ES2553149T3

ES2553149T3 - Composiciones y métodos para producir enterocinasa en la levadura

Info

Publication number: ES2553149T3
Application number: ES11788004.7T
Authority: ES
Inventors: Ian Fotheringham; Peter J. Sheffield
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 2010-11-23
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2015-12-04
Anticipated expiration: 2031-11-18
Also published as: JP5425350B2; NZ611164A; WO2012071257A1; US20130302853A1; HK1189028A1; EP2643457B1; KR20140018850A; UA105459C2; KR101920094B1; AU2011332131B2; MX2013005749A; CA2816217C; RU2560577C2; IL226165A0; CL2013001476A1; MY170261A; SG190316A1; AU2011332131A1; DK2643457T3; EP2643457A1

Abstract

Una molécula polinucleotídica aislada que comprende la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

En otros aspectos más de esta descripción, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa puede ser una variante polinucleotídica que se hibrida a una molécula polinucleotídica que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, o un complemento de las mismas, en condiciones rigurosas. Tales condiciones de hibridación rigurosas las conocen los expertos en la técnica y se pueden encontrar en, p. ej., «Current Protocols in Molecular

5 Biology», John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, incorporado en su totalidad por referencia. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridación rigurosas (p. ej., rigor elevado) son la hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a 6x a aproximadamente 45 ºC seguido por uno o varios lavados en SSC a 0,2x, SDS al 0,1% a 5065 ºC.

Aún en otros aspectos de esta descripción, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa

10 puede ser una variante polinucleotídica descrita en la tabla 1. Esta tabla incluye la secuencia aminoacídica de la cadena ligera de la enterocinasa, los codones que comprenden el marco abierto de lectura de la región polinucleotídica de la SEQ ID nº 4 y de la SEQ ID nº 6 que codifica este fragmento de cadena ligera, y las variantes codónicas que pueden sustituir a los codones de la SEQ ID nº 4 y de la SEQ ID nº 6. En aspectos de esta descripción, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

15 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 codones variantes de la tabla 1 sustituyendo a los correspondientes codones presentes en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6. En otros aspectos de esta descripción, una molécula de la variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones variantes de la

20 tabla 1 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6. En otros aspectos más de esta realización, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., como mucho 1, como mucho 2, como mucho 3, como mucho 4, como mucho 5, como mucho 6, como mucho 7, como mucho 8, como mucho 9, como mucho 10, como mucho 11, como mucho 12, como mucho 13, como mucho 14, como mucho 15, como mucho 16, como mucho 17, como mucho 18, como mucho 19 o como mucho 20 codones variantes de la

25 tabla 1 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6.

Tabla 1. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido I V G G S: D S R E G A W

Codón ATA GTT GGC GGC TCT: GAC TCC AGA GAA GGT GCC TGG

Variante ATT ATC -GGT GGA GGT GGA -: GAT TCT - - GGA GCT -

Aminoácido P W V V A: L Y F D D Q Q

Codón CCA TGG GTC GTT GCC: TTA TAC TTT GAT GAT CAA CAG

Variante CCT -GTT -GCT: TTG TAT - - - - CAA

Aminoácido V C G A S: L V S R D W L

Codón GTC TGT GGT GCT TCA: CTT GTT TCT AGA GAT TGG TTG

Variante GTT -GGA -TCT: TTG - - - - - -

Aminoácido V S A A H: C V Y G R N M

Codón GTG TCC GCA GCA CAT: TGT GTG TAT GGT AGG AAT ATG

Variante: GTT TCT GCT GCT - - GTT TAC GGA AGA CAA -

Tabla 1. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido I V G G S: D S R E G A W

