 정제되어 있다면 다시 구성된 단백질을 고수득률로 회수하는 것이 용이 한것으로 여겨지나 프로테아제 억제제가 정제되기전에 그의 활성구조임을 인정하도록 재구성되어질 수도 있다. 한편, 배양매체로부터 회수될때 다시구성되어진 활성상태로 존재하는 프로테아제 억제제도 좋다. 또, 어떤 경우에는 프로테아제 억제제가 숙주미생물내에서 표현될때 그의 적당한 활성구조를 취하고 세포벽이나 세포막을 따라 또는 주변 원형질 공간으로 그 단백질을 전달하게 되며 이것은 적당한 리더씨퀀스의 DNA 코딩이 재결합 단백질의 DNA 코딩과 연결된다면 일반적으로 일어나게 된다. 만약에 프로테아제 억제제가 그의 적당한 활성구조를 취하지 못한다면 프로테아제 억제제가 그의 활성구조를 취하고 조절조건하에서 구아니다늄 클로라이드와 메르캡토에탄올 같은 환원제의 희석 및 산화가 있도록 하기 전에 형성된 어떠한 디설파이드 결합이나 일어나게될 비공유 결합이 이와같은 변성 및 환원제에 의해 우선 깨지게 된다.

이하 본 발명을 실시예의 의거 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

상기 아미노산 씨퀀스와 Escherichia coli의 고도로 표현된 유전자에서 코돈의 이용 및 편리한 제한 핵산 중간 분해 효소 절단장소의 영역에 근거하여 다음과 같은 DNA 씨퀀스가 제안되었다.

E. coli의 주변원형질로 내보낼 수 있는 형태로 단백질의 표현을 조절하기 위해 다음과 같은 조절요소가 제안되어진 바, 고도의 전사개시를 위한 tac 촉진제, 전사조절을 위한 lac 작용제, 플라스미드상의 어느곳에서든 코드화 되도록 하는 lac 억제인자(lac I^q), 고도의 해독개시를 위한 OmpA Shine-Dalgarno 씨퀀스, 생성물의 주변원형질로의 방출을 용이하게 하는 OmpA 리더 및 완전한 백혈구 에라스타제 억제제를 형성하기 위해 초기 생성물을 절단시키는 상기 작용 요소들에 의해 코드화된 단백질 씨퀀스와 상기 구조적 유전자에 의해 코드화된 단백질 씨퀀스와의 사이의 Ala-Ser 연결중 Ala이 있고 이 모두는 다음과 같은 DNA 씨퀀스에 통합되어진다.

단백질이 E.coli 세포질내에 남아 있는 형태로 단백질의 표현을 조절하기 위해서는 다음과 같은 작용 요소가 제안되어지는바, tac 촉진제, lac 작용제, llac 억제인자(lac I), Shine-Dalgarno 씨퀀스의 일치 및 고독의 해독을 개시하기 위해 해독 결합기로서 이용될 OmpA 리더 펩타이드 분획이 해독 결합기 씨퀀스는 OmpA 유전자의 해독 초기 부위의 DNA 코딩, OmpA 리더 펩타이드의 초기 8개 아미노산, 상기의 일치되는 Shine-Dalgarno 씨퀀스 및 해독 말단 인자로 되어 있고 세린프로테아제 억제제 유전자의 해독 개시 장소와 촉진제 사이에 삽입되어 해독 개시 장소와 중복되게 되며 이 모두는 다음과 같은 DNA 씨퀀스에 통합 되어진다.

(1) 유전자 분획의 제조

상기 씨퀀스를 얻어내기 위해 ABI DNA 합성기(Foster City, California)를 이용하여 다음의 데옥시 리보뉴클레오티드를 합성하고, 그 생성물은 ABI instrumental manual에 기재된 대로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제시킨 다음 표준방법을 이용하여 T4 폴리뉴클레오티드 키나제와 ATP를 사용하여 5'를 인산화시키면 올리고뉴클레오티드 씨퀀스의 다음과 같은 그룹이 Aa 분획을 얻기 위해 사용되어진다.

올리고뉴클레오티드 Aa 1는

GCTGT TGACA ATTAA TCAT이며,

올리고뉴클레오티드 Aa 2는

CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T

올리고뉴클레오티드 Aa 3는

CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA.

올리고뉴클레오티드 Aa 4는

ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG.

올리고뉴클레오티드 Aa 5는

CAGTG GCACT GGCTG GTTTC GCTAC CGTAC CGCAG GCCAG CGGTA AA.

올리고뉴클레오티드 Aa 6는

GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA.

올리고뉴클레오티드 Aa 7는

TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C.

올리고뉴클레오티드 Aa 8는

CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA.

올리고뉴클레오티드 Aa 9는

GCCAC TGCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG.

올리고뉴클레오티드 Aa 10는

AGCTT TTACC GCTGG CCTGC GCTAC GGTAG CGAAA CCAGC CAGT이다.

또한 다음의 올리고뉴클레오티드 씨퀀스가 Ab 분획을 얻기위해 조합되어진다.

뉴클레오티드 Ab 1는

GCTGT TGACA ATTAA TCAT.

뉴클레오티드 Ab 2는

CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATAA CAATT T.

뉴클레오티드 Ab 3는

CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA.

뉴클레오티드 Ab 4는

ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG.

뉴클레오티드 Ab 5는

GAGTG TAAGA AATGA GAGGT AAA.

뉴클레오티드 Ab 6는

GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA.

뉴클레오티드 Ab 7는

TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C.

뉴클레오티드 Ab 8는

CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA.

뉴클레오티드 Ab 9는

AGCTT TTACC GCTCA TTTCT TACAC TCCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG.

그리고 B분획을 얻기위해 조합되어진 올리고뉴클레오티드 씨퀀스는 다음과 같다.

