CN111187779A - 抗病基因OsRLR1、转录因子OsWRKY19以及在水稻抗白叶枯病育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗病基因OsRLR1、转录因子OsWRKY19以及在水稻抗白叶枯病育种中的应用，本发明利用分子生物学与生物化学技术表明超量表达OsRLR1增强了对白叶枯病的抗性。OsRLR1与转录因子OsWRKY19发生蛋白质的相互作用，且均能增强对白叶枯病的抗性反应。水稻抗病基因OsRLR1的突变导致了叶片出现褐色的类病斑，增强了水稻病程相关基因的表达，激活了体内的免疫反应，对白叶枯病的抗性增强。本发明为增强水稻的白叶枯病抗病性和提高水稻产量开辟新的途径。

Description

抗病基因OsRLR1、转录因子OsWRKY19以及在水稻抗白叶枯病 育种中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及基因OsRLR1、转录因子OsWRKY19以及在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

背景技术

目前水稻白叶枯病的防治主要依赖于传统的化学药剂，但其环保及抗药性问题日益严重。而新兴的生物防治由于拮抗微生物筛选困难、防治效果不稳定以及成本较高而很难得到推广和应用(陈立华et al.，2014；刘薇，杨超，邹剑锋&宋娟，2009)。目前的研究挖掘了一些白叶枯病抗性的QTL位点，而关于水稻白叶枯病抗性分子机制的研究甚少。因而筛选水稻白叶枯病抗性基因并应用于分子育种，产生高产高抗水稻品种，而较少农药的使用，既使农民增收也能保护环境(Wasano&Hirota，1986)。

植物在生长和发育过程中受到各种生物和非生物胁迫。为了阻止病菌的侵害，植物进化了复杂的两个防御系统(Dangl&Jones 2001年；Matzinger 2002年)。当病原体突破植物细胞壁的防御时，病菌的保守结构，如鞭毛蛋白，几丁质和肽聚糖，通过模式识别植物体的PRR 受体，激活植物体的第一道免疫系统—PTI(Zipfel&Felix 2005；Kaku等人。2006年；Liu等人。2012年)。当病原体试图绕过PTI的抑制进一步侵染植物时，就会分泌一些无毒的效应因子，来麻木植物的免疫系统。但无毒的效应因子可以被特异的植物体内的抗病蛋白(R) 识别，进而激活植物体的第二道防御系统ETI(BelkHadir等，2004年)。为了提高植株的整体抗性，由信号分子水杨酸(SA)介导的系统获得性抵抗(SAR)可以持久的激活植物体的免疫反应，防止病菌的进一步侵染。抗病反应由于R基因突变的持续激活通常会导致活性氧 (ROS)爆发和过敏性抵抗(HR)细胞死亡。

目前，白叶枯病的抗病机制相对于稻瘟病的研究较为浅显，而且克隆的抗病基因的基因家族并不固定，包括膜上的类受体PRR蛋白和抗病基因R蛋白(Liu et al.,2014)。众所周知，白叶枯病作为水稻的三大病害之一，一旦发病对水稻的生长发育以及灌浆结实都有严重影响。所以，克隆相关的白叶枯病相关基因，并探究其作用机制和应用具有重要价值。目前克隆的白叶枯病的抗病基因仅有不到十个，因而克隆白叶枯病的抗性基因，并清晰的解析其抗性的作用机制对于白叶枯病抗病育种应用具有十分重要的理论意义与实践效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供水稻抗病基因OsRLR1及编码蛋白、水稻转录因子 OsWRKY19及编码蛋白，以及在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、水稻抗病基因OsRLR1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、水稻抗病基因OsRLR1的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3、水稻转录因子OsWRKY19，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4、水稻转录因子OsWRKY19的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5、上述水稻抗病基因OsRLR1或编码蛋白在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

6、上述水稻转录因子OsWRKY19或编码蛋白在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

7、上述水稻抗病基因OsRLR1与水稻转录因子OsWRKY19的相互作用在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

优选的，所述水稻品种为缙恢10号。

本发明的有益效果在于：

申请人发现缙恢10号的遗传背景下突变OsRLR1(LOC_Os10g07978)基因后的突变体 rlr1对白叶枯病的抗性增强。本发明利用分子生物学与生物化学技术表明超量表达OsRLR1 增强了对白叶枯病的抗性。OsRLR1与转录因子OsWRKY19发生了蛋白质的相互作用。为了进一步研究，本发明利用转基因技术在突变体rlr1中，干涉基因OsWRKY19的表达，得到了纯合的转基因植株。由抗病反应持续激活导致的转基因植株的表型和农艺性状均得到不同程度的恢复。白叶枯病接种实验也表明：超表达OsRLR1能够增强植株对白叶枯病的抗病性。同时，干涉基因OsWRKY19的表达后，转基因植株对白叶枯病的抗性减弱，因而OsRLR1和OsWRKY19发生蛋白质的相互作用，且均能增强对白叶枯病的抗性反应。

水稻抗病基因OsRLR1的突变导致了叶片出现褐色的类病斑，增强了水稻病程相关基因的表达，激活了体内的免疫反应，对白叶枯病的抗性增强。在野生型中，超量表达OsRLR1 对白叶枯病的抗性增强。在突变体rlr1中，干涉基因OsWRKY19的表达，导致了突变体rlr1 对白叶枯病的抗性减弱。本发明清晰地解析了OsRLR1抗白叶枯病的作用机制是由基因 OsWRKY19的发生蛋白质的相互作用而介导的，并且，OsWRKY19能够直接激活抗病反应最下游的病程相关基因OsPR10(基因编号：LOC_Os12g36880)的表达，直接激活水稻的防御反应。因此，本发明为增强水稻的白叶枯病抗病性和提高水稻产量开辟新的途径。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为野生型(WT)和突变体rlr1对白叶枯病的抗性；

