CN109810985A - 一种岷江百合Lr4CL-1基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种岷江百合Lr4CL‑1基因及应用，所述Lr4CL‑1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明将含有Lr4CL‑1基因的过表达载体转入烟草中，获得的转基因烟草植株对灰葡萄孢、链格孢和炭疽病菌等病原菌具有明显抑制作用，同时发现转基因植株叶片更加深绿且轻微下垂。本发明通过功能基因组学研究证明Lr4CL‑1基因具有提高植物抗真菌以及改变叶片性状的双重功能，为今后利用该基因进行植物分子遗传改良提供理论和技术支持，因此具有潜在的应用价值。

Description

一种岷江百合Lr4CL-1基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，特别的涉及一种岷江百合Lr4CL-1基因及其应用。

背景技术

在农业生产中，植物病害尤其是真菌病害一直是限制农作物产量提高的重要因素。目前主要采用化学农药作为防治病害的主要手段，但长期使用化学农药不仅导致病原菌产生抗药性，同时还造成生态环境的破坏。因此，抗病品种选育越来越受关注，成为植物病害的有效防治措施之一。然而，由于常规育种周期长、育种资源有限、病原菌变异迅速，因此不易获得抗性植株，难以满足生产的需要。随着生物工程技术发展，研究者开始利用转基因技术，将外源抗病基因转入植物以提高植株的抗病性；这种方法具有选育速度快，易于获得抗性植株，且具有较好的遗传稳定性等优点，已成为获得抗病性植株的主要手段。但目前由于缺乏高效、广谱、持久的抗病基因，植物抗病基因工程在农业生产和商业上的应用受到很大限制；因此，获得高效、广谱的抗病基因，并分析其对植物抗病能力的影响是植物抗病基因工程的研究重点。

岷江百合(Lilium regale Wilson)是百合科百合属中重要的野生种质资源，广泛分布于我国四川岷江流域(杨利平和符勇耀著，中国百合资源利用研究[M]，哈尔滨：东北林业大学出版社,2018.11)。相对于模式植物，岷江百合的生长发育调控机制具有复杂性和特殊性。前人研究表明，岷江百合对百合真菌病和病毒病具有较强的抗性，目前已经从岷江百合中获得多个逆境胁迫相关基因，如Lr14-3-3、LrPR10、LrbZIP1和LrWRKY1等(Li H.,etal.,Sci.Hort.2014,168:9-16；He H.,et al.,Genes Genom.2014,36:497-507；ZhangN.N.,Genes Genom.et al.,2014,36:789-798；Han Q.,et al.,Sci.Hort.2016,198:370-378；专利号201610001896.4)，为了丰富基因库这些抗性基因还远远不够，值得进一步的深入探究岷江百合中更多新的高效抗菌基因。

4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL,4-coumarate:CoA ligase)是连接苯丙烷代谢途径与木质素生物合成途径的关键酶。4CL不仅是木质素合成途径上的限速酶(Wei et al.,2013)，而且催化产物香豆酰辅酶A是类黄酮代谢途径上的查耳酮合酶的代谢底物(Cukovica et al.,2001)；Mansell等(1976)首次从嫩柳枝中提取出4CL以来，4CL基因陆续被克隆出来。目前，4CL已在拟南芥、毛白杨、烟草、大豆、棉花、芒果等植物中得到了克隆。4CL在植物中多以基因家族的形式存在，功能也不相同，Dc4CL1和其他植物中的4CL如拟南芥中的At4CL1(At1g51680)、At4CL2(At3g21240)和大豆的Gm4CL1(AF279267)、Gm4CL2(AF002259)一样参与植物木质素的合成；另一部分如拟南芥中的At4CL3(At1g65060)、大豆中的Gm4CL3(AF002258)和Gm4CL4(X69955)等参与黄酮类化合物的生物合成(Ehlting etal.,1999)。但有关岷江百合4CL基因的研究未见报道，其生物学功能及作用机制存在空白。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种岷江百合Lr4CL-1基因，为植物的基因改造提供了一个新的高效抗病基因，为植物抗病基因工程提供了更多的选择，同时也为通过分子手段改良植物抵抗真菌病害能力及叶片性状改变奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种岷江百合Lr4CL-1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述岷江百合Lr4CL-1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，包括上述Lr4CL-1基因的核苷酸序列。