올리고뉴클레오티드 B 1는

AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG.

올리고뉴클레오티드 B 2는

CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG.

올리고뉴클레오티드 B 3는

TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C.

올리고뉴클레오티드 B 4는

CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TA.

올리고뉴클레오티드 B 5는

GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TTTTT TACCCGGGCA.

올리고뉴클레오티드 B 6는

CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT GTACC G.

올리고뉴클레오티드 B 7는

CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TTGA.

또한 C분획을 얻기위해 사용되어진 올리고뉴클레오티드 씨퀀스는 다음과 같다.

올리고뉴클레오티드 C 1는

GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG.

올리고뉴클레오티드 C 2는

ACTCG TCGAA AA.

올리고뉴클레오티드 C 3는

CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC.

올리고뉴클레오티드 C 4는

CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC.

올리고뉴클레오티드 C 5는

TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT.

올리고뉴클레오티드 C 6는

CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT.

올리고뉴클레오티드 C 7는

CGGCG GGTC ACGAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA GGTTA CCGGG CA.

올리고뉴클레오티드 C 8는

TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT.

올리고뉴클레오티드 C 9는

CGGGG TATCA ACCG.

뿐만아니라 D분획을 얻기위해 다음과 같은 올리고뉴클레오티드 씨퀀스가 조합되어진다.

올리고뉴클레오티드 D 1는

GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC.

올리고뉴클레오티드 D 2는

AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G.

올리고뉴클레오티드 D 3는

TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A.

올리고뉴클레오티드 D 4는

CATAC CCATA CAGCA TTTCA.

올리고뉴클레오티드 그룹을 표준 상태하에서 혼합하여 어닐(anneal)시키고 서로 표준 상태에서 T4 DNA 리카아제를 이용한 적당한 제한 핵산 중간 분해 효소로 자른 보균자 M13 mp18과 19를 클로닝하고 시퀀싱하도록 묶는다.

그 생성물을 E. coli JM105 변환시키기 위해 사용하고 그 DNA를 함유하는 클론을 IPTG-Xgal판안의 백색 배지로부터 취해 어닐링 단계에서 사용된 그룹에서 취한 32P-라벨된 올리고뉴클레오티드로 교배시켜 좀더 선택한다. 삽입물의 구조는 일반적인 시발체(Primer)를 사용하여서된 DNA의 디데옥시 시퀀싱에 의해 확인된다.

그룹 Aa는 Pst1과 HindIII로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶여진 올리고뉴클레오티드 Aa1-Aa10을 포함하고 있고 그룹 Ab는 Pst1과 HindIII로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶여진 올리고뉴클레오티드 Aa1-Ab9을 포함하고 있으며 그룹 B는 HindIII와 BamH I로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶여진 올리고뉴클레오티드 B1-B7을 포함하며 그룹 C는 BamH I과 Xba I으로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶여진 올리고뉴클레오티드 C1-C9을, 그룹 D는 BamH I과 Sal I으로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶여진 올리고뉴클레오티드 D1-D4를 포함하고 있다.

M13 복제형 DNA를 표준방법에 따라 원하는 삽입 DNA를 포함하고 있는 클론으로부터 회수하는데 그룹 Aa에 대응하는 삽입 DNA는 DNA를 적당한 제한 핵산 중간 분해 효소로 잘라냄으로써 M13 DNA로부터 분리되고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제되게 되며 그 구조는 다음과 같다.

그룹 Ab에 대응하는 삽입 DNA는 DNA를 제한 핵산 중간 분해 효소인 EcoR I 및 HindIII로 잘라냄으로써 분리되고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제되며 그 구조는 다음과 같다.

그룹 B에 대응하는 삽입 DNA는 DNA를 제한 핵산 중간 분해 효소인 HindIII와 BamH I으로 잘라내어 분리시키고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 정제시키면 그 구조는 다음과 같다.

그룹 C에 대응하는 삽입 DNA는 DNA를 제한 핵산 중간 분해 효소인 BamH I과 Bgl II으로 잘라내어 분리시키고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 정제시키면 그 구조는 다음과 같다.

그룹 D에 대응하는 삽입 DNA를 제한 핵산 중간 분해 효소인 sauIIIA와 Sal I으로 잘라내어 분리시키고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 정제시키면 그 구조는 다음과 같다.

(2) 유전자의 제조

방출하도록 제조하기위해, 그룹 Aa, B, C 및 D로부터의 삽입물을 혼합하여 표준상태에서 T4 및 DNA 리가제를 사용한 EcoR I 및 Sal I으로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶는다.

유전자를 포함하는 클론을 Xgal 판상에서 그 색깔에 의해 선택하고³²P라벨된 올리고뉴클레오티드와 교배시켜 좀더 선택하여 이렇게 선택된 클론의 구조를 일반적인 시발체를 이용한 DNA의 삽입부위의 디데옥시 시퀀싱에 의해 확인한다. 세포질 표현을 위한 제조에서는 그룹 Ab,B,C 및 D로부터의 삽입물을 혼합하여 표준상태에서 T4 DNA 리가제를 사용한 EcoR I 과 Sal I으로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶는다.

유전자를 포함하는 클론을 Xgal 판상에서 그 색깔에 의해 선택하고³²P라벨된 삽입물과 교배시켜 좀더 선택하여 이렇게 선택된 클론의 구조를 일반적인 시발체를 이용한 DNA의 삽입부위의 디데옥시 시퀀싱에 의해 확인한다.

[실시예 2]

상기 아미노산 씨퀀스와 Escherichia coli의 고도로 표현된 유전자에서 코돈의 사용 및 편리한 제한 핵산 중간 분해 효소 절단장소의 영역에 근거하여 다음과 같이 DNA 씨퀀스가 제안되었다.

