CN103937820A

CN103937820A - 一种岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTU3及应用

Info

Publication number: CN103937820A
Application number: CN201410137732.5A
Authority: CN
Inventors: 刘迪秋; 张南南; 季博; 韩青; 何华; 葛锋; 陈朝银
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2014-04-08
Filing date: 2014-04-08
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2034-04-08
Also published as: CN103937820B

Abstract

本发明涉及一种具有抗真菌活性的岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTU3及其应用，LrGSTU3基因具有SEQIDNO：1所述的核苷酸序列，编码tau类谷胱甘肽S-转移酶；本发明通过功能基因组学相关技术研究证实LrGSTU3基因具有提高植物抗真菌能力的功能。将本发明抗真菌LrGSTU3基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性。LrGSTU3超表达转基因烟草对灰葡萄孢以及尖孢镰刀菌的生长具有明显的抑制作用。

Description

一种岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTU3及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌活性的岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTU3及应用。

背景技术

植物在生长过程中经常会遭受各种各样的生物和非生物胁迫，例如，真菌、病毒以及干旱、重金属、极端温度、化学毒害等等。其中最严重、发病率最高的就是真菌病害，真菌病害在大规模发生时会致使农作物减产甚至死亡。而对于真菌病害的防治普遍使用的是化学农药，同时还有耕作制度改良和依靠传统育种方法培育的抗性植物品种。但是传统育种方法周期长，化学农药的大量使用会污染环境甚至在农产品中产生大量的化学农药残留进而危害人畜健康。因此快速高效地培育新的抗病性强的植物品种已迫在眉睫。随着重组DNA技术的创立和快速发展，利用基因工程技术来培育新的植物品种以应对真菌病害已取得初步成效，有望从根本上解决真菌病害问题。

真菌病原菌在侵染植物的同时会向植物细胞分泌一些有毒的效应分子以增强其在宿主细胞内的适应性，而这些效应分子同时也作为效应物激活植物体防卫反应中的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)激发的免疫反应(PAMP-triggered immunity, PTI)，使植物体产生对病原菌的广谱抗性反应，如氧爆发(Jones JDG, Dangl JL. The plant immune system. Nature, 2006, 444: 323~329)。氧爆发是指植物体在受到外界相应的胁迫时会在体内产生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，这种应激反应能提高植物的抗病性。然而，ROS还可以与植物体细胞内的蛋白质、脂质以及DNA反应，引起植物体内金属酶类活性降低、细胞膜渗透性改变等一系列的不利影响。植物体在长期的进化过程中形成了一系列有效的活性氧清除机制，包括非酶促反应和酶促反应两类(Hayes JD, Strange RC. Glutathione S-transferase polymorphisms and their biological consequences. Pharmacology, 2000, 61: 154~166)。非酶保护机制中直接参与活性氧清除的物质有抗坏血酸、谷胱甘肽α-生育酚、黄酮、类胡萝卜素等。酶促反应中所涉及到的抗氧化酶类主要有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase， APX)、谷胱甘肽硫-转移酶((glutathione S-transferase，GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)等。其中GST不仅可以清除体内的活性氧，还可以催化内源或者外源的有毒有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽(GSH)的巯基结合并形成更容易溶于水的、无毒或弱毒的衍生物，从而避免蛋白、核酸等生物大分子受到损害(冯雪, 王彬, 孙艳香. 谷胱甘肽硫转移酶的研究进展. 生物学教学, 2012, 37: 5~6)。

