CN117660419A

CN117660419A - 水解活性提高的胶原酶及其应用

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Publication number: CN117660419A
Application number: CN202211094212.1A
Authority: CN
Inventors: 刘晓; 赵季祥
Original assignee: SHANGHAI YAXIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI YAXIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2022-09-08
Filing date: 2022-09-08
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明提供了一种水解活性提高的胶原酶及其应用。首次揭示一种杂合酶，该杂合酶包含相互连接的胶原酶结构域与PKD‑CBD1‑CBD2结构域。该杂合酶能够被有效地表达，对于含有胶原酶水解位点的蛋白呈现很高的降解活性，具有优异的生物活性。

Description

水解活性提高的胶原酶及其应用

技术领域

本发明属于酶工程领域，更具体地，本发明涉及水解活性提高的胶原酶及其应用。

背景技术

蛋白酶是一类能催化蛋白质肽键的断裂并将其降解成多肽、寡肽或氨基酸的水解酶，目前在全球的各个领域中均有着广泛的应用，约占全球酶行业交易总量的60％。

胶原蛋白的氨基酸组分中脯氨酸的高含量、特定的氨基酸序列以及刚性的三重螺旋和纤维的独特结构，使其在生理条件下能抵抗大多数蛋白酶的水解。将在生理pH、温度和盐浓度条件下，能够作用于天然胶原蛋白的螺旋区域，并将其降解成多肽，寡肽或氨基酸的蛋白酶称为胶原酶。目前对胶原酶的定义和分类还存在争议，其中最主要的原因是底物胶原蛋白的复杂性(胶原蛋白存在螺旋区和非螺旋区，以及天然胶原蛋白中或多或少的存在明胶和胶原多肽等)。与天然胶原蛋白相比，胶原多肽和明胶等小分子底物虽然含有Gly-X-Y三联体序列但是缺乏三重螺旋的刚性结构，一般将能水解胶原蛋白、胶原多肽或明胶等具有典型Gly-X-Y三联体序列底物的蛋白酶称为广义的胶原酶，而将能作用于天然胶原蛋白三重螺旋区域的蛋白酶称为真胶原酶，在本发明中胶原酶这个术语等同于真胶原酶。

胶原酶的研究始于十九世纪末，从梭状芽孢杆菌分离出一种具有水解胶原蛋白的胞外酶的研究报道之后，陆续鉴定和表征了许多来源于细菌和哺乳动物的其它胶原酶。目前人们已在多种生物中发现胶原酶的存在，如动物、植物和微生物，但是它们的底物特性各不相同。真核生物来源的胶原酶活性具有非常特殊的识别位点，而微生物胶原酶具有广泛的特异性，所以与动物胶原酶相比，微生物胶原酶具有更大的应用前景。

微生物胶原酶主要包括M9家族的金属蛋白酶和少数来自S1、S8和S53家族的丝氨酸蛋白酶，除此之外，U32家族的一些成员也被报道具有水解天然胶原蛋白的能力。M9家族成员金属胶原酶包含一个保守的锌结合基序(HEY/FTH)或(HEYT/VH)作为催化残基，S1家族、S8家族和S53家族分别以His-Asp-Ser、Asp-His-Ser和Glu-Asp-Ser作为其催化残基，而U32家族有许多未知催化类型的胶原酶。此外，虽然对微生物胶原酶的研究较早，但目前仍知之甚少。

发明内容

本发明的目的在于提供水解活性提高的胶原酶及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种改造胶原酶、提高胶原酶水解活性的方法，包括：将胶原酶结构域与PKD-CBD1-CBD2结构域相互连接。

在一种或多种实施方式中，所述胶原酶结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第1～677位所示。

在一种或多种实施方式中，所述PKD结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第678-773位所示。

在一种或多种实施方式中，所述CBD1结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第777-894位所示。

在一种或多种实施方式中，所述CBD2结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第899-1009位所示。

在一种或多种实施方式中，改造的酶蛋白从氨基端到羧基端依次包含：胶原酶结构域，PKD-CBD1-CBD2结构域。

在一种或多种实施方式中，经改造的酶蛋白中，所述胶原酶结构域、所述PKD-CBD1-CBD2结构域通过肽键连接。

在一种或多种实施方式中，经改造的酶蛋白的Kcat/Km高于45min*mmol/L；较佳地高于50min*mmol/L；更佳地高于55min*mmol/L；更佳地高于60min*mmol/L。