E.coli의 주변원형질로 내보낼 수 있는 형태로 단백질의 표현을 조절하기 위해 다음과 같은 조절요소가 제한되어진 바, 고도의 전사개시를 위한 플라스미드 pkk 223-3상의 tac 촉진제, 전사조절을 위한 플라스미드 pkk 223-3상의 lac 작용제, E.coli종 JM107의 염색체상에 코드화 되도록 하는 lac 억제인자(lac I^q), 고도의 해독 개시를 위한 OmpA Shine-Dalgarno 씨퀀스 생성물의 주변원형질로의 방출을 용이하게 하는 OmpA 리더 및 완전한 백혈구에 라스타제 억제제를 형성하기 위해 코드화된 단백질 씨퀀스와 이러한 작용 요소들에 의해 코드화된 단백질 씨퀀스와의 사이의 Ala-Ser 연결중 Ala이 있고 OmpA 요소는 다음과 같은 DNA 씨퀀스에 통합되어진다.

단백질이 E.coli 세포질내에 남아있는 형태로 단백질 표현을 조절하기 위해서는 다음과 같은 작용 요소가 제한되어지는 바, 플라스미드 pkk 223-3상의 tac 촉진제, 플라스미드 pkk 223-3상의 lac 작용제, E.coli종 JM107의 염색체상의 lac 억제인자(lac I^q) Shine-Dalgarno 씨퀀스의 일치 및 고도의 해독을 개시하기 위해서 해독 결합기로서 이용될 OmpA 리더 펩타이드 분획이 있고 해독 결합기 씨퀀스는 OmpA 유전자의 해독 초기 부위의 DNA 코딩, OmpA 리더 펩타이드의 초기 8개 아미노산, 상기의 일치되는 Shine-Dalgarno 씨퀀스 및 해독 말단인자로 되어 있고 세린프로테아제 억제제 유전자의 해독 개시 장소와 lac 촉진제 사이에 삽입되어 해독 개시 장소와 중복되게 되며 해독결합기는 다음과 같은 씨퀀스에 통합되어진다.

(1) 유전자 분획의 제조

상기 씨퀀스를 얻어내기 위해, ABI DNA 합성기(Foster City, California)를 이용하여 다음의 데옥시리보뉴클레오티드를 합성하고 그 생성물은 ABI instrument manual에 기재된 대로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제시킨 다음, 표준방법을 이용하여 T4 폴리뉴클레오티드 키나제와 ATP를 사용하여 5'를 인산화시키면 올리고뉴클레오티드 씨퀀스의 다음과 같은 그룹이 Aa 분획을 얻기 위해 사용되어진다.

올리고뉴클레오티드 Aa 1는

AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAA.

올리고뉴클레오티드 Aa 2는

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG.

올리고뉴클레오티드 Aa 3는

GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC.

올리고뉴클레오티드 Aa 4는

GCCTCGTTATCATCCAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG.

올리고뉴클레오티드 Aa 5는

GATCCGATCGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTCTGGTAAA.

올리고뉴클레오티드 Aa 6는

AGCTTTTACCAGAGCCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCTGTGCCACTGCGATCG.

또한 다음의 올리고뉴클레오티드 씨퀀스가 Ab 분획을 얻기위해 조합되어진다.

올리고뉴클레오티드 Ab 1는

AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAA.

올리고뉴클레오티드 Ab 2는

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG.

올리고뉴클레오티드 Ab 3는

GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC.

올리고뉴클레오티드 Ab 4는

GCCTCGTTATCATCCAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG.

올리고뉴클레오티드 Ab 5는

CAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA.

올리고뉴클레오티드 Ab 6는

AGCTTTTACCGCTCATTTATTTCTCCTTGAT.

그리고 B분획을 얻기위해 조합되어진 올리고뉴클레오티드 씨퀀스는 다음과 같다.

올리고뉴클레오티드 B 1는

AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG.

올리고뉴클레오티드 B 2는

CAGTG TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG.

올리고뉴클레오티드 B 3는

TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT TGTTG C.

올리고뉴클레오티드 B 4는

CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG.

올리고뉴클레오티드 B 5는

GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TTTTT TACCC GGGCA.

올리고뉴클레오티드 B 6는

CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT GTACC G.

올리고뉴클레오티드 B 7는

CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TTGA.

또한 C분획을 얻기위해 사용되어진 올리고뉴클레오티드 씨퀀스는 다음과 같다.

올리고뉴클레오티드 C 1는

GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG.

올리고뉴클레오티드 C 2는

ACTCG TCGAA AA.

올리고뉴클레오티드 C 3는

CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC.

올리고뉴클레오티드 C 4는

CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC.

올리고뉴클레오티드 C 5는

TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT.

올리고뉴클레오티드 C 6는

CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT.

올리고뉴클레오티드 C 7는

CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG CA.

올리고뉴클레오티드 C 8는

TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT.

올리고뉴클레오티드 C 9는

CGGGG TATCA ACCG.

뿐만아니라, D분획을 얻기 위해 다음과 같은 올리고뉴클레오티드 씨퀀스가 조합되어진다.

올리고뉴클레오티드 D 1는

GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC.

올리고뉴클레오티드 D 2는

AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G.

올리고뉴클레오티드 D 3는

TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A.

올리고뉴클레오티드 D 4는

CATAC CCATA CAGCA TTTCA.

올리고뉴클레오티드 그룹을 표준상태하에서 혼합하여 어닐시키고 서로 표준상태에서 T4 DNA 리가아제를 이용한 적당한 제한 핵산 중간 분해 효소로 자른 보균자 M13 mp18과 19를 클로닝하고 시퀀싱 하도록 묶는다. 그 생성물을 E. coli JM105를 변환시키기 위해 사용하고 DNA를 함유하는 클론을 어닐링 단계에서 사용된 그룹에서 취한 p-라벨된 올리고뉴클레오티드로 교배시켜 좀더 선택한다.