Aminoácido E P S K W: K A V L G L H

Codón GAG CCT TCA AAG TGG: AAA GCT GTA TTG GGG TTG CAT

Variante GAA CCA TCT --: AAG - GTT - GGT GGA - -

Aminoácido M A S N L: T S P Q I E T

Codón ATG GCC TCT AAC CTT: ACA AGT CCA CAA ATT GAA ACT

Variante -GCT --TTG: ACT TCT CCT - ATC - -

Aminoácido R L I D Q: I V I N P H Y

Codón AGA CTA ATT GAT CAA: ATT GTT ATC AAT CCT CAT TAC

Variante -TTG ATC --: ATC - ATT AAC CCA - -

Aminoácido N K R R K: N N D I A M M

Codón AAT AAG CGT AGG AAA: AAC AAT GAC ATA GCA ATG ATG

Variante AAC -AGA AGA AAG: - AAC GAT ATT ATC GCT - -

Aminoácido H L E M K: V N Y T D Y I

Codón CAC TTG GAG ATG AAA: GTT AAC TAC ACA GAC TAC ATC

Variante CAT -GAA -AAG: - - - ACT GAT - ATT

Aminoácido Q P I C L: P E E N Q V F

Codón CAA CCA ATA TGT TTG: CCT GAG GAA AAT CAG GTG TTC

Variante: - CCT ATT ATC - - CCA GAA - AAC CAA GTT TTT

Tabla 1. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido I V G G S: D S R E G A W

Aminoácido P P G R I: C S I A G W G

Codón CCA CCT GGT CGT ATT: TGT AGT ATT GCT GGA TGG GGA

Variante CCT CCA GGA AGA ATC: - TCT ATC - GGT - GGT

Aminoácido A L I Y Q: G S T A D V L

Codón GCC CTG ATC TAC CAA: GGA TCT ACC GCT GAC GTA TTA

Variante GCT TTG ATT --: GGT - ACT - GAT GTT TTG

Aminoácido Q E A D V: P L L S N E K

Codón CAA GAG GCA GAT GTT: CCT CTG CTG TCC AAC GAG AAA

Variante -GAA GCT --: CCA TTG TTG TCT - GAA AAG

Aminoácido C Q Q Q M: P E Y N I T E

Codón TGC CAG CAA CAA ATG: CCA GAA TAC AAC ATC ACT GAA

Variante -CAA ---: CCT - - - ATT - -

Aminoácido N M V C A: G Y E A G G V

Codón AAC ATG GTT TGT GCT: GGT TAT GAA GCT GGA GGT GTA

Variante -----: GGA TAC - - GGT GGA GTT

Aminoácido D S C Q G: D S G G P L M

Codón GAT TCA TGC CAG GGA: GAT TCA GGC GGT CCT CTA ATG

Variante -TCT -CAA GGT: - TCT GGT GGA GGA CCA TTG -

Aminoácido: C Q E N N R W L L A G V

Tabla 1. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido I V G G S: D S R E G A W

Codón TGC CAG GAG AAT AAC: CGA TGG TTG CTT GCT GGT GTA

Variante -CAA GAA AAC -: AGA - - TTG - GGA GTT

Aminoácido T S F G Y: Q C A L P N R

Codón ACG AGT TTT GGA TAT: CAA TGC GCT TTA CCT AAC CGT

Variante ACT TCT -GGT TAC: - - - TTG CCA - AGA

Aminoácido P G V Y A: R V P R F T E

Codón CCA GGG GTC TAT GCA: AGA GTC CCA AGA TTC ACC GAG

Variante CCT GGT GGA GTT TAC GCT: - GTT CCT - TTT ACT GAA

Aminoácido W I Q S F: L H * imagen4 imagen5 imagen6 imagen7

Codón TGG ATT CAA TCT TTT: CTG CAC TGA imagen8 imagen9 imagen10 imagen11

Variante: - ATC - - - TTG CAT TAA imagen12 imagen13 imagen14 imagen15

En otros aspectos, una molécula polinucleotídica que codifica la enterocinasa puede ser una variante de polinucleótido descrita en la tabla 2. Esta tabla incluye la secuencia aminoacídica de la cadena ligera de la enterocinasa, los codones comprenden el marco abierto de lectura de la región polinucleotídica de SEQ ID nº 4 y 5 SEQ ID nº 6 que codifica este fragmento de cadena ligera, y las variantes codónicas que pueden sustituir a los codones de SEQ ID nº 4 y SEQ ID nº 6. En aspectos, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 codones variantes de la tabla 2 sustituyendo a los correspondientes codones presentes en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6. En otros aspectos, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., al menos 1, al menos 2, al 10 menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones variantes de la tabla 2 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº

6. En otros aspectos, una molécula variante polinucleotídica que codifica la enterocinasa tiene, p. ej., como mucho 1, como mucho 2, como mucho 3, como mucho 4, como mucho 5, como mucho 6, como mucho 7, como mucho 8,

15 como mucho 9, como mucho 10, como mucho 11, como mucho 12, como mucho 13, como mucho 14, como mucho 15, como mucho 16, como mucho 17, como mucho 18, como mucho 19 o como mucho 20 codones variantes de la tabla 2 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6.