在一种或多种实施方式中，经改造的酶蛋白的Km值低于0.35mmol/L；较佳地低于0.3mmol/L；更佳地低于0.28mmol/L。

在本发明的另一方面，提供一种经改造的酶蛋白，所述酶蛋白由相互连接的以下的蛋白片段形成：胶原酶结构域，PKD-CBD1-CBD2结构域。

在本发明的另一方面，提供所述的经改造的酶蛋白的用途，用于：降解含有胶原酶水解位点的蛋白。

在本发明的另一方面，提供制备降解含有胶原酶水解位点的蛋白的组合物。

在一种或多种实施方式中，所述含有胶原酶水解位点的蛋白为胶原蛋白(包括含有胶原酶水解位点的胶原蛋白类似物)。

在本发明的另一方面，提供一种核酸分子或含有该核酸分子的重组载体，所述的核酸分子编码所述的经改造的酶蛋白。

在一种或多种实施方式中，所述的载体以pET28a为骨架载体。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程细胞，所述细胞含有所述的重组载体或其基因组中整合有所述的核酸分子。

在一种或多种实施方式中，所述细胞为原核细胞。

在一种或多种实施方式中，所述细胞为大肠杆菌细胞。

在本发明的另一方面，提供一种用于降解含有胶原酶水解位点的蛋白的组合物，所述的组合物含有：(i)所述的经改造的酶蛋白；和(ii)生物学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种降解含有胶原酶水解位点的蛋白的方法，包括：以所述的经改造的酶蛋白或所述的组合物处理所述含有胶原酶水解位点的蛋白或包含其的对象。

在一种或多种实施方式中，所述胶原酶水解位点包括胶原蛋白三重螺旋区域。

在一种或多种实施方式中，所述降解含有胶原酶水解位点的蛋白的方法中，所述经改造的酶蛋白通过作用于胶原蛋白三重螺旋区域，降解含有胶原酶水解位点的蛋白。

在一种或多种实施方式中，进行所述降解时，反应体系的温度为0～70℃；较佳地为5～65℃或10～65℃(如为15～65℃，更具体地如20、22、25、28、30、35、40、45、50、55、60、62℃)。

在一种或多种实施方式中，进行所述降解时，反应体系的pH值范围3～13；较佳地pH值范围为4～12或4～11(如为4.5～11，更具体地如5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5)。

在一种或多种实施方式中，进行所述降解时，反应体系中，添加Co²⁺以促进酶的活性；较佳地，该体系中包含PZ肽(4-苯基偶氮苄氧基羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg)；较佳地，Co²⁺在体系中的终浓度为1～5mM。

在一种或多种实施方式中，进行所述降解时，反应体系中，添加Ca²⁺、Mg²⁺或Co²⁺以促进酶的活性；较佳地，该体系中包含明胶或胶原蛋白；较佳地，Ca²⁺在体系中的终浓度为1～10mM；较佳地，Mg²⁺在体系中的终浓度为1～10mM；较佳地，Co²⁺在体系中的终浓度为1～10mM(更佳地，Ca²⁺在体系中的终浓度为1～5mM；较佳地，Mg²⁺在体系中的终浓度为1～5mM；较佳地，Co²⁺在体系中的终浓度为1～5mM)。

在本发明的另一方面，提供一种用于降解含有胶原酶水解位点的蛋白的试剂盒，其中含有所述的经改造的酶蛋白。

在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括选自下组的金属离子：Ca²⁺、Mg²⁺或Co²⁺，或能产生Ca²⁺、Mg²⁺或Co²⁺的物质(如化合物)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、胶原酶的结构示意图；PKD：多囊肾病样结构域；CBD：胶原结合结构域。

图2、重叠延伸PCR进行基因片段的融合。

图3、PCR产物的鉴定；M：核酸marker。

(A)1、2：杂合酶第一轮PCR的前片段产物；3、4：杂合酶第一轮PCR的后片段产物。

(B)1、2：杂合酶第二轮PCR的产物。

图4、重组菌的菌液PCR鉴定；M：核酸marker；1-4：pET28a-5’colH-3’colG转化DH5α的；1-7号菌落的菌液PCR鉴定结果。

图5、ColH、ColHΔC和杂合酶的表达鉴定。

图6、ColH、ColHΔC和杂合酶对不同底物水解活性的对比。

图7、SDS-PAGE分析ColH、ColHΔC和杂合酶对明胶(A)和胶原(B)水解的情况。

图8、杂合酶和ColH的温度稳定性。

图9、杂合酶和ColH的pH稳定性。

图10、金属离子对杂合酶(白色柱体)和ColH(灰色柱体)水解PZ肽活性的影响。

图11、金属离子对杂合酶和ColH水解明胶(A)和胶原(B)活性的影响。

图12、钙离子对杂合酶和ColH温度稳定性(A)和抗反复冻融(B)的影响；+：含钙离子；-：不含钙离子。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种杂合酶，该杂合酶包含相互连接的胶原酶结构域与PKD-CBD1-CBD2结构域。该杂合酶能够被有效地表达，表达后能够形成正确的蛋白空间结构，对于含有胶原酶水解位点的蛋白呈现很高的降解活性，具有优异的生物活性。

