KR101920094B1

KR101920094B1 - 효모에서 엔테로키나아제를 생산하는 조성물과 방법

Info

Publication number: KR101920094B1
Application number: KR1020137016104A
Authority: KR
Inventors: 이안 포더링험; 피터 제이. 셰필드
Original assignee: 알러간, 인코포레이티드
Priority date: 2010-11-23
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2018-11-19
Also published as: US8557558B2; CA2816217C; WO2012071257A1; RU2013128339A; EP2643457B1; MY170261A; ES2553149T3; US20130302853A1; IL226165A; KR20140018850A; CL2013001476A1; JP2014501511A; IL226165A0; CN103282490A; SG190316A1; NZ611164A; US20120156720A1; RU2560577C2; AU2011332131A1; JP5425350B2

Abstract

본 명세서에서는 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자, 효모 발현 벡터 및 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체, 이런 효모 발현 구조체를 포함하는 효모 세포, 이런 효모 세포를 이용하여 엔테로키나아제를 생산하는 방법, 그리고 이런 방법에 의해 생산된 엔테로키나아제를 이용하여 재조합 폴리펩티드를 개열하거나 제조하는 방법을 개시한다.

Description

효모에서 엔테로키나아제를 생산하는 조성물과 방법{Compositions and Methods of Producing Enterokinase in Yeast}

Ian Fotheringham 및 Peter J. Sheffield

본 출원은 전체로서 참고문헌으로 편입되는, 2010년 11월 23일자 제출된 U.S. 특허가출원 번호 61/416,622에 35 U.S.C. § 119(e)에 따른 우선권을 주장한다.

엔테로키나아제 (EK, 일명 엔테로펩티다아제 (EP); EC 3.4.21.9)는 십이지장의 세포에 의해 생산되는 이형이합체성 당단백질이다. 세린 프로테아제의 키모트립신-일족의 일부인 이것은 위에서 옮겨지고 십이지장과 공장 점막 내에 존재하는 섭취된 음식물의 진입 이후에, 장선 (리베르퀸선)으로부터 분비된다. 식이 단백질의 소화에 관여하는 EK는 트립시노겐으로부터 N-말단 산성 펩티드 단편의 개열을 촉진하여 이 치모겐을 활성 형태 트립신으로 전환시킨다. 트립신의 활성화는 일련의 단백분해 반응을 개시하여, 키모트립시노겐, 프로엘라스타아제, 프로카르복시펩티다아제, 그리고 일부 프로리파아제를 비롯한 많은 췌장 치모겐의 활성화를 유발한다.

엔테로키나아제는 예로써, 인간, 소, 쥐, 그리고 생쥐를 비롯한 몇몇 포유동물 공급원으로부터 클로닝되었다. 구조적으로, EK는 창자 브러시 테두리 막에서 엔테로키나아제를 고정하는 약 82-140 kDa 중쇄, 그리고 촉매 아단위를 내포하는 약 35-62 kDa 경쇄를 포함하는 세린 프로테아제이다. 경쇄는 단일 이황화 가교를 거쳐 중쇄에 연결된다. 이러한 단일 도메인간 이황화 가교에 더하여, 경쇄는 특정한 도메인내 이황화 결합을 형성하는 것으로 밝혀진 추가의 8개 시스테인 잔기를 내포한다. 엔테로키나아제 경쇄는 촉매 활성을 내포하고 개열에 충분하다. EK 및 이의 촉매 활성 단편은 펜타-펩티드 서열 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (서열 번호: 1)에 고도로 특이적이고, 리신 잔기 뒤 (DDDDK^↓)에 위치하는 갈라지기 쉬운 결합을 개열한다.

높은 정도의 특이성으로 인하여, EK는 생화학적 및 생물공학 적용에서 적절한 반응물로서 이용되고 있다. 가령, EK 개열 부위에 의해, 이 서열에 의해 연결된 C-말단 정제 태그 (가령, 폴리-His)를 내포하는 융합 단백질은 단백질 정제 이후에 표적 단백질을 획득하기 위해, 정제 태그를 제거하는 EK에 의해 개열될 수 있다. 대안으로, 활성화에 앞서 개열되어야 하는 프로테아제의 N-말단 프로-서열은 엔테로키나아제로 활성화가 가능하도록 돌연변이되어야 한다.

재조합 엔테로키나아제 (rEK)는 촉매 경쇄 도메인만을 포함하는 28 kDa 단백질을 생산하는 유전자를 이용하는 대장균 (Escherichia coli)과 같은 세균 및 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)와 같은 효모 둘 모두에서 성공적으로 생산되었다. 하지만, 상업적 적용을 위한 충분한 수율로 이러한 재조합 효소를 발현하는 관점에서 어려움이 여전하다. 본 명세서는 상업적 적용에 유용한 비용-효과적 방식과 양으로 재조합 엔테로키나아제를 생산하는데 유용한 개선된 발현 작제를 개시한다.

요약

본 명세서의 양상은 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 개시한다. 엔테로키나아제를 인코딩하는 개시된 폴리뉴클레오티드 분자에는 제한 없이, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 이들의 뉴클레오티드 변이체, 이들의 절두된 변이체, 및/또는 이들의 보체가 포함된다. 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드는 효모 발현 벡터를 더욱 포함할 수 있다. 다른 양상은 효모 발현 벡터 및 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체를 개시한다.

본 명세서의 다른 양상은 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체를 포함하는 효모 세포를 개시한다. 개시된 효모 발현 구조체는 효모 세포에서 일시적으로 내포되거나, 또는 효모 세포에서 안정적으로 내포될 수 있다. 효모 세포에는 제한 없이, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주로부터 세포, 피치아 메탈로니카 (Pichia methanolica) 균주로부터 세포, 피치아 안구스타 (Pichia angusta) 균주로부터 세포, 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 균주로부터 세포, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 균주로부터 세포, 또는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 균주로부터 세포가 포함된다.

본 명세서의 또 다른 양상은 효모 발현 구조체를 이용하여 엔테로키나아제를 생산하는 방법을 개시한다. 이들 개시된 방법은 본원에서 개시된 효모 발현 구조체를 효모 세포에서 발현하는 단계를 포함한다. 다른 양상은 본원에서 개시된 효모 발현 구조체를 효모 세포 내로 도입하는 단계 및 발현 구조체를 효모 세포에서 발현하는 단계를 포함하는, 엔테로키나아제를 생산하는 방법을 제시한다.

본 명세서의 또 다른 양상은 엔테로키나아제를 이용하여 엔테로키나아제 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 개열하기 위한 방법을 개시한다. 이들 개시된 방법은 엔테로키나아제 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 엔테로키나아제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드와 상기 엔테로키나아제의 접촉은 엔테로키나아제 개열 부위의 특정한 개열을 유발한다. 이용된 엔테로키나아제는 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 인코딩되는, 본원에서 개시된 효모 발현 구조체를 이용하여 생산되는, 및/또는 본원에서 개시된 효모 세포에서 발현함으로써 생산되는 것일 수 있다.

본 명세서의 다른 양상은 엔테로키나아제를 이용하여 엔테로키나아제 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법을 개시한다. 이들 개시된 방법은 엔테로키나아제 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 엔테로키나아제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리펩티드와 상기 엔테로키나아제의 접촉은 엔테로키나아제 개열 부위의 특정한 개열을 유발한다. 이용된 엔테로키나아제는 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 인코딩되는, 본원에서 개시된 효모 발현 구조체를 이용하여 생산되는, 및/또는 본원에서 개시된 효모 세포에서 발현함으로써 생산되는 것일 수 있다.

도면의 간단한 설명
도 1은 본원에서 개시된 통합된 EK 카세트를 포함하는 6가지 상이한 효모 세포주로부터 생산된 엔테로키나아제의 평균 효소적 활성의 그래프를 도시한다.

상세한 설명

효모 발현 시스템은 이종기원 폴리펩티드에 대한 생산 시스템으로서 여러 이점을 제공한다. 첫째, 효모 세포는 발효기에서 고 바이오매스 (>300 g/L 습식 세포 중량)로 성장되고, 다량의 원하는 폴리펩티드를 생산하기 위한 밀집한 배양액을 제공할 수 있다. 둘째, 원핵 발현 시스템과 달리, 효모 발현 시스템은 진핵 폴리펩티드에 특이적인 번역 후 접힘 및 기타 변형을 정확하게 지배하고, 따라서 이종기원 폴리펩티드의 생물학적 활성, 기능과 안정성의 보존을 담보할 수 있다. 셋째, 효모 발현 시스템은 다예하고 융통성이 있어, 1) 염색체외 또는 게놈-기초된 발현; 2) 발현의 구조성 또는 유도성 제어, 그리고 3) 발현된 이종기원 폴리펩티드를 특정한 세포 또는 세포외 구획으로 지향시켜 단리와 정제를 용이하게 하는 능력을 제공한다.

본 명세서는 상업적 적용에 유용한 비용-효과적 방식과 충분히 많은 양으로 재조합 엔테로키나아제를 생산하는데 유용한 개선된 발현 작제를 개시한다. 이들 결과는 엔테로키나아제를 인코딩하는 개시된 유전자-조작된 폴리뉴클레오티드 분자 중에서 임의의 한 가지를 이용하여 달성될 수 있다. 일단 효모 발현 벡터 내로 클로닝되고 효모 세포 내로 도입되면, 이들 조작된 분자는 현재 가능한 것보다 훨씬 많은 양의 엔테로키나아제를 생산할 수 있다.

따라서 본 명세서의 양상은 부분적으로, 폴리뉴클레오티드 분자를 제시한다. 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 분자는 생물체의 게놈으로부터 단리된 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA, 재조합적으로 생산된 cDNA, 또는 화학적으로 합성된 DNA 분자일 수 있다. 게다가, "단리된" 폴리뉴클레오티드 분자는 전형적으로, 게놈 공급원으로부터 단리되거나 재조합 기술에 의해 생산될 때, 다른 세포 물질이 실질적으로 없고, 또는 화학적으로 합성될 때, 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없다.

본 명세서의 양상은 부분적으로, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제시한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "엔테로키나아제"는 "EK"와 동의이고, 그리고 리신 잔기 뒤 (DDDDK^↓)에 위치하는 갈라지기 쉬운 결합에서 펜타-펩티드 서열 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (서열 번호: 1)을 선별적으로 인식하고 개열할 수 있는 임의의 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 엔테로키나아제와 관련하여 용어 "선별적으로 인식하고 개열한다"는 분자 내에 위치하는 임의의 다른 펜타-펩티드 서열과 실질적으로 상호작용하고 개열하지 않으면서, 엔테로키나아제와 서열 번호: 1을 포함하는 분자의 차별적 상호작용 및 서열 번호: 1의 리신 잔기 뒤에 위치하는 갈라지기 쉬운 결합의 개열을 지칭한다. 따라서 엔테로키나아제는 약 82-140 kDa 중쇄 및 단일 이황화 가교에 의해 연결된 약 35-62 kDa 경쇄를 포함하는 고유 이형이합체성 당단백질뿐만 아니라 임의의 촉매 활성 경쇄 단편을 지칭한다. 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 만드는 실례는 실시예 1, 2, 그리고 4-6에서 기술된다.

구체예에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "보체"는 엔테로키나아제를 인코딩하는 센스 분자에 대한 안티-센스 분자인 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 다른 유형의 폴리펩티드 분자, 예를 들면, 정제 태그, 세포 분비 신호, 및/또는 세포 이하 국지화 신호를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역을 포함할 수 있다. 이런 부류의 예시적인 폴리뉴클레오티드 분자는 서열 번호: 6이다. 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 또한, 예로써 전사, 번역, 및/또는 번역후 가공 처리의 양상을 주동하거나 조장하는 제어 또는 조절 폴리뉴클레오티드 영역을 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체의 뉴클레오티드 변이체일 수 있고, 단서로서 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체에서 뉴클레오티드 변화는 폴리뉴클레오티드 변이체에 의해 인코딩된 엔테로키나아제의 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. 따라서 본원에서 개시된 서열 번호: 4 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 5의 엔테로키나아제를 인코딩하고, 그리고 본원에서 개시된 서열 번호: 6 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 7의 엔테로키나아제를 인코딩한다.

이러한 구체예의 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 분자는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체의 폴리뉴클레오티드 서열에 예로써, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 동일할 수 있다

이러한 구체예의 다른 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 분자는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체에 비하여 예로써, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 30, 약 5 내지 약 25, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 35, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 45, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 45, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 55, 또는 약 10 내지 약 60개의 비-연속 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 분자는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체에 비하여 예로써, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 30, 약 5 내지 약 25, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 35, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 45, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 45, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 55, 또는 약 10 내지 약 60개의 연속 뉴클레오티드 치환을 가질 수 있다.

전체적인 방법, 국지적인 방법 및 하이브리드 방법, 예를 들면, 분절 접근 방법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 서열 정렬 방법이 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 동일성 비율을 결정하는데 이용될 수 있다. 동일성 비율을 결정하기 위한 프로토콜은 본원의 교시로부터 당업자의 평균적인 지식의 범위 내에서 일과적인 절차이다.

