CN110106184A - 一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX的克隆及应用 - Google Patents
一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX的克隆及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX，其编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用实时荧光定量qRT‑PCR，对该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX的表达模式进行分析，结果表明MsBBX基因在苜蓿中响应干旱和盐胁迫，为快速培育抗逆性强的紫花苜蓿品种提供了选择。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX的克隆及应用。
背景技术
干旱和盐碱是世界范围内限制农业生产的两大主要因素，受干旱和盐碱胁迫影响的区域几乎占世界农业用地的一半。据统计，全国盐碱土面积约l0亿hm2，其中，中国土地盐碱化大约占到全球盐碱土面积的1/10，且面积还在不断增加中，对农牧业生产和生态环境建设带来了严重的威胁。
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是我国种植面积最大的豆科多年生优质牧草，也是世界上栽培种植利用最为广泛的人工牧草，号称“牧草之王”。由于苜蓿的抗盐碱性，可以改良盐碱地，提高盐碱地的利用率，因此提高苜蓿的抗逆性至关重要。然而，由于紫花苜蓿品种混乱，并且大多数引入的外来品种不适宜当地气候环境，其耐盐、抗旱能力普遍不高，导致产量和品质都有所下降。因此，培育抗旱耐盐的紫花苜蓿新品种是提高干旱半干旱地区的牧草产量和改良盐碱地的根本途径。
在育种手段上，目前紫花苜蓿的抗性育种主要还是传统的育种方式，育种周期长，进展缓慢。近年来，随着现代分子生物学技术的快速发展，克隆、鉴定功能基因并将其转化到目标植物中以获得转基因植株取得了突破性进展，也为加速苜蓿育种进程提供了新的方向。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX的克隆及应用。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX，其特征在于，该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX编码区的核苷酸序列如下：
根据本发明，所述的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX编码区的氨基酸序列如下：
上述紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)苜蓿幼苗cDNA合成：
提取苜蓿幼苗总RNA，反转录得到第一链cDNA；
(2)MsBBX基因全长的克隆：
以紫花苜蓿cDNA为模板，根据NCBI上蒺藜苜蓿的MtBBX基因序列进行同源比对并设计引物P1和引物P2，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序得到中间片段；再根据测序得到的序列设计5’RACE引物P3和3’RACE引物P4，进行5’端序列和3’端序列的PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；最终将中间序列，5’端序列和3’端拼接得到MsBBX基因的全长序列，并用ORF Finder找到该基因的开放阅读框ORF；其中：
引物P1序列为：5’-AGGCTTCTTCTTCAATGTCT-3’；
引物P2序列为：5’-CTTCGTTATTACGCCAGCT-3’；
5’RACE引物P3序列为：
5’-GATTACGCCAAGCTTGCTGAGGAGGAGAAACTTTGACGGGA-3’；
3’RACE引物P4序列为：
5’-GATTACGCCAAGCTTAGTTTCGCATCCTCTTGGGCTGTTG-3’；
(3)在ORF两端设计引物P5和引物P6并通过PCR扩增，将其产物进行纯化、载体连接、大肠杆菌转化，测序得到紫花苜蓿干旱耐盐基因MsBBX的编码区的核苷酸序列和氨基酸序列；其中：
引物P5序列为：5’-ATGAAAATACAGTGTGATGTGTG-3’；
引物P6序列为：5’-TTAGCCGAAATCTGGCAC-3’。
根据申请人的实验表明，将该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX，利用实时荧光定量技术检测其对干旱和盐的响应，表明该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX在植物干旱和盐中发挥着积极的作用。
与现有技术相比，本发明给出的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX，带来的有益的技术效果在于：
首次从紫花苜蓿中克隆出了与抗旱耐盐性相关的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX，获得了其完整的编码区的核苷酸序列和氨基酸序列。并通过qRT-PCR技术验证该基因在植物干旱和盐胁迫中所发挥的作用。
附图说明
图1为紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX中间片段扩增图；
图2为5’RACE扩增图；
图3为3’RACE扩增图；
图4为紫花苜蓿抗旱耐盐MsBBX基因编码区序列的扩增图；
图5为紫花苜蓿干旱耐盐基因MsBBX干旱处理结果图；
图6为紫花苜蓿干旱耐盐基因MsBBX盐处理结果图。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施方式
需要说明的是，以下的实施例仅为本发明的较佳实施例，仅用于本领域技术人员充分理解本发明，本发明不限于这些实施例。
实施例1：紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX编码区序列的获得
(1)苜蓿幼苗cDNA合成：
用总RNA提取试剂盒Plant RNA Extraction Kit(TAKARA)提取苜蓿幼苗总RNA，操作步骤按提取试剂盒说明书进行。