A：野生型(左)和rlr1突变体(右)的叶片在接种白叶枯病后的表型；B：野生型和OsRLR1突变体在接种白叶枯病后第5,10,15天的病斑长度统计；C：野生型和OsRLR1突变体在接种白叶枯病后第15天的生物量统计。

图2为超量表达OsRLR1增强了对白叶枯病的抗性；

A:接种白叶枯病的野生型(左)、rlr1突变体(中)和超量表达OsRLR1(右)水稻叶片；B:在接种白叶枯病后第5,10,15天的病斑长度统计；C:在接种白叶枯病后第15天的生物量统计。

图3为OsRLR1蛋白与OsWRKY19蛋白相互作用；

A：以OsRLR1的CC结构域为诱饵，通过酵母双杂交系统(Y2H)筛选5种WRKY蛋白：OsWRKY13，OsWRKY19，OsWRKY47，OsWRKY68和OsWRKY76。OsRLR1的CC结构域(OsRLR1_CC)与OsWRKY19相互作用；B：OsWRKY19与OsRLR1的不同截短蛋白之间互作。C：BiFC法检测烟草叶片OsRLR1-cYFP和OsWRKY19-nYFP、OsRLR1-cYFP和nYFP、 cYFP和OsWRKY19-nYFP的共表达。D：BiFC法测定烟草叶片叶片OsRLR1_M-cYFP和 OsWRKY19-nYFP、OsRLR1_M-cYFP和nYFP、cYFP和OsWRKY19-nYFP的共表达。

图4为在OsRLR1的突变体内干涉基因OsWRKY19的表型分析；

A：OsWRKY19在突变体遗传背景下干涉WRKY19的T₀代植株中的相对表达，L₁-L₄是不同的转基因系。B-D：野生型、rlr1和纯合子干涉WRKY19的植株分蘖期的植株表型。E-G：野生型、rlr1和纯合子干涉WRKY19的植物的叶片；1、2和3代表从上到下的倒一叶、倒二叶和倒三叶。H：野生型、rlr1和纯合子干涉WRKY19的植株叶片的DAB染色；2和3自上而下代表倒二叶和倒三叶。I：成熟期的：野生型、rlr1和纯合子干涉WRKY19的植株。J：成熟期野生型、rlr1和纯合子干涉WRKY19的植株的稻穗。

图5为在OsRLR1的突变体内干涉基因OsWRKY19的农艺性状分析；

A：株高(cm)；B：有效穗数；C：一次枝梗数；D：二次枝梗数；E：穗长(cm)；F：每穗实粒数；G：结实率；H：千粒重(g)。

图6为野生型和突变体rlr1内干涉基因OsWRKY19转基因植株接种白叶枯病表达分析；在接种白叶枯病后第五天，野生型(左)，突变体rlr1(中)，干涉OsWRKY19转基因植株(后二)的抗病相关基因NPR1,PR1a和PR10的表达分析。

图7为野生型和突变体rlr1内干涉基因OsWRKY19转基因植株接种白叶枯病统计分析；

A：野生型、突变体rlr1和干涉OsWRKY19转基因植株的叶片在接种白叶枯病后的表型；B：野生型、突变体rlr1和干涉OsWRKY19转基因植株在接种白叶枯病后第5,10,15天的病斑长度统计；D：野生型、突变体rlr1和干涉OsWRKY19转基因植株在接种白叶枯病后第15天的生物量统计。

图8为转录因子OsWRKY19激活病程相关基因PR10的表达；

A：在水稻原生质体中，OsWRKY19具有转录活性；B：病程相关基因PR10的启动子元件分析；C：转录因子OsWRKY19能够激活PR10的表达；D：OsRLR1能够增强OsWRKY19对 PR10启动子激活。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明实施例中使用的材料：野生型水稻材料缙恢10号(WT)和突变体rlr1(Xinget al., 2016)，均由本实验室培育；本研究中使用的各种限制性内切酶和T4连接酶(D2011A)均购自大连TaKaRa生物工程有限公司；各种快速限制性内切酶、pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly重组酶及DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；其他的化学试剂，如蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、氯化钙、CTAB、Tris-HCl、EDTA、氯化钠、丙烯酰胺、 TEMED、琼脂粉、X-Glu主要购自于美国SIGMA公司和上海生工生物工程股份有限公司；通用型DNA纯化回收试剂盒(Universal DNA Purification Kit)，质粒提取试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)均购自天根生化科技(北京)有限公司，RNA提取试剂盒(Eastep Super总RNA提取试剂盒)和RNA反转录试剂盒(GoScript逆转录Mix,Oligo(dT))均购自美国Promega公司；实时定量PCR(SYBR Premix Dimer Eraser试剂盒)购自大连TaKaRa生物工程有限公司；引物合成和DNA测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；pTCK303、pAN580植物表达载体、大肠杆菌DH5α、农杆菌LBA4404在 BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买。酵母双杂交的DDO和QDO培养基均从生工生物技术公司购买。