전체적인 방법은 분자의 처음에서부터 끝까지 서열을 정렬하고, 그리고 개별 잔기 쌍의 스코어를 합산하고 갭 페널티 (gap penalty)를 부가함으로써 최적 정렬을 결정한다. 무제한적 방법에는 예로써, CLUSTAL W (예로써, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)을 참조한다); 그리고 반복적 보정 (iterative refinement) (예로써, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)을 참조한다)이 포함된다.

국지적인 방법은 모든 입력 서열에 의해 공유된 하나 또는 그 이상의 보존된 모티프를 확인함으로써 서열을 정렬한다. 무제한적 방법에는 예로써, 매치-박스 (Match-box) (예로써, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509 (1992)를 참조한다); 깁스 표집법 (Gibbs sampling) (예로써, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993)를 참조한다); Align-M (예로써, Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics,:1428-1435 (2004)를 참조한다)이 포함된다.

하이브리드 방법은 전체적인 정렬 방법과 국지적인 정렬 방법 둘 모두의 기능적 양상을 합동한다. 무제한적 방법에는 예로써, 분절-대-분절 비교 (예로써, Burkhard Morgenstern et al., Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based 0n Segment-To-Segment Comparison, 93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 12098-12103 (1996)을 참조한다); T-Coffee (예로써, Cedric Notredame et al., T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment, 302(1) J. Mol. Biol. 205-217 (2000)을 참조한다); MUSCLE (예로써, Robert C. Edgar, MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput, 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797 (2004)을 참조한다); 그리고 DIALIGN-T (예로써, Amarendran R Subramanian et al., DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment, 6(1) BMC Bioinformatics 66 (2005)을 참조한다)가 포함된다.

이러한 구체예의 다른 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 분자는 엄격한 조건 하에, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 변이체일 수 있다. 이런 엄격한 혼성화 조건은 당업자에게 공지되어 있고 예로써, 전체로서 참고문헌으로 편입되는 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6에서 찾아볼 수 있다. 엄격한 (가령, 높은 엄격도) 혼성화 조건의 무제한적 실례는 약 45℃에서 6x 염화나트륨/구연산나트륨 (SSC)에서 혼성화, 그 이후에 50-65℃에서 0.2 x SSC, 0.1% SDS에서 1회 또는 그 이상 세척이다.

이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 분자는 표 1에 개시된 폴리뉴클레오티드 변이체일 수 있다. 상기 표는 엔테로키나아제 경쇄의 아미노산 서열, 이러한 경쇄 단편을 인코딩하는 서열 번호: 4와 서열 번호: 6의 폴리뉴클레오티드 영역의 개방 해독틀을 포함하는 코돈, 그리고 서열 번호: 4와 서열 번호: 6의 코돈에 대해 치환될 수 있는 코돈 변이체를 포함한다. 이러한 구체예의 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 분자는 예로써, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6 내에 상응하는 코돈 존재에 대해 치환되는, 표 1의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 변이체 코돈을 갖는다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 분자는 예로써, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6에서 상응하는 코돈 존재에 대해 치환되는, 표 1의 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 변이체 코돈을 갖는다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 분자는 예로써, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6에서 상응하는 코돈 존재에 대해 치환되는, 표 1의 최대한 1, 최대한 2, 최대한 3, 최대한 4, 최대한 5, 최대한 6, 최대한 7, 최대한 8, 최대한 9, 최대한 10, 최대한 11, 최대한 12, 최대한 13, 최대한 14, 최대한 15, 최대한 16, 최대한 17, 최대한 18, 최대한 19, 또는 최대한 20개의 변이체 코돈을 갖는다.

엔테로키나아제의 핵산 서열

아미노산

I

V

G

S

D

S

R

E

G

A

W

코돈

ATA

GTT

GGC

TCT

GAC

TCC

AGA

GAA

GGT

GCC

TGG

변이체

ATT
ATC

-

GGT
GGA

-

GAT

TCT

-

GGA

GCT

-

아미노산

P

W

V

A

L

Y

F

D

Q

코돈

CCA

TGG

GTC

GTT

GCC

TTA

TAC

TTT

GAT

CAA

CAG

변이체

CCT

-

GTT

-

GCT

TTG

TAT

-

CAA

아미노산

V

C

G

A

S

L

V

S

R

D

W

L

코돈

GTC

TGT

GGT

GCT

TCA

CTT

GTT

TCT

AGA

GAT

TGG

TTG

변이체

GTT

-

GGA

-

TCT

TTG

-

아미노산

V

S

A

H

C

V

Y

G

R

N

M

코돈

GTG

TCC

GCA

CAT

TGT

GTG

TAT

GGT

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AAT

ATG

변이체

GTT

TCT

GCT

-

GTT

TAC

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아미노산

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G

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변이체

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아미노산

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-

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ACT

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-

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아미노산

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I

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변이체

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TTG

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-

ATC

-

ATT

AAC

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아미노산

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A

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AAG

CGT

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AAT

GAC

ATA

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AAC

-

AGA

AAG

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AAC

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ATT
ATC

GCT

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아미노산

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K

V

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Y

T

D

Y

I

코돈

CAC

TTG

GAG

ATG

AAA

GTT

AAC

TAC

ACA

GAC

TAC

ATC

변이체

CAT

-

GAA

-

AAG

-

ACT

GAT

-

ATT

아미노산

Q

P

I

C

L

P

E

N

Q

V

F

코돈

CAA

CCA

ATA

TGT

TTG

CCT

GAG

GAA

AAT

CAG

GTG

TTC

변이체

-

CCT

ATT
ATC

-

CCA

GAA

-

AAC

CAA

GTT

TTT

아미노산

P

G

R

I

C

S

I

A

G

W

G

코돈

CCA

CCT

GGT

CGT

ATT

TGT

AGT

ATT

GCT

GGA

TGG

GGA

변이체

CCT

CCA

GGA

AGA

ATC

-

TCT

ATC

-

GGT

-

GGT

아미노산

A

L

I

Y

Q

G

S

T

A

D

V

L

코돈

GCC

CTG

ATC

TAC

CAA

GGA

TCT

ACC

GCT

GAC

GTA

TTA

변이체

GCT

TTG

ATT

-

GGT

-

ACT

-

GAT

GTT

TTG

아미노산

Q

E

A

D

V

P

L

S

N

E

K

코돈

CAA

GAG

GCA

GAT

GTT

CCT

CTG

TCC

AAC

GAG

AAA

변이체

-

GAA

GCT

-

CCA

TTG

TCT

-

GAA

AAG

아미노산

C

Q

M

P

E

Y

N

I

T

E

코돈

TGC

CAG

CAA

ATG

CCA

GAA

TAC

AAC

ATC

ACT

GAA

변이체

-

CAA

-

CCT

-

ATT

-

아미노산

N

M

V

C

A

G

Y

E

A

G

V

코돈

AAC

ATG

GTT

TGT

GCT

GGT

TAT

GAA

GCT

GGA

GGT

GTA

변이체

-

GGA

TAC

-

GGT

GGA

GTT

아미노산

D

S

C

Q

G

D

S

G

P

L

M

코돈

GAT

TCA

TGC

CAG

GGA

GAT

TCA

GGC

GGT

CCT

CTA

ATG

변이체

-

TCT

-

CAA

GGT

-

TCT

GGT
GGA

GGA

CCA

TTG

-

아미노산

C

Q

E

N

R

W

L

A

G

V

코돈

TGC

CAG

GAG

AAT

AAC

CGA

TGG

TTG

CTT

GCT

GGT

GTA

변이체

-

CAA

GAA

AAC

-

AGA

-

TTG

-

GGA

GTT

아미노산

T

S

F

G

Y

Q

C

A

L

P

N

R

코돈

ACG

AGT

TTT

GGA

TAT

CAA

TGC

GCT

TTA

CCT

AAC

CGT

변이체

ACT

TCT

-

GGT

TAC

-

TTG

CCA

-

AGA

아미노산

P

G

V

Y

A

R

V

P

R

F

T

E

코돈

CCA

GGG

GTC

TAT

GCA

AGA

GTC

CCA

AGA

TTC

ACC

GAG

변이체

CCT

GGT
GGA

GTT

TAC

GCT

-

GTT

CCT

-

TTT

ACT

GAA

아미노산

W

I

Q

S

F

L

H

*

코돈

TGG

ATT

CAA

TCT

TTT

CTG

CAC

TGA

변이체

-

ATC

-

TTG

CAT

TAA

이러한 구체예의 추가의 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 표 2에서 개시된 폴리뉴클레오티드 변이체일 수 있다. 상기 표는 엔테로키나아제 경쇄의 아미노산 서열, 이러한 경쇄 단편을 인코딩하는 서열 번호: 4와 서열 번호: 6의 폴리뉴클레오티드 영역의 개방 해독틀을 포함하는 코돈, 그리고 서열 번호: 4와 서열 번호: 6의 코돈에 대해 치환될 수 있는 코돈 변이체를 포함한다. 이러한 구체예의 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 분자는 예로써, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6에서 상응하는 코돈 존재에 대해 치환되는, 표 2의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 변이체 코돈을 갖는다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 분자는 예로써, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6에서 상응하는 코돈 존재에 대해 치환되는, 표 2의 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 변이체 코돈을 갖는다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 변이체 분자는 예로써, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6에서 상응하는 코돈 존재에 대해 치환되는, 표 2의 최대한 1, 최대한 2, 최대한 3, 최대한 4, 최대한 5, 최대한 6, 최대한 7, 최대한 8, 최대한 9, 최대한 10, 최대한 11, 최대한 12, 최대한 13, 최대한 14, 최대한 15, 최대한 16, 최대한 17, 최대한 18, 최대한 19, 또는 최대한 20개의 변이체 코돈을 갖는다.