GST广泛存在于真核生物的细胞溶质中，少数位于细胞的液泡等部位。GST一般由两条25-27 KDa的亚基以同源或者异源的方式聚合而成，等电点一般为pH 4-5。GSTs的蛋白质空间结构都是类似的，每个亚基都含有C端和N端两个空间结构不同的基本结构域，C端结构域一般是由4-7个α-螺旋组成，N端结构域则是由β-折叠和α-螺旋以βαβαββα的顺序构成，并且通过一个约10个氨基酸的片段与C端结构域连接在一起。此外，每个亚基上都有两个配体结合位点：一个位于N端的GSH特异结合位点(G位点)，在此位点中有一个保守的丝氨酸/酪氨酸残基，其羟基可驱动GST的结合、以及与过氧化酶和异构化酶的反应；另一个位于C端的结合疏水底物的位点(H位点)，该位点的结构可变性较大，主要由羧基端的非极性侧链残基组成(冯雪, 王彬, 孙艳香. 谷胱甘肽硫转移酶的研究进展. 生物学教学, 2012, 37: 5~6)。早期，根据序列同源性以及基因的组织特异性将植物体内的GST分为phi，tau，zeta和theta四类，其中phi和tau类较大，另外两类较小。Phi和tau类的GST只存在于植物体内，其主要作用就是参与植物体内除草剂的清除，同时这两类GST可能也在植物体内的一些新陈代谢过程中发挥作用，例如作为谷胱甘肽过氧化物酶类清除植物体内过多的活性氧，也可以作为类黄酮结合蛋白，胁迫信号分子以及细胞凋亡调控子等等(Dixon DP, Davis BG, Edwards R. Functional Divergence in the Glutathione Transferase Superfamily in Plants identification of two classes with putative functions in redox homeostasis in Arabidopsis thaliana. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277: 30859~30869.)。与之相对，较小的两类GST蛋白，zeta和theta类，在动物和真菌中均有发现，这也就是表明这两类GST蛋白在真核生物体内拥有保守而稳定的生物学功能。在谷胱甘肽存在的情况下，zeta和theta类GST蛋白参与调控酪氨酸分解代谢中的重要过程，即催化马来酰乙酰乙酸异构化形成延胡索酰乙酰乙酸(Thom R, Dixon DP, Edwards R, Cole DJ, Lapthorn AJ. The structure of a zeta class glutathione S-transferase from Arabidopsis thaliana: characterisation of a GST with novel active-site architecture and a putative role in tyrosine catabolism. Journal of Molecular Biology, 2001, 308: 949~962.)。此外，Theta类GST蛋白还可以作为谷胱甘肽过氧化酶清除植物氧胁迫应激反应中形成的氢过氧化物。此后，Dixon等人又发现了两种新的GST蛋白，即脱氢抗坏血酸还原酶和lambda类的GST蛋白。这两类GST蛋白同样拥有GSH结合位点，只是其中的关键氨基酸，丝氨酸被半胱氨酸所替代，由于半胱氨酸没有丝氨酸所具有的催化作用而使蛋白的功能有所改变。脱氢抗坏血酸还原酶与水稻中的脱氢抗坏血酸还原酶的功能类似。而lambda类的GST蛋白不能起到谷胱甘肽脱氢酶的作用，但可以作为依赖于GSH的巯基转移酶来发挥作用(Dixon DP, Davis BG, Edwards R. Functional Divergence in the Glutathione Transferase Superfamily in Plants. The Journal of Biological Chemistry, 2002, 277: 30859~30869)。

在不同植物体内的不同部位GST的表达情况有所不同，例如OsGSTZ1和OsGSTZ2在水稻叶中的表达量明显高于根。玉米ZmGSTI和ZmGSTV在根内的表达多于地上部分, 而ZmGSTII只在根中表达，从南瓜花中纯化得到的phi 类GST-Pugf 蛋白在南瓜叶柄、茎、根和花内都有较高的含量, 而且在幼嫩器官比成熟器官中丰富(宋新华. 植物体内的多功能蛋白酶——谷胱甘肽转移酶. 山东科学, 2007, 20: 49~55)。一些GSTs基因家族成员的表达受病原菌的调控，玉米GSTs含量的增高总是伴随着植株对强致病菌Cochliobolus heterostrophus ， Cercospora zeae-maydis，C. zeina 和Setosphaeria turc抗性的增强(Wisser RJ, Kolkman JM, Patzoldt ME, Holland JB, Yu J, Krakowsky M, Nelson RJ, Balint-Kurti PJ. Multivariate analysis of maize disease resistances suggests a pleiotropic genetic basis and implicates a GST gene. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108: 7339~7344.)。在Phytophthora infestans接种后2小时，马铃薯(Solanum tuberosum)中抗病相关的GST基因Pprp-1的表达明显受到诱导，而且在接种后48-56h内表达量达到最大，马铃薯对P. infestans引起的晚疫病的抗性增强来源于Pprp-1 表达量的增加(Taylor JL, Fritzemeier KH, Häuser I, Kombrink E, Rohwer F, Schroder M, Strittmatter G, Hahlbrock K. Structural analysis and activation by fungal infection of a gene encoding a pathogenesis-related protein in potato. Molecular Plant-Microbe Interact, 1990, 3: 72~77; Hammond-Kosack KE, Jones JD. Resistance gene-dependent plant defense responses. The Plant Cell, 1996, 8: 1773~1791)。用Peronospora parasitica接种拟南芥(Arabidopsis thaliana)后，拟南芥中phi，tau和zeta类GST的表达量都明显增加(Wagner U, Edwards R, Dixon DP, Mauch F. Probing the diversity of the Arabidopsis glutathione S-transferase gene family. Plant Molecular Biology, 2002, 49: 515~532.)。总的来说，目前认为GST增强植株对病原菌的抗性主要是有两方面的原因，一方面是因为GST可以清除病原菌释放的有毒效应分子，减少病原菌对植株的直接伤害，另一方面是因为GST可以清除病原菌侵染后植物体内产生的过多的ROS，减少超敏反应所造成的损伤(Hernández I, Chacón O, Rodriguez R, Portieles R, Lopez Y, Pujol M, Borras-Hidalgo O. Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2009, 387: 300~304)。