一种遗传工程化的宿主细胞，含有所述重组载体或基因组中整合所述Lr4CL-1基因。

上述Lr4CL-1基因编码的蛋白在对植物病原真菌的抑菌方面的应用。

进一步，所述病原真菌为灰葡萄孢、链格孢或炭疽病菌。

一种增强植物抗真菌性的方法，包括以下步骤：将制备的或提供的含有所述的Lr4CL-1基因的表达载体转化农杆菌，得到农杆菌工程菌，再将所述农杆菌工程菌浸染植物，使Lr4CL-1基因过表达，即得到转基因植物，与不含有所述Lr4CL-1基因的对照植物相比，所述转基因植物显示增强的抗真菌性能。

进一步，所述转基因植物的叶片性状发生改变。

进一步，所述叶片性状改变包括：促进叶片叶绿素增多、促进花色素苷增多和/或促进叶片下垂。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明首次克隆了岷江百合Lr4CL-1基因全长序列，获得其编码的蛋白序列，并将该蛋白在烟草中表达后，通过抑菌实验，研究该蛋白的抑菌能力，实验结果表明该蛋白对植物病原真菌具有高效广谱抑菌，尤其针对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、链格孢(Alternaria alternate)和炭疽病菌(Colletotrichum liliacearum)具有明显的抑制作用，为植物抗病基因工程提供了一个高效的抗病基因，并为进一步培育具有真菌抗性和叶片性状改变的转基因新材料或新品种奠定了基础。

2、本发明通过功能基因组学研究证明Lr4CL-1基因具有提高植物抗真菌以及改变叶片性状的双重功能，提供一种改良植物真菌病抗性和改变叶片性状的新方法。该方法通过分子手段定向培育转基因植物，具有育种周期短，操作简单，容易获得目标材料等优点。利用该方法可获得如观赏花卉，农作物，林木等新材料，可以减少农药使用，降低环境污染，还可以使得植株叶片颜色和形态改变，更加美观。本发明为今后利用该基因进行植物分子遗传改良提供理论和技术支持，因此，具有重要的推广价值。

附图说明

图1为岷江百合Lr4CL-1基因的PCR扩增电泳图；

图2为植物过表达载体pART-CAM-Lr4CL-1的图谱示意图；

图3为转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果电泳图，泳道1-15为T0代转基因株系，M为DL2000，WT为阴性对照，CK为空白对照，P为阳性对照；

图4为T1代阳性转基因烟草中Lr4CL-1基因转录水平的定量表达分析柱状图；WT为野生型烟草，OX-L1、OX-L3、OX-L4和OX-L5分别为转基因烟草阳性株系；

图5为T1代阳性转基因烟草与野生型烟草的表型图；A图为野生型烟草植株，B图为转基因烟草植株；

图6为转基因烟草的叶绿素和花色素苷的含量测定结果图；

图A为叶绿素含量的测定结果，图B为花色素苷的测定结果，数据分析采用t-test，星号(**)代表显著性差异水平(P<0.01)；

图7为转基因烟草体外抑菌活性效果图；其中A组、B组、C组培养基分别接种灰葡萄孢、链格孢和炭疽病菌；每组培养基从左往右依次添加野生型烟草(WT)叶片提取液，转基因烟草阳性株系OX-L1叶片提取液，转基因烟草阳性株系OX-L3叶片提取液和转基因烟草阳性株系OX-L4叶片提取液。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中所述原料如无特殊说明，均为普通市售产品。实施例中所述的实验方法无特别说明，即按常规分子生物学实验方法操作。