Tabla 2. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido I V G G S D: S R E G A W

Codón ATA GTT GGC GGC TCT GAC: TCC AGA GAA GGT GCC TGG

Variante ATT -GGT GGT -GAT: TCT - - - GCT -

Aminoácido P W V V A L: Y F D D Q Q

Codón CCA TGG GTC GTT GCC TTA: TAC TTT GAT GAT CAA CAG

Variante --GTT -GCT TTG: TAT - - - - CAA

Aminoácido V C G A S L: V S R D W L

Codón GTC TGT GGT GCT TCA CTT: GTT TCT AGA GAT TGG TTG

Variante GTT ---TCT TTG: - - - - - -

Aminoácido V S A A H C: V Y G R N M

Codón GTG TCC GCA GCA CAT TGT: GTG TAT GGT AGG AAT ATG

Variante GTT TCT GCT GCT --: GTT TAC - AGA CAA -

Aminoácido E P S K W K: A V L G L H

Codón GAG CCT TCA AAG TGG AAA: GCT GTA TTG GGG TTG CAT

Variante GAA CCA TCT --AAG: - GTT - GGT - -

Aminoácido M A S N L T: S P Q I E T

Codón ATG GCC TCT AAC CTT ACA: AGT CCA CAA ATT GAA ACT

Variante -GCT --TTG ACT: TCT - - - - -

Aminoácido: R L I D Q I V I N P H Y

Tabla 2. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Codón AGA CTA ATT GAT CAA ATT: GTT ATC AAT CCT CAT TAC

Variante -TTG ----: - ATT AAC CCA - -

Aminoácido N K R R K N: N D I A M M

Codón AAT AAG CGT AGG AAA AAC: AAT GAC ATA GCA ATG ATG

Variante AAC -AGA AGA AAG -: AAC GAT ATT GCT - -

Aminoácido H L E M K V: N Y T D Y I

Codón CAC TTG GAG ATG AAA GTT: AAC TAC ACA GAC TAC ATC

Variante CAT -GAA -AAG -: - - ACT GAT - ATT

Aminoácido Q P I C L P: E E N Q V F

Codón CAA CCA ATA TGT TTG CCT: GAG GAA AAT CAG GTG TTC

Variante --ATT --CCA: GAA - AAC CAA GTT TTT

Aminoácido P P G R I C: S I A G W G

Codón CCA CCT GGT CGT ATT TGT: AGT ATT GCT GGA TGG GGA

Variante -CCA -AGA --: TCT - - GGT - GGT

Aminoácido A L I Y Q G: S T A D V L

Codón GCC CTG ATC TAC CAA GGA: TCT ACC GCT GAC GTA TTA

Variante GCT TTG ATT --GGT: - ACT - GAT GTT TTG

Aminoácido Q E A D V P: L L S N E K

Codón CAA GAG GCA GAT GTT CCT: CTG CTG TCC AAC GAG AAA

Variante: - GAA GCT - - CCA TTG TTG TCT - GAA AAG

Tabla 2. Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Aminoácido C Q Q Q M P: E Y N I T E

Codón TGC CAG CAA CAA ATG CCA: GAA TAC AAC ATC ACT GAA

Variante -CAA ----: - - - ATT - -

Aminoácido N M V C A G: Y E A G G V

Codón AAC ATG GTT TGT GCT GGT: TAT GAA GCT GGA GGT GTA

Variante ------: TAC - - GGT - GTT

Aminoácido D S C Q G D: S G G P L M

Codón GAT TCA TGC CAG GGA GAT: TCA GGC GGT CCT CTA ATG

Variante -TCT -CAA GGT -: TCT GGT - CCA TTG -

Aminoácido C Q E N N R: W L L A G V

Codón TGC CAG GAG AAT AAC CGA: TGG TTG CTT GCT GGT GTA

Variante -CAA GAA AAC -AGA: - - TTG - - GTT

Aminoácido T S F G Y Q: C A L P N R

Codón ACG AGT TTT GGA TAT CAA: TGC GCT TTA CCT AAC CGT

Variante ACT TCT -GGT TAC -: - - TTG CCA - AGA

Aminoácido P G V Y A R: V P R F T E

Codón CCA GGG GTC TAT GCA AGA: GTC CCA AGA TTC ACC GAG

Variante -GGT GTT TAC GCT -: GTT - - TTT ACT GAA

Aminoácido: W I Q S F L H * imagen16 imagen17 imagen18 imagen19

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tabla 2.: Secuencias del ácido nucleico de enterocinasa

