CN104480120B - 植物耐盐相关基因PpSIG2及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐盐相关基因PpSIG2及其应用，植物耐盐相关基因其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码该蛋白的基因其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，或其简并序列。将本发明基因导入水稻过表达，能够提高转基因水稻植株的盐胁迫下的存活率、生长速率和生物量。本发明植物耐盐相关蛋白PpSIG2基因为培育耐盐性提高的作物提供了基础。

Description

植物耐盐相关基因PpSIG2及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种植物耐盐相关基因PpSIG2及其应用。

背景技术

土壤盐渍化是是一个世界性问题，据联合国教科文组织（UNESCO）和粮农组织（FAO）不完全统计，全世界盐碱土地面积约10亿公顷。目前，分布在我国西北、东北及滨海地区的盐碱荒地和盐碱障碍耕地总面积超过５亿亩，其中具有农业利用潜力的近２亿亩，占我国耕地总面积的10％以上。盐碱对于植物生长发育具有重要影响，是导致作物减产的重要因素。虽然盐碱地可以通过水分灌溉、施用化学改良剂来进行土壤改良，但是常常因耗资巨大、见效少而难以实现。通过常规育种选育耐盐碱高产新品种，往往周期长，同时也不易取得理想的结果。

提高植物耐盐性的一个重要手段是将耐盐相关基因通过转基因方法导入植物，从而提高转基因植株的耐盐性。发掘新的耐盐相关基因资源是通过基因工程手段提高作物耐盐性的基础。盐生植物在长期的进化过程中获得了对环境盐胁迫的抗性，在盐生植物中有优秀的抗逆基因资源。

发明内容

本发明的目的是提供一个来源于生长在我国福建、广东沿海潮间带的盐生植物红树水黄皮(Pongamia pinnata (L.) Pierre)、能够提高作物耐盐性的盐胁迫诱导表达基因Pongamia pinnata Salt Induced Gene 1，简称PpSIG2。

本发明提供的植物耐盐相关基因Pongamia pinnata Salt Induced Gene 2，简称PpSIG2，来源于豆科植物水黄皮(Pongamia pinnata (L.) Pierre)，其编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1的序列由272个氨基酸残基组成。

本发明还提供将SEQ ID NO:1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由SEQ ID NO:1序列衍生的蛋白质。

为了使所述的植物耐盐相关蛋白PpSIG2便于纯化，可在由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

上述由SEQ ID NO:1序列衍生的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到，其编码基因可通过将SEQ ID NO:2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5´端和/或3´端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还提供一种编码所述植物耐盐相关基因PpSIG2，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示，或其简并序列。

同时，本发明还提供如SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子。

本发明还提供在在严格条件下与SEQ ID NO:2所示的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；同时还提供与该DNA分子具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA分子；所述严格条件可为在6×SSC，0.5% SDS的溶液中，在65^oC下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1% SDS各洗膜一次。

本发明还提供所述基因的重组表达载体。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体是将所述基因插入pCXUN的多克隆位点得到的重组质粒。

含有以上任一所述基因（PpSIG2）的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因（PpSIG2）全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还提供所述基因（PpSIG2）在耐盐能力增强的转基因植物中的应用，其是将含有所述基因的重组表达载体导入目的植物获得耐盐能力增强的转基因植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得耐盐能力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

实验表明，将本发明的编码调控植物耐盐相关基因PpSIG2 的DNA序列导入水稻中过表达，能够提高转基因水稻耐盐性，提高转基因水稻植株的盐胁迫下的存活率、生长速率和生物量。本发明的编码植物耐盐相关基因PpSIG2基因为培育其他具有耐盐性提高的作物提供了基础。

附图说明

图1为过表达转基因植株PCR鉴定。

图2为过表达转基因植株实时定量PCR鉴定。

图3为水培对照和盐胁迫处理野生型和PpSIG2转基因株系ox1。

图4为水培对照和盐胁迫处理野生型和PpSIG2转基因株系ox1和ox2的存活率。

图5为水培对照和盐胁迫处理野生型和PpSIG2转基因株系ox1和ox2的株高。

图6为土培实验对照和盐胁迫处理野生型和PpSIG2转基因株系ox1和ox2。

图7为土培实验对照和盐胁迫处理野生型和PpSIG2转基因株系ox1和ox2的存活率。

图8为土培实验对照和盐胁迫处理野生型和PpSIG2转基因株系ox1和ox2的株高。

图9为土培实验对照和盐胁迫处理野生型和PpSIG2转基因株系ox1和ox2的地上部分单株鲜重。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的，实验均设置三次重复，结果取平均值。