术语

如本文所用，术语“本发明的杂合酶”、“杂合酶”、“胶原杂合酶”、“杂合(的)胶原酶”等可互换使用，都指含有胶原酶结构域与PKD-CBD1-CBD2结构域的蛋白；较佳的它们之间通过化学键(如肽键)相连接。

如本文所用，“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制以编码序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”，“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，“生物学可接受的载体”是用于将本发明的杂合酶传送给需要处理的对象(包括工业原料、工业加工产物、食品、饲料等)的，在毒性、副作用方面可控的(如不存在可见的毒性、副作用)、环境友好或对人畜无害的溶剂、悬浮剂或赋形剂等。所述载体可以是液体或固体，较佳地是能够较高程度保持本发明的杂合酶的生物学活性的载体。

如本发明所用，除非另外说明，所述的“水解”与“降解”可互换使用。

杂合酶

本发明提供一种杂合酶，其包含胶原酶结构域与PKD-CBD1-CBD2结构域，两者操作性连接。较佳的，所述的杂合酶是一种分离的蛋白，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物；所述的杂合酶也可存在于混合物中，如存在于一种细胞裂解物或粗提物中。

本发明包括所述胶原酶结构域或PKD-CBD1-CBD2结构域的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的胶原酶结构域或PKD-CBD1-CBD2结构域相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。

在本发明中，术语“胶原酶结构域”是包括SEQ ID NO:1中第1～677位所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与所述胶原酶结构域相同功能的、SEQ ID NO:1中第1～677位所示氨基酸序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，常常不会改变多肽的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸常常不会改变多肽的功能。因此该术语还包括所述胶原酶结构域的活性片段和活性衍生物。

在本发明中，术语“PKD-CBD1-CBD2”是包括SEQ ID NO:1中第678-773位、第777-894位、第899-1009位所示氨基酸序列的多肽，或包括SEQ ID NO:1中第678-1009位所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与所述PKD-CBD1-CBD2相同功能的、SEQ ID NO:1中相应氨基酸序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，常常不会改变多肽的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸常常不会改变多肽的功能。因此该术语还包括所述PKD-CBD1-CBD2的活性片段和活性衍生物。

应理解，本发明也包括与所述胶原酶结构域或PKD-CBD1-CBD2的具有较高同源性的蛋白，如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明所述的胶原酶结构域与PKD-CBD1-CBD2之间，通过化学键相连或相互偶联；所述的化学键是共价键或非共价键。作为本发明的优选方式，所述的胶原酶结构域、PKD-CBD1-CBD2之间通过化学键相连；更佳的，所述的化学键是肽键。

作为本发明的优选方式，所述的杂合酶从氨基端到羧基端依次包含：胶原酶结构域、PKD-CBD1-CBD2。

所述的胶原酶结构域与PKD-CBD1-CBD2之间可以直接相连接，或者通过多肽连接子(连接肽)连接。所述的连接子例如包括1-50个氨基酸；较佳地包括1-30个或包括2～20个氨基酸。作为本发明的优选方式，所述的胶原酶结构域、PKD-CBD1-CBD2之间进行直接相连接。即使不使用一些柔性连接肽的辅助，所述的胶原酶结构域、PKD-CBD1-CBD2之间也能实现兼容且发挥优异的生物活性。

另一方面，本发明还提供了编码所述的杂合酶的分离的核酸，也可以是其互补链。任何编码所述的杂合酶的核酸都适用于本发明。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。

编码本发明杂合酶的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得编码胶原酶结构域、PKD-CBD1-CBD2氨基酸的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明杂合酶的DNA序列。

本发明还提供了包含编码所述杂合酶的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述杂合酶的表达。

多种合适的载体可被应用于本发明中，比如一些用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞的克隆和表达的载体，例如可参考Pouwels等，克隆载体：实验室手册中所描述的。较佳地，所述的表达载体为原核细胞如大肠杆菌适用的表达载体。

此外，含有编码所述杂合酶的核酸序列的重组细胞也包括在本发明中。

在本发明中，细胞可包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；例如可为大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在本发明的优选方式中，采用原核细胞作为宿主细胞。作为本发明的最优选的方式，所述的原核细胞为大肠杆菌细胞。

生产本发明的杂合酶的方法也已包括在本发明中。所述方法包括培养含有杂合酶编码核酸的重组细胞。所述方法还可包括杂合酶的分离和/或纯化。

可将上述制备获得的杂合酶纯化为基本均一的性质，例如在SDS-PAGE电泳上呈单一条带。

杂合酶的应用

胶原酶包括ColG、ColH等蛋白。本发明人为了实现胶原酶的活性的提高，经由大量的研究工作，将来自ColG、ColH的不同区段加以连接，从而大大提高了胶原酶的酶活性。本发明的经改造的胶原酶，可较为广泛地水解(降解)含有胶原酶水解位点的蛋白(底物)。