吸取2μl提取的总RNA溶液用酶标仪进行测定，以无RNase的水为空白对照，测定溶液中RNA浓度(ng/μl)。接着用cDNA反转录试剂盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNASynthesis Kit(TAKARA)按照操作步骤反转录为cDNA。
(2)紫花苜蓿抗旱耐盐MsBBX基因全长的克隆：
根据NCBI上蒺藜苜蓿的MtBBX基因序列进行同源比对并设计引物P1和引物P2，进行PCR扩增，PCR扩增结果如图1所示。回收和纯化PCR扩增产物，并进行载体连接、大肠杆菌转化并测序得到中间片段。
引物P1序列为：5’-AGGCTTCTTCTTCAATGTCT-3’；
引物P2序列为：5’-CTTCGTTATTACGCCAGCT-3’；
再根据Clotech公司的RACE 5′/3′Kit试剂盒说明书，设计5’RACE引物P3和3’RACE引物P4。按照试剂盒说明书操作步骤完成RACE过程，分别扩增获得该基因的5’端序列和3’端序列如图2和图3所示,目的条带长分别是760bp和790bp。
其中：
5’RACE引物P3序列为：
5’-GATTACGCCAAGCTTGCTGAGGAGGAGAAACTTTGACGGGA-3’；
3’RACE引物P4序列为：
5’-GATTACGCCAAGCTTAGTTTCGCATCCTCTTGGGCTGTTG-3’；
将克隆得到的5’端序列和3’端序列经测序后，利用DNAMAN软件将其与中间片段进行拼接获得基因的全长序列，再通过设计ORF两端引物P5和引物P6，并利用高保真酶扩增得到该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX的全长cDNA，将其产物进行纯化、载体连接、大肠杆菌转化并送去测序，得到紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX的编码区的核苷酸序列和氨基酸序列。
其中：
引物P5序列为：
5’-ATGAAAATACAGTGTGATGTGTG-3’；
引物P6序列为：
5’-TTAGCCGAAATCTGGCAC-3’。
紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX编码区序列的扩增图如图4所示，目的条带的全长为723bp。
综上，获得的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX编码区的核苷酸序列如下(SEQ IDNO.1)所示。
该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX编码区的氨基酸序列如下：
实施例2：干旱处理下的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX基因的表达量
紫花苜蓿植株在干旱处理下，分别在0h，2h，4h和6h取样，用实时荧光定量PCR对紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX基因的表达量进行检测，结果如图5所示。
实施例3：盐处理下的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX基因的表达量
紫花苜蓿植株在盐(150mM NaCl)处理下，分别在0，2，4，8和12h取样，用实时荧光定量PCR对紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX基因的表达量进行检测，结果如图6所示。
实施例4：紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX用于提高苜蓿的抗旱耐盐性的应用
由于紫花苜蓿组培生长周期较长，在紫花苜蓿植株中验证该基因的功能还需一定的时间，但可以初步判定，该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX在苜蓿的抗旱耐盐过程也起到一定的调节作用，对于下一步研究转基因苜蓿的抗旱耐盐性，以及快速培育抗逆性强的紫花苜蓿品种提供了重要选择。
核苷酸序列表
<110>西北农林科技大学
<120>一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX的克隆及应用
<160>
<210> 1
<211> 723
<212> DNA
<213>核苷酸序列
<220>
<400>
atgaaaatac agtgtgatgt gtgtgaaaaa gctcctgcta cggtgatttg ttgtgctgat
gaagctgctt tgtgtgctaa atgtgatgtt gaagttcatg ctgctaataa gcttgctagc
aagcatcaaa ggcttcttct tcaatgtctt tctaacaagc ttcctaaatg tgatatctgc
caagataagc cagctttcat attttgtgtt gaagaccgag cactgttctg taaggactgt
gatgaaccaa ttcatgtagc tggtagtctt tctggaaacc accagcgctt ccttgctacc
ggtatccgtg tggctttggc ttctagttgc accaaagaca atgagaaaag ccaagttgaa
ccatctaatc cagacacgca acaagttccc gtcaaagttt ctcctcctca gcaagtgcct
agtttcgcat cctcttgggc tgttgatgat ttcttggaat taactggctt tgattcacca
gacaagaagc aatccatgga gtttggagag cttgaatggc tatcggatgc aggtcttttc
aatgaccagt ttcctcagga aggtttagct gcagctgaag ttccgcaact tccagtaatg
catgctggca gtgtttatcc ttacaaagcc tttaaatttt atatgtttta caaaaagcct
aggattgaag tccgacatga agacgatgat gatgagcact tcatggtgcc agatttcggc