엔테로키나아제의 핵산 서열

아미노산

I

V

G

S

D

S

R

E

G

A

W

코돈

ATA

GTT

GGC

TCT

GAC

TCC

AGA

GAA

GGT

GCC

TGG

변이체

ATT

-

GGT

-

GAT

TCT

-

GCT

-

아미노산

P

W

V

A

L

Y

F

D

Q

코돈

CCA

TGG

GTC

GTT

GCC

TTA

TAC

TTT

GAT

CAA

CAG

변이체

-

GTT

-

GCT

TTG

TAT

-

CAA

아미노산

V

C

G

A

S

L

V

S

R

D

W

L

코돈

GTC

TGT

GGT

GCT

TCA

CTT

GTT

TCT

AGA

GAT

TGG

TTG

변이체

GTT

-

TCT

TTG

-

아미노산

V

S

A

H

C

V

Y

G

R

N

M

코돈

GTG

TCC

GCA

CAT

TGT

GTG

TAT

GGT

AGG

AAT

ATG

변이체

GTT

TCT

GCT

-

GTT

TAC

-

AGA

CAA

-

아미노산

E

P

S

K

W

K

A

V

L

G

L

H

코돈

GAG

CCT

TCA

AAG

TGG

AAA

GCT

GTA

TTG

GGG

TTG

CAT

변이체

GAA

CCA

TCT

-

AAG

-

GTT

-

GGT

-

아미노산

M

A

S

N

L

T

S

P

Q

I

E

T

코돈

ATG

GCC

TCT

AAC

CTT

ACA

AGT

CCA

CAA

ATT

GAA

ACT

변이체

-

GCT

-

TTG

ACT

TCT

-

아미노산

R

L

I

D

Q

I

V

I

N

P

H

Y

코돈

AGA

CTA

ATT

GAT

CAA

ATT

GTT

ATC

AAT

CCT

CAT

TAC

변이체

-

TTG

-

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AAC

CCA

-

아미노산

N

K

R

K

N

D

I

A

M

코돈

AAT

AAG

CGT

AGG

AAA

AAC

AAT

GAC

ATA

GCA

ATG

변이체

AAC

-

AGA

AAG

-

AAC

GAT

ATT

GCT

-

아미노산

H

L

E

M

K

V

N

Y

T

D

Y

I

코돈

CAC

TTG

GAG

ATG

AAA

GTT

AAC

TAC

ACA

GAC

TAC

ATC

변이체

CAT

-

GAA

-

AAG

-

ACT

GAT

-

ATT

아미노산

Q

P

I

C

L

P

E

N

Q

V

F

코돈

CAA

CCA

ATA

TGT

TTG

CCT

GAG

GAA

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CAG

GTG

TTC

변이체

-

ATT

-

CCA

GAA

-

AAC

CAA

GTT

TTT

아미노산

P

G

R

I

C

S

I

A

G

W

G

코돈

CCA

CCT

GGT

CGT

ATT

TGT

AGT

ATT

GCT

GGA

TGG

GGA

변이체

-

CCA

-

AGA

-

TCT

-

GGT

-

GGT

아미노산

A

L

I

Y

Q

G

S

T

A

D

V

L

코돈

GCC

CTG

ATC

TAC

CAA

GGA

TCT

ACC

GCT

GAC

GTA

TTA

변이체

GCT

TTG

ATT

-

GGT

-

ACT

-

GAT

GTT

TTG

아미노산

Q

E

A

D

V

P

L

S

N

E

K

코돈

CAA

GAG

GCA

GAT

GTT

CCT

CTG

TCC

AAC

GAG

AAA

변이체

-

GAA

GCT

-

CCA

TTG

TCT

-

GAA

AAG

아미노산

C

Q

M

P

E

Y

N

I

T

E

코돈

TGC

CAG

CAA

ATG

CCA

GAA

TAC

AAC

ATC

ACT

GAA

변이체

-

CAA

-

ATT

-

아미노산

N

M

V

C

A

G

Y

E

A

G

V

코돈

AAC

ATG

GTT

TGT

GCT

GGT

TAT

GAA

GCT

GGA

GGT

GTA

변이체

-

TAC

-

GGT

-

GTT

아미노산

D

S

C

Q

G

D

S

G

P

L

M

코돈

GAT

TCA

TGC

CAG

GGA

GAT

TCA

GGC

GGT

CCT

CTA

ATG

변이체

-

TCT

-

CAA

GGT

-

TCT

GGT

-

CCA

TTG

-

아미노산

C

Q

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W

L

A

G

V

코돈

TGC

CAG

GAG

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AAC

CGA

TGG

TTG

CTT

GCT

GGT

GTA

변이체

-

CAA

GAA

AAC

-

AGA

-

TTG

-

GTT

아미노산

T

S

F

G

Y

Q

C

A

L

P

N

R

코돈

ACG

AGT

TTT

GGA

TAT

CAA

TGC

GCT

TTA

CCT

AAC

CGT

변이체

ACT

TCT

-

GGT

TAC

-

TTG

CCA

-

AGA

아미노산

P

G

V

Y

A

R

V

P

R

F

T

E

코돈

CCA

GGG

GTC

TAT

GCA

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GTC

CCA

AGA

TTC

ACC

GAG

변이체

-

GGT

GTT

TAC

GCT

-

GTT

-

TTT

ACT

GAA

아미노산

W

I

Q

S

F

L

H

*

코돈

TGG

ATT

CAA

TCT

TTT

CTG

CAC

TGA

변이체

-

TTG

CAT

TAA

또 다른 구체예에서, 엔테로키나아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 뉴클레오티드 변이체의 절두된 단편일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체의 절두된 단편"은 서열 번호: 4에 의해 구현된 710개 뉴클레오티드 서열 또는 이의 뉴클레오티드 변이체, 또는 서열 번호: 6에 의해 구현된 953개 뉴클레오티드 서열 또는 이의 뉴클레오티드 변이체로부터 뉴클레오티드의 제거를 지칭한다. 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체의 5'-단부, 3'-단부, 또는 5'-단부와 3'-단부 둘 모두로부터 뉴클레오티드가 제거될 수 있다.

이러한 구체예의 양상에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 뉴클레오티드가 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 보체의 5'-단부, 3'-단부, 또는 5'-단부와 3'-단부 둘 모두로부터 제거된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 최소한 20, 최소한 25, 최소한 30, 최소한 35, 최소한 40, 최소한 45, 또는 최소한 50개의 뉴클레오티드가 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 보체의 5'-단부, 3'-단부, 또는 5'-단부와 3'-단부 둘 모두로부터 제거된다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 최대한 1, 최대한 2, 최대한 3, 최대한 4, 최대한 5, 최대한 6, 최대한 7, 최대한 8, 최대한 9, 최대한 10, 최대한 11, 최대한 12, 최대한 13, 최대한 14, 최대한 15, 최대한 16, 최대한 17, 최대한 18, 최대한 19, 최대한 20, 최대한 25, 최대한 30, 최대한 35, 최대한 40, 최대한 45, 또는 최대한 50개의 뉴클레오티드가 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 보체의 5'-단부, 3'-단부, 또는 5'-단부와 3'-단부 둘 모두로부터 제거된다.

이러한 구체예의 다른 양상에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 코돈이 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 보체의 5'-단부, 3'-단부, 또는 5'-단부와 3'-단부 둘 모두로부터 제거된다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 코돈이 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 보체의 5'-단부, 3'-단부, 또는 5'-단부와 3'-단부 둘 모두로부터 제거된다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 최대한 1, 최대한 2, 최대한 3, 최대한 4, 최대한 5, 최대한 6, 최대한 7, 최대한 8, 최대한 9, 최대한 10, 최대한 11, 최대한 12, 최대한 13, 최대한 14, 최대한 15, 최대한 16, 최대한 17, 최대한 18, 최대한 19, 또는 최대한 20개의 코돈이 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 보체의 5'-단부, 3'-단부, 또는 5'-단부와 3'-단부 둘 모두로부터 제거된다.

본 명세서의 양상은 부분적으로, 효모 발현 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 개시한다. 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 발현 벡터, 피치아 메탈로니카 (Pichia methanolica) 발현 벡터, 피치아 안구스타 (Pichia angusta) 발현 벡터, 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 발현 벡터, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 발현 벡터 및 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 발현 벡터가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 효모 발현 벡터가 EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 발현하는데 이용될 수 있다. 효모 발현 벡터의 무제한적 실례에는 pGal-MF 발현 벡터 (DualsystemsBiotech, AG, Schlieren, CH), pMET 발현 벡터 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), PICHIAPINK 발현 벡터 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), pPICZ 발현 벡터 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), pPpT4Alpha 발현 벡터 (Ingenza, Ltd., Midlothian, UK), pTEF-MF 발현 벡터 (DualsystemsBiotech, AG, Schlieren, CH), pYES 발현 벡터 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)가 포함된다.

효모 발현 벡터는 전형적으로, 예로써 복제, 통합, 전사, 번역, 및/또는 번역후 가공 처리의 양상을 주동하거나 조장하는 제어 또는 조절 폴리뉴클레오티드 영역을 포함한다. 가령, 효모 발현 벡터는 EK 발현을 주동하는데 이용되는 구조성 프로모터와 인핸서 요소 및/또는 유도성 프로모터와 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 구조성 발현 벡터의 무제한적 실례는 EK 생산을 주동하기 위해 글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소 (GAP) 프로모터를 이용하는 것이다. 유도성 발현 벡터의 무제한적 실례는 유도제로서 메탄올과 함께, 알데히드 옥시다아제 1 (AOX1) 프로모터를 이용하는 것이다. 어떤 경우든, 높은 수준의 발현이 달성될 수 있는데, 리터당 최대 수 그램의 산물이 수득된다. 가령, 메탄올 유도된 효모 세포에서, AOX1은 총 가용성 단백질의 30%를 차지할 수 있다. AOX1 유전자를 결여하는 균주 (일명, Mut^S 균주)는 메탄올에 의해 여전히 유도될 수 있는데, 그 이유는 이들이 알코올 옥시다아제 2 유전자 (AOX2)를 발현하지만, 메탄올이 유일한 탄소 공급원으로서 이용될 때, 야생형 균주보다 느리게 성장하기 때문이다. 하지만, AOX1 단백질 생산을 위해 유력한 에너지와 재화를 이용하는 대신에, Mut^S 균주에서 AOX1 프로모터의 힘은 주로 재조합 단백질 생산을 향해 지향될 수 있다. 이에 더하여, 더욱 낮은 메탄올 수준이 적용될 수 있다.

효모 발현 벡터는 다른 유형의 폴리펩티드 분자, 예를 들면, 정제 태그, 세포 분비 신호, 및/또는 세포 이하 국지화 신호를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역을 포함할 수 있다. 이런 폴리뉴클레오티드 영역은 통상적으로, 융합 폴리펩티드의 형태에서 EK에 작동가능하게 연결된다. 정제 태그의 무제한적 실례에는 히스티딘 태그, myc 태그, V5 태그가 포함된다. 신호 서열의 무제한적 실례에는 EK를 세포 세포질, 세포 소기관, 예를 들면, 페록시솜, 또는 세포외 배양 배지로 지향시키는 것들이 포함된다. 가령, 알파 인자 펩티드 신호의 포함은 배양 배지 내로 EK의 분비를 가능하게 한다.

본 명세서의 양상은 부분적으로, 효모 발현 구조체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 개시한다. 효모 발현 구조체는 본원에서 개시된 바와 같은 효모 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 본원에서 개시된 바와 같은 EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 효모 발현 구조체의 실례는 실시예 2와 4-6에서 기술된다.

본 명세서의 양상은 부분적으로, 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 분자를 효모 세포 내로 도입하는 것을 개시한다. 세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드 분자는 상기 세포에 의해 일시적으로 또는 안정적으로 유지될 수 있다. 안정적으로-유지된 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외이고 자율적으로 복제하거나, 또는 이들은 세포의 염색체 물질 내로 통합되고 비-자율적으로 복제할 수 있다.

본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 분자를 세포 내로 도입하기 위한 임의의 모든 방법이 이용될 수 있는 것으로 구상된다. 핵산 분자를 세포 내로 도입하는데 유용한 방법에는 제한 없이, 화학-매개된 형질감염, 예를 들면, 인산칼슘-매개된, 디에틸-아미노에틸 (DEAE) 덱스트란-매개된, 지질-매개된, 폴리에틸렌이민 (PEI)-매개된, 폴리리신-매개된 및 폴리브렌-매개된 형질감염; 물리-매개된 형질감염, 예를 들면, 바이오리스틱 입자 (biolistic particle) 전달, 미세주사, 원형질체 융합 및 전기천공; 그리고 바이러스-매개된 형질감염, 예를 들면, 레트로바이러스-매개된 형질감염이 포함된다. 당업자는 발현 구조체를 세포 내로 도입하기 위한 특정한 방법의 선별이 부분적으로, 상기 세포가 발현 구조체를 일시적으로 내포할 지의 여부 또는 상기 세포가 발현 구조체를 안정적으로 내포할 지의 여부에 좌우될 것이라는 것을 이해한다. 이들 프로토콜은 본원의 교시로부터 당업자의 평균적인 지식의 범위 내에서 일과적인 절차이다 (예로써, Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp. 16.1-16.62 (Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3^rded. 2001)을 참조한다). 본원에서 개시된 효모 발현 구조체를 효모 세포 내로 도입하는 실례는 실시예 2와 4-6에서 기술된다.

본 명세서의 양상은 부분적으로, 본원에서 개시된 바와 같이 EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체를 포함하는 효모 세포를 개시한다. 이러한 구체예의 양상에서, 효모 세포는 본원에서 개시된 바와 같이 EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체를 일시적으로 내포한다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 효모 세포는 본원에서 개시된 바와 같이 EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 구조체를 안정적으로 내포한다. 이러한 구체예의 양상에서, 효모 세포는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 피치아 메탈로니카 (Pichia methanolica), 피치아 안구스타 (Pichia angusta), 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica)로부터 유래된 효모 세포 균주이다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 효모 발현 구조체는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 발현 벡터, 피치아 메탈로니카 (Pichia methanolica) 발현 벡터, 피치아 안구스타 (Pichia angusta) 발현 벡터, 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 발현 벡터, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 발현 벡터 또는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 발현 벡터이다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 보체이다.

본 명세서의 양상은 부분적으로, 효모 발현 시스템을 이용하여 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 EK를 발현하는 것을 개시한다. 효모 발현 시스템을 이용한 폴리뉴클레오티드 분자의 발현은 유도성 발현, 비-유도성 발현, 구조성 발현, 바이러스-매개된 발현, 안정적으로-통합된 발현, 그리고 일시적 발현이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 다양한 특성을 포함할 수 있다. 이들 프로토콜은 본원의 교시로부터 당업자의 평균적인 지식의 범위 내에서 일과적인 절차이다. 효모 발현 시스템의 무제한적 실례에는 EASYSELECT^TM 피치아 (Pichia) 발현 키트 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), EASYSELECT^TM ECHO^TM 피치아 (Pichia) 발현 키트 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), 피치아 메탈로니카 (Pichia methanolica) 발현 시스템 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), PICHIAPINK^TM 분비된 단백질 키트 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), YES-ECHO^TM 발현 벡터 키트 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), 그리고 SPECTRA^TM 쉬조사카로미세스 폼베 (S. pombe) 발현 시스템 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)이 포함된다. 효모 발현 시스템을 이용하여 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 EK를 발현하는 실례는 실시예 2-6에서 기술된다.

구체예에서, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 폴리뉴클레오티드 변이체의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체로부터 발현된 EK의 양은 서열 번호: 2로부터 발현된 EK의 양과 비교하여 증가한다.