삽입물의 구조는 일반적인 시발체를 사용하여 된 DNA의 디데옥시 씨퀀싱에 의해 확인된다.

EcoRI과 BamHI으로 잘라낸 M13 mp18과 19와 올리고뉴클레오티드 Aa1-Aa 4를 묶으며 얻고자 하는 삽입 DNA를 포함하고 있는 M13 복제형 DNA를 표준방법으로 회수한다. M13 DNA를 제한 핵산 중간 분해 효소 EcoRI과 PvuI로 자른 M13로 DNA로부터 삽입 DNA를 잘라내고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정체시키면 그 구조는 다음과 같다.

BamHI과 HindIII으로 잘라낸 M13과 mp18과 19와 올리고뉴클레오티드 Aa 5와 Aa 6를 묶으며 얻고자 하는 삽입 DNA를 포함하는 M13 복제형 DNA를 표준방법으로 회수한다. 삽입 DNA를 제한 핵산 중간 분해 효소 PvuI과 HindIII로 DNA를 잘라내어 M13 DNA로부터 잘라내고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제시키면 그 구조는 다음과 같다.

이러한 PvuI-HindIII로 분획을 올리고뉴클레오티드 Aa 1-Aa 4로부터 얻어낸 EcoRI-PvuI 분획과 결합시키고 EcoRI과 HindIII로 자른 M13 mp18과 19와 묶는다. 원하는 삽입 DNA를 포함하는 M13 복제형 DNA를 표준방법으로 회수한다. DNA 분획 Aa인 삽입 DNA는 제한 핵산 중간 분해 효소 EcoRI과 HindIII로 M13 DNA를 잘라내어 M13 DNA로부터 잘라내고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제시키면 그 구조는 다음과 같다.

올리고뉴클레오티드 Ab 1-Ab 4를 EcoRI과 BamHI으로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶고 원하는 삽입 DNA를 포함하는 M13 복제형 DNA를 표준방법으로 회수한다. 삽입 DNA는 제한 핵산 중간 분해 효소 EcoRI과 PvuI으로 DNA를 잘라내어 M13 DNA로부터 잘라내고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제시키면 그 구조는 다음과 같다.

이와 같은 EcoRI-PvuI 분획을 올리고뉴클레오티드 Ab 5와 Ab 6와 결합시키고 EcoRI과 HindIII로 자른 M13 mp18이나 19와 묶으며 원하는 삽입 DNA를 포함하는 M13 복제형 DNA를 표준방법으로 회수한다. 분획 Ab인 삽입 DNA는 제한 핵산 중간 분해 효소 EcoRI과 HindIII로 DNA를 잘라낸 M13 DNA로부터 잘라내어 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제시키면 그 구조는 다음과 같다.

올리고뉴클레오티드 B1-B7을 포함하는 그룹 B를 HindIII와 BamHI으로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶고 제한 핵산 중간 분해 효소 HindIII와 BamHI로 DNA를 잘라내어서 그룹 B에 대응하는 삽입 DNA를 잘라내며 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제시키면 그 구조는 다음과 같다.

올리고뉴클레오티드 C1-C9을 포함하는 그룹 C를 BamHI과 XbaI으로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶고 제한 핵산 중간 분해 효소 BamHI과 Bgl

I로 DNA를 잘라내어서 그룹 C에 대응하는 삽입 DNA를 잘라내며 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제시키면 그 구조는 다음과 같다.

올리고뉴클레오티드 D1-D4를 포함하는 그룹 D를 BamH과 SalI으로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶고 제한 핵산 중간 분해 효소 sauIIIA와 sal I으로 DNA를 잘라내어서 그룹 D에 대응하는 삽입 DNA를 잘라내며 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제시키면 그 구조는 다음과 같다.

(2) 유전자의 제조

방출하도록 제조하기 위해, 그룹 Aa, B, C 및 D로부터의 삽입물을 혼합하여 표준상태에서 T4 및 DNA 리가제를 사용한 EcoRI 및 salI으로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶는다.

세포질 표현을 위한 제조에서는 그룹 Ab, B, C 및 D로부터의 삽입물을 혼합하여 표준상태에서 T4 DNA 리가제를 사용한 EcoRI 및 salI으로 잘라낸 M13 mp18과 19와 묶는다. 유전자를 포함하는 클론을 Xgal 판상에서 그 색깔에 의해 선택하고³²P라벨된 올리고뉴클레오티드와 교배시켜 좀더 선택하여 이렇게 선택된 클론의 구조를 일반적인 시발체를 이용한 DNA의 삽입부위의 디데옥시 씨퀀싱에 의해 확인한다.

[실시예 3]

표현 보균자의 제조

방출하도록 제조하고 세포질 표현을 위해 제조하기 위한 삽입물을 다음과 같이 표현 플라스미드에 전이시켰다. 원하는 삽입 DNA를 갖는 M13 복제형 DNA를 상기와 같이 표준방법에 의해 회수한다. 제한 핵산 중간 분해 효소인 EcoRI과 PstI으로 DNA를 잘라냄으로서 M13 DNA로부터 적당한 삽입 DNA를 잘라내어 이를 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 정제시킨다. 그 다음에 제한 핵산 중간 분해 효소 EcoRI과 PstI으로 잘라낸 PKK223-3과 묶어서 이와 같이 하여서 된 플라스미드를 E. coli JM107에 클로닝시킨다.

방출하도록 제조하기 위한 실시예 4와 5에서 사용된 것은 PSGE 6이고 세포질 표현을 위해 제조하는데 실시예 7에서 사용된 것은 PSGE 8이다. 실시예 4와 5에서 방출하도록 제조하기 위한 E. coli는 SGE 10고, 실시예 6에서 세포질 표현을 위해 제조하기 위한 E. coli는 SGE 30이다.