Codón: TGG ATT CAA TCT TTT CTG CAC TGA

Variante: imagen20 - - - - - TTG CAT TAA imagen21 imagen22 imagen23 imagen24

Aún en otro aspecto, la molécula polinucleotídica que codifica la enterocinasa puede ser un fragmento truncado de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o una variante nucleotídica de las mismas. Tal y como se emplea en esta memoria, la terminología «fragmento truncado» de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o cualquier variante nucleotídica de las mismas, hace referencia a la retirada de nucleótidos de la secuencia de 710 nucleótidos representada por la SEQ ID nº 4, o una variante nucleotídica de la misma, o la secuencia de 953 nucleótidos representada por la SEQ ID nº 6, o una variante nucleotídica de la misma. Los nucleótidos del extremo 5', del extremo 3' o bien tanto del extremo 5' como del extremo 3' de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, se pueden retirar.

En algunos aspectos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 3' y desde el extremo 5', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas. En otros aspectos de esta realización, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, o al menos 50 nucleótidos se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas. Aún en otros aspectos de esta realización, como mucho 1, como mucho 2, como mucho 3, como mucho 4, como mucho 5, como mucho 6, como mucho 7, como mucho 8, como mucho 9, como mucho 10, como mucho 11, como mucho 12, como mucho 13, como mucho 14, como mucho 15, como mucho 16, como mucho 17, como mucho 18, como mucho 19,como mucho 20, como mucho 25, como mucho 30, como mucho 35, como mucho 40, como mucho 45 o como mucho 50 nucleótidos se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas.

En otros aspectos,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 codones se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas. En otros aspectos de esta realización, al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas. Aún en otros aspectos de esta realización, como mucho 1, como mucho 2, como mucho 3, como mucho 4, como mucho 5, como mucho 6, como mucho 7, como mucho 8, como mucho 9, como mucho 10, como mucho 11, como mucho 12, como mucho 13, como mucho 14, como mucho 15, como mucho 16, como mucho 17, como mucho 18, como mucho 19 o como mucho 20 codones se retiran desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas.

Los aspectos de la presente especificación describen, en parte, una molécula polinucleotídica que comprende un vector de expresión para levaduras. Se puede emplear un amplia gama de vectores de expresión para levaduras para expresar una molécula polinucleotídica que codifica la EK, entre ellas, sin limitación, un vector de expresión para Pichia pastoris, un vector de expresión para Pichia methanolica, un vector de expresión para Pichia angusta, un vector de expresión para Schizosaccharomyces pombe, un vector de expresión para Saccharomyces cerevisiae y un vector de expresión para Yarrowia lipolytica. Ejemplos no limitantes de los vectores de expresión para levaduras incluyen un vector de expresión pGal-MF (DualsystemsBiotech, AG, Schlieren, CH), un vector de expresión pMET (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un vector de expresión PICHIAPINK (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un vector de expresión pPICZ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un vector de expresión pPpT4Alpha (Ingenza, Ltd., Midlothian, GB), un vector de expresión pTEF-MF (DualsystemsBiotech, AG, Schlieren, CH), un vector de expresión pYES (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA).

Un vector de expresión para levaduras incluye típicamente regiones polinucleotídicas de control o reguladoras que dirigen o facilitan, p. ej., aspectos de la replicación, de la integración, de la transcripción, de la traducción y/o del procesamiento postraduccional. Por ejemplo, un vector de expresión para levaduras puede incluir un promotor constitutivo y elementos potenciadores y/o un promotor inducible y elementos potenciadores utilizados para dirigir la expresión de la EK. Un ejemplo no limitante de un vector de expresión constitutivo es uno que emplea un promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) para dirigir la producción de la EK. Un ejemplo no limitante de

imagen25

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

kit de expresión para Pichia EASYSELECT™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un kit de expresión para Pichia EASYSELEC™ ECHO™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un sistema de expresión para Pichia methanolica (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un kit de proteínas secretadas PICHIAPINK™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), un kit de vector de expresión YES-ECHO™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) y un sistema de expresión para S. pombe SPECTRA™ (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Los ejemplos para expresar una EK desde una molécula polinucleotídica descrita en la presente memoria mediante un sistema de expresión para levaduras se describen en los ejemplos 2 a 6.