本发明中GST基因LrGSTU3来自岷江百合(Lilium regale Wilson)。岷江百合又名王百合，多年生草本植物，我国的百合特有种。仅分布于四川西岷江流域海拔800～2700m的河谷到山腰的岩石缝中，具有极强的抗病性。

发明内容

本发明的目的是提供一种从岷江百合中克隆获得具有抗真菌活性的谷胱甘肽S-转移酶的全长基因LrGSTU3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该基因全长为828bp，包含一个720bp的开放阅读框、16bp的5’UTR及92bp的3’UTR，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明所述谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTU3的编码区是序列表SEQ ID NO：1中第17-736位所示的核苷酸序列。

本发明分离克隆岷江百合的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中过量表达，并通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础。发明人将这个基因命名为LrGSTU3。

在植物体受到病原菌的侵害时，体内GST的含量会迅速增加。GST可以催化还原型谷胱甘肽的巯基与有毒物质的亲电子基团结合，形成弱毒或者无毒的共轭物，在清除过氧化物的同时清除病原菌向细胞内分泌的有毒效应分子，从而增强植物体对病原菌的抗性。

本发明涉及分离包含LrGSTU3的DNA片段并鉴定其功能，具有该基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌侵袭的表型。其中所述DNA片段如序列表SEQ ID NO：1所示，对该基因进行分析，表明LrGSTU3全长cDNA为828bp，包含一个720bp的开放阅读框、16bp的5’UTR及92bp的3’UTR，其中ORF编码一个具有239个氨基酸的蛋白质。LrGSTU3编码蛋白具有tau 类GST蛋白的特征结构域，G位点和H位点。BLASTp检索结果表明LrGSTU3编码的蛋白质与蓖麻(Ricinus communis) GST蛋白的相似性为57%，与来自黑杨(populus trichocarpa)、马铃薯(Solanum tuberosum)、柿子(Diospyros kaki)、风信子(Hyacinthus orientalis)等物种的GST蛋白也都具有一定的同源性，这就表明其属于岷江百合中的GST蛋白。超表达序列表SEQ ID NO：2所示氨基酸序列蛋白质可以增强烟草对灰葡萄孢和尖孢镰刀菌两种真菌的抗性。

上述LrGSTU3基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：

（1）采用扩增LrGSTU3的特异引物，从接种尖孢镰刀菌后的岷江百合根中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增出LrGSTU3的全长编码区，然后将其连接到pMD-18T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆。

（2）用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切pMD18-T-LrGSTU3载体和植物表达载体pCAMBIA2300S，通过胶回收得到目的基因片段和载体大片段。再将所获得LrGSTU3基因片段与pCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达。

（3）以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植株对于病原真菌侵染的抗性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明中来自岷江百合的LrGSTU3基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉等提供方便，减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减少环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中部分LrGSTU3转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果，其中Marker：DL2000 DNA Marker (大连宝生物)，由2,000bp、1,000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp六条DNA片段组成；正对照：质粒pMD18-T-LrGSTU3为模板的PCR反应；WT：非转基因烟草(野生型)总DNA为模板进行的PCR；

图2是本发明中部分阳性LrGSTU3转基因烟草中LrGSTU3转录水平的表达分析结果图；其中Marker：DL2000 DNA Marker(大连宝生物)；WT：非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；正对照：质粒pMD18-T- LrGSTU3为模板的PCR产物；

图3是本发明中LrGSTU3转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果图，其中图a、b中接种的真菌分别是灰葡萄孢和尖孢镰刀菌；WT为野生型烟草的总蛋白；CK为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1： LrGSTU3全长cDNA克隆以及序列分析