本发明论证了所述杂合酶对于多种底物的水解作用，所述底物为含有胶原酶水解位点的蛋白，包括但不限于：胶原蛋白，明胶，PZ肽等。胶原蛋白是构成脊椎动物皮肤，肌腱，韧带等结缔组织的主要成分，是脊椎动物体内最丰富的蛋白质成分之一，约占体内总蛋白的三分之一。胶原蛋白是由三条相同或不同的左旋α链相互缠绕形成的右手三螺旋结构蛋白。PZ肽是人工合成的小分子底物，分子式为4-苯基偶氮苄氧基羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg，可以被胶原酶识别催化生成PZ-Pro-Leu，以此定义胶原酶的活性。明胶是胶原蛋白部分水解而得到的一类蛋白质，明胶与胶原蛋白具有同源性。本发明的实施结果显示，所述杂合酶对于含有胶原酶水解位点的蛋白均具有良好的水解活性。

在本发明的具体实施例中，构建了所述杂合酶(5’ColH-3’ColG)和一种只含有ColH催化域的酶片段(ColHΔC)，研究了附属结构域对胶原酶水解合成肽(PZ肽)、明胶、胶原蛋白等底物活性的影响，并对杂合酶和ColH的基本酶学性质进行了比较。比较ColH、杂合酶对PZ肽、明胶、胶原蛋白和猪皮的水解活性，结果显示，与野生型的或其它改造类型的酶相比，杂合酶对所有底物的水解活性均为最高。

在本发明的具体实施例中，利用SDS-PAGE研究明胶的水解进程，也得出相同的结论，杂合酶对明胶中大分子的水解活性是最高的。茚三酮法测定了ColH和杂合酶对猪皮水解活性，显示杂合酶对猪皮水解活性是ColH的2.2倍，这令人出乎意料。

除PZ肽、明胶和胶原蛋白外，本发明人还进行了以猪皮为底物的实验，所述杂合酶对于其也具有良好的水解活性。

因此，本发明的杂合酶的酶活性非常理想；其能够适于在原核细胞表达的条件下被重组表达，有着广泛的应用潜力。根据本发明人的新发现，本发明所述的杂合酶的用途包括：降解含有胶原酶水解位点的蛋白(底物)；或制备水解含有胶原酶水解位点的蛋白(底物)的组合物。同时应理解，尽管本发明实施例中进行了一定数量的底物的研究试验，本发明的杂合酶蛋白也可被应用于水解(降解)与PZ肽、明胶、胶原蛋白在化学结构/生物结构上具有相似性的类似蛋白，此类应用也应被涵盖在本发明中。

在获得了本发明的杂合酶后，根据本发明的教导，本领域人员可以方便地应用该酶来发挥水解作用。在一种方式中，提供了一种水解含有胶原酶水解位点的蛋白(底物)的方法，包括：利用本发明所述的杂合酶或所述的组合物进行处理。在另一种方式中，提供了一种水解含有胶原酶水解位点的蛋白(底物)的方法，包括：将编码本发明所述的杂合酶多肽的多核苷酸引入到基因工程细胞中，所述基因工程细胞可大规模地被扩繁，将所述的基因工程细胞或其加工产物施用于需要水解处理的对象(例如但不限于：工业原材料、工业加工产物、食品、饮料或饲料)，从而发挥水解作用。

应理解，在本发明的教导下，还存在本发明杂合酶的多种多样的应用模式，这些均应被涵盖在本发明中。

组合物/制剂/试剂盒

本发明提供了一种组合物，其中包含有效量的杂合酶，以及余量的生物学上可接受的载体。

所述组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：冻干剂，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物或微胶囊。

应理解，只要能够将本发明所述的杂合酶在保持全部或部分活性的前提递送到需要解毒处理的对象(例如但不限于：工业原材料、工业加工产物、食品、饮料或饲料)的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，作为一些优选的方式，所述组合物可以是冻干剂、液体剂、喷洒剂或喷雾剂。

浓缩型的组合物中活性成分(多肽)的含量较高，如可含有占比5-90％或10-90％的杂合酶含量，而稀释型组合物中活性成分含量较低，例如可以为0.00005-4.99％。此外，还可以包含其他合适的成分，如前面所列举的各种生物学上可接受的载体。

在一些需要的情况下，本发明组合物中还可以含有其它活性酶共同混合而制备组合物，以实现通过一次使用而将多种底物进行水解。

本发明的杂合酶、含有其的载体或宿主细胞、含有其或其宿主细胞的组合物，还可被包含在容器或试剂盒中。较佳地，所述的试剂盒中还包括使用说明书等，以便于本领域技术人员应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