实施例1：PpSIG2 cDNA的克隆

因为目前没有水黄皮基因组序列信息，我们利用 Illumina Genome AnalyzerIIx对盐胁迫处理及未处理对照水黄皮转录组进行高通量测序，所获得的原始序列过滤去除接头和低质量序列后，采用SOAPdenovo程序(http://soap.genomics.org.cn)进行序列组装,获得非重复序列(Unigenes)，对Unigenes采用BLASTx程序搜索Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG数据库，采用相似性最高的序列注释作为该Unigene的注释。通过RPKM值计算每个基因的表达水平，我们筛选得到1050个受盐胁迫诱导的基因。目前这些基因绝大多数没有进行功能分析，为了挖掘水黄皮在盐胁迫应答中发挥关键功能的新基因资源，从未知功能的基因中，我们选择在盐胁迫处理中诱导表达迅速升高的10个基因，将其克隆并通过转基因方法验证其转基因水稻盐胁迫反应中的功能。功能分析证实其中一个受盐胁迫诱导的水黄皮Unigene在水稻中过表达后能够提高转基因水稻的耐盐性，我们命名为PpSIG2ORF。实验方法如下，根据该推断序列设计以下特异引物：

上游引物：5’- ATGGCTTCCATGAGTTCTCTG -3’；

下游引物：5’- TCAATTGGTGAAGTTTGGTATAG -3’。

以200 mM NaCl处理一月龄水黄皮(Pongamia pinnata (L.) Pierre)植株6小时后，取0.2g水黄皮叶片，液氮研磨，TRIzol法提取总RNA。取2μg总RNA用SuperScript® IIRT 反转录酶进行反转录，合成cDNA第一链，以此为模板，以特异引物进行PCR反应。PCR产物经电泳分离回收后，克隆到pEASY-T（北京全式金生物技术有限公司），命名为pEASY-T-PpSIG2ORF，进行测序。

测序结果表明，该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质。

实施例2：PpSIG2在水稻中的超表达

一、pCXUN-PpSIG2表达载体的构建

1、以实施1中重组质粒pEASY-T-PpSIG2ORF为模版，采用HiTaq DNA聚合酶和以下列特异性引物扩增得到PpSIG2序列。

上游引物：5’- ATGGCTTCCATGAGTTCTCTG -3’；

下游引物：5’- TCAATTGGTGAAGTTTGGTATAG -3’。

PCR产物电泳分离后，切胶回收940 bp DNA片段。

2、用限制性内切酶XcmI酶切pCXUN(Ubiquitin启动子) (Plant Physiol. 2009July; 150(3): 1111–1121)，回收骨架。

3、将步骤1得到的片段和步骤2得到的片段连接，转化大肠杆菌DH5α，测序确认正确，得到pCXUN-PpSIG2。

二、转基因植物的获得

1、利用电击法将重组表达载体pCXUN-PpSIG2导入农杆菌AGL0(ATCC® BAA-100™，www.atcc.org)。

5、将含有pCXUN-PpSIG2的农杆菌AGL0侵染日本晴野生型诱导产生的胚型愈伤组织，然后在MS培养基 (含有30mg/L潮霉素) 中筛选抗性愈伤组织，每代15天，共计3代，而后将抗性愈伤组织诱导成完整植株，插秧于大田，收获转基因植物的T1代种子。

三、转基因植物的分子检测

CTAB法提取叶片DNA，以pCXUN-PpSIG2特异性引物5’- AGTAGCTCAGGTGGCAAATC -3’和5’- GGAGAGTATGGCCACATATCAG -3’PCR检测，结果表明转基因植株中有特异性扩增条带，而野生型DNA无特异扩增条带(图1)，这表明PpSIG2已经导入转基因植株。