实施例1岷江百合Lr4CL-1全长基因克隆及序列分析

岷江百合(Lilium regale Wilson)的基因组测序尚未完成，课题组前期利用灰葡萄孢侵染岷江百合(现蕾期)，以处理24h后的叶片为材料，采用TRIzol^TMPlus RNAPurification Kit(12183555，Invitrogen^TM)，按说明书步骤提取总RNA，利用DNase I(18047019，Invitrogen^TM)去除残余的微量DNA，并用分光光度计测定RNA的浓度，备用。

取约2.0μg岷江百合叶片总RNA，按照PrimeScript II first-strand cDNAsynthesis kit(6210A,Takara)说明书步骤合成第一链cDNA。

PCR扩增体系：2xfast pfu master Max 10ul，正向引物(Lr4CL-1-F,10μM)1μL，反向引物(Lr4CL-1-R,10μM)1μL，模板(cDNA)1μL，无菌ddH₂O补足至20μL。

正向引物和反向引物为：

Lr4CL-1-F：5’-ATGGGCTCCATCTCTCCG-3’

Lr4CL-1-R：5’-TCACTGCTGTCGACCGTT-3’

PCR反应程序为：预变性94℃，3min；94℃，30s；60℃，45s；72℃，1min30s，35个循环；72℃，10min。

获得PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，如图1所示，在紫外光照射下，在1.5kb左右可以观察到一条特异性的扩增条带。按照胶回收试剂盒(9672，Takara)纯化后备用。

利用平末端加A试剂将纯化的DNA片段加A，通过TA克隆将其与pMD20-T vector(6019，Takara)相连，连接产物转化大肠杆菌DH5a，从含有氨苄霉素(100mg/L)的LB培养板上挑取2-3个阳性克隆测序进行测序分析，结果表明，岷江百合Lr4CL-1全长基因序列如SEQID NO.1所示，含有1650bp的开放阅读框(含终止密码)。

根据SEQ ID NO.1，通过DNAman软件翻译，获得岷江百合Lr4CL-1的蛋白质序列如SEQ ID NO.2所示，含有549个氨基酸(*表示终止信号)。借助蛋白亚细胞定位在线分析(WoLF PSORT)显示，Lr4CL-1在植物细胞中的表达定位可能性依次为chlo:4,cyto:3,E.R.:3,nucl:2,extr:1,vacu:1。通过cNLS Mapper在线预测表明，在Lr4CL-1蛋白的C端具有核定位信号序列(RLRELIKYKGFQVAPAELEAMLLTHPDIKISAV)。通过ExPASy ProtParam在线分析表明，Lr4CL-1的分子量约为60.0KDa，等电点为5.41。将Lr4CL-1全长核苷酸序列和氨基酸序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现其与经过RNA测序获得的拼接序列岷江百合4CL(GenBank:KX842490.1和ASV46316.1)，相似度分别为96％(1578/1644)和98％(537/548)，分别存在66个核苷酸和11个氨基酸序列的区别，从比对结果来看Lr4CL-1基因为新基因。

实施例2植物过表达载体的构建

(1)构建pART-CAM::Lr4CL-1过表达载体

根据岷江百合Lr4CL-1全长基因序列(SEQ ID NO.1)，设计引物Lr4CL-1-inf-F和Lr4CL-1-inf-R，引物中引入无缝克隆(In-fusion)载体接头序列。以实施例1中TA连接的阳性克隆质粒为模板，以Lr4CL-1-inf-F和Lr4CL-1-inf-R为引物进行基因Lr4CL-1的特异性扩增。

所述引物序列如下：

Lr4CL-1-inf-F:5’-GGAGAGGACACGCTCGAGATGGGCTCCATCTCTCCG-3’

Lr4CL-1-inf-R:5’-TTAAAGCAGGACTCTAGATCACTGCTGTCGACCGTT-3’

其中，下划线处为In-fusion克隆载体接头序列。

PCR扩增体系：2xfast pfu master Max 10ul，正向引物(Lr4CL-1-F,10μM)1μL，反向引物(Lr4CL-1-R,10μM)1μL，模板(DNA)1μL，无菌ddH₂O补足至20μL。