实施例1、水稻野生型和突变体rlr1对白叶枯病的抗性分析

利用缙恢10号的遗传背景下突变基因OsRLR1(LOC_Os10g07978)后的突变体rlr1与缙恢10号为野生型的对照，在分蘖期接种白叶枯病(zhe173,由中国水稻研究所提供)。结果发现：野生型的病斑长度远远高于突变体rlr1(图1中A)。在接种白叶枯病后第5,10,15天进行了病斑长度统计，统计结果也表明：野生型的病斑长度随着时间的推移，在不断地变长，而突变体rlr1的病斑长度不仅远小于野生型，而且变化不大(图1中B)。而在接种白叶枯病后第15天进行的白叶枯病菌生物量统计也发现野生型中的菌落数要远远高于突变体rlr1 (图1中C)。

综上所述，OsRLR1是一个参与了白叶枯病抗性的抗性基因，其突变体是功能获得性突变体，并增强了对白叶枯病的抗性。

实施例2、超量表达OsRLR1增强了水稻对白叶枯病的抗性

利用在缙恢10号(已推广品种)的遗传背景下的超量表达OsRLR1的转基因植株接种白叶枯病菌。结果表明：与野生型相比，超表达OsRLR1植株的叶片病斑长度更短(图2中A)。而在接种后5,10和15天的统计结果也表明，超表达OsRLR1植株的病斑长度与野生型相比均更短(图2中B)。同时，在接种后15天的叶片中白叶枯病菌的生物量统计结果也表明：超表达植株叶片中的白叶枯病菌更少(图2中C)。因而，抗病基因OsRLR1能够增强水稻对白叶枯病的抗病性。

实施例3、OsRLR1与转录因子OsWRKY19互作

鉴于CLR家族的基因通常通过其CC结构域与WRKY家族的转录因子互作来发挥防御作用，因此选择了5种WRKY基因：OsWRKY13(LOC_Os01g54600)，OsWRKY19 (LOC_Os05g49620)，OsWRKY47(LOC_Os07g48260)，OsWRKY68(LOC_Os04g51560) 和OsWRKY76(LOC_Os09g25060)，通过酵母双杂交系统(Y2H)筛选与OsRLR1的CC结构域(OsRLR1_CC)相互作用的蛋白。由于全长的WRKY蛋白通常在酵母中具有毒性(Inoue 等人，2013)，因此在本发明中使用了截短的蛋白(去除了羧基)。共转化的酵母均可以在DDO 培养基上生长(图3中A)，但是只有OsWRKY19能与OsRLR1_CC互作而在缺陷培养基 QDO/AbA上生长(图3中A右)。为了进一步验证我们的实验结果，OsRLR1和OsRLR1 (E318V)的截短与野生型和突变型的两个全长(FL)蛋白分别与OsWRKY19共转化酵母。结果发现所有转化的酵母均可以在DDO培养基上生长(图3中B)。来自OsRLR1和OsRLR1 (E318V)的所有截短蛋白都可以与截短的OsWRKY19互作，而全长OsRLR1或OsRLR1 (E318V)都不能与截短的OsWRKY19相互作用(图3中B)。所用克隆基因所用引物序列见表1。

表1.引物序列

申请人通过双分子荧光互补(BiFC)验证了OsRLR1和OsWRKY19之间的互作。具体方法为：以OsRLR1bifc-F：5′-GCCggatccATGGCTGAGGGCGTCATTGGCTC-3′(SEQ ID No.20) 和OsRLR1bifc-R：5′-GCCgtcgacTTGTATCCTTTCTGCAGCCAGCTCACC-3′(SEQ ID No.21)为引物，扩增野生型基因OsRLR1(LOC_Os10g07978)的CDS片段，扩增产物连接到了pxy104 表达载体(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建OsRLR1-cYFP融合表达蛋白。

以OsWRKY19bifc-F：5′-GCCggatccATGGTGGAGCTCTGCGGCG-3′(SEQ ID No.22)和OsWRKY19bifc-R：5′-GCCtctagaCTACAGATTCTGAATCTCCGATTGGA-3′(SEQ ID No.23)为引物，扩增野生型基因OsRLR1(LOC_Os10g07978)的CDS片段，扩增产物连接到了pxy106表达载体(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建OsWRKY19-nYFP融合表达蛋白。我们利用在共表达的OsRLR1-cYFP和OsWRKY19-nYFP的本氏烟草叶片的细胞，28℃暗培养48h后，用蔡司激光扫描共焦显微镜来观察GFP和细胞核染料DAPI的荧光。核中观察到YFP荧光信号(图3中C)，这与DAPI信号高度吻合。与野生型一样，OsRLR1(E318V) 可以在细胞核内与OsWRKY19互作(图3中D)。我们的结果表明，OsRLR1和OsRLR1(E318V) 都能在本氏烟草叶的细胞核中与OsWRKY19相互作用。