TRIzol方法提取2周龄野生型和PpSIG2转基因植株(ox1, 2)叶片总RNA，取2 μg总RNA，以2 u RQ1 RNase-free DNase (Promega) 37 °C 处理30 min，加终止反应液后，以polyA为引物，利用M-MLV反转录酶42 °C 1小时合成cDNA第一链，然后以cDNA为模板，以Ubiquitin (引物5’-CCATCCTCAAGCTGCTTACC-3’和5’-GACTGGCAAGACCATTACCC-3’)为内参，PCR方法检测PpSIG2基因(引物5’- TGTAAATGGCCTCATATCTGTC -3’和5’-CATTCAGCAACAAGCTATACTC -3’)表达，结果如图2所示。在野生型对照植株中检测不到PpSIG2基因的表达，而pCXUN-PpSIG2转基因植株(ox1, 2) PpSIG2基因表达水平约为Ubiquitin表达水平的0.67-0.76倍。

实施例3：PpSIG2转基因水稻植株耐盐性检测

一、水培水稻植株耐盐性检测

野生型和PpSIG2转基因水稻种子42°C处理3天后，于水中浸种24小时，37°C催芽，选取萌芽一致的种子于下述培养液中，28°C培养4天，然后在含100 mM NaCl的培养液中处理4天。结果如图3-5所示，未处理对照中野生型和PpSIG2转基因水稻植株没有显著差异。100 mM NaCl处理后，野生型和转基因植株在处理过程中逐渐萎蔫、死亡，对生理指标统计表明，野生型植株存活率为39%，株高13.9cm，而PpSIG2转基因株系ox1和ox2的存活率65%和55%；PpSIG2转基因株系ox1和ox2的株高分别为，17.5和16.8 cm。这表明在水培盐胁迫处理中，PpSIG2转基因水稻植株耐盐性显著高于野生型对照。

培养液配方：四水硝酸钙 945 mg/L ，硝酸钾 506 mg/L，硝酸铵 80 mg/L ，磷酸二氢钾 136 mg/L，硫酸镁 493 mg/L ，铁盐溶液 2.5 ml /L，微量元素母液5 ml/L，pH=6.0。

铁盐溶液：七水硫酸亚铁 2.78g ，乙二胺四乙酸二钠（EDTA.Na） 3.73g，蒸馏水500ml，pH=5.5。

微量元素母液：碘化钾 0.83 mg/l ，硼 酸 6.2 mg/L ，硫酸锰 22.3mg/L ，硫酸锌 8.6mg/L ，钼酸钠 0.25mg/L，硫酸铜 0.025mg/L，氯化钴 0.025mg/L。

二、土培水稻植株耐盐性检测

野生型和PpSIG2转基因水稻种子42°C处理3天后，于水中浸种24小时，37°C催芽，选取萌芽一致的种子种于装有营养土的小盆中，覆盖一层保鲜膜保湿，待幼苗出土后，去除保鲜膜，2周后，将种植水稻苗的小盆放入含100 mM NaCl的水中浸泡1周，然后将盐水倒出，每天换一次自来水，1周后照相，统计生理表型。如图6-9所示，在没有盐胁迫处理的对照实验中，PpSIG2转基因水稻株系ox1和ox2生长没有明显差异，经过100 mM NaCl处理1周而后复水，野生型对照植株的存活率只有29%，而PpSIG2转基因水稻株系ox1和ox2的存活率分别为50%和55%，显著高于野生型对照。测量植株高度和鲜重结果如图8和9所示，PpSIG2转基因水稻株系ox1和ox2的植株高度为26.5和26.9 cm, 显著高于野生型对照植株的21.2 cm;PpSIG2转基因水稻株系ox1和ox2的单株鲜重为167和178 mg，也显著高于野生型对照单株鲜重83 mg。以上结果表明，在土培实验中，与非转基因野生型对照相比，PpSIG2转基因水稻株系的耐盐性显著提高。