PCR反应程序为：预变性94℃，3min；94℃，30s；60℃，45s；72℃，1min30s，35个循环；72℃，10min。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的目的片段与预期片段大小相同，按照胶回收试剂盒(9672，Takara)的说明书步骤回收纯化，即获得目的基因片段。

用XbaI和XhoI双酶切植物双元表达载体pART-CAM质粒。酶切体系为：pART-CAMvector 1μg；XbaI 2μL；XhoI 1μL；10xTango buffer 4μL；无菌ddH₂O补足至20μL；30℃反应1.5h，37℃反应1.5h，65℃，20min。酶切结束后，根据Takara琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体大片段。

利用无缝克隆技术(In-fusion HD Cloning Kit，Takara)构建pART-CAM::Lr4CL-1过表达载体。

重组反应体系为：

Purifed PCR fragment(回收的Lr4CL-1目的片段)50ng；Linearized vector(pART-CAM)100-150ng；5x In-fusion HD Enzyme Premix 2μL；无菌ddH₂O补足至10μL。然后按照分子克隆实验指南将上述重组反应体系转化大肠杆菌DH5a，并涂布于含有链霉素(50μg/mL)的LB培养基上，通过阳性克隆筛选和测序，获得正确的含Lr4CL-1基因片段的重组表达载体pART-CAM::Lr4CL-1(图2)。重组表达载体中目的基因Lr4CL-1的5’端位于组成型启动子P_35S下游，它能使Lr4CL-1基因过量表达；Lr4CL-1的3’端组装有OCS终止子，可以有效终止融合基因的转录。在重组表达载体上组装有nptII基因，作为转基因植物的筛选标记，可以用卡纳霉素进行转基因植株的筛选。在重组表达载体上组装有LB和RB序列，促使组装于其间的表达框架和筛选标记基因nptII整合至植物基因组中。

采用TIANprep Mini Plasmid Kit质粒抽提试剂盒(DP103,TIANGEN)提取并纯化上述大肠杆菌中的pART-CAM::Lr4CL-1质粒。用液氮冻融法将上述构建的pART-CAM::Lr4CL-1过表达载体转入农杆菌EHA105(AC1010,上海唯地)感受态细胞，获得阳性克隆加入20％左右的甘油置于-80℃保存备用。

实施例3农杆菌介导的烟草转化及转基因阳性系筛选

将烟草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)种子经无菌水冲洗干净，75％乙醇消毒1min，次氯酸钠溶液(有效氯为2％)消毒15min，无菌水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干种子表面的水分，接种于LS培养基(PH5.8)上。

将甘油菌在YEB固体培养基(50μg/mL链霉素+20μg/mL利福平)上划线，28℃培养两天后，挑取单克隆接种到5ml的YEB液体培养基(50μg/mL链霉素+20μg/mL利福平)中，28℃，220rpm恒温震荡培养过夜至OD₆₀₀约为0.6时，5000rpm离心10min收集菌体，将收集的菌体用MS液体培养基重悬至OD₆₀₀＝0.4。

1～2个月后取无菌细嫩叶片，去掉边缘及主脉，再剪成0.5×0.5的小块。将剪好的外植体置于重悬好的农杆菌菌液中，轻柔摇晃5min，用无菌滤纸吸干外植体表面的菌液，将其置于共培养培养基(MS+6-BA 1mg/L pH5.8)上黑暗培养2-3天。共培养后，将外植体转移到芽诱导分化培养基(MS+6-BA 1mg/L+Timentin 300mg/L+Kan 100mg/L pH5.8)上。诱导生芽，每两周更换一次培养基。

当抗性芽长到2cm时切下，转入生根培养基中(1/2MS+Timentin 300mg/L+IAA0.1mg/L+Kan 100mg/L pH5.8)，待形成完整小植株时，切取部分叶片，采用CTAB法提取基因组DNA，用基因特异引物(35S-F和Lr4CL-1-R2)检测阳性植株。

