JP5425350B2 - 酵母においてエンテロキナーゼを生成するための構成物および方法 - Google Patents
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Description
1.配列番号4、配列番号6、それらのポリヌクレオチド変異形またはそれらの切断変異形およびそれらの相補体を含む単離されたポリヌクレオチド分子。
2.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体のポリヌクレオチド配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一である、ポリヌクレオチド分子。
3.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体に比較して約1〜約10、約1〜約15、約1〜約20、約1〜約25、約1〜約30、約5〜約25、約5〜約30、約5〜約35、約5〜約40、約5〜約45、約10〜約40、約10〜約45、約10〜約50、約10〜約55または約10〜約60の不連続ヌクレオチド置換を有する、ポリヌクレオチド分子。
4.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体に比較して約1〜約10、約1〜約15、約1〜約20、約1〜約25、約1〜約30、約5〜約25、約5〜約30、約5〜約35、約5〜約40、約5〜約45、約10〜約40、約10〜約45、約10〜約50、約10〜約55または約10〜約60の連続ヌクレオチド置換を有する、ポリヌクレオチド分子。
5.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は厳密な条件下で配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体を含むポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド分子。
6.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された表1からの少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20の変異コドンを有する、ポリヌクレオチド分子。
7.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された表2からの少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20の変異コドンを有する、ポリヌクレオチド分子。
8.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その切断変異形は配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45または少なくとも50のヌクレオチドを除去されている、ポリヌクレオチド分子。
9.実施形態1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その切断変異形は配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20のコドンを除去されている、ポリヌクレオチド分子。
10.酵母発現ベクターである、実施形態1〜9に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
11.実施形態10に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターはピキア・パストリス(Pichia pastoris)発現ベクター、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)発現ベクター、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)発現ベクター、分裂酵母発現ベクター、出芽酵母発現ベクターおよびヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)発現ベクターである、ポリヌクレオチド分子。
12.実施形態10または11に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターは実施形態1〜9のポリヌクレオチド分子の発現を方向付ける構成的プロモーター、構成的エンハンサー、誘導的プロモーター、誘導的エンハンサーまたはそれらの組み合わせを含む、ポリヌクレオチド分子。
13.実施形態12に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その誘導的プロモーターはアルデヒドオキシダーゼ1(AOX1)プロモーターである、ポリヌクレオチド分子。
14.実施形態10〜14に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターは実施形態1〜9のポリヌクレオチド分子によりコードされるEKを特定の細胞または細胞外区画へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、ポリヌクレオチド分子。
15.実施形態10〜14に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターは実施形態1〜9のポリヌクレオチド分子によりコードされるEKを細胞質、細胞オルガネラへまたは細胞外培養培地へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、ポリヌクレオチド分子。
16.実施形態14または15に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのシグナル配列はアルファ因子ペプチドである、ポリヌクレオチド分子。
17.酵母発現構築物である、実施形態1〜9に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
18.酵母発現ベクターおよび配列番号4、配列番号6、それらのポリヌクレオチド変異形またはそれらの切断変異形およびそれらの相補体を含むポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物。
19.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体のポリヌクレオチド配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一である、酵母発現構築物。
20.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体に比較して約1〜約10、約1〜約15、約1〜約20、約1〜約25、約1〜約30、約5〜約25、約5〜約30、約5〜約35、約5〜約40、約5〜約45、約10〜約40、約10〜約45、約10〜約50、約10〜約55または約10〜約60の不連続ヌクレオチド置換を有する、酵母発現構築物。
21.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体に比較して約1〜約10、約1〜約15、約1〜約20、約1〜約25、約1〜約30、約5〜約25、約5〜約30、約5〜約35、約5〜約40、約5〜約45、約10〜約40、約10〜約45、約10〜約50、約10〜約55または約10〜約60の連続ヌクレオチド置換を有する、酵母発現構築物。