酶活性测定方法

PZ肽测活方法：将0.5mL 1mg/mL底物溶液和0.1mL 0.1mol/L氯化钙溶液转移到试管中混合，并在25℃孵育15min。向上述试管中加入0.025mL样品溶液开始反应(用0.025mL0.1mol/L pH 7.1Tris-HCl缓冲液替换样品溶液以作为空白对照)。反应15min后，立即转移0.5mL反应液至含有1.0mL 0.025mol/L柠檬酸的试管中，涡旋混合20s，以终止反应。再向上述试管中加入5mL乙酸乙酯涡旋混合20s，萃取反应生产的PZ-Pro-Leu。转移4mL乙酸乙酯相(上层)至含有0.35-0.4g无水硫酸钠的试管中，并充分涡旋混匀。将上清液转移到比色皿中，在320nm处记录吸光度。

以下面公式计算胶原酶的活性：

U/mL＝(A-AB)×[VT×VE/(ε×V×VR×B×T)]×D；

其中A＝样品溶液的吸光度；

AB＝空白对照的吸光度；

VT＝反应液体积，mL；

VE＝萃取混合物中乙酸乙酯体积，mL；

ε＝PZ-Pro-Leu在320nm下的消光系数，21(1cm²·μmoL^-1)；

V＝样品溶液的体积，mL；

VR＝转移至柠檬酸中的反应液体积，mL；

B＝吸收路径长度，cm；

T＝孵育时间，min；

D＝稀释倍数。

在测定条件下，一个酶活力单位定义为每分钟从底物PZ肽中释放1μmol的PZ-Pro-Leu的酶量。

明胶和胶原蛋白的测活方法：采用常规茚三酮显色法：用缓冲液配置胶原蛋白(或明胶)溶液，取胶原蛋白(或明胶)溶液与胶原酶溶液反应。反应结束后，向试管中加入HCl终止反应。并向终止反应试管中加入醋酸缓冲液、茚三酮溶液(以乙二醇为溶剂)、氯化亚锡溶液等显色，在570nm处记录吸光度变化。同时以甘氨酸为标准氨基酸作出标准曲线，以上述胶原酶反应的吸光度在标准曲线上计算出生成的氨基酸含量来计算胶原酶活性。

相对酶活性：按照PZ肽或茚三酮法测定的活性除以酶的浓度，即相对酶浓度的活性。

实施例1、杂合酶与ColHΔC表达菌的构建

本发明人构建杂合酶和ColHΔC，杂合酶和结构示意图如图1所示。获取ColH的胶原酶结构域，与ColG的PKD-CBD1-CBD2结构域，共同形成杂合酶。

利用重叠延伸PCR技术将colG和colH进行融合构建杂合酶基因。图2显示的是利用重叠延伸PCR技术进行异源基因片段融合操作的步骤。引物R1和F2除了含有与模板互补的序列外，在其5’端分别添加与对应融合基因重叠的基因序列(在图中以红色和黄色表示引物的重叠区域)。

杂合酶氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

VQNESKRYTVSYLKTLNYYDLVDLLVKTEIENLPDLFQYSSDAKEFYGNKTRMSFIMDEIGRRAPQYTEIDHKGIPTLVEVVRAGFYLGFHNKELNEINKRSFKERVIPSILAIQKNPNFKLGTEVQDKIVSATGLLAGNETAPPEVVNNFTPILQDCIKNIDRYALDDLKSKALFNVLAAPTYDITEYLRATKEKPENTPWYGKIDGFINELKKLALYGKINDNNSWIIDNGIYHIAPLGKLHSNNKIGIETLTEVMKVYPYLSMQHLQSADQIKRHYDSKDAEGNKIPLDKFKKEGKEKYCPKTYTFDDGKVIIKAGARVEEEKVKRLYWASKEVNSQFFRVYGIDKPLEEGNPDDILTMVIYNSPEEYKLNSVLYGYDTNNGGMYIEPEGTFFTYEREAQESTYTLEELFRHEYTHYLQGRYAVPGQWGRTKLYDNDRLTWYEEGGAELFAGSTRTSGILPRKSIVSNIHNTTRNNRYKLSDTVHSKYGASFEFYNYACMFMDYMYNKDMGILNKLNDLAKNNDVDGYDNYIRDLSSNYALNDKYQDHMQERIDNYENLTVPFVADDYLVRHAYKNPNEIYSEISEVAKLKDAKSEVKKSQYFSTFTLRGSYTGGASKGKLEDQKAMNKFIDDSLKKLDTYSWSGYKTLTAYFTNYKVDSSNRVTYDVVFHGYLTDNADISN NKAPIAKVTGPSTGAVGRNIEFSGKDSKDEDGKIVSYDWDFGDGATSRGKNSVHAYKKAGTYNVTLKVTDDKGATAT ESFTIEIKNEDTTTPITKEMEPNDDIKEANGPIVEGVTVKGDLNGSDDADTFYFDVKEDGDVTIELPYSGSSNFTWL VYKEGDDQNHIASGIDKNNSKVGTFKSTKGRHYVFIYKHDSASNISYSLNIKGLGNEKLKEKENNDSSDKATVIPNF NTTMQGSLLGDDSRDYYSFEVKEEGEVNIELDKKDEFGVTWTLHPESNINDRITYGQVDGNKVSNKVKLRPGKYYLL VYKYSGSGNYELRVNK