上述结果发现OsWRKY19通过与OsRLR1互作来参与了其介导的免疫反应。因此，我们推测OsWRKY19可能对防御反应起到积极的调节作用。

实施例4、在OsRLR1的突变体内干涉基因OsWRKY19转基因植株表型分析

为了确定OsWRKY19对OsRLR1介导的白叶枯病的调控模式，通过在突变体rlr1中干涉基因OsWRKY19的表达，进行表型观察和抗病性的分析。具体方法为：以RNAiWRKY19-F1：5′-GCCggatccCGTCGTCTACCTTGGCGACCACAC-3′(SEQ ID No.24)和RNAiWRKY19-R1：5′- GCCggtaccGCGAGATGAAGGAGAAGTAGCCGTC-3′(SEQ ID No.25)以及RNAiWRKY19-F2： 5′-AAATGTTTGAACGGAGCTCCGTCGTCTACCTTGGCGACCACAC-3′(SEQ ID No.26) RNAiWRKY19-R2：5′-ATTTTCAATCGATACTAGTGCGAGATGAAGGAGAAGTAGCCGTC-3′(SEQ ID No.27)为引物，扩增OsWRKY19基因LOC_Os05g49620的保守序列，扩增产物连接到了 PDCK303表达载体(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建 OsWRKY19-RNAi干涉载体，并将质粒转化到农杆菌中，通过农杆菌侵染突变体的rlr1愈伤组织，进一步得到了以突变体rlr1为背景的OsWRKY19-RNAi转基因植株。

首先，通过实时荧光定量分析了OsWRKY19在T₀代中的表达量，与突变体相比，OsWRKY19的表达量在L₁-L₄不同的转基因系均降低，表明已经被成功干涉(图4中A)。在分蘖期时，纯合的干涉OsWRKY19的转基因植株的表型，同突变体相比也得到了一定程度的恢复，但仍不及野生型的生长发育水平(图4中B-D)。同时，纯合的干涉OsWRKY19的转基因叶片的细胞死亡的表型也得到了很大程度的恢复(图4中E-G)，而DAB染色的结果的也表明纯合的干涉OsWRKY19的转基因叶片中积累的活性氧更少，叶片早衰的表型也得到了恢复(图4中H)。在成熟期，纯合子干涉OsWRKY19的植株的株高和分蘖数(图4中I)，穗长(图4中J)都大于突变体，但仍不及野生型。

对于OsWRKY19的表达分析是利用表2的引物进行的实时荧光定量分析。以UBIQUITIN 为内参反应体系为：在25μL的反应体系中加入2μL的cDNA模板，2μL引物，12.5μLSYBR Green荧光染料和8.5μL RNase-free H₂O，在Bio-rad荧光定量PCR仪上进行荧光定量扩增；扩增条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸1分钟，40 个循环；最后72℃延伸10分钟，然后利用CFX-Manager软件进行数据的收集与处理。

表2.引物序列

实施例5、突变体内干涉基因OsWRKY19纯合转基因植株的农艺性状分析

对其中干涉基因OsWRKY19转基因发育最好的一个株系进行了农艺性状分析。我们在同一块大田，按同样的标准(每丛一株，间距4×7寸)种植。成熟后，进行拷种分析。结果表明：干涉基因OsWRKY19纯合转基因植株与rlr1相比，要极显著的高于rlr1，但仍然极显著的低于野生型(图5中A)。而对于有效穗数，干涉基因OsWRKY19纯合转基因植株与野生型相比没有显著差异，但极显著的多于突变体(图5中B)。此外，对于一次枝梗数、二次枝梗数，穗长、每穗实粒数和结实率，干涉基因OsWRKY19纯合转基因植株都要极显著的多于突变体，但仍然极显著的低于野生型(图5中C-G)。而对于千粒重，干涉基因OsWRKY19 纯合转基因植株与rlr1相比，显著升高，但仍然极显著的低于野生型的千粒重(图5中H)。

实施例6、OsWRKY19介导白叶枯病抗性的分子机制研究

我们对在突变体rlr1内干涉基因OsWRKY19纯合转基因植株的白叶枯病抗病性进行了分析。在叶片接种白叶枯病菌后5天，取材利用上述的实时荧光定量的方法分析了抗病相关基因的表达。结果表明，在突变体rlr1内干涉基因OsWRKY19后，突变体对白叶枯病菌的抗病性得到了减弱，尽管与野生型相比，NPR1,PR1a和PR10的表达量被激活得更高(图6)。但是低于突变体rlr1中的NPR1,PR1a和PR10的表达量(图6)，表明OsWRKY19正调控了OsRLR1介导的抗病反应。相关基因的定量引物见表3。

表3.引物序列

在接种白叶枯病后第5，10，15天进行了的病斑长度统计，统计结果也表明：与突变体相比，在突变体rlr1内干涉基因OsWRKY19纯合转基因植株的病斑长度均更高，随着时间的推移，病斑长度也在不断的增长，但是仍然小于野生型的病斑长度(图7中A、B)。而在接种白叶枯病后第15天进行了的白叶枯病菌生物量的统计也发现在突变体rlr1内干涉基因OsWRKY19纯合转基因植株的菌落数要远远高于突变体rlr1，但仍然低于野生型(图7中C)。为了进一步分析OsWRKY19抗白叶枯病的免疫机制，我们首先利用以OsWRKY19gal-F1：5′ -GCCcatatgATGGTGGAGCTCTGCGGCG-3′(SEQ ID No.40)和OsWRKY19gal-R1：5′- GCCggtaccCTACAGATTCTGAATCTCCGATTGGAA-3′(SEQ ID No.41)克隆了并连接到在 GAL载体中，在原生质体中表达，利用promega的化学发光仪检测其转录激活水平。结果发现OsWRKY19具有转录激活活性(图8中A)。我们利用生物信息学的网站 (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析了PR10的启动子的元件，发现其有WRKY家族的结合位点(图8中B)。利用引物：pGeen-PR10-F：5′ -GCCaagcttGCTGGAATGATAAGCAATTTGAAACGGA-3′(SEQ ID No.42)pGeen-PR10-R：5′-GCCggatccCACTCTACTGACCACTGATGCCTGTAGC-3′(SEQ ID No.43)克隆了PR10 的约1000bp的启动子序列，并将其克隆到载体pGreen中。利用引物将OsWRKY19sl-F：5′ -GCCactagtATGGTGGAGCTCTGCGGCG-3′(SEQ ID No.44)OsWRKY19sl-R：5′- GCCtctagaCAGATTCTGAATCTCCGATTGGAA-3′(SEQ IDNo.45)克隆了基因的编码框，并克隆到pAN580的载体上。在原生质体中共表达PR10的启动子和OsWRKY19，利用promega 的化学发光仪检测其转录激活水平。结果发现OsWRKY19对PR10的启动子有转录激活作用 (图8中C)。而同时分别加入野生型和突变体的OsRLR1基因，均能增强对的激活作用，且突变的基因作用更强(图8中D)。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 基因OsRLR1、转录因子OsWRKY19以及在水稻抗白叶枯病育种中的应用