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 植物耐盐相关基因PpSIG2及其编码蛋白和应用

<130> PpSIG2

<160> 2

<210> 1

<211> 272

<212> PRT

<213> Pongamia pinnata

<400> 1

Met Leu Thr Leu Leu Phe Gly Val Thr Ser Ala Ala Arg Gly Ile Pro

Asn Thr Met Ala Ser Met Ser Ser Leu Asn Met Ile Ser Ser Leu Lys

Leu Ser Asp Pro Ser Ser Ile Ser Thr Leu Gln Thr Gln Lys Gln Val

Gly Ser Ser Leu Phe Gln Ser Phe Pro Ala Lys Thr Ser Lys Phe Ser

Ala Thr Pro Gln Leu Ser Thr Thr Arg Arg Ser Ser Lys Asn Thr Thr

Thr Thr Ala Phe Phe Phe Asn Asn Lys Lys Gln His Gln Asp Ser Ser

Lys Pro Ala Lys Val Gln Glu Leu Ser Val Tyr Glu Ile Asn Glu Arg

Asp Arg Gly Ser Pro Ala Tyr Leu Arg Leu Ser Gln Lys Ser Val Asn

Ser Leu Gly Asp Leu Val Pro Phe Ser Asn Lys Leu Tyr Ser Gly Asp

Leu Glu Lys Arg Leu Gly Ile Thr Ala Gly Leu Cys Val Leu Ile Gln

His Val Pro Glu Lys Arg Gly Asp Arg Tyr Glu Ala Ile Tyr Ser Phe

Tyr Phe Gly Glu Tyr Gly His Ile Ser Val Gln Gly Ala Tyr Leu Thr

Tyr Gln Asp Thr Tyr Leu Ala Val Thr Gly Gly Ser Gly Ile Phe Glu

Gly Val Tyr Gly Gln Val Lys Leu Gln Gln Leu Val Phe Pro Phe Lys

Leu Phe Tyr Thr Phe Tyr Leu Lys Gly Ile Pro Asp Leu Pro Pro Glu

Leu Leu Gly Lys Pro Val Glu Pro Ser Pro Met Val Glu Pro Ser Pro

Ala Ala Lys Ala Thr Glu Pro His Ala Ser Ile Pro Asn Phe Thr Asn

<210> 2

<211> 819

<212> DNA

<213> Pongamia pinnata

<400> 2

atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcagcccggg ggatccccaa tactatggct 60

tccatgagtt ctctgaatat gatctcttcc ctcaaactct ctgatccaag ttctatctct 120

actcttcaaa cccaaaagca agtaggttct agtctctttc aatccttccc agccaaaacc 180

tcaaagttct cagctacccc acaattatct acaaccagaa gaagttccaa gaacaccaca 240

accactgcat tcttcttcaa taacaaaaag cagcatcaag attcctcaaa accagccaaa 300

gttcaagaac tctctgttta tgagatcaat gaacgtgaca gaggcagtcc tgcataccta 360

aggctaagtc agaagtctgt taactctctt ggagatttgg tgccattcag caacaagcta 420

tactctggag acttagaaaa gagattagga ataactgcag gcttatgtgt gctcatacaa 480

catgtacctg agaaaagggg tgacagatat gaggccattt acagcttcta ctttggagag 540

tatggccaca tatcagtgca aggagcttat ctgacatacc aagacacata tctggctgta 600

acaggaggat ctggaatctt tgaaggtgtg tatggacaag tgaaactgca gcaacttgta 660

ttcccgttca agttgttcta caccttctac ttgaagggta ttccagattt gccacctgag 720

ctactaggga agcctgttga accatcacca atggttgaac catctccagc tgctaaggct 780

actgagcctc atgcctctat accaaacttc accaattga 819

Claims (10)

1.一种植物耐盐相关PpSIG2基因，其特征在于：其编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：其编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，进一步包括编码在其氨基末端或羧基末端连接的标签序列。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：所述标签序列为Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tag II、c-myc。

5.含有如权利要求1至4任一项所述基因的表达盒，其特征在于，所述基因与启动子可操作连接。

6.含有如权利要求1至4任一项所述基因的重组表达载体。

7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：所述载体是双元农杆菌载体。

8.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：所述载体是用于植物微弹轰击的载体。

9.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将所述基因插入pCXUN的多克隆位点得到的重组质粒。

10.如权利要求1至4任一项所述基因在耐盐能力增强的转基因植物中的应用，其是将含有所述基因的重组表达载体导入目的植物获得耐盐能力增强的转基因植物，所述植物是水稻。