35S-F：5'-TGACGCACAATCCCACTATC-3'

Lr4CL-1-R2：5'-TCTCCACTAGCTCCATCATCT-3'

PCR扩增体系为2×TransDirect PCR SuperMix(+dye)10ul，正向引物(35S-F,10μM)1μL，反向引物(Lr4CL-1-R2,10μM)1μL，模板(DNA)1μL，无菌ddH₂O补足至20μL。

PCR反应程序为：预变性94℃，3min；94℃，30s；60℃，45s；72℃，45s，35个循环；72℃，10min。

PCR检测结果显示(图3)，在野生型植株(WT)中检测不到目标片段存在，只有在转基因植株及阳性对照中扩增获得目标片段，表明外源基因Lr4CL-1已经导入烟草基因组。本试验一共得到T0代阳性植株有11株，分别为T0-1、T0-3、T0-4、T0-5、T0-6、T0-8、T0-9、T0-11、T0-13、T0-14和T0-15。

实施例4：转基因烟草的表型观察及真菌抗性分析

从T0代阳性植株中收取种子，继续播种，获得T1代转基因烟草株系。使用TaKaRaMiniBEST Plant RNA Extraction Kit(9769,Takara)试剂盒分别从野生型和转基因烟草中提取总RNA，利用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(PR047A,TaKaRa)反转录获得cDNA，以18S基因为内参，并用SYBR Premix Ex Taq^TM II(PR820A,TaKaRa)试剂进行qRT-PCR检测，分析转基因阳性株系与野生型烟草中Lr4CL-1基因表达水平。

检测18S基因引物为：

18S-F:5'-GGTGGAGCGATTTGTCTGGT-3'

18S-R:5'-CAGGCTGAGGTCTCGTTCGT-3'

检测Lr4CL-1基因引物为：

Lr4CL-1-qF：5'-TATCGACATCAACAACTCCCTC-3'

Lr4CL-1-qR：5'-ACTTCGCCTTTCTTGATGCC-3'

结果如图4所示，与野生型植株(WT)相比，在3个代表转基因株系(OX-L1、OX-L3和OX-L4)中目的基因岷江百合Lr4CL-1均异源上调表达，并且OX-L1表达水平为最高，而在野生型植株(WT)中检测不到Lr4CL-1的表达，表明Lr4CL-1已经导入烟草基因组并成功转录表达。

在温室中正常培养2个月的烟草表型观察如图5所示，转基因烟草表现出叶片更加深绿，并且轻微下垂，与野生型有显著区别。

采用常规生化方法，分别取转基因烟草和野生烟草各0.1g基部对应叶片，加碳酸钙粉和石英砂少许，加入3-5mL95％乙醇，研磨至组织变白；漏斗过滤，用少量乙醇冲洗研钵几次，一并加入漏斗过滤；滤液最终定容至10mL。以95％乙醇作为对照组，在波长OD₆₆₅nm和OD₆₄₉nm处分别测吸光值。然后根据叶绿素含量计算方法(胡秉芬,黄华梨,季元祖,赵晓芳,戚建莉,张露荷,张广忠.分光光度法测定叶绿素含量的提取液的适宜浓度.草业科学,2018,35(8):1965-1974.)，测定转基因烟草和野生烟草滤液中的叶绿素含量，结果如图6A所示。由图中可以看出，与野生型烟草对照相比，转基因烟草株系中叶绿素的含量显著增多，约增加了原来的4倍。

采用常规生化方法，分别取转基因烟草和野生烟草各0.2g基部对应叶片，剪碎放入研钵，加入液氮，磨成粉，加入盐酸乙醇溶液(1.5mol/L HCl:95％乙醇＝15:85(v/v))中，黑暗条件下，浸提24h。取盐酸乙醇溶液作为空白对照，测定提取液在OD₅₃₀nm处的吸光值。以U＝OD₅₃₀/g.FW作为一个花色苷单位来测定滤液中的花色素苷。结果如图6B，从图中可以看出，与野生型烟草对照相比，转基因烟草株系中花色素苷的含量明显增多，约增加了原来的10倍。