其中，第1-677位为胶原酶结构域，第678-773位为PKD，第777-894位为CBD1，第899-1009位为CBD2。

ColHΔC基酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

VQNESKRYTVSYLKTLNYYDLVDLLVKTEIENLPDLFQYSSDAKEFYGNKTRMSFIMDEIGRRAPQYTEIDHKGIPTLVEVVRAGFYLGFHNKELNEINKRSFKERVIPSILAIQKNPNFKLGTEVQDKIVSATGLLAGNETAPPEVVNNFTPILQDCIKNIDRYALDDLKSKALFNVLAAPTYDITEYLRATKEKPENTPWYGKIDGFINELKKLALYGKINDNNSWIIDNGIYHIAPLGKLHSNNKIGIETLTEVMKVYPYLSMQHLQSADQIKRHYDSKDAEGNKIPLDKFKKEGKEKYCPKTYTFDDGKVIIKAGARVEEEKVKRLYWASKEVNSQFFRVYGIDKPLEEGNPDDILTMVIYNSPEEYKLNSVLYGYDTNNGGMYIEPEGTFFTYEREAQESTYTLEELFRHEYTHYLQGRYAVPGQWGRTKLYDNDRLTWYEEGGAELFAGSTRTSGILPRKSIVSNIHNTTRNNRYKLSDTVHSKYGASFEFYNYACMFMDYMYNKDMGILNKLNDLAKNNDVDGYDNYIRDLSSNYALNDKYQDHMQERIDNYENLTVPFVADDYLVRHAYKNPNEIYSEISEVAKLKDAKSEVKKSQYFSTFTLRGSYTGGASKGKLEDQKAMNKFIDDSLKKLDTYSWSGYKTLTAYFTNYKVDSSNRVTYDVVFHGYL

表1为所使用的引物序列。利用重叠延伸PCR技术和普通PCR技术分别扩增杂合酶的基因片段。

表1、引物

如图3所示，琼脂糖电泳显示的PCR产物大小与预期产物大小相符。通过切胶回收PCR产物，去除非特异性产物等杂质。

根据实验方法所述，进行PCR产物与pET28a质粒的双酶切以及酶切产物的连接，用连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，对转化的DH5α菌落进行菌液PCR的鉴定。

图4为重组克隆菌的菌液PCR鉴定结果，分别挑选2个阳性菌落送至测序公司进行测序鉴定。

实施例2、杂合酶和ColHΔC的表达与纯化

抽取鉴定正确的质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，构建重组表达菌。

图5为重组表达菌的表达鉴定结果。从表达鉴定图可见，杂合酶在大肠杆菌中的表达方式与ColH在大肠杆菌的表达方式一致，均以可溶性表达为主，所以后续的纯化也是以菌体超声破碎后的上清液为原材料。

杂合酶和ColHΔC重组表达菌的诱导表达和胶原酶的纯化。杂合酶与ColH一样均在90mmol/L NaCl处被洗脱，通过两步纯化得到纯度较高的胶原酶示。杂合酶在150mmol/L咪唑浓度下被洗脱，从Q柱纯化结果可看出，通过亲和层析和离子交换层析可去除大部分杂质得到纯度较高的杂合酶。

实施例3、ColH和杂合酶对不同底物活性的比较

1、不同酶对不同底物水解活性比较

进行胶原酶的活性测定，分别以PZ肽、明胶和胶原蛋白为底物，取相同摩尔量的ColHΔC、ColH和杂合酶，比较ColH、ColHΔC和杂合酶对不同底物水解活性的差异。

结果如图6所示。从图中可看出，在检测的三种底物中，杂合酶水解活性均为最高，ColHΔC均为最低。

2、SDS-PAGE测定不同酶对底物的降解进程

通过SDS-PAGE显示ColH、ColHΔC和杂合酶降解明胶和胶原蛋白的进程。实验结果如图7所示。

从ColH、ColHΔC和杂合酶降解明胶的SDS-PAGE电泳图，可明显看出杂合酶水解活性最高，ColHΔC的水解活性最低；水解1h后，杂合酶实验组中大分子底物已被水解完全，而ColHΔC实验组中大分子底物在电泳图中还很明显，该结果与上述测定ColH、ColHΔC和杂合酶对明胶的水解活性结果相符。