이러한 구체예의 양상에서, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 폴리뉴클레오티드 변이체의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체로부터 발현된 EK의 양은 서열 번호: 2로부터 발현된 EK의 양과 비교하여, 예로써 최소한 0.5-배, 최소한 1-배, 최소한 1.5-배, 최소한 2-배, 최소한 3-배, 최소한 4-배, 최소한 5-배, 최소한 6-배, 최소한 7-배, 최소한 8-배, 최소한 9-배, 최소한 10-배, 최소한 15-배, 최소한 20-배, 최소한 25-배, 최소한 30-배, 최소한 35-배, 또는 최소한 40-배 증가한다. 이러한 구체예의 다른 양상에서, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 폴리뉴클레오티드 변이체의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체로부터 발현된 EK의 양은 서열 번호: 2로부터 발현된 EK의 양과 비교하여, 예로써 약 1-배 내지 약 5-배, 약 1-배 내지 약 10-배, 약 1-배 내지 약 15-배, 약 1-배 내지 약 20-배, 약 1-배 내지 약 25-배 증가한다.

이러한 구체예의 다른 양상에서, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 폴리뉴클레오티드 변이체의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체로부터 발현된 EK의 양은 약 100 mg/L 내지 약 30 g/L이다. 이러한 구체예의 양상에서, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 폴리뉴클레오티드 변이체의 폴리뉴클레오티드 분자로부터 발현된 EK의 양은 예로써, 최소한 100 mg/L, 최소한 500 mg/L, 최소한 1 g/L, 최소한 1.5 g/L, 최소한 2.5 g/L, 최소한 5 g/L, 최소한 7.5 g/L, 최소한 10 g/L, 최소한 12.5 g/L, 최소한 15 g/L, 최소한 20 g/L, 최소한 25 g/L, 또는 최소한 30 g/L일 수 있다. 이러한 구체예의 또 다른 양상에서, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 폴리뉴클레오티드 변이체의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체로부터 발현된 EK의 양은 예로써, 약 100 mg/L 내지 약 5 g/L, 약 100 mg/L 내지 약 10 g/L, 약 100 mg/L 내지 약 15 g/L, 약 500 mg/L 내지 약 5 g/L, 약 500 mg/L 내지 약 10 g/L, 약 500 mg/L 내지 약 15 g/L, 약 1 g/L 내지 약 5 g/L, 약 1 g/L 내지 약 10 g/L, 약 1 g/L 내지 약 15 g/L, 약 1 g/L 내지 약 20 g/L, 약 5 g/L 내지 약 10 g/L, 약 5 g/L 내지 약 15 g/L, 약 5 g/L 내지 약 20 g/L, 약 5 g/L 내지 약 25 g/L, 약 5 g/L 내지 약 30 g/L일 수 있다.

본원에서 개시된 효모 발현 구조체로부터 발현된 EK는 임의의 다양한 방법을 이용하여 효모 세포 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 정제 방법의 실례에는 제한 없이, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산성 추출, 이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 겔-여과 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 히드록시아파티트 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피 (FPLC), 그리고 고성능 액체 (HPLC) 크로마토그래피가 포함된다. 관심되는 표적 펩티드의 결합 모이어티는 수지, 아가로오즈, 그리고 자성 구슬이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 다양한 물질에 부착될 수 있다. 이에 더하여, 배치식 가공 처리, 그리고 중력-피드 칼럼 (gravity-feed column)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 다양한 가공 처리 기술이 이용될 수 있다. 단백질 재접힘 단계 역시 본 명세서에서 개시된 핵산 분자에 의해 인코딩된 기능적으로 활성 BoNT/A의 회수를 담보하기 위하여 필요할 수도 있다. 단백질을 정제하고 회수하기 위한 특정한 프로토콜의 무제한적 실례는 예로써, John Abelson et al., Guide to Protein Purification, (Academic Press, 1990), Protein Purification: Principles and Practice, (Robert K. Scopes et al. eds., Springer Verlag, 3^rded. 1994), Protein Purification Techniques: A Practical Approach, (Simon Roe ed., Oxford University Press, 2^nded. 2001), Molecular Cloning A Laboratory Manual, supra, (2001), Ian M. Rosenberg, Protein Analysis & Purification: Benchtop Techniques, (Springer Verlag, 2002)에서 기술된다. 이들 프로토콜은 본원의 교시로부터 당업자의 평균적인 지식의 범위 내에서 일과적인 절차이다.

EK 양은 임의의 다양한 방법을 이용하여 EK 발현 동안, EK 발현의 완결 후, 및/또는 EK 정제 후 측정될 수 있다. 단백질 측정 방법의 실례에는 제한 없이, 겔 전기영동과 단백질 염색, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 단백질-표지화, UV 흡광도, Lowry 검정, biuret 검정, Smith 구리/바이신코닉 (BCA) 검정, 그리고 Bradford 염료 검정이 포함된다 (예로써, Christine V. Sapan et al., Colorimetric Protein Assay Techniques, 29(2) Biotechnol. Appl. Biochem. 99-108, (1999)을 참조한다).

본 명세서의 양상은 부분적으로, EK를 이용하여 EK 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 개열하기 위한 방법을 개시한다. 한 구체예에서, EK 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 개열하기 위한 방법은 EK 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 EK와 접촉시키는 단계를 포함하고, EK는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 이들의 임의의 폴리뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 임의의 절두된 변이체를 포함하는 효모 발현 구조체를 효모 세포에서 발현함으로써 생산되고, 여기서 상기 재조합 폴리펩티드와 상기 엔테로키나아제의 접촉은 EK 개열 부위의 특정한 개열을 유발한다. 이러한 구체예의 한 양상에서, EK 개열 부위는 서열 번호: 1이다. 폴리펩티드는 EK 개열 부위를 자연적으로 갖는 것이거나, 또는 EK 개열 부위를 내포하도록 유전자 조작된 재조합 폴리펩티드일 수 있다.

본 명세서의 양상은 부분적으로, EK를 이용하여 EK 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법을 개시한다. 한 구체예에서, EK 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 제조하기 위한 방법은 EK 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 EK와 접촉시키는 단계를 포함하고, EK는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 이들의 임의의 폴리뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 임의의 절두된 변이체를 포함하는 효모 발현 구조체를 효모 세포에서 발현함으로써 생산되고, 여기서 상기 재조합 폴리펩티드와 상기 엔테로키나아제의 접촉은 EK 개열 부위의 특정한 개열을 유발한다. 이러한 구체예의 한 양상에서, EK 개열 부위는 서열 번호: 1이다. 폴리펩티드는 EK 개열 부위를 자연적으로 갖는 것이거나, 또는 EK 개열 부위를 내포하도록 유전자 조작된 재조합 폴리펩티드일 수 있다.

EK 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 개열하거나 제조하기 위해 EK를 이용하는 방법은 표준 시험관내 단백분해 개열 검정을 이용하여 수행될 수 있다. 가령, EK 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드는 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl, 20 mM CaCl₂ 및 본원에서 기술된 바와 같이 생산된 EK를 포함하는 반응 혼합물에 첨가되고, 그리고 약 20 내지 약 22℃에서 약 2시간 내지 약 16시간 동안 항온처리될 수 있다. 이렇게 생산된 개열되거나 제조된 폴리펩티드의 정도는 표준 절차, 예를 들면, SDS-PAGE 분석, 면역-기초된 검정, 예를 들면, 웨스턴 블롯 분석 또는 ELISA, 또는 상기 폴리펩티드에 대한 활성 검정을 이용하여 평가될 수 있다. 개열되거나 제조된 폴리펩티드는 또한, 표준 절차를 이용하여 정제될 수 있다. EK 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 개열하거나 제조하는데 유용한 검정은 예로써, Ogiwara, et al., Modified Enteropeptidase Protein, US 8,013,137; La Vallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use, US 6,746,859에서 기술되고, 이들 각각은 전체로서 참고문헌으로 편입된다.

본 명세서의 양상은 또한, 하기와 같이 기술될 수 있다:

1. 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 이들의 폴리뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 절두된 변이체 및 이들의 임의의 보체를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.

2. 구체예 1의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체의 폴리뉴클레오티드 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 동일하다.

3. 구체예 1의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체에 비하여 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 30, 약 5 내지 약 25, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 35, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 45, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 45, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 55, 또는 약 10 내지 약 60개의 비-연속 뉴클레오티드 치환을 갖는다.

4. 구체예 1의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체에 비하여 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 30, 약 5 내지 약 25, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 35, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 45, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 45, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 55, 또는 약 10 내지 약 60개의 연속 뉴클레오티드 치환을 갖는다.

5. 구체예 1의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 엄격한 조건 하에, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자에 혼성화된다.

6. 구체예 1의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6에서 상응하는 코돈 존재에 대해 치환되는, 표 1로부터 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 변이체 코돈을 갖는다.

7. 구체예 1의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6에서 상응하는 코돈 존재에 대해 치환되는, 표 2로부터 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 변이체 코돈을 갖는다.

8. 구체예 1의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 절두된 변이체는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 임의의 보체의 5'-단부, 3'-단부, 또는 5'-단부와 3'-단부 둘 모두로부터 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 최소한 20, 최소한 25, 최소한 30, 최소한 35, 최소한 40, 최소한 45, 또는 최소한 50개의 뉴클레오티드가 제거된다.

9. 구체예 1의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 절두된 변이체는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 보체의 5'-단부, 3'-단부, 또는 5'-단부와 3'-단부 둘 모두로부터 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 코돈이 제거된다.

10. 구체예 1-9의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 효모 발현 벡터이다.

11. 구체예 10의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 효모 발현 벡터는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 발현 벡터, 피치아 메탈로니카 (Pichia methanolica) 발현 벡터, 피치아 안구스타 (Pichia angusta) 발현 벡터, 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 발현 벡터, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 발현 벡터 및 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 발현 벡터이다.

12. 구체예 10 또는 11의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 효모 발현 벡터는 구조성 프로모터, 구조성 인핸서, 유도성 프로모터, 유도성 인핸서, 또는 구체예 1-9의 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 주동하는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

13. 구체예 12의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 유도성 프로모터는 알데히드 옥시다아제 1 (AOX1) 프로모터이다.

14. 구체예 10-14의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 효모 발현 벡터는 구체예 1-9의 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 인코딩된 EK를 특정한 세포 또는 세포외 구획으로 지향시키는 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역을 포함한다.

15. 구체예 10-14의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 효모 발현 벡터는 구체예 1-9의 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 인코딩된 EK를 세포 세포질, 세포 소기관, 또는 세포외 배양 배지로 지향시키는 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역을 포함한다.

16. 구체예 14 또는 15의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 신호 서열은 알파 인자 펩티드이다.

17. 구체예 1-9의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 여기서 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 효모 발현 구조체이다.

18. 효모 발현 벡터, 그리고 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 이들의 폴리뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 절두된 변이체 및 이들의 임의의 보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체.

19. 구체예 18의 효모 발현 구조체, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체의 폴리뉴클레오티드 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 91%, 최소한 92%, 최소한 93%, 최소한 94%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 또는 최소한 99% 동일하다.

20. 구체예 18의 효모 발현 구조체, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체에 비하여 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 30, 약 5 내지 약 25, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 35, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 45, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 45, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 55, 또는 약 10 내지 약 60개의 비-연속 뉴클레오티드 치환을 갖는다.

21. 구체예 18의 효모 발현 구조체, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체에 비하여 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 15, 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 25, 약 1 내지 약 30, 약 5 내지 약 25, 약 5 내지 약 30, 약 5 내지 약 35, 약 5 내지 약 40, 약 5 내지 약 45, 약 10 내지 약 40, 약 10 내지 약 45, 약 10 내지 약 50, 약 10 내지 약 55, 또는 약 10 내지 약 60개의 연속 뉴클레오티드 치환을 갖는다.

22. 구체예 18의 효모 발현 구조체, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 엄격한 조건 하에, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자에 혼성화된다.

23. 구체예 18의 효모 발현 구조체, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6에서 상응하는 코돈 존재에 대해 치환되는, 표 1로부터 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 변이체 코돈을 갖는다.

24. 구체예 18의 효모 발현 구조체, 여기서 폴리뉴클레오티드 변이체는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6에서 상응하는 코돈 존재에 대해 치환되는, 표 2로부터 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 변이체 코돈을 갖는다.

25. 구체예 18의 효모 발현 구조체, 여기서 절두된 변이체는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 임의의 보체의 5'-단부, 3'-단부, 또는 5'-단부와 3'-단부 둘 모두로부터 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 최소한 20, 최소한 25, 최소한 30, 최소한 35, 최소한 40, 최소한 45, 또는 최소한 50개의 뉴클레오티드가 제거된다.

26. 구체예 18의 효모 발현 구조체, 여기서 절두된 변이체는 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 또는 이들의 임의의 뉴클레오티드 변이체, 또는 이들의 보체의 5'-단부, 3'-단부, 또는 5'-단부와 3'-단부 둘 모두로부터 최소한 1, 최소한 2, 최소한 3, 최소한 4, 최소한 5, 최소한 6, 최소한 7, 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 코돈이 제거된다.

27. 구체예 18-26의 효모 발현 구조체, 여기서 효모 발현 벡터는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 발현 벡터, 피치아 메탈로니카 (Pichia methanolica) 발현 벡터, 피치아 안구스타 (Pichia angusta) 발현 벡터, 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 발현 벡터, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 발현 벡터 및 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 발현 벡터이다.