22.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は厳密な条件下で配列番号4、配列番号6またはそれらの相補体を含むポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする、酵母発現構築物。
23.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された表1からの少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20の変異コドンを有する、酵母発現構築物。
24.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号4または配列番号6中の対応するコドンの存在について置換された表2からの少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20の変異コドンを有する、酵母発現構築物。
25.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、その切断変異形は配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも40、少なくとも45または少なくとも50のヌクレオチドを除去されている、酵母発現構築物。
26.実施形態18に記載の酵母発現構築物であって、その切断変異形は配列番号4、配列番号6もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の5’末端、3’末端または5’末端および3’末端の両方から少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19または少なくとも20のコドンを除去されている、酵母発現構築物。
27.実施形態18〜26に記載の酵母発現構築物であて、その酵母発現ベクターはピキア・パストリス(Pichia pastoris)発現ベクター、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)発現ベクター、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)発現ベクター、分裂酵母発現ベクター、出芽酵母発現ベクターおよびヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)発現ベクターである、酵母発現構築物。
28.実施形態27に記載の酵母発現構築物であって、その酵母発現ベクターは実施形態1〜9のポリヌクレオチド分子の発現を方向付ける構成的プロモーター、構成的エンハンサー、誘導的プロモーター、誘導的エンハンサーまたはそれらの組み合わせを含む、酵母発現構築物。
29.実施形態28に記載の酵母発現構築物であって、その誘導的プロモーターはアルデヒドオキシダーゼ1(AOX1)プロモーターである、酵母発現構築物。
30.実施形態27〜29に記載の酵母発現構築物であって、その酵母発現ベクターは実施形態1〜9のポリヌクレオチド分子によりコードされるEKを特定の細胞または細胞外区画へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、酵母発現構築物。
31.実施形態27〜29に記載の酵母発現構築物であって、その酵母発現ベクターは実施形態1〜9のポリヌクレオチド分子によりコードされるEKを細胞質、細胞オルガネラへまたは細胞外培養培地へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、酵母発現構築物。
32.実施形態30または31に記載の酵母発現構築物であって、そのシグナル配列はアルファ因子ペプチドである、酵母発現構築物。
33.実施形態1〜17に記載のポリヌクレオチドを含む酵母細胞。
34.実施形態33に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に過渡的に含有される、酵母細胞。
35.実施形態33に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に安定的に含有される、酵母細胞。
37.ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株からの細胞、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)株からの細胞、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)株からの細胞、分裂酵母株からの細胞、出芽酵母株からの細胞、またはヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)株からの細胞を含む、実施形態33〜35に記載の酵母細胞。
38.ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株からの細胞である、実施形態33〜35に記載の酵母細胞。
39.実施形態18〜32に記載の酵母発現構築物を含む酵母細胞。
40.実施形態39に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に過渡的に含有される、酵母細胞。
41.実施形態39に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に安定的に含有される、酵母細胞。
42.ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株からの細胞、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)株からの細胞、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)株からの細胞、分裂酵母株からの細胞、出芽酵母株からの細胞、またはヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)株からの細胞を含む、実施形態39〜41に記載の酵母細胞。
43.ピキア・パストリス(Pichia pastoris)株からの細胞である、実施形態39〜41に記載の酵母細胞。
44.エンテロキナーゼの生成方法であって、実施形態33〜43の酵母細胞を用いてエンテロキナーゼを発現するステップを含む、方法。
45.エンテロキナーゼを精製することをさらに含む、実施形態44に記載の方法。
46.組換えポリペプチドの切断方法であって、配列番号1の切断部位を含む組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させるステップを含み、そのエンテロキナーゼは実施形態44または45の方法により生成され、その組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることは配列番号1の特異的切断をもたらす、方法。
47.組換えポリペプチドの調製方法であって、配列番号1の切断部位を含む組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させるステップを含み、そのエンテロキナーゼは実施形態44または45の方法により生成され、その組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることは配列番号1の特異的切断をもたらす、方法。