(1) PSGE 6의 구성

플라스미드 PSGE 6은 PKK223-3상의 EcoRI과 PstI 사이에서 DNA를 OmpASLP I의 DNA 코딩을 갖는 EcoRI/PstI로 치환시킴으로써 이루어진다.

ompA-SLPI의 DNA의 씨퀀스는 다음과 같다.

이하 "ompA-SLPI"로 표시된 씨퀀스는 상기의 방출을 위한 최종 M13 mp18 제조에 의한 DNA를 말하며 플라스미드 pSGE6는 제 1 도와 같다.

제 1 도에서 ompAss-SLPI의 첫번째 코돈은 "ompA-SLPI"로 표시된 DNA 씨퀀스의 62-64 위치이며 성숙된 SLPI의 첫번째 코돈은 125-127 위치이다. Ptac은 tac 촉진제, lac 작용제 및 베타 갈락토시다제 Shine/Dalgarno 씨퀀스를 위한 DNA를 포함한다. R1, Pst 및 Bam의 약어는 제한효소 EcoRI, pstI 및 BamHI의 씨퀀스를 나타내며 Tet^r은 테트라싸이클린에 저항성이 있는 pBR322로부터의 유전자의 일부이고, amp^r은 암피실린에 저항성이 있는 것이며 rrnB는 6416-6840 위치의 rrnB 오페론으로부터의 DNA를 포함한다. 여기서 화살표는 전사의 방향을 나타낸다.

(2) pCJ-ompA-SLPI의 구성

플라스미드 pCJ-ompA-SLPI는 부분적인 유전자보다 완전한 테트라싸이클린 저항 유전자와 촉진제를 함유하고 있는 것을 제외하고는 pSGE6와 같다.

이러한 플라스미드는 E. coli에 삽입되어 ompA-SLPI의 DNA 코딩을 함유하는 EcoRI/PstI 분획을 pKK223-3라기보다 보균자 pCJ1에서 클로닝시킨 것을 제외하고는 같은 방법으로 pSGE6에서 이루어질때 테트라싸이클린 저항을 나타낸다. 보균자 pCJ1은 다음과 같이 제조되는바, 플라스미드 pKK223-3을 SphI으로 완전히 그리고 BamHI으로 부분적으로 분해시킨 다음, 4.4Kbp 분획을 겔로 정제시키며 합성적응인자(adaptor)와 결합시킨다.

그리고 PBR322의 ter^r유전자의 ClaI,SphI 분해로부터의 DNA의 539bp 분획이다(PL Biochemicals, 27-4891-01).

(3) pSGE8의 구조

플라스미드 pSGE8은 EcoRI과 PstI 장소사이의 DNA가 상기의 세포질 표현을 위한 최종 M13 mp18 제조에 의해 유도된 ompA-tc-met-SLPI 씨퀀스를 함유하고 있는 것을 제외하고는 pSGE6과 유사하다.

이 씨퀀스는 E. coli의 세포질에서 메티오닐-SLPI를 합성하도록 하며 "ompA-tc-met-SLPI 씨퀀스 ompA의 시발코돈은 62-64 위치이고 종단코돈은 95-97이며 메티오닐-SLPI의 시발코돈은 98-100위치이다. ompA-tc-met-SLPI의 DNA 씨퀀스는 다음과 같다.

(4) pCJ-met-SLPI의 구성

플라스미드 pCJ-met-SLPI은 부분적이라기 보다는 완전히 테트라싸이클린 저항유전자를 함유하는 것을 제외하고는 pSGE8과 같다.

플라스미드 CJ-met-SLPI은 ompA-tc-met-SLPI의 DNA 코딩을 함유하는 EcoRI/PstI 분획이 pKK223-3라기보다 보균자 PCJ1으로 클로닝된 것외에는 pSGE8과 유사하게 얻어진다.

(5) 효모표현 플라스미드의 제조

플라스미드 pUC8을 HindIII로 분해하여 Amersham, Cat.No.DA1006으로부터 얻어진 HIndIII/smaI 적용인자와 묶는다.

이 적용인자를 HindIII 장소에 첨가하면 HindIII 장소를 다시 만들지 않는다. 그 다음에 DNA를 SmaI으로 분해하여 희석용액에서 묶어서 E.Coli JM83을 변형시킨다. 폴리링커에서 HindIII 장소로부터 SmaI 장소까지 제한 장소가 부족한 플라스미드와 같은 플라스미드를 EcoRI,SmaI나 HindIII로 변형물로부터 분리시킨 플라스미드 DNA를 분해하여 확인하여 HindIII가 부족하나 EcoRI와 SmaI 장소는 함유하는 플라스미드를 포함하는 변형물을 이와 같은 방법으로 확인하면 이 플라스미드는 pGS 185이다.

효모 MFαI 유전자 함유 EcoRI 분획을 Cell 30 : 933(1982)(J.Kurjan & I.Herskowitz)에서 설명한 바와 같은 플라스미드 pCY17로부터 겔 전기영동에 의해 정제시키며 pGS 185의 잘린 EcoRI과 묶는다. 이와같은 혼합물을 암피시린 저항을 위해 선택한 E. coli HB101을 변형시키기 위해 사용하며 플라스미드 DNA를 변형물로 부터 분리시켜 원하는 삽입물의 존재를 EcoRI으로 DNA를 분해시켜서 확인한다. 이것은 플라스미드 pGS285이며 제 2 도와 같다(이때 EcoRI 분획은 pCY17로부터 α-인자 유전자를 포함하고 있다).