28. 구체예 27의 효모 발현 구조체, 여기서 효모 발현 벡터는 구조성 프로모터, 구조성 인핸서, 유도성 프로모터, 유도성 인핸서, 또는 구체예 1-9의 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 주동하는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

29. 구체예 28의 효모 발현 구조체, 여기서 유도성 프로모터는 알데히드 옥시다아제 1 (AOX1) 프로모터이다.

30. 구체예 27-29의 효모 발현 구조체, 여기서 효모 발현 벡터는 구체예 1-9의 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 인코딩된 EK를 특정한 세포 또는 세포외 구획으로 지향시키는 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역을 포함한다.

31. 구체예 27-29의 효모 발현 구조체, 여기서 효모 발현 벡터는 구체예 1-9의 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 인코딩된 EK를 세포 세포질, 세포 소기관, 또는 세포외 배양 배지로 지향시키는 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 영역을 포함한다.

32. 구체예 30 또는 31의 효모 발현 구조체, 여기서 신호 서열은 알파 인자 펩티드이다.

33. 구체예 1-17의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포.

34. 구체예 33의 효모 세포, 여기서 발현 구조체는 효모 세포에서 일시적으로 내포된다.

35. 구체예 33의 효모 세포, 여기서 발현 구조체는 효모 세포에서 안정적으로 내포된다.

37. 구체예 33-35의 효모 세포, 여기서 효모 세포는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주로부터 세포, 피치아 메탈로니카 (Pichia methanolica) 균주로부터 세포, 피치아 안구스타 (Pichia angusta) 균주로부터 세포, 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 균주로부터 세포, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 균주로부터 세포, 또는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 균주로부터 세포를 포함한다.

38. 구체예 33-35의 효모 세포, 여기서 효모 세포는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주로부터 세포이다.

39. 구체예 18-32의 효모 발현 구조체를 포함하는 효모 세포.

40. 구체예 39의 효모 세포, 여기서 발현 구조체는 효모 세포에서 일시적으로 내포된다.

41. 구체예 39의 효모 세포, 여기서 발현 구조체는 효모 세포에서 안정적으로 내포된다.

42. 구체예 39-41의 효모 세포, 여기서 효모 세포는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주로부터 세포, 피치아 메탈로니카 (Pichia methanolica) 균주로부터 세포, 피치아 안구스타 (Pichia angusta) 균주로부터 세포, 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 균주로부터 세포, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 균주로부터 세포, 또는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 균주로부터 세포를 포함한다.

43. 구체예 39-41의 효모 세포, 여기서 효모 세포는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주로부터 세포이다.

44. 엔테로키나아제를 생산하는 방법, 상기 방법은 구체예 33-43의 효모 세포를 이용하여 엔테로키나아제를 발현하는 단계를 포함한다.

45. 구체예 44의 방법, 여기서 상기 방법은 엔테로키나아제를 정제하는 단계를 더욱 포함한다.

46. 재조합 폴리펩티드를 개열하는 방법, 상기 방법은 서열 번호: 1의 개열 부위를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 엔테로키나아제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 엔테로키나아제는 구체예 44 또는 45의 방법에 생산되고, 여기서 상기 재조합 폴리펩티드와 상기 엔테로키나아제의 접촉은 서열 번호: 1의 특정한 개열을 유발한다.

47. 재조합 폴리펩티드를 제조하는 방법, 상기 방법은 서열 번호: 1의 개열 부위를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 엔테로키나아제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 엔테로키나아제는 구체예 44 또는 45의 방법에 생산되고, 여기서 상기 재조합 폴리펩티드와 상기 엔테로키나아제의 접촉은 서열 번호: 1의 특정한 개열을 유발한다.

실시예

하기의 무제한적 실시예는 본원에서 고려되는 대표적인 구체예의 더욱 완전한 이해를 조장하기 위해 단지 예시의 목적으로 제공된다. 이들 실시예는 본원에서 개시된 바와 같은 효모 발현 시스템을 이용하여 EK를 발현하는 방법에 관한 구체예를 비롯하여, 본 명세서에서 기술된 임의의 구체예를 한정하는 것으로 해석되지 않는다.

실시예 1

EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자의 합성

폴리뉴클레오티드 분자 서열 번호: 4는 표준 화학적 절차 (BlueHeron Biotechnology, Bothell, WA)를 이용하여 합성된다. 가령, 20 내지 50개 염기 길이의 올리고뉴클레오티드가 표준 포스포라미디트 합성을 이용하여 합성된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 나선으로 혼성화되고, 이들은 서로 결찰되어 전장 폴리뉴클레오티드 분자를 조립한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 분자는 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 SmaI 부위에서 pUCBHB1 벡터 내로 클로닝되어 pUCBHB1/EK가 산출된다. 합성된 폴리뉴클레오티드 분자는 Big Dye Terminator^TM Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 ABI 3100 서열분석기 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 염기서열분석에 의해 확증된다. 유사한 합성 전략이 폴리뉴클레오티드 분자 서열 번호: 6, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 변이체, 그리고 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 절두된 변이체를 만드는데 이용된다.

원하는 경우에, 효모 세포에서 발현을 개선하기 위해, 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 또는 서열 번호: 6에 기초된 발현 최적화된 폴리뉴클레오티드 분자가 합성된다. EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 1) 선택된 효모 균주의 고유 폴리뉴클레오티드 분자 내에 전형적으로 존재하는 동의의 코돈을 내포하고; 2) 선택된 효모 균주에서 관찰되는 고유 폴리뉴클레오티드 분자의 평균 G+C 함량에 더욱 가깝게 필적하는 G+C 함량을 내포하고; 3) 폴리뉴클레오티드 분자 내에서 관찰되는 폴리모노뉴클레오티드 영역을 감소시키고; 및/또는 4) 폴리뉴클레오티드 분자 내에서 관찰되는 내부 조절 또는 구조 부위를 제거하기 위해 변형된다, 예로써, Lance E. Steward et al., Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, International Patent Publication WO 2006/011966 (Feb. 2, 2006); Lance E. Steward et al., Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, International Patent Publication WO 2006/017749 (Feb. 16, 2006)를 참조하고, 이들 각각은 전체로서 참고문헌으로 편입된다. 일단 서열 최적화가 완결되면, 20 내지 50개 염기 길이의 올리고뉴클레오티드가 표준 포스포라미디트 합성을 이용하여 합성된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 나선으로 혼성화되고, 이들은 서로 결찰되어 전장 폴리뉴클레오티드 분자를 조립한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 분자는 표준 분자 생물학 방법을 이용하여 SmaI 부위에서 pUCBHB1 벡터 내로 클로닝되어 pUCBHB1/EK가 산출된다. 합성된 폴리뉴클레오티드 분자는 Big Dye Terminator^TM Chemistry 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 ABI 3100 서열분석기 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 염기서열분석에 의해 확증된다. 유사한 합성 전략이 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 변이체, 또는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 절두된 변이체인 폴리뉴클레오티드 분자를 만드는데 이용된다.

실시예 2

pPpT4Alpha/EK의 작제와 발현

본원에서 개시된 바와 같이 EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체를 작제하기 위하여, 서열 번호: 4를 내포하는 pJ201/rEK 구조체는 서열 번호: 4 삽입물을 절제하기 위해 XhoI와 NotI로 절단되었다. 결과의 제한 단편은 QIAQUICK® Gel 추출 키트 (QIAGEN, Inc., Valencia, CA)에 의해 정제되고, 그리고 서열 번호: 4 단편은 제한 엔도뉴클레아제 XhoI와 NotI로 절단된 pPpT4Alpha_S 벡터 (Ingenza, Ltd., Midlothian, UK) 내로 서브클로닝되었다. pPpT4Alpha_S 벡터는 알파 인자 분비 신호 서열, AOX1 프로모터의 일부, AOD와 AOX1 전사체 종결 서열, 그리고 ZEOCIN^TM에 대한 개방 해독틀을 포함한다. 상기 단편과 벡터는 T4 DNA 리가아제 프로토콜에 의해 결찰되어 pPpT4Alpha/rEK가 산출되며, 그리고 이러한 결찰 혼합물의 분취량이 표준 전기천공 프로토콜에 의해 전기-적격성 NEB10 세포 (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA) 내로 형질전환되었다. 형질전환된 세포는 25 μg/mL의 ZEOCIN^TM을 내포하는 1.5% Luria-Bertani Lennox 한천 평판 (pH 7.0)에 도말되고, 그리고 하룻밤 성장을 위해 37℃ 배양기 내에 배치되었다. 후보 발현 구조체는 ZEOCIN^TM-내성 콜로니로서 선별되었다. 내성 콜로니는 차후 성장되고 수확되고, 그리고 표준 절차와 후보 발현 구조체를 이용하여 단리된 플라스미드 DNA는 정확한 삽입물 단편의 존재와 배향을 결정하기 위해 XhoI와 NotI, XbaI, 또는 NdeI를 이용한 제한 절단에 의해 스크리닝되었다. 원하는 pPpT4Alpha/rEK 발현 구조체를 내포하는 배양액은 성장되고 수확되며, 그리고 표준 절차와 후보 발현 구조체를 이용하여 단리된 플라스미드 DNA는 정확한 발현 구조체가 만들어졌는지를 확증하기 위해 염기서열분석되었다. 이러한 클로닝 전략은 서열 번호: 4를 포함하는 효모 발현 구조체를 산출하였다. 유사한 전략이 서열 번호: 6, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 변이체, 또는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 절두된 변이체를 포함하는 pPpT4Alpha/EK 발현 구조체를 만드는데 이용된다. 대안으로, 서열 번호: 4의 폴리뉴클레오티드 분자, 서열 번호: 4, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 변이체, 또는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 절두된 변이체가 실시예 1에서 기술된 바와 같이 합성된다.

서열 번호: 4에 의해 인코딩된 엔테로키나아제를 발현하는 효모 세포주를 작제하기 위하여, pPpT4Alpha/rEK 발현 구조체로부터 DNA는 서열 번호: 8의 AOX 정방향 프라이머 및 서열 번호: 9의 PUC 역방향 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭되어 선형 통합 카세트가 생성되었다. AOX 정방향 프라이머의 첫 5개 염기쌍은 pPpT4Alpha/EK DNA 서열과 동일하지 않은 BglII 부위를 내포한다. AOX 정방향 프라이머는 AOX1 프로모터의 부분인 영역 뒤에 결합한다. 비록 전장 AOX1 유전자가 선형 통합 카세트 상에 존재하진 않지만, 전체 전장 AOX1 유전자는 피치아 파스토리스 (P. pastoris) 염색체와의 통합 시에 재구성된다. 결과의 선형화된 발현 구조체는 전기천공 방법을 이용하여 적절한 피치아 파스토리스 (P. pastoris) Mut^S 균주 CBS7435 내로 형질전환되었다. 형질전환 혼합물은 100 μg/mL, 250 μg/mL, 또는 500 μg/mL의 ZEOCIN^TM을 내포하는 1.5% 효모, 펩톤, 덱스트로스, 소르비톨 (YPDS) 한천 평판 (pH 7.5)에 도말되고, 28-30℃ 배양기 내에 1-3일 동안 배치되었다. 5' AOX1 좌위에서 pPpT4Alpha/EK 단편을 통합하는 형질전환체의 선별은 ZEOCIN^TM에 대한 콜로니 내성에 의해 결정된다. 62개 재조합 콜로니가 상이한 농도의 ZEOCIN^TM을 내포하는 다양한 YPDS 평판으로부터 선별되고, 그리고 100 μg/mL ZEOCIN^TM을 내포하는 효모, 펩톤, 그리고 덱스트로스 (YPD) 액체배지 내로 접종되었다. 단리된 효모 세포주는 ZEOCIN^TM을 내포하는 YPD 액체배지에서 예상된 바와 같이 성장하였는데, 이것은 이들 균주가 Zeocin 내성이고 통합된 pPpT4Alpha/EK 카세트를 내포한다는 것을 지시하였다. 단리된 세포 효모 세포주를 내포하는 YPD 배양액의 분취량은 확립된 효모 세포주를 산출하기 위해 10 % (v/v) 글리세롤을 내포하는 1 mL YPD 액체배지를 갖는 바이알 내에 배치되고, 그리고 이들 바이알은 -80℃에서 보관되었다. 유사한 전략이 서열 번호: 6의 엔테로키나아제, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 변이체, 또는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 절두된 변이체를 발현하는 효모 세포주를 만드는데 이용된다.