提取转基因株系和野生型相对应的叶片，然后根据前人报道(Huang Y,Liu H,JiaZ,Fang Q,Luo K.Combined expression of antimicrobial genes(Bbchit1 and LJAMP2)in transgenic poplar enhances resistance to fungal pathogens.TreePhysiol.2012Oct；32(10):1313-20.)的方法提取叶片组织液，0.22μm过滤除菌。按每100mLPDA培养基(200g/L马铃薯，15g/L琼脂，20g/L葡萄糖)中加入8～10mL除菌后的叶片组织液混匀后倒平板，凝固后得到PDA固体培养基，其中，加入转基因株系叶片组织液的为实验组，加入野生型株系叶片组织液的为对照组。再将实验室保存的真菌，即灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、链格孢(Alternaria alternate)和炭疽病菌(Colletotrichum liliacearum)分别接种到上述PDA固体培养基上生长，28℃暗培养3-5天，观察真菌生长的情况。结果显示(图7)，与对照组(WT)相比，实验组的菌落圈直径明显较小，说明转Lr4CL-1基因烟草对灰葡萄孢、链格孢和炭疽病菌的生长均有较强的抑制作用，并且Lr4CL-1基因转录表达水平越高，其抑制效果越好。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 长江师范学院；

<120> 一种岷江百合Lr4CL-1基因及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1650

<212> DNA

<213> 岷江百合（Lilium regale Wilson）

<400> 1

atgggctcca tctctccggc aatcacctcc gacatcatct tccgatcaaa gctacccgat 60

atcgacatca acaactccct ccccctccac tcatactgct ttgaaaacct tgccgacttc 120

gctgaccgcc catgcatcat caatggcccc accggcgaca tcctcaccta cgccgaagtc 180

gagctctcct cccgcaaagt cgctgccggc ctccaccgtg ccggcatcaa gaaaggcgaa 240

gtcatcatgc ttctcctaaa caacacacca gaattcgttc tcacttttct aggcgcctcc 300

tacgtcggtg ccacctccac caccgctaat cccttctaca ccccagccga agtccacaag 360

caagccgccg cctccggctg tcgcatgata gtcacagaat cctgttactt cgataaggtc 420

cgcgacttcg ccaccgagca aaacgtctct gtcatcatta cggacgagtc ggtgccggct 480

ggatgccggc atttctcgga actattgcag gccgacgagg cagagctgcc ggttgtcgac 540

ttccagccgg acgatgtcgt ggcgctgcca tactcgtcgg ggaccacggg gctgccgaag 600

ggggtgatgt tgacgcaccg agggctcgtg accagtgttg ctcagcaggt tgatggggaa 660

aaccctaact tgtacttcaa gaaagaggat gtcgttcttt gtgtgttgcc cttgttccat 720

atatactcgc tcaactcggt gttgttgtgt gggttgaggg tgggggcggc gattttgttg 780

atgaggaagt tcgatgcggc gaagatgatg gagctagtgg agaagtataa ggtgacggtg 840

gggccgttcg tgccgccgat tgtcgtggag ctggcgaaga gcccggtgat cgatgattac 900

gacttgtcgt cgataagggt ggtgatgtca ggggcggcac cgatggggaa ggaactggag 960

gagaagttca atgcaaagat acccaatgct aaacttgggc agggttacgg gatgacagag 1020

gctggaccag tgctctcgat gtgtctagcg tttgccaaag agccctttga ggtgaagtca 1080

ggatcatgcg ggacagtggt gagaaatgca gagctcaaaa tcgtggatcc cgaaaccgga 1140

ttgtccctgc cacggaacaa gcccggagaa atttgcatca gaggagctca gatcatgaaa 1200

ggatatttga acgatccagt agcaactgag aacaccattg ataaggatgg atggctgcac 1260

accggagatg ttggtctagt cgatgatgac gacgagatct tcattgtcga cagactcagg 1320

gagttaatca agtacaaagg cttccaagtg gctccagctg agctagaagc catgctactc 1380