taa。
<210> 2
<211> 240
<212> 序列
<213>氨基酸
<220>
<400>
Met Lys Ile Gln Cys Asp Val Cys Glu Lys Ala Pro Ala Thr Val Ile Cys CysAla Asp Glu Ala Ala Leu Cys Ala Lys Cys Asp Val Glu Val His Ala Ala Asn LysLeu Ala Ser Lys His Gln Arg Leu Leu Leu Gln Cys Leu Ser Asn Lys Leu Pro LysCys Asp Ile Cys Gln Asp Lys Pro Ala Phe Ile Phe Cys Val Glu Asp Arg Ala LeuPhe Cys Lys Asp Cys Asp Glu Pro Ile His Val Ala Gly Ser Leu Ser Gly Asn HisGln Arg Phe Leu Ala Thr Gly Ile Arg Val Ala Leu Ala Ser Ser Cys Thr Lys AspAsn Glu Lys Ser Gln Val Glu Pro Ser Asn Pro Asp Thr Gln Gln Val Pro Val LysVal Ser Pro Pro Gln Gln Val Pro Ser Phe Ala Ser
Ser Trp Ala Val Asp Asp Phe Leu Glu Leu Thr Gly Phe Asp Ser Pro Asp LysLys Gln Ser Met Glu Phe Gly Glu Leu Glu Trp Leu Ser Asp Ala Gly Leu Phe AsnAsp Gln Phe Pro Gln Glu Gly Leu Ala Ala Ala Glu Val Pro Gln Leu Pro Val MetHis Ala Gly Ser Val Tyr Pro Tyr Lys Ala Phe Lys Phe Tyr Met Phe Tyr Lys LysPro Arg Ile Glu Val Arg His Glu Asp Asp Asp Asp Glu His Phe Met Val Pro AspPhe Gly。
<210> 3
<211> 20
<212> 引物P1序列
<213>DNA
<220>
<400>
5’- AGGCTTCTTCTTCAATGTCT -3’
<210> 4
<211> 19
<212> 引物P2序列
<213>DNA
<220>
<400>
5’- CTTCGTTATTACGCCAGCT -3’
<210> 5
<211> 41
<212> 5’RACE引物P3序列
<213>DNA
<220>
<400>
5’- GATTACGCCAAGCTTGCTGAGGAGGAGAAACTTTGACGGGA -3’
<210> 6
<211> 40
<212> 3’RACE引物P4序列
<213>DNA
<220>
<400>
5’- GATTACGCCAAGCTTAGTTTCGCATCCTCTTGGGCTGTTG -3’
<210> 7
<211> 23
<212> 引物P5序列
<213>DNA
<220>
<400>
5’- ATGAAAATACAGTGTGATGTGTG -3’
<210>8
<211> 18
<212> 引物P6序列
<213>DNA
<220>
<400>
5’- TTAGCCGAAATCTGGCAC -3’
Claims (4)
1.一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX，其特征在于，该紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX编码区的核苷酸序列如下：
2.如权利要求1所述的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX，其特征在于，所述的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX编码区的氨基酸序列如下：
3.权利要求1或2所述的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)苜蓿幼苗cDNA合成：
提取苜蓿幼苗总RNA，反转录得到第一链cDNA；
(2)MsBBX基因全长的克隆：
以苜蓿cDNA为模板，根据NCBI上蒺藜苜蓿的MtBBX基因序列进行同源比对并设计引物P1和引物P2，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序得到中间片段；再根据测序得到的序列设计5’RACE引物P3和3’RACE引物P4，进行5’端序列和3’端序列的PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；最终将中间序列，5’端序列和3’端拼接得到MsBBX基因的全长序列，并用ORF Finder找到该基因的开放阅读框ORF；其中：
引物P1序列为：
5’-AGGCTTCTTCTTCAATGTCT-3’；
引物P2序列为：
5’-CTTCGTTATTACGCCAGCT-3’；
5’RACE引物P3序列为：
5’-GATTACGCCAAGCTTGCTGAGGAGGAGAAACTTTGACGGGA-3’；
3’RACE引物P4序列为：
5’-GATTACGCCAAGCTTAGTTTCGCATCCTCTTGGGCTGTTG-3’；
(3)在ORF两端设计引物P5和引物P6并通过PCR扩增，将其产物进行纯化、载体连接、大肠杆菌转化，测序得到紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX的编码区核苷酸序列和氨基酸序列；其中：
引物P5序列为：
5’-ATGAAAATACAGTGTGATGTGTG-3’；
引物P6序列为：
5’-TTAGCCGAAATCTGGCAC-3’。
4.权利要求1或2所述的紫花苜蓿抗旱耐盐基因MsBBX用于提高苜蓿的抗旱耐盐性的应用。
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-
2019
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