通过SDS-PAGE显示，ColH、ColHΔC和杂合酶对明胶和胶原蛋白的水解进程，发现杂合酶对大分子的水解活性最高，ColHΔC最低。

通过SDS-PAGE电泳法研究ColG和ColH降解胶原蛋白的过程，可见ColG和ColH在水解胶原蛋白模式上是存在差异。从图7杂合酶降解胶原蛋白的SDS-PAGE图中可明显看出，在杂合酶降解过程中并未产生像ColH水解胶原蛋白那样50-80kDa片段产物，所以认为C端的附属结构域是导致胶原酶降解胶原蛋白模式存在差异的原因。

3、茚三酮显色法测定不同酶水解胶原纤维的差异

以猪皮(胶原蛋白)为底物通过茚三酮显色法测定了ColH与杂合酶对水解胶原纤维的差异。

结果显示，杂合酶的活性是23.1units/mL，ColH的活性是10.4units/mL，杂合酶的活性是ColH的2.2倍。

实施例4、杂合酶的稳定性

1、温度稳定性

杂合酶和ColH在25℃、30℃、40℃、50℃、55℃和60℃水浴1h后对明胶水解活性的变化如图8所示。从图中可看出，在55℃下杂合酶和ColH的稳定性基本无差异，温浴1h后，还都能保留90％以上的活性；但是当温度为60℃时，ColH温浴1h后完全丧失对明胶的水解活性，但是杂合酶温浴1h后还残存约20％的明胶水解活性。温度为60℃时，杂合酶的稳定性不仅高于ColH，同样也高于ColG的稳定性。

因此，将ColH的催化域与ColG的C端附属结构域融合可显著提高胶原酶的温度稳定性。

2、pH稳定性

杂合酶和ColH在25℃pH3-11的缓冲液中孵育1h后，对明胶水解活性的变化如图9所示。从pH稳定性曲线可看出，在缓冲液的pH高于6的条件下，杂合酶和ColH都具有很高的稳定性，在该pH下25℃放置1h后，杂合酶和ColH对明胶的水解活性均基本无损失；但是当缓冲液的pH低于4时，杂合酶和ColH都不稳定。

从pH稳定性曲线还可明显看出，在pH为4～5的缓冲液条件下，杂合酶的稳定性要显著高于ColH的稳定性。因此，将ColH的催化域与ColG的C端附属结构域融合可以显著增加pH稳定性。

实施例5、金属离子对杂合酶活性的影响

金属离子(5mM)对杂合酶和ColH水解PZ肽活性的影响如图10所示。从图中可看出，金属离子对杂合酶和ColH水解PZ肽影响效果基本一致，Co²⁺对杂合酶和ColH水解PZ肽均有明显的促进作用，Cu²⁺、Fe²⁺和Al³⁺则完全抑制杂合酶和ColH水解PZ肽的活性。

金属离子对杂合酶和ColH水解明胶和胶原蛋白活性的影响如图11所示。Mg²⁺、Mo²⁺和Ca²⁺对杂合酶和ColH水解明胶均无促进作用；但是Ca²⁺对ColH水解胶原具有促进作用，Mg² ⁺、Mo²⁺和Ca²⁺对杂合酶水解胶原均具有促进作用，且Ca²⁺的促进作用最显著。

钙离子具有促进CBD与胶原蛋白的结合能力，从而促进胶原酶对胶原蛋白的水解。

本发明人观测到，钙离子对杂合酶和ColH的热稳定性具有重要作用，在钙离子存在下，杂合酶和ColH在53℃孵育6h后，均保留90％以上的活性；在无钙离子时，胶原酶活性随着孵育时间的延长逐渐降低，杂合酶在孵育6h后完全失活，而ColH在孵育12h后也仅保留8％的活性。同时也观察到相同的现象：无论有无钙离子，ColH的热稳定性总高于同条件下的杂合酶的热稳定性，如图12A。

研究钙离子对杂合酶和ColH抗冻融稳定性的影响。在钙离子存在下，杂合酶和ColH在进行反复冻融7次后，活性均保留在90％左右；去除钙离子后，对杂合酶和ColH抗冻融稳定性能力影响不大，反复冻融7次后，活性均保留在80％左右。

实验结果还显示，杂合酶抗冻融稳定性的能力一定程度地高于ColH，如图12B。

实施例6、ColHΔC、ColH和杂合酶酶学参数的测定

测定ColHΔC、ColH和杂合酶的酶学参数，实验结果如表2所示。

表2、ColH和杂合酶的酶学参数(PZ肽为底物)

	Km(mmol/L)	Kcat(min^-1)	Kcat/Km(min*mmol/L)
				ColH	0.4589	18.42	40.14
杂合酶	0.2626	16.44	62.60
				ColHΔC	0.4149	15.42	37.17