플라스미드 pGS285를 HindIII로 완전히 분해하여 희석용액중에서 다시 묶고 MFαI 유전자(Kurjan & Herskowitz, ibid)내의 4개의 내부 HindIII 장소중 3개를 제거하여 얻고자 하는 구조를 상기와 같이 선택한다. 이것이 플라스미드 pGS385이다. 합성 SLPI 유전자의 107을 다라아미노산 4를 코드화하는 뉴클레오티드 씨퀀스를 옮기는 실시예 2에서와 같은 M13 AaBCD 클론은 HindIII로 자른다. 이 DNA는 다음과 같은 올리고뉴클레오티드 적응인자와 묶는다.

이와 같은 적응인자는 두 개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링 하므로써 형성되어진다. 5' GCT GAA GCT TCA GGT AAG와 5' AGC TCT TAC CTG AAG CTT CAGC를 70℃ 온도에서 2초간 처리하여 하룻밤동안 천천히 냉각시킨다.

M13 AaBCD의 Hind 절단에 적응인자를 묶은 다음 HindIII와 SalI으로 잘라내어 아가로즈 겔 전기영동과 일렉트로루숀(lectrolution)에 의해 정제된 분획을 분리시킨다. 이 분획을 한번 더 HindIII로 자르고 HindIII와 SalI으로 절단시킨 pGS385 DNA와 묶는다. E. coli HB101을 이 묶여진 혼합물로 변형시키고 암피시린 저항성 변형물을 선택한다.

얻고자 하는 삽입 DNA로 된 플라스미드를 함유하는 변형물은 플라스미드 DNA를 제조하여 HindIII와 SalI으로 잘라냄으로써 확인되어진다. 이와 같은 방법으로 제조되어 분리되어진 플라스미드를 pGS485로 나타내며 제 4 도와 같다. 이 플라스미드는 그 틀안에 MFαI 유전자의 첫번째 스페이서 부위(Spacer region) 안의 HindIII 장소에 합성 SLPI 유전자와 융합시킨 MFαI 유전자를 함유하고 있다. 효모안에 위치할때 이와 같은 제조는 이중 단백질을 직접 합성, 작용 및 분비하는 것으로 설명되어 있다(A.J.Brake et al. in PNAS(USA) 81 : 4642) MFαI 유전자와 SLPI의 융합은 pGS 485의 EcoRI 분획상에 포함되어 있고 이러한 EcoRI 분획은 실시예 8에서 설명하게 될 보균자 YIp5로 클론된다.

[실시예 4]

플라스미드 pSGE6를 이용한 분비선 백혈구 프로테아제 억제제(SLPI)의 표현과 정제

플라스미드 pSGE6(SGE10 세포) 함유 E. coli 세포를 2% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 20g/l 글루코즈, 200ml/l 비타민 B₁및 100mg/l 암피시린 첨가물로 된 M9 매체 10l 안에서 6시간동안 배향했다. IPTG를 0.2mM 첨가하고 6시간 더 배양시킨다. 8g/l의 E. coli SGE10 세포 10l를 18,000×g에서 뭉쳐서 50mM Tris. HC1(pH 7.5), 4mM EDTA 완충액(이하 T50E4로 약칭함)안에서 재현탁시키고 작은 알맹이로 뭉치게한다. 이것을 2.7l의 T50E4 안에서 재현탁시키고 150ml씩으로 하여 냉각시킨다. 이와 같은 것(세포 36g에 해당)을 8개 담가서 12,000psi의 압력과 4℃의 온도의 압축기에 한번 통과시켜 분쇄시킨다. 이것을 20,000×g에서 1시간 반동안 원심분리시키고 불용해세포 함유 작은 알맹이의 1/6(세포 6g에 해당)을 T50E4 125ml로 2번 세척하고 남은 물질을 하룻밤동안 냉각시킨다.

냉동펠렛(pellet)을 20mM DTT(Sigma, Cat. No.D-0632), 4mM PMSF(Sigma, Cat. No.p-7626) 및 8M 요소(상당히 순수, BRL, Cat. No.5505UA)를 함유하는 100mM Tris. HCl(pH 8.0), 4mM EDTA(이하 T100E4로 칭함)의 25ml로 1시간동안 37℃의 온도에서 추출하여 10분동안 10,000×g에서 원심분리시킨다.

이때 상층액을 20mM DTT와 8M 요소함유 T100E4 추출완충용액으로 미리 평형화시킨 10mL Sephadex SP-C25(pharmacia)와 혼합시키며 SP-Sephadex에 SLPI를 흡수하기 위해 37℃의 온도에서 10분동안 로울러상에서 혼합시킨다.

흡수된 SLPI의 수지를 10분동안 3,000×g에서 원심분리시켜 작은 알맹이로 만들고 상층액은 가만히 따른다. 남아 있는 수지를 20mM DTT와 8M 요소함유 T100E4 25ml로 두번 세척하고 20mM DTT 함유 T100E4 25ml로 2번 세척시킨다. 그 다음에 수지를 20mM DTT와 0.3M NaCl 함유 T100E4 25ml와 5M NaCl 0.6ml의 혼합물로 한번 추출한다.

이 추출물은 0.15mg/ml 단백질과 0.04mg/ml 이상의 SLPI을 함유한다. 이 방법에 의해 얻어진 SLPI은 HPLC(High Pressure Liquid Chromatography)에 의해서 70% 이상 순수한 것으로 결정되었다.

[실시예 5]

실시예 4의 방법을 이용하여, 2번째 냉각펠렛을 첫번째 T100E4/DTT/PMSF/요소 세척대신에 1% 트리톤×-100(Sigma, Cat. No. T-6878) 함유 T100E4로 추출시켰다.

이러한 SLPI은 실시예 4에서 얻어진 것보다 약간 더 순수하며 다음의 실시예 6에서 설명하는 리홀딩 분석(refolding assay)에서 더 활성이 높은 것으로 나타나 있다.

[실시예 6]

정제된 SLPI의 리홀딩

실시예 4 또는 5로부터 부분적으로 정제된 SLPI 40g이 8M 요소나 5M 구아니딘염산(Pierce Chemical Co., #24110) 및 4mM DTT에서 만들고 실온에서 1시간동안 배양시킨다.