<130> 2020

<160> 45

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3139

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

aatttccccc tcttttcatc catgactttt tgtgcagtaa ccagcatata gaacagtcac 60

agtgttcatt gtcacactca ttagctcaca attcacagac tctacacttg aaatggtgag 120

aatcttatag ctctggctag acaaccatgg ctgagggcgt cattggctcg ttaatcctga 180

agctaggtga tgccttgggt aatgaatctt gccagctggg atcgtcattg ctcgtttatg 240

aggcatctgc tctgaaaggc ctgtttggcg agatacggat gatcaaggag gagctggaga 300

gcatgcaggc cttcttctgc accgctgagc ggttcaagga tactgatgag acaacagttg 360

cattcgtgaa gcagatcaga ggccttgcat tcgacatcga ggatgttatc gatgagttca 420

cctacaagtt gggagaagat cgcgaaggca tgtttctgct gaaggcattc aggaggatca 480

gacagatcaa gacatggtat cggttggcca acagtctgca ggatatcaaa gttagcctca 540

agagtgctgc agagaggagg tgcagatatg acctgaaggg tgttcgaagg gagaggaaac 600

tgatgcggtt agggagcttg aatcagagat ctacagaatc agtacatttc aagagggaag 660

ctgatcttgt ggggattgct gagaacaaac agctgttgat ggattggttg aaagatgagg 720

agcagcagca catgataatt actgtatggg gtatgggcgg tgtcggtaaa acgacacttg 780

ttgctcatgt ttacagtgct atcaagactg actttgatac ttgtgcttgg atcacagtgt 840

ctaatagcta tgaagccgat gatttgctga aacaaattgt tgcggagttc cggaagaatg 900

accgcaagaa ggagttccca aaggatgtcg atgtcacaga ttatagaagc ctggttgaga 960

caatccgact ttacctggag aagaaaaggt atgttcttgt tttagatgac gtgtggagtg 1020

tgaatgtttg gtttgatatc aaagatgcat tttctggtgg gaaacatggg cggataattt 1080

ttacatctag gatctatgag gtcgctctac ttgctcctga aagccaaaag attaaccttc 1140

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agggcttgcc aatcgctata gtgtgcatag ggcgcctcct ttcattcaag agtgcaaatt 1320

tgttggagtg ggagaatgtg tacagaaatc ttgagatgca gtttaccaac aattacatcc 1380

ttgacatgaa cataatcctg aaggttagtt tggaagactt gccacacaac atgaagaatt 1440

gcttcctcta ttgctccatg ttcccagaaa attatgtgat gcaaaggaag tggttagtac 1500

ggctttggat tgcagaagga tttattgaag agagtgagca caagacgctg gaggaggtag 1560

cagaggatta cttgaccgaa cttattaaca gatgtttgtt agtggaggtc aagaggaatg 1620

agtctggata tattgatgat ttccagatgc atgatatatt tcgtgtttta gctcttagca 1680

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aagcacgccg tttgtcgatt caaagggggg atatctcaca aattgcagaa aatgtgccac 1800