acacaccctg atatcaaaat ctcagctgtt gtccccatga aggatgaggt ggccggtgag 1440

gttccagtcg cctttgttgt ccgatctgac ggttctaaaa taactgagga tgagatcaag 1500

cgctttgtcc acaaacaggt cgtgttctat aagaggattc agagagtgtt ctttgttgac 1560

aaaattcccg tatcaccggc gggaaaaata ttgaggaagg agttgagagc catgttggcc 1620

gctggatacc cgaacggtcg acagcagtga 1650

<210> 2

<211> 549

<212> PRT

<213> 岷江百合（Lilium regale Wilson）

<400> 2

MGSISPAITS DIIFRSKLPD IDINNSLPLH SYCFENLADF ADRPCIINGP TGDILTYAEV 60

ELSSRKVAAG LHRAGIKKGE VIMLLLNNTP EFVLTFLGAS YVGATSTTAN PFYTPAEVHK 120

QAAASGCRMI VTESCYFDKV RDFATEQNVS VIITDESVPA GCRHFSELLQ ADEAELPVVD 180

FQPDDVVALP YSSGTTGLPK GVMLTHRGLV TSVAQQVDGE NPNLYFKKED VVLCVLPLFH 240

IYSLNSVLLC GLRVGAAILL MRKFDAAKMM ELVEKYKVTV GPFVPPIVVE LAKSPVIDDY 300

DLSSIRVVMS GAAPMGKELE EKFNAKIPNA KLGQGYGMTE AGPVLSMCLA FAKEPFEVKS 360

GSCGTVVRNA ELKIVDPETG LSLPRNKPGE ICIRGAQIMK GYLNDPVATE NTIDKDGWLH 420

TGDVGLVDDD DEIFIVDRLR ELIKYKGFQV APAELEAMLL THPDIKISAV VPMKDEVAGE 480

VPVAFVVRSD GSKITEDEIK RFVHKQVVFY KRIQRVFFVD KIPVSPAGKI LRKELRAMLA 540

AGYPNGRQQ 549

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggctcca tctctccg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcactgctgt cgaccgtt 18

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagaggaca cgctcgagat gggctccatc tctccg 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttaaagcagg actctagatc actgctgtcg accgtt 36

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgacgcacaa tcccactatc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tctccactag ctccatcatc t 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggtggagcga tttgtctggt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caggctgagg tctcgttcgt 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tatcgacatc aacaactccc tc 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acttcgcctt tcttgatgcc 20

Claims (9)

1.一种岷江百合Lr4CL-1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述岷江百合Lr4CL-1基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1所述Lr4CL-1基因的核苷酸序列。

4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述重组载体或基因组中整合有权利要求1所述Lr4CL-1基因。

5.如权利要求2所述Lr4CL-1基因编码的蛋白在对植物病原真菌的抑菌方面的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述病原真菌为灰葡萄孢、链格孢或炭疽病菌。

7.一种增强植物抗真菌性的方法，其特征在于，包括以下步骤：将制备的或提供的含有如权利要求1所述的Lr4CL-1基因的表达载体转化农杆菌，得到农杆菌工程菌，再将所述农杆菌工程菌浸染植物，使Lr4CL-1基因过表达，即得到转基因植物，与不含有所述Lr4CL-1基因的对照植物相比，所述转基因植物显示增强的抗真菌性能。

8.根据权利要求7所述增强植物抗真菌性的方法，其特征在于，所述转基因植物的叶片性状发生改变。

9.根据权利要求8所述增强植物抗真菌性的方法，其特征在于，所述叶片性状改变包括：促进叶片叶绿素增多、促进花色素苷增多和/或促进叶片下垂。