통합된 pPpT4Alpha/E 카세트의 존재를 더욱 확증하고 각 단리된 효모 세포주에서 상대적인 EK 유전자 사본 수를 결정하기 위하여, 62개 단리된 세포주에서 PCR 분석이 수행되었다. 1 mL가 앞서 논의된 YPD 배양액으로부터 이전되고 용해되고, 그리고 게놈 DNA가 표준 절차를 이용하여 단리되었다. 단리된 게놈 DNA는 서열 번호: 10의 EK 정방향 프라이머 및 서열 번호: 11의 EK 역방향 프라이머를 이용하여 29회 사이클 동안 PCR 증폭되어, EK 유전자로부터 250-bp 산물이 생성되었다. 증폭의 완결 후, 반응 혼합물은 0.1 Kb 내지 10 Kb 크기 2-로그 DNA 사다리와 함께, 폴리뉴클레오티드 착색제를 내포하는 0.8 % 아가로즈 겔에서 분석되었다. 이들 실험은 검사된 61개 세포주의 경우에, 예상된 250-bp EK 단편이 산출된다는 것을 확인하였다. PCR 증폭은 균주 간에 상대적 사본 수를 산정하기 위해, 단지 18회 사이클이지만 동일한 게놈 DNA 제조물을 이용하여 반복되었다. 비록 상대적으로 낮은 수준의 편차가 관찰되긴 했지만, 4가지 세포주는 다른 것들에 비하여 더욱 높은 유전자 사본 수를 보였다.

실시예 3

엔테로키나아제 활성에 대한 검정

발현된 엔테로키나아제의 존재, 품질과 양을 조사하기 위하여, 통합된 pPpT4Alpha/EK 카세트를 내포하는 세포주는 액상 비색 엔테로키나아제 (EK) 검정, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, 그리고 ELISA를 이용하여 검정되었다. 통합된 pPpT4Alpha/EK 카세트로부터 엔테로키나아제의 발현을 유도하기 위해, 각 확립된 효모 세포주로부터 분취량은 1.34% (w/v) 효모 질소 염기 (YNB), 200 mM 인산염 완충액, 4 x 10^-5% (w/v) 비오틴, 그리고 1% (v/v) 글리세롤을 포함하는 10 mL의 정의된 성장 배지를 내포하는 100 mL 칸막이 진탕 플라스크를 접종하는데 이용되었다. 접종물은 진탕 배양기 (250 rpm) 내에 약 28-30℃에서 약 60-65시간 동안 성장되었다. 세포는 원심분리 (22℃에서 5분 동안 3,000x g)에 의해 수확되었다. 엔테로키나아제 발현을 유도하기 위해, 세포 펠릿은 1.34% (w/v) 효모 질소 염기 (YNB), 200 mM 인산염 완충액, 4 x 10^-5% (w/v) 비오틴, 그리고 5% (v/v) 메탄올을 포함하는 1 mL의 일차 유도 배지에서 재현탁되었다. 이들 세포는 진탕 배양기 (250 rpm) 내에 약 28-30℃에서 약 8-10시간 동안 배양되었다. 배양액은 100 μL의 메탄올로 채워지고, 약 16-18시간 동안 배양되고, 그리고 추가의 100 μL의 메탄올이 24시간 마다 배지에 첨가되었는데, 최종 투입량은 유도 후 약 72-74시간 시점에 첨가되었다. 진탕 플라스크 시료로부터 획득된 데이터를 비교하기 위해, 척도 균주 B18 (His-표식된 엔테로키나아제를 생산하는 피치아 파스토리스 (P. pastoris) CBS7435 Mut^S pPpT4Alpha/EK-HIS 발현 구조체)는 통합된 균주와 함께, 중복 진탕 플라스크에서 준비되었다.

발현된 엔테로키나아제의 효소적 활성을 결정하기 위해, 시료는 배양 유도의 경과 동안 채취되고, 그리고 액상 비색 엔테로키나아제 활성 검정을 이용하여 엔테로키나아제 활성에 대해 검정되었다. 검사 분취량의 배지가 유도 후 0시간, 24시간, 48시, 72시간 및 96시간 시점에, 앞서 기술된 효모 배양액으로부터 채취되었다. 검사 분취량은 튜브에 첨가되고, 그리고 세포의 제거를 담보하기 위해 14,000 rpm에서 2회 원심분리되었다. 준비된 배지 시료의 분취량이 이후, 5,5'디티오-비스 (2-니트로벤조산) (DTNB)의 존재에서 1 mM의 비색 펩티드 기질 N-카르보벤질옥시-Lys-티오벤질 에스테르 (Z-Lys-SBZL; Bachem, AG, Bubendorf, CH)를 내포하는 반응 혼합물에 첨가되었다. 개열 반응은 무색에서 황색으로 변화를 개시하고, 그리고 최초 속도는 평판 판독기에서 동역학적 양식으로 405 nm의 흡광도에서 측정되었다. 효소 농도는 시료 희석액이 검정의 선형 범위 (0-100 mOD/min) 내에 있도록 담보하기 위해 조정되었다. 시료는 음성 대조 및 양성 대조와 함께, 삼중으로 검정되었다.

모든 균주의 엔테로키나아제 활성 검정 결과에 뒤이어, 액상 비색 엔테로키나아제 활성 검정이 YCL-48, YCL-49, YCL-98 및 YCL-99로 지칭되는 최고 엔테로키나아제 활성을 갖는 4가지 확립된 효모 세포주, 그리고 YCL-40 및 YCL-88로 지칭되는 최저 엔테로키나아제 활성을 갖는 2가지 세포주를 이용하여 반복되었다. 모든 시료는 기질의 단일 배치 (batch)를 이용하여 삼중으로 검정되었다. 도 X는 유도 후 시간에 대한 각 효모 세포주의 평균 엔테로키나아제 활성을 도시한다. 오차 바는 삼중 진탕 플라스크 값 사이에 95% 신뢰 구간을 지시한다. 상기 데이터로부터, YCL-49는 최대 엔테로키나아제 활성을 갖고, 그리고 YCL-88은 최저 활성을 가졌다.

발현된 엔테로키나아제의 실체와 품질을 결정하기 위해, YCL-40, YCL-48, YCL-49, YCL-88, YCL-98 및 YCL-99의 96-98시간 유도 후 시점으로부터 시료가 채취되고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 분석되었다. 시료는 2x SDS 시료 완충액에 첨가되고, 그리고 변성, 환원 조건 하에 10-20% Bis-Tris 미리성형된 폴리아크릴아미드 겔 (Expedeon, Inc, San Diego, CA)을 이용한 MOPS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리되었다. SDS-PAGE 분석을 위하여, 겔은 단백질 결합 패턴을 드러내는 Coomassie Brilliant Blue로 염색되었다. 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 분리된 폴리펩티드는 니트로셀룰로오스로 이전되고 다중클론성 α-엔테로키나아제 항체로 염색되었다. 엔테로키나아제 폴리펩티드는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에서 대략 38 kDa에서 단일 띠로서 분명하게 보였다. 전기영동 이동은 엔테로키나아제가 번역 후 변경을 겪는다는 것을 지시한다. 이에 더하여, 임의의 검출가능한 거짓 띠의 부재는 통합된 pPpT4Alpha/EK 카세트를 갖는 효모 세포주의 발현된 엔테로키나아제의 높은 품질을 지시하였다.

발현된 엔테로키나아제의 농도를 결정하기 위해, YCL-49, YCL-88, 그리고 YCL-98의 96-98시간 유도 후 시점으로부터 시료가 채취되고 샌드위치 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 이용하여 분석되었다. 일련의 희석액이 검사 시료로부터 제조되고, 그리고 상업적으로 가용한 재조합 엔테로키나아제 표준 (EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)으로부터 정의된 농도에서, 삼중으로 검정되었다. 상업적 표준의 연속 희석액으로부터 산출된 표준 곡선은 YCL-49와 YCL-88 시료의 정량을 가능하게 하였다. 이들 ELISA 결과는 통합된 균주의 진탕 플라스크 성장과 발현 이후에 획득된 완전 액체배지 시료의 상층액 내에 존재하는 EK 물질의 수준을 계산하는데 이용되었다 (표 3).

ELISA 분석

시료	엔테로키나아제 농도
B18	1.0 μg/mL
YCL-49	2.6 μg/mL
YCL-88	2.9 μg/mL
YCL-98	2.2 μg/mL

앞서 기술된 분석은 몇몇 확립된 효모 세포주가 통합된 pPpT4Alpha/EK 카세트로부터 높은 품질, 효소-활성 엔테로키나아제를 발현한다는 것을 지시하였다.

실시예 4

pPICZ A/EK-myc-His의 작제와 발현

본원에서 개시된 바와 같이 EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체를 작제하기 위하여, 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 pPIC A 벡터 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하는데 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위가 표준 DNA 합성 절차를 이용하여 서열 번호: 4의 5'-와 3'-단부 내로 함입된다. 이러한 구조체는 1) 엔테로키나아제를 인코딩하는 서열 번호: 4를 절제하고; 그리고 2) 이 삽입물이 pPIC A 벡터에 작동가능하게 연결될 수 있도록 하는 제한 효소로 절단된다. 상기 삽입물은 T4 DNA 리가아제 절차를 이용하여 pPIC A 벡터 내로 서브클로닝되고, 이것은 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단되어 pPIC A/BoNT/E-myc-His가 산출된다. 이러한 결찰 혼합물은 열 충격 방법을 이용하여 화학적으로 적격성 대장균 (E. coli) DH5α 세포 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) 내로 형질전환되고, 25 μg/mL의 ZEOCIN^TM을 내포하는 1.5% 저염 Luria-Bertani 한천 평판 (pH 7.5)에 도말되고, 그리고 하룻밤 성장을 위해 37℃ 배양기 내에 배치된다. 발현 구조체를 내포하는 세균은 ZEOCIN^TM 내성 콜로니로서 확인된다. 후보 구조체는 알칼리성 용해 플라스미드 미니-제조 절차를 이용하여 단리되고, 그리고 삽입물의 존재와 배향을 결정하기 위해 제한 엔도뉴클레아제 절단 맵핑에 의해 분석된다. 이러한 클로닝 전략은 카르복시-말단 c-myc 및 폴리히스티딘 결합 펩티드에 작동가능하게 연결된 엔테로키나아제를 인코딩하는 효모 발현 구조체를 산출한다. 유사한 전략이 서열 번호: 6, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 변이체, 또는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 절두된 변이체를 포함하는 pPIC A/EK 발현 구조체를 만드는데 이용된다.

엔테로키나아제를 발현하는 효모 세포주를 작제하기 위하여, pPICZ A/EK-myc-His는 적절한 제한 엔도뉴클레아제 (즉, SacI, PmeI 또는 BstXI)로 절단되고, 그리고 결과의 선형화된 발현 구조체는 전기천공 방법을 이용하여 적절한 피치아 파스토리스 (P. pastoris) Mut^S 균주 KM71H 내로 형질전환된다. 형질전환 혼합물은 100 μg/mL의 ZEOCIN^TM을 내포하는 1.5% YPDS 한천 평판 (pH 7.5)에 도말되고 1-3일의 성장을 위해 28-30℃ 배양기 내에 배치된다. 5' AOX1 좌위에서 pPICZ A/EK-myc-His를 통합하는 형질전환체의 선별은 ZEOCIN^TM에 대한 콜로니 내성에 의해 결정된다. pPICZ A/EK-myc-His 구조체를 통합하는 세포주는 이후, 엔테로키나아제 발현에 대해 조사된다. pPICZ A/EK-myc-His를 통합하는 검사 세포주로부터 단리된 콜로니는 100 mL의 MGYH 배지를 내포하는 1.0 L 칸막이 플라스크를 접종하는데 이용되고, 그리고 배양액이 OD₆₀₀=2-6에 도달할 때 (대략 16-18시간)까지 진탕 배양기 (250 rpm) 내에 약 28-30℃에서 성장된다. 세포는 원심분리 (22℃에서 5분 동안 3,000x g)에 의해 수확된다. 발현을 유도하기 위하여, 세포 펠릿은 15 mL의 MMH 배지에서 재현탁되고, 그리고 100% 메탄올이 0.5%의 최종 농도로 첨가된다. 배양액은 진탕 배양기 (250 rpm) 내에 약 28-30℃에서 6일 동안 성장된다. 추가의 100% 메탄올이 24시간 마다 0.5%의 최종 농도로 배양액에 첨가된다. 1.0 mL 검사 분취량이 0시에서부터 144시간 시점까지 24시간 마다 배양액으로부터 채취된다. 세포는 이들 세포를 펠릿화하기 위한 마이크로원심분리에 의해 분취량으로부터 수확되고, 그리고 5분 동안 -80℃, 이후 5분 동안 37℃로 구성되는 3회 동결-해동 라운드를 이용하여 용해된다. 용해 시료는 2x SDS 시료 완충액 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)에 첨가되고, 그리고 확립된 세포주로부터 발현은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된다 (실시예 3에서 기술된 바와 같음). 엔테로키나아제의 최고 발현 수준을 보이는 피치아 파스토리스 (P. pastoris) Mut^S KM71H 세포주는 상업적 발효 절차를 이용한 대규모 발현을 위해 선별된다. 대규모 발현을 위한 절차는 배양 부피가 5 L BioFlo 3000 발효기에서 성장된 대략 2.5 L MGYH 배지이고 모든 시약의 농도가 상기 부피를 위해 비례적으로 증가할 것이라는 점을 제외하고, 상기에서 개설된 바와 동일하다. 본 실시예에서 기술된 모든 절차에 대한 더욱 상세한 내용은 EasySelect^TM Pichia Expression Kit, version G, A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris, 122701, 25-0172 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)를 참조한다. 유사한 전략이 서열 번호: 6의 엔테로키나아제, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 변이체, 또는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 절두된 변이체를 발현하는 효모 세포주를 만드는데 이용된다.