atctgcggtc attgcttgtt ttccacaatt cacttagttt caattcactt cgtttgtttg 1860

caaggtctgt gaagttactg tctgtcctga atctgcaaga tagttcaatt gagagtctac 1920

ccaatgatgt gtttgatttg tttaacttac gttttctggg ccttagacga actaatattg 1980

catatatctc aagatcaatt gggagacttc aaaatttggt cgtgttggat gcttggaaaa 2040

gcaaaattat gaacctacca gaggaaatta taaggctatc taagttgaca catcttattg 2100

tgactgtgaa accagtgatt acttctatga attttgttcc ttctgttggc atacctgcac 2160

ctactggttt atggtctttg ggatgtttgc agaccttatt actgatggaa gctagttctg 2220

aaatggtctt ttaccttggt gctctggtga atttgagatc atttcgcatc agcaaagtac 2280

aaggccgcca ttgtgccaag ctgtttgtgg caatcaccaa tatgtttcat cttgtccgcc 2340

tcgggataca cgcaaacgac aatcaggagg ttctacaact tgaagcattg aaaccatctc 2400

cgttacttca gaagcttatc ttgcaggggg cattagataa agaatcattg cctcagttct 2460

tcatgtcaat cagtaaactg aaaagcctca ccattctacg gcttgtctgg tcgaaactcg 2520

acgaagaaga cttctactat cttgaggaat tacagcagct agtgaagctt cagctttatg 2580

atgcatataa tggcaagagg ctgtctttcc aggcaacatc atttccaaag ctcaggatac 2640

tgaagatctg gggagctcct cacctcagtc tgatcaagat agaaagaggg gccatgtcaa 2700

gcatggttga tcttaagctc ctgctctgcc ctgaattgaa gttgttgcct cgcggcattg 2760

agcatgtgac cactctcgaa gagatgactt tggattctac agcagaggag cttgtgggca 2820

gggttaggaa gaagaatgag gccaggattt ctcatgtcaa gagagtttat gttgggttca 2880

tcagaaatgg tgagctggct gcagaaagga tacaataaat cgatgtctat ctagacaatg 2940

tcatgtatca tttcaactat gattttccta ttttgtacat ttataatttt gtattggtct 3000

tatgatgtaa tccagacaat gccattttcc ttttcagata tagtttctta tctgtaagta 3060

tttgtacata tttgtgacat ataaacctgt tttgggtttt attgtcaata tatgaatgta 3120

tacaaataag attcttccc 3139

<210> 2

<211> 923

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Met Ala Glu Gly Val Ile Gly Ser Leu Ile Leu Lys Leu Gly Asp Ala

1 5 10 15

Leu Gly Asn Glu Ser Cys Gln Leu Gly Ser Ser Leu Leu Val Tyr Glu

20 25 30

Ala Ser Ala Leu Lys Gly Leu Phe Gly Glu Ile Arg Met Ile Lys Glu

35 40 45

Glu Leu Glu Ser Met Gln Ala Phe Phe Cys Thr Ala Glu Arg Phe Lys

50 55 60

Asp Thr Asp Glu Thr Thr Val Ala Phe Val Lys Gln Ile Arg Gly Leu

65 70 75 80

Ala Phe Asp Ile Glu Asp Val Ile Asp Glu Phe Thr Tyr Lys Leu Gly

85 90 95

Glu Asp Arg Glu Gly Met Phe Leu Leu Lys Ala Phe Arg Arg Ile Arg

100 105 110

Gln Ile Lys Thr Trp Tyr Arg Leu Ala Asn Ser Leu Gln Asp Ile Lys

115 120 125

Val Ser Leu Lys Ser Ala Ala Glu Arg Arg Cys Arg Tyr Asp Leu Lys

130 135 140

Gly Val Arg Arg Glu Arg Lys Leu Met Arg Leu Gly Ser Leu Asn Gln

145 150 155 160

Arg Ser Thr Glu Ser Val His Phe Lys Arg Glu Ala Asp Leu Val Gly

165 170 175

Ile Ala Glu Asn Lys Gln Leu Leu Met Asp Trp Leu Lys Asp Glu Glu

180 185 190

Gln Gln His Met Ile Ile Thr Val Trp Gly Met Gly Gly Val Gly Lys

195 200 205

Thr Thr Leu Val Ala His Val Tyr Ser Ala Ile Lys Thr Asp Phe Asp

210 215 220

Thr Cys Ala Trp Ile Thr Val Ser Asn Ser Tyr Glu Ala Asp Asp Leu

225 230 235 240

Leu Lys Gln Ile Val Ala Glu Phe Arg Lys Asn Asp Arg Lys Lys Glu

245 250 255

Phe Pro Lys Asp Val Asp Val Thr Asp Tyr Arg Ser Leu Val Glu Thr

260 265 270

Ile Arg Leu Tyr Leu Glu Lys Lys Arg Tyr Val Leu Val Leu Asp Asp

275 280 285

Val Trp Ser Val Asn Val Trp Phe Asp Ile Lys Asp Ala Phe Ser Gly

290 295 300

Gly Lys His Gly Arg Ile Ile Phe Thr Ser Arg Ile Tyr Glu Val Ala

305 310 315 320

Leu Leu Ala Pro Glu Ser Gln Lys Ile Asn Leu Gln Pro Leu Gln Asn

325 330 335

His Tyr Ala Trp Asp Leu Phe Cys Lys Glu Ala Phe Trp Lys Ser Glu

340 345 350

Asn Arg Ser Cys Pro Val Glu Leu His Pro Trp Ala Gln Arg Phe Val

355 360 365

Asp Lys Cys Lys Gly Leu Pro Ile Ala Ile Val Cys Ile Gly Arg Leu

370 375 380

Leu Ser Phe Lys Ser Ala Asn Leu Leu Glu Trp Glu Asn Val Tyr Arg

385 390 395 400

Asn Leu Glu Met Gln Phe Thr Asn Asn Tyr Ile Leu Asp Met Asn Ile

405 410 415

Ile Leu Lys Val Ser Leu Glu Asp Leu Pro His Asn Met Lys Asn Cys

420 425 430

Phe Leu Tyr Cys Ser Met Phe Pro Glu Asn Tyr Val Met Gln Arg Lys

435 440 445

Trp Leu Val Arg Leu Trp Ile Ala Glu Gly Phe Ile Glu Glu Ser Glu

450 455 460

His Lys Thr Leu Glu Glu Val Ala Glu Asp Tyr Leu Thr Glu Leu Ile

465 470 475 480

Asn Arg Cys Leu Leu Val Glu Val Lys Arg Asn Glu Ser Gly Tyr Ile

485 490 495

Asp Asp Phe Gln Met His Asp Ile Phe Arg Val Leu Ala Leu Ser Lys

500 505 510

Ala Arg Glu Glu Asn Phe Cys Phe Val Leu Asp Tyr Thr Lys Thr His

515 520 525

Leu Ile Gly Lys Ala Arg Arg Leu Ser Ile Gln Arg Gly Asp Ile Ser

530 535 540

Gln Ile Ala Glu Asn Val Pro His Leu Arg Ser Leu Leu Val Phe His

545 550 555 560

Asn Ser Leu Ser Phe Asn Ser Leu Arg Leu Phe Ala Arg Ser Val Lys

565 570 575

Leu Leu Ser Val Leu Asn Leu Gln Asp Ser Ser Ile Glu Ser Leu Pro

580 585 590

Asn Asp Val Phe Asp Leu Phe Asn Leu Arg Phe Leu Gly Leu Arg Arg

595 600 605

Thr Asn Ile Ala Tyr Ile Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Gln Asn Leu