En una realización, la cantidad de EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de las mismas, está incrementada en comparación con la cantidad de la EK expresada desde la SEQ ID nº 2.

En aspectos de esta realización, la cantidad de EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de la misma, está incrementada en torno a, p. ej., al menos 0,5 veces, al menos 1 vez, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces, al menos 20 veces, al menos 25 veces, al menos 30 veces, al menos 35 veces o al menos 40 veces, en comparación con la cantidad de la EK expresada desde la SEQ ID nº 2. En otros aspectos de esta realización, la cantidad de EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de la misma, está incrementada en torno a, p. ej., de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 5 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 10 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 15 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 20 veces, de aproximadamente 1 vez a aproximadamente 25 veces, en comparación con la cantidad de EK expresada desde la SEQ ID nº 2.

En otros aspectos de esta realización, la cantidad de EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de las mismas, es de aproximadamente 100 mg/l a aproximadamente 30 g/l. En aspectos de esta realización, la cantidad de la EK expresada desde una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de las mismas, puede ser, p. ej., al menos 100 mg/l, al menos 500 mg/l, al menos 1 g/l, al menos 1,5 g/l, al menos 2,5 g/l, al menos 5 g/l, al menos 7,5 g/l, al menos 10 g/l, al menos 12,5 g/l, al menos 15 g/l, al menos 20 g/l, al menos 25 g/ o al menos 30 g/l. En otros aspectos de esta realización, la cantidad de EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o cualquier variante polinucleotídica de las mismas, puede ser, p. ej., de aproximadamente 100 mg/l a aproximadamente 5 g/l, de aproximadamente 100 mg/l a aproximadamente 10 g/l, de aproximadamente 100 mg/l a aproximadamente 15 g/l, de aproximadamente 500 mg/l a aproximadamente 5 g/l, de aproximadamente 500 mg/l a aproximadamente 10 g/l, de aproximadamente 500 mg/l a aproximadamente 15 g/l, de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 5 g/l, de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 10 g/l, de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 15 g/l, de aproximadamente 1 g/l a aproximadamente 20 g/l, de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 10 g/l, de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 15 g/l, de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 20 g/l, de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 25 g/l, de aproximadamente 5 g/l a aproximadamente 30 g/l.

Una EK expresada desde una construcción de expresión para levaduras descrita en la presente memoria se puede purificar de la célula de levadura o del medio de cultivo mediante cualquiera de una sierie de métodos. Los ejemplos de los métodos de purificación incluyen, sin limitación, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de lectina, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacciones hidrófobas, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de adsorción, cromatografía en hidroxiapatita, cromatografía líquida de resolución rápida (FLPC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los restos de fijación del péptido diana de interés se pueden unir a cualquiera de una serie de sustancias que incluyen, sin limitación, resinas, agarosa y perlas magnéticas. Además, se puede utilizar cualquiera de una serie de técnicas de procesamiento, entre ellas, sin limitación, el procesamiento por lotes, y columnas de alimentación por gravedad. Las etapas de replegamiento de las proteínas también pueden ser necesarias para asegurar la recuperación de una BoNT/A funcionalmente activa codificada por las moléculas de ácido nucleico descritas en la especificación. Ejemplos no limitantes de protocolos específicos para purificar y recuperar las proteínas se describen en, p. ej., John Abelson et al., «GUIDE TO PROTEIN PURIFICATION», (Academic Press, 1990), «PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE», (Robert K. Scopes et al. eds., Springer Verlag, 3.ª ed. 1994), «PROTEIN PURIFICATION TECHNIQUES: A PRACTICAL APPROACH», (Simon Roe ed., Oxford University Press, 2.ª ed. 2001),«MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL», véase más arriba, (2001), Iran M. Rosenberg, «PROTEIN ANALYSIS & PURIFICATION: BENCHTOP TECHNIQUES», (Springer Verlag, 2002). Estos protocolos son métodos corrientes dentro del alcance de un experto en la técnica y a partir de las enseñanzas de esta memoria.

Las cantidades de EK se pueden medir durante la expresión de la EK, después de completar la expresión de la EK y/o después de la purificación de la EK utilizando cualquiera de una serie de métodos. Los ejemplos de los métodos de medición de proteínas incluyen, sin limitación, la electroforesis en gel y la tinción de proteínas, análisis de inmunotransferencia, ELISA, marcación con proteínas, absorbancia UV, el análisis de Lowry, el análisis de Biuret, el

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

análisis de cobre/bicinconínico de Smith (BCA) y el análisis del colorante de Bradford, véase, p. ej., Christine V. Sapan et al., «Colorimetric Protein Assay Techniques», 29(2) BIOTECHNOL. APPL. BIOCHEM. 99-108, (1999).