ポリヌクレオチド分子配列番号4は標準の化学的手順を用いて合成される(BlueHeron Biotechnology,Bothell,WA)。例えば、長さ20〜50塩基のオリゴヌクレオチドは標準のホスホラミダイト合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして二重鎖にし、ライゲートして全長ポリヌクレオチド分子を組み立てる。このポリヌクレオチド分子を標準の分子生物学的方法を用いてpUCBHB1ベクター内のSmaI部位にクローニングし、pUCBHB1/EKを作出する。その合成されたポリヌクレオチド分子をBig Dye Terminator(商標)Chemistry 3.1(Applied Biosystems,Foster City,CA)およびABI 3100シークエンサー(Applied Biosystems,Foster City,CA)を用いたシークエンスにより検証する。同様の合成法をポリヌクレオチド分子配列番号6、配列番号4または配列番号6のヌクレオチド変異形、および配列番号4または配列番号6の切断変異形を作出するために使用する。
本明細書中に開示されるようにEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、配列番号4を含むpJ201/rEK構築物をXhoIおよびNotIで消化し、配列番号4挿入物を切り出した。生ずる制限酵素処理断片をQIAQUICK(登録商標)ゲル抽出キット(QIAGEN,Inc.,Valencia,CA)により精製し、そして配列番号4断片を制限酵素エンドヌクレアーゼXhoIおよびNotIで消化したpPpT4アルファ_Sベクター(Ingenza,Ltd.,Midlothian,UK)内にサブクローニングした。pPpT4アルファ_Sベクターはアルファ因子分泌シグナル配列、AOX1プロモーターの一部、AODおよびAOX1転写終了配列、およびZEOCIN(商標)のオープンリーディングフレームを含む。その断片およびベクターを、T4DNAリガーゼプロトコルを用いてライゲートし、pPpT4アルファ/rEKを作出し、そしてこのライゲーション混合物の一部を用いて標準のエレクトロポーレーションプロトコルによりエレクトロコンピテントNEB10細胞(New England Biolabs,Inc.,Ipswich,MA)を形質転換した。形質転換された細胞を25μg/mLのZEOCIN(商標)を含む1.5%Luria‐Bertani Lennoxアガープレート(pH7.0)上に撒き、そして37℃のインキュベーター内に入れ、一晩生育させた。候補発現構築物をZEOCIN(商標)耐性コロニーとして選択した。耐性コロニーを続いて生育させ、回収し、そして標準の手順を用いてプラスミドDNAを単離し、そして正しい挿入断片の存在および向きを決定するために、候補発現構築物をXhoIおよびNotI、XbaIまたはNdeIを用いた制限酵素消化によりスクリーニングした。所望のpPpT4アルファ/rEK発現構築物を含む培養物を生育させ、回収し、そして標準の手順を用いてプラスミドDNAを単離し、そして正しい発現構築物が作出されたことを検証するために、候補発現構築物をシークエンスした。このクローニング法は配列番号4を含む酵母発現構築物を作出した。同様の方法を配列番号6、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形を含むpPpT4アルファ/EK発現構築物を作出するために使用する。あるいは、配列番号4のポリヌクレオチド分子、配列番号4、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形を実施例1中に示されるように合成する。
発現されたエンテロキナーゼの存在、質および量について試験するために、統合pPpT4アルファ/EKカセットを含む細胞系を液体比色エンテロキナーゼ(EK)分析、SDS‐PAGE、ウェスタンブロット、およびELISAを用いて分析した。統合pPpT4アルファ/EKカセットからエンテロキナーゼの発現を誘導するために、各確立された酵母細胞系からの等分を1.34%(w/v)酵母窒素ベース(YNB)、200mMリン酸緩衝液、4×10−5%(w/v)ビオチン、および1%(v/v)グリセロールを含む10mLの定義された生育培養液を含む100mLバッフル付き振とうフラスコに接種するために使用した。接種したものを振とうインキュベーター(250rpm)内で約28〜30℃で約60〜65時間生育させた。細胞を遠心分離(22℃で3,000×g、5分間)により回収した。エンテロキナーゼ発現を誘導するために、その細胞ペレットを1.34%(w/v)酵母窒素ベース(YNB)、200mMリン酸緩衝液、4×10−5%(w/v)ビオチン、および5%(v/v)メタノールを含む1mLの第1誘導培養液中に再懸濁した。その細胞を振とうインキュベーター(250rpm)内で約28〜30℃で約8〜10時間培養した。その培養物を100μLのメタノールでチャージし、約16〜18時間培養し、そして追加の100μLのメタノールを24時間毎にその培養液に添加し、最終的なチャージを誘導から約72〜74時間後に添加した。振とうフラスコサンプルから得られたデータを比較するために、基準株B18(Hisタグエンテロキナーゼを生成するピキア・パストリス(Pichia pastoris)CBS7435MutSpPpT4アルファ/EK‐HIS発現構築物)を統合株と並べて2つの振とうフラスコ中にセットした。
本明細書中に開示されるようにEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、機能的に連結された核酸分子をpPIC Aベクター(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)にクローニングするために好適な制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を標準のDNA合成手順を用いて配列番号4の5’‐および3’末端に導入した。この構築物を1)エンテロキナーゼをコードする配列番号4を切り出す、および2)この挿入物がpPIC Aベクターに機能的に連結されることを可能にする制限酵素で消化する。この挿入物をT4 DNAリガーゼ手順を用いてpPIC A/BoNT/E‐myc‐Hisを作出するのに適切な制限酵素エンドヌクレアーゼで消化されたpPIC Aベクター内にサブクローニングする。ヒートショック法を用いてそのライゲーション混合物で化学的コンピテント大腸菌DH5アルファ細胞(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)を形質転換し、25μg/mLのZEOCIN(商標)を含む1.5%低塩Luria‐Bertaniアガープレート(pH7.5)上に撒き、そして37℃のインキュベーター内に入れ一晩生育させる。発現構築物を含む細菌はZEOCIN(商標)耐性コロニーとして同定される。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニプレップ手順を用いて単離し、そして制限酵素エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、その挿入物の存在および向きを決定する。このクローニング法はカルボキシ末端c−mycおよびポリヒスチジン結合ペプチドに機能的に連結されたエンテロキナーゼをコードする酵母発現構築物を作出する。同様の方法を配列番号6、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形を含むpPIC A/EK発現構築物を作出するために使用する。