산화 글루타티온(Sigma, Cat. No.G-4626)을 13.5mM로 첨가시키고 그 혼합물로 다시 1시간 동안 실온에서 배양시킨다. 이 혼합물은 pH 10.7인 NaOH내의 50mM Tris 용액으로 10배 희석시키고 실온에서 4시간동안 더 배양시킨다.

이 혼합물을 pH 8.0의 50mM Tris와 0.15M NaCl로 5배 희석시키고 pH 8.0의 50mM Tris와 0.25M NaCl로 미리 평형시킨 Sephadex SP-C25의 1×2cm 컬럼에 넣는다. 수지를 0.25M NaCl함유 pH 8.0의 50mM Tris로 세척하고 0.5M NaCl 함유 pH 8.0의 50mM Tris로 다시 세척시킨다.

0.5M 염세척으로 용출된 분획은 상당한 활성을 가지며 컬럼에 제공한 SLPI의 약 30%를 나타낸다.

[실시예 7]

SGE 30 세포 분쇄물의 용해 및 불용해 분획으로 부터 SLPI의 정제

E. coli SGE 30 세포내의 플라스미드 pSGE8의 표현은 세포 분쇄물의 용해 및 불용성 분획물 둘다에서 SLPI을 제조한다. 전체 세포단백질의 1%인 SLPI가 용해분획물에 약 80%, 그리고 불용성 분획물 약 20% 분포되어 있다.

(1) 불용성 분획물로부터 SLPI의 정제

PSGE8 함유 E. coli SGE 30 세포를 교반플라스크내의 50g/ml의 암피시린 함유 LB 매체에서 OD600이 0.7이 되도록 배양시키고 IPTG를 0.2mM 첨가시켜 유도한다. 3시간 후에 세포가 알맹이로 되고 50mM Tris. HCI(pH7.5)와 4mM EDTA(이하 T50E4로 칭함)의 2배무게 되는 양에 현탁시킨다. 이 세포를 4℃의 온도에서 음파파쇄로 파쇄시키고 그 추출물을 4℃의 온도에서 12,000×g에 20분동안 원심분리시킨다.

이 알맹이를 3배 부피의 T50E4로 세척하고 상온에서 10M 요소나 6M 구아니딘염산과 5mM 감소 DTT 함유 용액에 용해시켰다. 상온에서 1시간 동안 배양시킨 후, 산화 글루타티온을 17.5mM 농도로 첨가시키고 그 혼합물을 한시간 더 배양시킨다. 그 다음에 이 혼합물을 pH 10.7의 10배 부피의 50mM Tris.HCI로 희석시키고 그 희석혼합물을 상온에서 4시간 동안 방치시킨 후 5N HCI을 첨가하여 pH를 8로 조절하고 이 혼합물은 원심분리하여서 침전된 단백질은 제거한다.

이와 같이 하여 제조된 상층액은 분비선 백혀구 단백질 분해 효소 억제제 활성을 나타내는 SLPI를 포함하고 있으며, 상기 Sephadex SP-C25 컬럼크로마토그래피를 정제시킨다.

(2) 용해분획물로부터의 SLPI의 정제

플라스미드 pSGE8 함유 E. coli SGE 30 세포교반플라스크내에서 OD600이 0.7이 되도록 배양시키고 IPTG를 0.2mM로 첨가시켜 유도한다. OD600이 1.1일때, 세포를 20,000×g에 15분동안 펠렛화 시킨다. 이 펠렛을 T50E4에서 재현탁시켜 4℃의 온도에서 20,000psi의 프렌치 압축기를 두번 통과시켜 분쇄시킨다. 이 분쇄물을 25,000×g에서 15분동안 원심분리시킨다.

상층액은 DTT 25mM 안에서 만들어지며 이 혼합물은 0℃의 온도에서 1시간 동안 배양시키고 충분한 HCl을 최종농도가 5% 될때까지 첨가시킨다.

0℃의 온도에서 30분동안 배양시킨 후, 이 혼합물을 15분동안 25,000×g에서 원심분리시켜 상층액은 좀더 반응을 진행시키기 위해 제거한다.

상층액의 pH는 10M NaOH로 8.0으로 조정하고 SPS-Page, 역상 HPLC 및 ELISA로 분석하면 130㎍의 전(全)단백질당 적어도 0.7g의 SLPI를 나타내었다. 이와 같이 하여 얻은 SLPI은 Sephadex SP-C25 크로마토그래피 컬럼상에서 좀 더 정제시키고 실시예 6에 따라 활성 SLPI로 리홀드시킨다.

[실시예 8]

융합된 SLPI-MFαI 유전자(참고 : 실시예의 3의 (5)) 함유 EcoRI 분획물을 The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces(D.Botstein and R.W.Davis, Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 607-636(1982))에 기재된 효모보균자 YIp⁵의 EcoRI 장소에서 묶어서 YIpSLP-1을 제조하고 Methods in Enzymology 101 : 228(1983)(To Orr-Weaver et al.,)에서 기재하고 있는 장소-지향적 재결합에 의해 S. cercevisiae BS214(MAT, Ura 3-52, pep4, prbl)의 URA3 유전자로 통합시킨다. S.cerevisiae SGY-1종은 배양상층액으로 완전한 활성의 SLPI을 분비한다.