Los aspectos de la presente especificación describen, en parte, métodos para escindir un polipéptido que comprende un sitio de escisión para la EK mediante el uso de una EK. En una realización, un método para escindir un polipéptido que comprende un sitio de escisión para la EK incluye la etapa de poner en contacto el polipéptido que incluye un sitio de escisión para la EK, la EK producida mediante la expresión de una construcción de expresión para levaduras que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, cualquier variante polinucleotídica de las mismas, o cualquier variante truncada de las mismas, en la célula de levadura, en donde poner en contacto el polipéptido recombinante con la enterocinasa da lugar a una escisión específica por el sitio de escisión para la EK. En un aspecto de esta realización, el sitio de escisión para la EK es la SEQ ID nº 1. El polipéptido puede ser uno que tiene de forma natural un sitio de escisión de la EK o puede ser un polipéptido recombinante que está modificado genéticamente para contener un sitio de escisión de la EK.

Los aspectos de la presente especificación describen, en parte, métodos para preparar un polipéptido que comprende un sitio de escisión para la EK mediante el uso de una EK. En una realización, un método para preparar un polipéptido que comprende un sitio de escisión para la EK incluye la etapa de poner en contacto el polipéptido que incluye un sitio de escisión para la EK, la EK producida por la expresión de una construcción de expresión para levaduras que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, cualquier variante polinucleotídica de las mismas, o cualquier variante truncada de las mismas, en la célula de levadura, en donde poner en contacto el polipéptido recombinante con la enterocinasa da lugar a una escisión específica por el sitio de escisión para la EK. En un aspecto de esta realización, el sitio de escisión para la EK es la SEQ ID nº 1. El polipéptido puede ser uno que tiene de forma natural un sitio de escisión para la EK o puede ser un polipéptido recombinante que está modificado genéticamente para contener un sitio de escisión de la EK.

Los métodos para utilizar la EK para escindir o preparar un polipéptido que comprende un sitio de escisión de la EK se pueden realizar mediante un análisis estándar de escisión proteolítica in vitro. Por ejemplo, un polipéptido que comprende un sitio de escisión de EK se puede añadir a una mezcla de reacción que comprende Tris-HCl a 20 mM (pH 7,4), NaCl a 50 mM, CaCl2 a 20 mM y una EK producida tal y como se describe en la presente memoria, y se puede incubar de aproximadamente 20 a aproximadamente 22 ºC durante de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 16 horas. Así pues, el grado de escisión o de preparación del polipéptido producido se puede valorar mediante métodos estándares, tales como, p. ej., análisis de SDS-PAGE, un inmunoensayo como el análisis de inmunotransferencia o ELISA, o un ensayo de actividad para el polipéptido. El polipéptido preparado o escindido también se puede purificar mediante métodos estándares. Los ensayos útiles para escindir o preparar un polipéptido que comprende un sitio de escisión de EK se describen en, p. ej., Ogiwara et al., Modified Enteropeptidase Protein, patente de los EE. UU. US 8.013.137; La Vallie, Cloning of Enterokinase and Method of Use, patente de los EE. UU. US 6.746.859, cada uno incorporado en su totalidad mediante referencia.

Los aspectos de la presente especificación también se pueden describir como sigue:

1.: Una molécula polinucleotídica aislada que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, una variante polinucleotídica de las mismas, o una variante truncada de las mismas, y cualquier complemento de las mismas.

2.: La molécula polinucleotídica aislada de la realización 1, en donde la variante polinucleotídica es idéntica al menos al 70%, al menos al 75%, al menos al 80%, al menos al 85%, al menos al 90%, al menos al 91%, al menos al 92%, al menos al 93%, al menos al 94%, al menos al 95%, al menos al 96%, al menos al 97%, al menos al 98% o al menos al 99% a la secuencia polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 6, o un complemento de las mismas.

3.: La molécula polinucleotídica aislada de la realización 1, en donde la variante polinucleotídica tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 55, o de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 sustituciones de nucleótidos no contiguos respecto a la SEQ ID nº 4, a la SEQ ID nº 6, o a un complemento de las mismas.