610 615 620

Val Val Leu Asp Ala Trp Lys Ser Lys Ile Met Asn Leu Pro Glu Glu

625 630 635 640

Ile Ile Arg Leu Ser Lys Leu Thr His Leu Ile Val Thr Val Lys Pro

645 650 655

Val Ile Thr Ser Met Asn Phe Val Pro Ser Val Gly Ile Pro Ala Pro

660 665 670

Thr Gly Leu Trp Ser Leu Gly Cys Leu Gln Thr Leu Leu Leu Met Glu

675 680 685

Ala Ser Ser Glu Met Val Phe Tyr Leu Gly Ala Leu Val Asn Leu Arg

690 695 700

Ser Phe Arg Ile Ser Lys Val Gln Gly Arg His Cys Ala Lys Leu Phe

705 710 715 720

Val Ala Ile Thr Asn Met Phe His Leu Val Arg Leu Gly Ile His Ala

725 730 735

Asn Asp Asn Gln Glu Val Leu Gln Leu Glu Ala Leu Lys Pro Ser Pro

740 745 750

Leu Leu Gln Lys Leu Ile Leu Gln Gly Ala Leu Asp Lys Glu Ser Leu

755 760 765

Pro Gln Phe Phe Met Ser Ile Ser Lys Leu Lys Ser Leu Thr Ile Leu

770 775 780

Arg Leu Val Trp Ser Lys Leu Asp Glu Glu Asp Phe Tyr Tyr Leu Glu

785 790 795 800

Glu Leu Gln Gln Leu Val Lys Leu Gln Leu Tyr Asp Ala Tyr Asn Gly

805 810 815

Lys Arg Leu Ser Phe Gln Ala Thr Ser Phe Pro Lys Leu Arg Ile Leu

820 825 830

Lys Ile Trp Gly Ala Pro His Leu Ser Leu Ile Lys Ile Glu Arg Gly

835 840 845

Ala Met Ser Ser Met Val Asp Leu Lys Leu Leu Leu Cys Pro Glu Leu

850 855 860

Lys Leu Leu Pro Arg Gly Ile Glu His Val Thr Thr Leu Glu Glu Met

865 870 875 880

Thr Leu Asp Ser Thr Ala Glu Glu Leu Val Gly Arg Val Arg Lys Lys

885 890 895

Asn Glu Ala Arg Ile Ser His Val Lys Arg Val Tyr Val Gly Phe Ile

900 905 910

Arg Asn Gly Glu Leu Ala Ala Glu Arg Ile Gln

915 920

<210> 3

<211> 834

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

atggtggagc tctgcggcgg cgagggggag gggcagatca tgctggcgac ggagctgacc 60

cagctgcggg ccatggcgag ggagctggag gcgaagatgg acccggacag ggtggccgcg 120

cgggagctct gcagggcgct ggcgtcgtcc gtcgaccggt ccatccgcct cgccgcgtcc 180

tgcttcccgc cgccggagca cccgcccccc gccgccggca atgccggcag ggacgccgcg 240

ttcaagaaga ggaaggggat ggccaaggtg aggaggcagg tgagggtgac gtcggtgcag 300

gacacggcgt cgctggacga cggcctgagc tggaggaagt acggccagaa ggacattctt 360

ggcgccaaat acccgagggc ctacttcagg tgcactcacc ggcacacgca gggatgcaac 420

gcgaccaagc aggtgcagcg cgccgacggc gacccgctgc tcttcgacgt cgtctacctt 480

ggcgaccaca cctgcggcca ggccgccgtc gccgccgccg cccagagcgc gccgcccgag 540

catgccggcc aggagcagca gaggcagagc tcgctgctcg ctgcgggaac ggaaggaatt 600

catcagcagg tagtggcaga gcctatggcg gcgccgttct tgttcacctc gacggcggcc 660

ggcggcgtcg acgacggcta cttctccttc atctcgccgg cgaactccga ctgccagttc 720

agcagcgact tctcggcggg cagcgtcggg gttgacatgg accacgaggc tcgtttcgaa 780

gatcttttct cgagcactct tgagtttttc caatcggaga ttcagaatct gtag 834

<210> 4

<211> 277

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 4

Met Val Glu Leu Cys Gly Gly Glu Gly Glu Gly Gln Ile Met Leu Ala

1 5 10 15

Thr Glu Leu Ala Gln Leu Arg Ala Met Ala Arg Glu Leu Glu Ala Lys

20 25 30

Met Asp Pro Asp Arg Val Ala Ala Arg Glu Leu Cys Arg Ala Leu Ala

35 40 45

Ser Ser Val Asp Arg Ser Ile Arg Leu Ala Ala Ser Cys Phe Pro Pro

50 55 60

Pro Glu His Pro Pro Pro Ala Ala Gly Asn Ala Gly Arg Asp Ala Ala

65 70 75 80

Phe Lys Lys Arg Lys Gly Met Ala Lys Val Arg Arg Gln Val Arg Val

85 90 95

Thr Ser Val Gln Asp Thr Ala Ser Leu Asp Asp Gly Leu Ser Trp Arg

100 105 110

Lys Tyr Gly Gln Lys Asp Ile Leu Gly Ala Lys Tyr Pro Arg Ala Tyr

115 120 125

Phe Arg Cys Thr His Arg His Thr Gln Gly Cys Asn Ala Thr Lys Gln

130 135 140

Val Gln Arg Ala Asp Gly Asp Pro Leu Leu Phe Asp Val Val Tyr Leu

145 150 155 160

Gly Asp His Thr Cys Gly Gln Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Gln Ser

165 170 175

Ala Pro Pro Glu His Ala Gly Gln Glu Gln Gln Arg Gln Ser Ser Leu

180 185 190

Leu Ala Ala Gly Thr Glu Gly Ile His Gln Gln Val Val Ala Glu Pro

195 200 205

Met Ala Ala Pro Phe Leu Phe Thr Ser Thr Ala Ala Gly Gly Val Asp

210 215 220

Asp Gly Tyr Phe Ser Phe Ile Ser Pro Ala Asn Ser Asp Cys Gln Phe

225 230 235 240

Ser Ser Asp Phe Ser Ala Gly Ser Val Gly Val Asp Met Asp His Glu

245 250 255

Ala Arg Phe Glu Asp Leu Phe Ser Ser Thr Leu Glu Phe Phe Gln Ser

260 265 270

Glu Ile Gln Asn Leu

275

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

atggaggcca gtgaattcat ggcggccgga gaggaggtga 40

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

tcgagctcga tggatccctc gaaggagtag gtgacgagca gcac 44

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 7

gaattcatgg tggagctctg cggcggcgag ggg 33