실시예 5

pMET/EK-V5-His의 작제와 발현

본원에서 개시된 바와 같이 EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체를 작제하기 위하여, 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 pMET 벡터 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하는데 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위가 표준 DNA 합성 절차를 이용하여 서열 번호: 4의 5'-와 3'-단부 내로 함입된다. 이러한 구조체는 1) 엔테로키나아제를 인코딩하는 서열 번호: 4를 절제하고; 그리고 2) 이 삽입물이 pMET 벡터에 작동가능하게 연결될 수 있도록 하는 제한 효소로 절단된다. 상기 삽입물은 T4 DNA 리가아제 절차를 이용하여 pMET 벡터 내로 서브클로닝되고, 이것은 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단되어 pMET/BoNT/E-V5-His (도 9)가 산출된다. 이러한 결찰 혼합물은 열 충격 방법을 이용하여 화학적으로 적격성 대장균 (E. coli) DH5α 세포 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) 내로 형질전환되고, 100 μg/mL의 암피실린을 내포하는 1.5% 저염 Luria-Bertani 한천 평판 (pH 7.5)에 도말되고, 그리고 하룻밤 성장을 위해 37℃ 배양기 내에 배치된다. 발현 구조체를 내포하는 세균은 암피실린 내성 콜로니로서 확인된다. 후보 구조체는 알칼리성 용해 플라스미드 미니-제조 절차를 이용하여 단리되고, 그리고 삽입물의 존재와 배향을 결정하기 위해 제한 엔도뉴클레아제 절단 맵핑에 의해 분석된다. 이러한 클로닝 전략은 카르복시-말단 V5 및 폴리히스티딘 결합 펩티드에 작동가능하게 연결된 엔테로키나아제를 인코딩하는 효모 발현 구조체를 산출한다. 유사한 전략이 서열 번호: 6, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 변이체, 또는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 절두된 변이체를 포함하는 pMET/EK 발현 구조체를 만드는데 이용된다.

엔테로키나아제를 발현하는 효모 세포주를 작제하기 위하여, pMET/BoNT/E-V5-His는 적절한 제한 엔도뉴클레아제 (즉, ApaI, AscI, FseI, PacI, KpnI 또는 PstI)로 절단되고, 그리고 결과의 선형화된 발현 구조체는 전기천공 방법을 이용하여 적절한 피치아 메탈로니카 (P. methanolica) Mut^S 균주 PMAD16 내로 형질전환된다. 형질전환 혼합물은 아데닌을 결여하는 1.5% MD 한천 평판 (pH 7.5)에 도말되고 28-30℃ 배양기에서 3-4일 동안 성장된다. pMET/EK-V5-His를 통합하는 형질전환체의 선별은 아데닌-결핍 배지에서 콜로니 성장에 의해 결정된다. pMET/EK-V5-His 구조체를 통합하는 Ade⁺ 세포주는 소규모 발현 검사를 이용하여 엔테로키나아제 발현에 대해 조사된다. pMET/EK-V5-His를 통합한 검사 세포주로부터 단리된 Ade⁺ 콜로니는 15 mL의 BMDY 배지를 접종하는데 이용되고, 그리고 세포는 배양액이 OD₆₀₀=2-10에 도달할 때 (대략 16-18시간)까지 진탕 배양기 (250 rpm) 내에 약 28-30℃에서 성장된다. 세포는 원심분리 (22℃에서 5분 동안 1,500 x g)에 의해 수확된다. 발현을 유도하기 위하여, 세포 펠릿은 5 mL의 BMMY 배지에서 재현탁되고, 그리고 배양액은 진탕 배양기 (250 rpm) 내에 약 28-30℃에서 성장된다. 24시간 후, 500 μL 분취량이 제거되고, 메탄올이 0.5%의 최종 농도로 첨가되고, 그리고 배양액이 진탕 배양기 (250 rpm) 내에 약 28-30℃에서 성장된다. 500 μL 분취량이 제거되고, 그리고 추가의 메탄올이 3-5일 동안 24시간 마다 배양액에 0.5%의 최종 농도로 첨가된다. 수확된 세포는 원심분리 (4℃에서 5분 동안 1,500x g)되고, 물에서 1회 세척되고, 그리고 세포 펠릿이 필요할 때까지 -80℃에서 보관된다. 유도된 엔테로키나아제의 발현을 검출하기 위하여, 각 시점의 세포 펠릿은 산-세척된 유리 구슬 방법을 이용하여 용해된다. 용해 시료는 2x SDS 시료 완충액 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)에 첨가되고, 그리고 확립된 세포주로부터 발현은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된다 (실시예 3에서 기술된 바와 같음). 엔테로키나아제의 최고 발현 수준을 보이는 피치아 메탈로니카 (P. methanolica) Mut^S PMAD16 세포주는 상업적 발효 절차를 이용한 대규모 발현을 위해 선별된다. 대규모 발현을 위한 절차는 배양 부피가 5 L BioFlo 3000 발효기에서 성장된 대략 2.5 L BMDY/BMMY 배지이고 모든 시약의 농도가 상기 부피를 위해 비례적으로 증가할 것이라는 점을 제외하고, 상기에서 개설된 바와 동일하다. 본 실시예에서 기술된 모든 절차에 대한 더욱 상세한 내용은 P. methanolica Expression Kit, version C, A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia methanolica, 062101, 25-0288 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)을 참조한다. 유사한 전략이 서열 번호: 6의 엔테로키나아제, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 변이체, 또는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 절두된 변이체를 발현하는 효모 세포주를 만드는데 이용된다.

실시예 6

pYES2/EK-V5-His의 작제와 발현

본원에서 개시된 바와 같이 EK를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 효모 발현 구조체를 작제하기 위하여, 작동가능하게 연결된 핵산 분자를 pYES2 벡터 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하는데 적합한 제한 엔도뉴클레아제 부위가 표준 DNA 합성 절차를 이용하여 서열 번호: 4의 5'-와 3'-단부 내로 함입된다. 이러한 구조체는 1) 엔테로키나아제를 인코딩하는 서열 번호: 4를 절제하고; 그리고 2) 이 삽입물이 pYES2 벡터에 작동가능하게 연결될 수 있도록 하는 제한 효소로 절단된다. 상기 삽입물은 T4 DNA 리가아제 절차를 이용하여 pYES2 벡터 내로 서브클로닝되고, 이것은 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단되어 pYES2/EK-V5-His (도 10)가 산출된다. 이러한 결찰 혼합물은 열 충격 방법을 이용하여 화학적으로 적격성 대장균 (E. coli) DH5α 세포 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA) 내로 형질전환되고, 100 μg/mL의 암피실린을 내포하는 1.5% 저염 Luria-Bertani 한천 평판 (pH 7.5)에 도말되고, 그리고 하룻밤 성장을 위해 37℃ 배양기 내에 배치된다. 발현 구조체를 내포하는 세균은 암피실린 내성 콜로니로서 확인된다. 후보 구조체는 알칼리성 용해 플라스미드 미니-제조 절차를 이용하여 단리되고, 그리고 삽입물의 존재와 배향을 결정하기 위해 제한 엔도뉴클레아제 절단 맵핑에 의해 분석된다. 이러한 클로닝 전략은 카르복시-말단 V5 및 폴리히스티딘 결합 펩티드에 작동가능하게 연결된 엔테로키나아제를 인코딩하는 효모 발현 구조체를 산출한다. 유사한 전략이 서열 번호: 6, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 변이체, 또는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 절두된 변이체를 포함하는 p-YES2/EK 발현 구조체를 만드는데 이용된다.

엔테로키나아제를 발현하는 효모 세포주를 작제하기 위하여, pYES2/EK-V5-His는 리튬-기초된 형질전환 방법을 이용하여 적격성 사카로미세스 세레비지에 (S. cerevisiae) 균주 INVSc1 내로 형질전환된다. 형질전환 혼합물은 2% 글루코오스를 내포하고, 0.01% 우라실을 갖거나 우라실이 없는 2% SC 최소 배지 한천 평판 (pH 7.5)에 도말되고, 그리고 1-3일의 성장을 위해 28-30℃ 배양기 내에 배치된다. pYES2/EK-V5-His를 내포하는 형질전환체의 선별은 우라실을 내포하는 평판에서 콜로니 성장에 의해서만 결정된다. pYES2/EK-V5-His 구조체를 내포하는 세포는 소규모 발현 검사를 이용하여 엔테로키나아제 발현에 대해 조사된다. pYES2/EK-V5-His를 내포하는 검사 세포로부터 단리된 콜로니는 2% 글루코오스와 0.01% 우라실을 내포하는 15 mL의 SC 배지를 내포하는 50 mL 튜브를 접종하는데 이용되고, 그리고 진탕 배양기 (250 rpm) 내에 약 28-30℃에서 하룻밤 동안 성장된다. 하룻밤 배양액의 OD₆₀₀은 50 mL 부피에서 0.4의 OD₆₀₀의 세포 농도를 획득하기 위해 측정되고 등분된다. 이들 분취량은 원심분리 (22℃에서 5분 동안 1,500x g)되고, 그리고 결과의 세포 펠릿은 20% 갈락토오스와 10% 라피노오스를 내포하는 SC 배지에서 재현탁된다. 세포는 진탕 배양기 (250 rpm) 내에 약 28-30℃에서 성장되고, 그리고 5 mL 분취량이 0시간, 4시간, 8시간, 12시간, 16시간 및 24시간 시점에 채취되고 각 시료에 대한 OD₆₀₀ 농도가 측정된다. 수확된 세포는 원심분리 (4℃에서 5분 동안 1,500x g)되고, 물에서 1회 세척되고, 그리고 세포 펠릿이 필요할 때까지 -80℃에서 보관된다. 유도된 BoNT/E-V5-His의 발현을 검출하기 위하여, 각 시점의 세포 펠릿은 산-세척된 유리 구슬 방법을 이용하여 용해된다. 용해 시료는 2x SDS 시료 완충액 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)에 첨가되고, 그리고 확립된 세포주로부터 발현은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된다 (실시예 3에서 기술된 바와 같음). 엔테로키나아제의 최고 발현 수준을 유발하는 유도 조건이 상업적 발효 절차를 이용한 대규모 발현을 위해 선별된다. 대규모 발현을 위한 절차는 배양 부피가 5 L BioFlo 3000 발효기에서 성장된 대략 2.5 L SC 배지이고 모든 시약의 농도가 상기 부피를 위해 비례적으로 증가할 것이라는 점을 제외하고, 상기에서 개설된 바와 동일하다. 본 실시예에서 기술된 모든 절차에 대한 더욱 상세한 내용은 pYES2/CT, pYES3/CT, and pYC2/CT Yeast Expression Vectors with C-terminal Tags and Auxotrophic Selection Markers, version E, 25-0304, Jan. 27, 2003 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)을 참조한다. 유사한 전략이 서열 번호: 6의 엔테로키나아제, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 뉴클레오티드 변이체, 또는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 절두된 변이체를 발현하는 효모 세포주를 만드는데 이용된다.

결어로서, 비록 본 명세서의 양상이 특정한 구체예를 언급함으로써 강조되긴 하지만, 당업자는 이들 개시된 구체예가 본원에서 개시된 요부 (subject matter)의 원리를 단지 예시한다는 것을 용이하게 인지할 것으로 이해된다. 이런 이유로, 개시된 요부는 본원에서 기술되는 특정한 방법, 프로토콜, 및/또는 시약 등으로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 개시된 요부의 다양한 변형 또는 변화 또는 대안적 배열 (configuration)은 본 명세서의 기술적 사상으로부터 벗어남 없이 본원의 교시에 따라 만들어질 수 있다. 마지막으로, 본원에서 이용된 전문용어는 특정 구체예를 단지 설명하기 위한 것이고, 그리고 청구항에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서 본 발명은 도시되고 기술된 바에 엄밀하게 한정되지 않는다.

본 발명을 수행하기 위한 본 발명자들에게 공지된 최적 양식을 비롯하여, 본 발명의 일정한 구체예가 본 명세서에서 기술된다. 당연히, 이들 기술된 구체예에서 변화는 상기 설명을 읽어보면 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명자들은 당업자가 적절하면 이런 변화를 이용할 것으로 예상하고, 그리고 본 발명자들은 본 발명이 본원에서 구체적으로 기술된 것과 달리 실시될 수 있는 것으로 의도한다. 따라서 본 발명은 적용 법률에 의해 허용되는, 본 명세서에 첨부된 청구항에서 언급된 요부의 모든 변형과 등가물을 포함한다. 게다가, 모든 가능한 변화에서 앞서 기술된 성분의 임의의 조합은 본 명세서에서 달리 지시되거나, 또는 문맥에 의해 달리 명백하게 부정되지 않으면 본 발명에 포함된다.