根据上表，ColHΔC、ColH和杂合酶的Kcat值基本无差异，但杂合酶的Km值最小，表明杂合酶对PZ肽的亲和力最高，杂合酶的Kcat/Km最大。删除附属结构域片段会导致胶原蛋白水解活性的丧失，但是对PZ肽这种小分子无影响，通过该实验结果发现附属结构域可能也参与了PZ肽的识别。

4、结论

上述实施例中，通过PCR技术成功构建了5’ColH-3’ColG和ColHΔC的基因片段，并成功获得了杂合酶和ColHΔC的重组表达菌。通过Ni-NTA亲和柱和Q-sepharose离子交换层析柱，成功获得了纯度较高的杂合酶和ColHΔC。

比较ColH、ColHΔC和杂合酶对PZ肽、明胶和胶原蛋白的水解活性，结果显示杂合酶对三种底物的水解活性均为最高，ColHΔC最低。利用SDS-PAGE研究明胶的水解进程，也得出相同的结论，杂合酶对明胶中大分子的水解活性是最高的。

测定了ColH和杂合酶对猪皮水解活性，显示杂合酶的活性是ColH的2.2倍。

对杂合酶的基本酶学性质进行了研究，杂合酶的最适pH曲线与ColH相似，在pH为6时对明胶具有最大水解活性；杂合酶的pH稳定性曲线与ColG相似，在pH高于5时均具有很高的稳定性；金属离子对杂合酶水解PZ的影响效果与ColH相似，钙离子对杂合酶水解胶原蛋白具有促进作用。钙离子对杂合酶的稳定性也具有重要作用，去除酶溶液中钙离子杂合酶的温度酶稳定性会降低而且易发生降解(包括自水解)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims

1.一种改造胶原酶、提高胶原酶水解活性的方法，其特征在于，所述方法包括：将胶原酶结构域与PKD-CBD1-CBD2结构域相互连接；

其中，所述胶原酶结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第1～677位所示；所述PKD结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第678-773位所示，所述CBD1结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第777-894位所示，所述CBD2结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中第899-1009位所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，改造的酶蛋白从氨基端到羧基端依次包含：胶原酶结构域，PKD-CBD1-CBD2结构域；或

经改造的酶蛋白中，所述胶原酶结构域、所述PKD-CBD1-CBD2结构域通过肽键连接；或

经改造的酶蛋白的Kcat/Km高于45min*mmol/L；较佳地高于50min*mmol/L；更佳地高于55min*mmol/L；更佳地高于60min*mmol/L；或

经改造的酶蛋白的Km值低于0.35mmol/L；较佳地低于0.3mmol/L；更佳地低于0.28mmol/L。

3.一种经改造的酶蛋白，其特征在于，所述酶蛋白由相互连接的以下的蛋白片段形成：胶原酶结构域，PKD-CBD1-CBD2结构域；

4.权利要求1所述的经改造的酶蛋白的用途，用于：

降解含有胶原酶水解位点的蛋白；或

制备降解含有胶原酶水解位点的蛋白的组合物；

较佳地，所述含有胶原酶水解位点的蛋白为胶原蛋白。

5.一种核酸分子或含有该核酸分子的重组载体，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求3所述的经改造的酶蛋白。

6.一种基因工程细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求5所述的重组载体或其基因组中整合有权利要求5所述的核酸分子。

7.一种用于降解含有胶原酶水解位点的蛋白的组合物，其特征在于，所述的组合物含有：

(i)权利要求3所述的经改造的酶蛋白；和

(ii)生物学上可接受的载体。

8.一种降解含有胶原酶水解位点的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求3所述的经改造的酶蛋白或权利要求7所述的组合物处理所述含有胶原酶水解位点的蛋白或包含其的对象。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，进行所述降解时，

反应体系的温度为0～70℃；较佳地为5～65℃或10～65℃；或

反应体系的pH值范围3～13；较佳地pH值范围为4～12或4～11；或

反应体系中，添加Co²⁺以促进酶的活性；较佳地，该体系中包含PZ肽；较佳地，Co²⁺在体系中的终浓度为1～5mM；或

反应体系中，添加Ca²⁺、Mg²⁺或Co²⁺以促进酶的活性；较佳地，该体系中包含明胶或胶原蛋白；较佳地，Ca²⁺在体系中的终浓度为1～10mM；较佳地，Mg²⁺在体系中的终浓度为1～10mM；较佳地，Co²⁺在体系中的终浓度为1～10mM。

10.一种用于降解含有胶原酶水解位点的蛋白的试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求3所述的经改造的酶蛋白；

较佳地，所述试剂盒中还包括选自下组的金属离子：Ca²⁺、Mg²⁺或Co²⁺，或能产生Ca²⁺、Mg²⁺或Co²⁺的物质。