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 8

ggatccgtcg ccaaggtaga cgacgtcgaa gagcagc 37

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 9

atggaggcca gtgaattcat ggcgtctcct gatggtggcg ttg 43

<210> 10

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 10

tcgagctcga tggatccctc accgtagtag ctgatgacga actccga 47

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 11

atggaggcca gtgaattcat ggccgtggac ctgatgggct gct 43

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 12

tcgagctcga tggatccctc gccctcgtag gtcacgacca gca 43

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 13

atggaggcca gtgaattcat ggacgcggcg tggcgcgg 38

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 14

tcgagctcga tggatcccta gaattcgggc agcttctgga ggatcgc 47

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 15

gccatggagg ccgaattcat ggctgagggc gtcattggc 39

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 16

gcgatcttct cccaacttgt aggtga 26

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 17

gttaatcttt tggctttcag gagcaa 26

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 18

gtctaagaca aagcaaaagt tctcttctcg 30

<210> 19

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 19

cgctgcaggt cgacggatcc ttgtatcctt tctgcagcca gctc 44

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 20

gccggatcca tggctgaggg cgtcattggc tc 32

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 21

gccgtcgact tgtatccttt ctgcagccag ctcacc 36

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 22

gccggatcca tggtggagct ctgcggcg 28

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 23

gcctctagac tacagattct gaatctccga ttgga 35

<210> 24

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 24

gccggatccc gtcgtctacc ttggcgacca cac 33

<210> 25

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 25

gccggtaccg cgagatgaag gagaagtagc cgtc 34

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 26

aaatgtttga acggagctcc gtcgtctacc ttggcgacca cac 43

<210> 27

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 27

attttcaatc gatactagtg cgagatgaag gagaagtagc cgtc 44

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 28

accacttcga ccgccactac t 21

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 29

acgcctaagc ctgctggtt 19

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 30

ccaaggtgag gaggcaggtg aggg 24

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 31

gcgttgcatc cctgcgtgtg c 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 32

caggccgtcc tctctctgta 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 33

aaggatagca tgggggagag 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 34

aaaccggatc agtttcatca 20

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 35

aagaacactt agctcggatg ac 22

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 36

ttcatcacct gcaactactc g 21

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 37

tgcataaaca cgtagcatag cat 23

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 38

caccatctac accatgaagc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 39

agcacatccg actttaggac 20

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 40

gcccatatga tggtggagct ctgcggcg 28

<210> 41

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 41

gccggtaccc tacagattct gaatctccga ttggaa 36

<210> 42

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 42

gccaagcttg ctggaatgat aagcaatttg aaacgga 37

<210> 43

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 43

gccggatccc actctactga ccactgatgc ctgtagc 37

<210> 44

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 44

gccactagta tggtggagct ctgcggcg 28

<210> 45

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 45

gcctctagac agattctgaa tctccgattg gaa 33

Claims (7)

1.水稻抗病基因OsRLR1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述水稻抗病基因OsRLR1的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.水稻转录因子OsWRKY19，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求3所述水稻转录因子OsWRKY19的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.权利要求1所述水稻抗病基因OsRLR1或权利要求2所述编码蛋白在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

6.权利要求3所述水稻转录因子OsWRKY19或权利要求4所述编码蛋白在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

7.权利要求1所述水稻抗病基因OsRLR1与权利要求3所述水稻转录因子OsWRKY19的相互作用在水稻抗白叶枯病育种中的应用。

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