본 발명의 대안적 구체예, 요소, 또는 단계의 집단화는 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 각 집단 구성원은 개별적으로, 또는 본원에서 개시된 다른 집단 구성원과의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 집단의 하나 또는 그 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 집단 내에 포함되거나, 또는 집단으로부터 제외될 수 있을 것으로 예기된다. 이런 포함 또는 제외가 발생할 때, 본 명세서는 변형된 군을 내포하고, 따라서 첨부된 청구항에 이용되는 모든 마쿠쉬 그룹 (Markush group)의 서면으로 작성된 설명을 충족하는 것으로 여겨진다.

달리 지시되지 않으면, 본 명세서와 청구항에서 이용되는 특성, 항목, 양, 파라미터, 성질, 조건 등을 표시하는 모든 숫자는 모든 경우에, 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "약"은 이렇게 정량된 특성, 항목, 양, 파라미터, 성질, 또는 조건이 명기된 특성, 항목, 양, 파라미터, 성질, 또는 조건의 값 위아래에서 플러스 또는 마이너스 10%의 범위를 포함한다는 것을 의미한다. 따라서 반대로 지시되지 않으면, 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 진술된 수치 파라미터는 변할 수 있는 근사치이다. 청구항의 범위에 균등론의 적용을 결코 한정하지 않으면서, 각 수치 시도는 최소한, 보고된 유의미한 숫자의 총수에 비추어, 그리고 통상적인 반올림 기술을 적용함으로써 해석되어야 한다. 본 발명의 넓은 범위를 진술하는 수치 범위와 값이 근사치임에도 불구하고, 특정한 실시예에서 진술된 수치 범위와 값은 가능한 정확하게 보고된다. 하지만, 임의의 수치 범위 또는 값은 그들의 개별 검사 치수에서 관찰되는 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 일정한 오차를 본질적으로 내포한다. 본원에서 값의 수치 범위의 열거는 단순히, 상기 범위 내에 속하는 각 개별 수치 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서 기능하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 지시되지 않으면, 수치 범위의 각 개별 값은 마치 본원에서 개별적으로 지칭되는 것처럼 본 명세서 내에 편입된다.

본 발명을 기술하는 문맥에서 (특히, 하기 청구항의 문맥에서) 이용된 부정관사, 정관사 및 유사한 지시 대상은 본원에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않으면, 단수와 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석된다. 본원에서 기술되는 모든 방법은 본원에서 달리 지시되거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않으면, 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 모든 실례, 또는 예시의 어법 (가령, "예를 들면")의 이용은 본 발명을 더욱 충실하게 조명하기 위한 것으로 의도되고, 그리고 만약 그렇지 않으면 청구되는 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 명세서에서 어떤 어법도 발명의 실시에 필수적인 임의의 비-청구된 요소를 지시하는 것으로 해석되지 않는다.

본원에서 개시된 특정 구체예는 어법 "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는"을 이용하여 청구항에서 더욱 한정될 수 있다. 청구항에서 이용될 때, 출원 시점에 제출되거나, 또는 보정에 의하여 추가되는 지에 상관없이, 연결 어구 (transition term) "구성되는"은 청구항에서 특정되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 배제한다. 연결 어구 "본질적으로 구성되는"은 청구항의 범위를 특정된 물질 또는 단계, 그리고 기본적이고 신규한 특성(들)에 현저한 영향을 주지 않는 것들에 한정한다. 이렇게 청구된 본 발명의 구체예는 본원에서 내재적으로 또는 명백히 기술되고 가능해진다.

본 명세서에서 인용되고 확인된 모든 특허, 특허 공개, 그리고 기타 간행물은 예로써, 본 발명과 관련하여 이용될지도 모르는 이런 간행물에서 기술된 조성물과 방법을 설명하고 개시하는 목적으로, 본원에서 전체로서 참고문헌으로 개별적으로 및 명백히 편입된다. 이들 간행물은 본 출원의 출원 일자에 앞서 그들의 개시의 목적으로만 제공된다. 이와 관련하여 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의하여 또는 임의의 기타 이유로 이런 개시보다 선행할 권리가 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이들 문헌의 일자에 관한 모든 언급 또는 이들 문헌의 내용에 관한 진술은 출원인에게 가용한 정보에 기초되고, 그리고 이들 문서의 일자 또는 내용의 정확함에 관한 인정으로서 해석되지 않는다.

SEQUENCE LISTING <110> Fotheringham, Ian Sheffield, Peter J. <120> Compositions and Methods of Producing Enterokinase in Yeast <130> 18850 (BOT) <150> US 61/416,622 <151> 2010-11-23 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavage site for enterokinase <400> 1 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 2 <211> 708 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 2 attgtcggag gaagtgactc cagagaagga gcctggcctt gggtcgttgc tctgtatttc 60 gacgatcaac aggtctgcgg agcttctctg gtgagcaggg attggctggt gtcggccgcc 120 cactgcgtgt acgggagaaa tatggagccg tctaagtgga aagcagtgct aggcctgcat 180 atggcatcaa atctgacttc tcctcagata gaaactaggt tgattgacca aattgtcata 240 aacccacact acaataaacg gagaaaggac aatgacatcg ccatgatgca tcttgaaatg 300 aaagtgaact acacagatta tatacagcct atttgtttac cagaagaaaa tcaagttttt 360 tccccaggaa gaatttgttc tattgctggc tgggggacac ttatatatca aggttctact 420 gcagacgtac tgcaagaagc tgacgttccc cttctatcaa atgagaaatg tcaacaacag 480 atgccagaat ataacattac ggaaaatatg gtgtgtgcag gctacgaagc aggaggggta 540 gattcttgtc agggggattc aggcggacca ctcatgtgcc aagaaaacaa cagatggctc 600 ctggctggtg tgacatcatt tggatatcag tgtgcactgc ctaatcgccc aggggtgtat 660 gcccgggtcc caaggttcac agagtggata caaagttttc tacattag 708 <210> 3 <211> 235 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 3 Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val 1 5 10 15 Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser 20 25 30 Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met 35 40 45 Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn 50 55 60 Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile 65 70 75 80 Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met 85 90 95 His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys 100 105 110 Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile 115 120 125 Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu 130 135 140 Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln 145 150 155 160 Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu 165 170 175 Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met 180 185 190 Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly 195 200 205 Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro 210 215 220 Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His 225 230 235 <210> 4 <211> 710 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide molecule encoding an enterokinase light chain <400> 4 atagttggcg gctctgactc cagagaaggt gcctggccat gggtcgttgc cttatacttt 60 gatgatcaac aggtctgtgg tgcttcactt gtttctagag attggttggt gtccgcagca 120 cattgtgtgt atggtaggaa tatggagcct tcaaagtgga aagctgtatt ggggttgcat 180 atggcctcta accttacaag tccacaaatt gaaactagac taattgatca aattgttatc 240 aatcctcatt acaataagcg taggaaaaac aatgacatag caatgatgca cttggagatg 300 aaagttaact acacagacta catccaacca atatgtttgc ctgaggaaaa tcaggtgttc 360 ccacctggtc gtatttgtag tattgctgga tggggagccc tgatctacca aggatctacc 420 gctgacgtat tacaagaggc agatgttcct ctgctgtcca acgagaaatg ccagcaacaa 480 atgccagaat acaacatcac tgaaaacatg gtttgtgctg gttatgaagc tggaggtgta 540 gattcatgcc agggagattc aggcggtcct ctaatgtgcc aggagaataa ccgatggttg 600 cttgctggtg taacgagttt tggatatcaa tgcgctttac ctaaccgtcc aggggtctat 660 gcaagagtcc caagattcac cgagtggatt caatcttttc tgcactgagc 710 <210> 5 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterokinase light chain 1 <400> 5 Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val 1 5 10 15 Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser 20 25 30 Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met 35 40 45 Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn 50 55 60 Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile 65 70 75 80 Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met 85 90 95 His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys 100 105 110 Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile 115 120 125 Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu 130 135 140 Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln 145 150 155 160 Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu 165 170 175 Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met 180 185 190 Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly 195 200 205 Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro 210 215 220 Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His 225 230 235 <210> 6 <211> 953 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide molecule encoing the Alpha Factor and the enterokinase light chain <400> 6 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tctatagttg gcggctctga ctccagagaa ggtgcctggc catgggtcgt tgccttatac 300 tttgatgatc aacaggtctg tggtgcttca cttgtttcta gagattggtt ggtgtccgca 360 gcacattgtg tgtatggtag gaatatggag ccttcaaagt ggaaagctgt attggggttg 420 catatggcct ctaaccttac aagtccacaa attgaaacta gactaattga tcaaattgtt 480 atcaatcctc attacaataa gcgtaggaaa aacaatgaca tagcaatgat gcacttggag 540 atgaaagtta actacacaga ctacatccaa ccaatatgtt tgcctgagga aaatcaggtg 600 ttcccacctg gtcgtatttg tagtattgct ggatggggag ccctgatcta ccaaggatct 660 accgctgacg tattacaaga ggcagatgtt cctctgctgt ccaacgagaa atgccagcaa 720 caaatgccag aatacaacat cactgaaaac atggtttgtg ctggttatga agctggaggt 780 gtagattcat gccagggaga ttcaggcggt cctctaatgt gccaggagaa taaccgatgg 840 ttgcttgctg gtgtaacgag ttttggatat caatgcgctt tacctaaccg tccaggggtc 900 tatgcaagag tcccaagatt caccgagtgg attcaatctt ttctgcactg agc 953 <210> 7 <211> 316 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Enterokinase with Alpha Factor signal sequence <400> 7 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val 85 90 95 Val Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val 100 105 110 Ser Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn 115 120 125 Met Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser 130 135 140 Asn Leu Thr Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val 145 150 155 160 Ile Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met 165 170 175 Met His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile 180 185 190 Cys Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser 195 200 205 Ile Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val 210 215 220 Leu Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln 225 230 235 240 Gln Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr 245 250 255 Glu Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu 260 265 270 Met Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe 275 280 285 Gly Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val 290 295 300 Pro Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His 305 310 315 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 8 agatctaaca tccaaagacg aaagg 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 9 gcagagcgag gtatgtaggc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide for PCR <400> 10 cagatgttcc tctgctgtcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer for PCR <400> 11 atccactcgg tgaatcttgg 20

Claims

서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
청구항 1에 있어서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드 분자는 효모 발현 구조체에 포함되는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
서열 번호: 4의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 효모 발현 벡터를 포함하는 효모 발현 구조체.
청구항 3에 있어서, 효모 발현 구조체는 서열 번호: 4의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 알파 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 효모 발현 구조체.
청구항 4에 있어서, 서열 번호: 4의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 알파 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호: 6에 포함되는 것을 특징으로 하는 효모 발현 구조체.
서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 서열을 포함하는 효모 발현 구조체를 포함하는 효모 세포.
청구항 6에 있어서, 발현 구조체는 효모 세포에서 일시적으로 내포되는 것을 특징으로 하는 효모 세포.
청구항 6에 있어서, 발현 구조체는 효모 세포에서 안정적으로 내포되는 것을 특징으로 하는 효모 세포.
청구항 6에 있어서, 효모 세포는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주로부터 세포, 피치아 메탈로니카 (Pichia methanolica) 균주로부터 세포, 피치아 안구스타 (Pichia angusta) 균주로부터 세포, 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 균주로부터 세포, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 균주로부터 세포, 또는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 균주로부터 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 효모 세포.
청구항 6에 있어서, 효모 세포는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주로부터 세포인 것을 특징으로 하는 효모 세포.
엔테로키나아제를 생산하는 방법에 있어서, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 서열을 포함하는 효모 발현 구조체를 효모 세포에서 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 11에 있어서, 효모 세포는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주로부터 세포, 피치아 메탈로니카 (Pichia methanolica) 균주로부터 세포, 피치아 안구스타 (Pichia angusta) 균주로부터 세포, 쉬조사카로미세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) 균주로부터 세포, 사카로미세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 균주로부터 세포, 또는 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica) 균주로부터 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 11에 있어서, 효모 세포는 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 균주로부터 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 11에 있어서, 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 서열에 의해 인코딩된 엔테로키나아제를 정제하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
재조합 폴리펩티드를 개열하는 방법에 있어서, 상기 방법은 서열 번호: 1의 서열의 개열 부위를 포함하는 폴리펩티드를 엔테로키나아제와 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 엔테로키나아제는 서열 번호: 4 또는 서열 번호: 6의 서열을 포함하는 효모 발현 구조체를 효모 세포에서 발현함으로써 생산되고, 여기서 상기 폴리펩티드와 상기 엔테로키나아제의 접촉은 서열 번호: 1의 서열의 특정한 개열을 유발하는 것을 특징으로 하는 방법.