또한 SGY-3종은 활성의 SLPI을 생성하고 분비한다. 이 종은 복제 효모 플라스미드 pGS585 상에서 MFαI : SLPI 융합을 일으키고 이 플라스미드는 Methods in Enzymology 101 : 307(1983)(J.R.Broahc)에서 기재된대로 효모 URA3 유전자의 첨가로 pJDB 207로부터 제조되며 The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces(D.Botstein and R.W.Davis, Cold Spring Harbor Laboratory, PP. 607-636(1982))에서 기재된대로 플라스미드 YEp 24로 부터 분리되어지며 pJDB 207의 HindIII 장소로 클론되어 pGS 585를 제조한다. EcoRI 분획상에 포함되어 있는 MFαI : : SLPI 융합유전자를 EcoRI-XhoI 작용인자(Amersham, Cat, No. DA1007)를 이용하는 pGS 585의 SaiI 장소로 클론시켜 YEpSLPI-1을 제조한다.

이 플라스미드를 J. Bacteriology 153 : 163(1983)(Itc et al.)에 기재되어 있는 대로 변형시켜 S.cerevisiae DBY746으로 들여보낸다.

Saccharomyces cerevisiae종 SGY-1과 SGY-3를 30℃의 온도에서 Methods in Yeast Genetics(P62, F. Sherman et al., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York(1981)) 방법에 따라 우라실이 부족한 SD 매체안의 정체상에서 배양시킨다. 배양매체로부터 원심분리에 의해 세포를 제거하고 배양상층액을 (1) 프로테아제 억제제 활성과 (2) 항 SLPI 항체와 효소-연결면역분석(Enzymelinked immunoassay)에 의해 반응하는 물질의 양을 측정하여 SLPI 활성을 분석하였다. 정제는 상기의 종래방법과 동일하게 실시될 수 있다.

본 발명의 생성물과 제조 방법에 있어서 다양한 변화와 변형이 가능한바, 본 발명은 본 발명의 청구범위의 범위내에서 벗어나지 않는 한도내의 변형과 변화도 포함한다.

Claims (13)

1. (가) 귀밑샘 분비선으로부터 분리해낸 천연의 세린프로테아제억제제와 실질적으로 동형인 억제제로서, 세린프로테아제억제제 활성을 갖는 단백질을 숙주 미생물이 생성할 수 있도록 DNA 씨퀀스를 얻어내고, (나) 이 DNA 씨퀀스의 작용요소를 함유하며 전이시킬 수 있는 보균자에 상기 DNA 씨퀀스를 클로닝시켜 숙주 미생물내에서 복제시킨 다음, (다) 이러한 DNA 씨퀀스와 작용요소를 함유하고 있는 보균자를 프로테아제억제 단백질을 나타낼 수 있는 숙주미생물로 전이시키며, (라) 이 전이된 보균자를 확대시키고 그 억제제를 나타내기에 적당한 조건하에서 상기 숙주미생물을 배양시킨 후, (마) 억제제를 얻어내고, (바) 그 억제제를 활성을 갖는 3차구조가 되도록 하여서 세린프로테아제억제제 활성을 갖도록 하므로써, 적어도 하나 이상의 세린프로테아제억제제 활성을 갖는 활성부위를 가지는 단일 폴리펩타이드 사슬로 된 세린프로테아제억제제를 제조하기 위한 DNA 재결합방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 씨퀀스는 합성씨퀀스임을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 DNA 씨퀀스는 천연의 DNA 씨퀀스임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 천연의 DNA 씨퀀스 (1) 세린프로테아제억제제를 형성시킬 수 있는 세포로부터 사람의 cDNA 라이브러리를 얻어낸 다음, (2) 프로테아제억제제 유전자나 그의 단백질 생성물에 결합할 수 있는 하나 이상의 탐침으로 사람의 DNA 라이브러를 찾아서, (3) 클론의 능력에 의해 하나 이상의 탐침에 유전자나 그의 단백질 생성물이 결합하도록 억제제의 유전자 코딩을 함유하는 하나 이상의 클론을 확인한 후, (4) 확인된 클론으로부터 억제제를 코딩하는 유전자를 분리시켜서, (5) 그 유전자나 그의 적당한 분획물을 숙주미생물내의 유전자를 유지시키면서 표현하는데 필요한 작용요소에 연결시키므로써 얻어짐을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 세포는 사람의 귀밑샘 세포임을 특징으로 하는 방법.
6. 제 3 항에 있어서, 천연의 DNA 씨퀀스는 (1) 사람의 유전자 DNA 라이브러리를 얻어낸 다음, (2) 세린 단백질 억제제 유전자나 그의 단백질 생성물에 결합할 수 있는 하나 이상의 탐침으로 사람의 유전자 DNA 라이브러를 찾아서, (3) 클론의 능력에 의해 하나 이상의 탐침에 유전자나 그의 단백질 생성물이 결합하도록 억제제의 유전자 코딩을 함유하는 하나 이상의 클론을 확인한 후, (4) 확인된 클론으로부터 억제제를 코딩하는 유전자를 분리시켜서, (5) 유전자나 그의 적당한 분획물을 숙주미생물내의 유전자를 유지시키면서 표현하는데 필요한 작용요소에 연결시키므로써 얻어짐을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 보균자는 pBR322와 pIQ중에서 선택된 보균자의 일부분으로부터 된 것임을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 숙주미생물은 Escherichia, Bacillus 및 Saccharomyces종 미생물중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 얻어낸 억제제를 좀 더 정제시키는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 정제는 상기 억제제를 활성을 갖는 형태로 되도록 하기 전에 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9 항에 있어서, 정제는 상기 억제제를 활성을 갖는 형태로 되도록 한 다음에 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1 항에 있어서, DNA 씨퀀스가 다음의 (1) 또는 (2)중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.

    

    (2) 세린프로테아제억제제의 제조를 코드하는 유전학적으로 동등한 씨퀀스.
13. 제 1 항에 있어서, 추가 씨퀀스가 상기 DNA 씨퀀스 직전에 위치하되, 이 추가 씨퀀스는 뉴클레오티드 씨퀀스 TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAAATG를 갖는 해독결합기인 것임을 특징으로 하는 방법.

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