4.: La molécula polinucleotídica aislada de la realización 1, en donde la variante polinucleotídica tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 55 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 sustituciones de nucleótidos contiguos respecto a la SEQ ID nº 4, a la SEQ ID nº 6, o a un complemento de las mismas.

imagen26

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

al 98% o al menos al 99% a la secuencia polinucleotídica de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de un complemento de las mismas.

20.: La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante polinucleotídica tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 55 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 sustituciones de nucleótidos no contiguos respecto a la SEQ ID nº 4, a la SEQ ID nº 6, o a un complemento de las mismas.

21.: La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante polinucleotídica tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 10, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 1 a aproximadamente 25, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30, de aproximadamente 5 a aproximadamente 35, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 55 o de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 sustituciones de nucleótidos contiguos respecto a la SEQ ID nº 4, a la SEQ ID nº 6, o a un complemento de las mismas.

22.: La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante polinucleotídica se hibrida a una molécula polinucleotídica que comprende la SEQ ID nº 4, la SEQ ID nº 6, o un complemento de las mismas, en una condición rigurosa.

23.: La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante polinucleotídica tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones variantes de la tabla 1 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o en la SEQ ID nº 6.

24.: La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante polinucleotídica tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones variantes de la tabla 2 sustituyendo al correspondiente codón presente en la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6.

25.: La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante truncada tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, o al menos 50 nucleótidos retirados desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de cualquier complemento de las mismas.

26.: La construcción de expresión para levaduras de la realización 18, en donde la variante truncada tiene al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 codones retirados desde el extremo 5', desde el extremo 3', o bien desde el extremo 5' y desde el extremo 3', de la SEQ ID nº 4, de la SEQ ID nº 6, o de cualquier variante nucleotídica de las mismas, o de un complemento de las mismas.

27.: La construcción de expresión para levaduras de las realizaciones 18 a 26, en donde el vector de expresión para levaduras es un vector de expresión para Pichia pastoris, un vector de expresión para Pichia methanolica, un vector de expresión para Pichia angusta, un vector de expresión para Schizosaccharomyces pombe, un vector de expresión para Saccharomyces cerevisiae y un vector de expresión para Yarrowia lipolytica.

28.: La construcción de expresión para levaduras de la realización 27, en donde el vector de expresión para levaduras incluye un promotor constitutivo, un potenciador constitutivo, un promotor inducible, un potenciador inducible o cualquier combinación de los mismos que dirige la expresión de la molécula polinucleotídica de las realizaciones 1 a 9.

29.: La construcción de expresión para levaduras de la realización 28, en donde el promotor inducible es un promotor de la aldehído oxidasa 1 (AOX1).

30.: La construcción de expresión para levaduras de las realizaciones 27 a 29, en donde el vector de expresión para

imagen27

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Ejemplo 1

Síntesis de una molécula polinucleotídica que codifica la EK

Una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4 se sintetiza mediante los métodos químicos estándares (BlueHeron Biotechnology, Bothell, WA). Por ejemplo, se sintetizan oligonucleótidos de 20 a 50 bases de longitud por síntesis estándar con fosforamiditas. Estos oligonucleótidos se hibridan en cadenas bicatenarias que se ligan juntos para ensamblar la molécula polinucleotídica de longitud completa. Esta molécula de polinucleótido se clona con los métodos estándares de biología molecular en un vector pUCBHB1 en el sitio SmaI para generar el pUCBHB1/EK. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica por secuenciación con química BIG DYE TERMINATOR™ 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se utiliza una estrategia de síntesis similar para hacer una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 6, variantes nucleotídicas de la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6, y variantes truncadas de la SEQ ID nº 4 o la SEQ ID nº 6.