本明細書中に開示されるようにEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、機能的に連結された核酸分子をpMETベクター(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)にクローニングするために好適な制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を標準のDNA合成手順を用いて配列番号4の5’および3’末端に導入する。この構築物を、1)エンテロキナーゼをコードする配列番号4を切り出す、2)この挿入物がpMETベクターに機能的に連結されることを可能にする、制限酵素で消化する。この挿入物をT4 DNAリガーゼ手順を用いて適切な制限酵素エンドヌクレアーゼで消化されたpMETベクター内にサブクローニングし、pMET/BoNT/E‐V5‐Hisを作出する(図9)。ヒートショック法を用いてそのライゲーション混合物で化学的コンピテント大腸菌DH5アルファ細胞(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)を形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含む1.5%低塩Luria‐Bertaniアガープレート(pH7.5)上に撒き、そして37℃のインキュベーター内に入れ、一晩生育させる。発現構築物を含む細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニプレップ手順を用いて単離し、そして制限酵素エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、その挿入物の存在および向きを決定する。このクローニング法はカルボキシ末端V5に機能的に連結されたエンテロキナーゼおよびポリヒスチジン結合ペプチドをコードする酵母発現構築物を作出する。同様の方法を配列番号6、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形を含むpMET/EK発現構築物を作出するために使用する。
本明細書中に開示されるようにEKをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、機能的に連結された核酸分子をpYES2ベクター(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)内にクローニングするために好適な制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を標準のDNA合成手順を用いて配列番号4の5’および3’末端に導入する。この構築物を、1)エンテロキナーゼをコードする配列番号4を切り出す、および2)この挿入物がpYES2ベクターに機能的に連結されることを可能にする、制限酵素で消化する。この挿入物をT4 DNAリガーゼ手順を用いて適切な制限酵素エンドヌクレアーゼで消化されたpYES2ベクター内にサブクローニングし、pYES2/EK‐V5‐Hisを作出する(図10)。ヒートショック法を用いてそのライゲーション混合物で化学的コンピテント大腸菌DH5アルファ細胞(Invitrogen,Inc,Carlsbad,CA)を形質転換し、100μg/mLアンピシリンを含む1.5%低塩Luria‐Bertaniアガープレート(pH7.5)上に撒き、そして37℃のインキュベーター内に入れ、一晩生育させる。発現構築物を含む細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニプレップ手順を用いて単離し、そして制限酵素エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、その挿入物の存在および向きを決定する。このクローニング法はカルボキシ末端V5に機能的に連結されたエンテロキナーゼおよびポリヒスチジン結合ペプチドをコードする酵母発現構築物を作出する。同様の方法を配列番号6、配列番号4もしくは配列番号6のヌクレオチド変異形または配列番号4もしくは配列番号6の切断変異形を含むpYES2/EK発現構築物を作出するために使用する。
Claims (14)
- 配列番号4または配列番号6のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子。
- 請求項1に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、酵母発現構築物をさらに含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
- 配列番号4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された酵母発現ベクターを含む、酵母発現構築物。
- 請求項3に記載の酵母発現構築物であって、配列番号4のヌクレオチド配列を含む該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたアルファ因子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、酵母発現構築物。
- 請求項4に記載の酵母発現構築物であって、配列番号4のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結されたアルファ因子をコードする該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号6である、酵母発現構築物。
- 配列番号4または配列番号6のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む酵母発現構築物で形質転換された酵母細胞。
- 該発現構築物は該酵母細胞内において染色体外である、請求項6に記載の酵母細胞。
- 該発現構築物は、該酵母細胞の染色体に安定的に統合される、請求項6に記載の酵母細胞。
- 請求項6に記載の酵母細胞であって、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)、分裂酵母、出芽酵母、またはヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)細胞である、酵母細胞。
- 請求項6に記載の酵母細胞であって、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)細胞である、酵母細胞。
- エンテロキナーゼの生成方法であって、配列番号4または配列番号6のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む酵母発現構築物で形質転換された酵母細胞を培養して、それにより配列番号4または配列番号6のヌクレオチド配列によりコードされるエンテロキナーゼを生成するステップを含む、方法。
- 請求項11に記載の方法であって、該酵母細胞は、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)、分裂酵母、出芽酵母、またはヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)細胞である、方法。
- 該酵母細胞はピキア・パストリス(Pichia pastoris)細胞である、請求項11に記載の方法。
- 配列番号4または配列番号6のヌクレオチド配列によりコードされる該エンテロキナーゼを精製することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
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