Si se desea, se sintetiza una molécula polinucleotídica optimizada de expresión basada en la SEQ ID nº 2, en la SEQ ID nº 4 o en la SEQ ID nº 6 para mejorar la expresión en las células de levadura. La molécula polinucleotídica que codifica la EK se modifica para 1) contener los codones sinónimos típicamente presentes en las moléculas polinucleotídicas nativas de una cepa de levadura de elección; 2) contener un contenido de G+C que se acerca lo más posible al contenido de G+C medio de las moléculas polinucleotídicas nativas encontradas en una cepa de levadura de elección; 3) reducir las regiones polimononucleotídicas encontradas dentro de la molécula polinucleotídica; y/o 4) eliminar los sitios reguladores o estructurales internos encontrados dentro de la molécula polinucleotídica, véase, p. ej., Lance E. Steward et al., Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type E, solicitud de publicación de patente internacional WO 2006/011966 (2 de febrero de 2006); Lance E. Steward et al., Optimizing Expression of Active Botulinum Toxin Type A, solicitud de publicación de patente internacional WO 2006/017749 (16 de febrero de 2006), cada una incorporada totalmente por referencia. Una vez que la optimización de secuencias está completa, los oligonucleótidos de 20 a 50 bases de longitud se sintetizan con la síntesis estándar de fosforamiditas. Estos oligonucleótidos se hibridan en cadenas bicatenarias que se ligan juntas para ensamblar la molécula polinucleotídica de longitud completa. Esta molécula de polinucleótido se clona con los métodos estándares de biología molecular en un vector pUCBHB1 en el sitio SmaI para generar el pUCBHB1/EK. La molécula de polinucleótido sintetizada se verifica por secuenciación con química BIG DYE TERMINATOR™ 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Una estrategia de síntesis similar se utiliza para fabricar una molécula polinucleotídica que es variante nucleotídica de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6, o variantes truncadas de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6.

Ejemplo 2

Construcción y expresión de pPpT4Alpha/EK

Para construir una construcción de expresión para levaduras que comprende una molécula polinucleotídica que codifica la EK según se describe en la presente memoria, una construcción pJ201/rEK que contiene la SEQ ID nº 4 se digirió con XhoI y NotI para cortar el inserto de la SEQ ID nº 4. El fragmento de restricción resultante se purificó mediante el kit de extracción de gel QIAQUICK® (QIAGEN, Inc., Valencia, CA) y el fragmento de la SEQ ID nº 4 se subclonó en el vector pPpT4Alpha_S (Ingenza, Ltd., Midlothian, UK) que se había digerido con las endonucleasas de restricción XhoI y NotI. El vector pPpT4Alpha_S incluye una secuencia señal de secreción del factor α, una porción de un promotor de AOX1, las secuencias de terminación de la transcripción de AOD y AOX1, y un marco abierto de lectura para ZEOCIN™. El fragmento y el vector se ligan mediante el protocolo de la ADN ligasa de T4 para producir el pPpT4Alpha/rEK y una alícuota de esta mezcla de ligación se transformó mediante un protocolo estándar de electroporación en las células electrocompetentes NEB10 (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA). Las células transformadas se sembraron en placas de agar Lennox de Luria-Bertani al 1,5% (pH 7,0) que contenían 25 µg/ml de ZEOCIN™ y se colocaron en un incubador a 37 °C para que crezcan durante una noche. Las construcciones de expresión candidatas se seleccionaron como colonias resistentes a ZEOCIN™. Posteriormente, las colonias resistentes se hicieron crecer, se recogieron y se les aisló el ADN plasmídico con métodos estándares, y las construcciones de expresión candidatas se cribaron mediante digestión de restricción con XhoI y NotI, XbaI, o NdeI para determinar la presencia y la orientación correctas del fragmento insertado. Los cultivos que contienen la construcción de expresión deseada pPpT4Alpha/rEK se hicieron crecer, se recogieron y el ADN plasmídico se aisló con los métodos estándares, y las construcciones de expresión candidatas se secuenciaron para verificar que se hubiese hecho la construcción de expresión correcta. Esta estrategia de clonación produjo una construcción de expresión para levaduras que comprende la SEQ ID nº 4. Se utiliza una estrategia similar para hacer una construcción de expresión pPpT4Alpha/EK que incluye la SEQ ID nº 6, una variante nucleotídica de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6, o una variante truncada de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6. Como alternativa, una molécula polinucleotídica de SEQ ID nº 4, SEQ ID nº 4, una variante nucleotídica de SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6 o una variante truncada de la SEQ ID nº 4 o de la SEQ ID nº 6 se sintetiza como se describe en el ejemplo 1.

Para construir una línea celular de levadura que expresa una enterocinasa codificada por la SEQ ID nº 4, el ADN de la construcción de expresión pPpT4Alpha/rEK se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con un cebador directo de AOX de SEQ ID nº 8 y un cebador inverso de PUC de SEQ ID nº 9 para producir un casete de integración lineal. Las cinco primeras pares de bases del cebador directo de AOX contienen un sitio BglII que no es

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

imagen32

imagen33

Claims

imagen1