用尖孢镰刀菌接种岷江百合，用接种12 h后的根提取总RNA。用液氮将处理过的岷江百合的根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA。采用逆转录酶M-MLV (promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5 μg total RNA，依次加入50 ng oligo (dT)，2 μL dNTP Mix (2.5mM each)，加DEPC水将反应体积补齐至14.5 μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-stand buffer、0.5 μL RNasin (200U)、1 μL M-MLV (200U)，混匀并简短离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因LrGSTU3，所用上下游引物序列分别为5’GGTCACTCGAAATGAAATCAATGG3’及5’TTCTCTCAACATAGCGTGCGAA3’。采用Advantage^TM 2 PCR Enzyme (Clontech)扩增出目的基因。PCR反应条件：95℃ 1 min；95℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 1min s，32个循环；72℃ 2 min。反应体系(20 μL)为1 μL cDNA、2 μL 10×Advantage 2 PCR Buffer、1.8 μL dNTP Mix (10mM each)、0.2 μL 正向引物(10 μM)、0.2μL 反向引物(10 μM)、0.2 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6 μL PCR-Grade water。PCR结束后，取8 μL进行琼脂糖凝胶电泳，用以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到PCR产物只有一条DNA带，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pMD18-T vector kit (大连宝生物)，反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pMD18-T vector (50 ng/μL)和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16℃过夜反应。通过热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态中，用含有氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增LrGSTU3的特异引物检测多克隆位点插入LrGSTU3的克隆。将得到的阳性克隆进行测序，最终获得的LrGSTU3全长cDNA为828bp，通过NCBI ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析发现其包含一个720bp的开放读码框(见序列表)，LrGSTU3编码一个含239个氨基酸的蛋白质LrGSTU3，其分子量约为26.8 KDa，等电点为7.02。借助生物信息学软件SignalP 4.1分析LrGSTU3编码的蛋白序列，检测其是否具有N端信号肽，结果显示在LrGSTU3中没有检测到信号肽的存在，这就表明LrGSTU3是一种非分泌蛋白。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入LrGSTU3的大肠杆菌质粒pMD18-T-LrGSTU3以及植物表达载体pCAMBIA2300S质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低。用限制性内切酶EcoRI (TaKaRa)和BamHI (TaKaRa)分别对质粒pMD18-T-LrGSTU3和pCAMBIA2300S进行双酶切(100 μL体系)，反应体系和操作过程为：分别取20 μL pMD18-T-LrGSTU3和pCAMBIA2300S质粒、依次加入10 μL 10×K buffer、5 μL EcoRI、5 μL BamHI、60 μL ddH₂O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应。将所有酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒 (上海生工)对LrGSTU3片段和pCAMBIA2300s载体大片段分别进行胶回收。取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的LrGSTU3DNA片段和pCAMBIA2300S载体片段连接起来，反应体系(20 μL)和操作过程为：取10 μL LrGSTU3DNA片段依次加入2 μL pCAMBIA2300S载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μL ddH₂O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增LrGSTU3的特异引物进行PCR，挑选出LrGSTU3与pCAMBIA2300S成功连接的克隆，并向检测得到的阳性菌株中加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒(上海生工)提取并纯化上述大肠杆菌DH5α中的pCAMBIA2300S-LrGSTU3质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300S-LrGSTU3转入所制备的根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取2 μg pCAMBIA2300S-LrGSTU3质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5 min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5 min，再冰浴2 min，之后加入500 μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃倒置培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增LrGSTU3的特异性引物进行PCR反应，检测pCAMBIA2300S-LrGSTU3是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草(Nicotiana tabacum L.)，将烟草种子用75%的酒精浸泡30 s，用无菌水洗涤后用0.1%的HgCl₂浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养5-8 d，发芽后转至光照培养箱(25℃，16h/d光照)，以后每月用MS培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-LrGSTU3质粒的农杆菌LBA4404菌种，取20uL接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48 h。随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养5-8 h以活化农杆菌。

取无菌烟草苗叶子切成约1 cm²的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，25℃浸染15 min。用无菌滤纸吸干叶盘表面的菌液，将叶盘置于共培养基上，22℃无光条件下共培养2天。烟草转化的共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6 g/L琼脂+50 mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素(cefotaxime sodium salt，Cef)；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养(25℃，16h/d光照，8h/d黑暗)。待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培养基继代培养。因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选。将烟草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。

采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，取1 μL所得基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度。以转基因植株的基因组DNA为模板用LrGSTU3的特异引物进行PCR反应。PCR结束后，取8 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株。部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，LrGSTU3转基因烟草共筛选到35株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中LrGSTU3的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

分别取阳性转基因植株以及非转基因烟草(野生型)的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增LrGSTU3的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因植株中LrGSTU3转录水平的表达。总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同。PCR结束之后，取8 μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到27个转基因单株中LrGSTU3在转录水平有表达，这些单株的编号为1～27。

将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基(200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20 g/L葡萄糖)上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。供试真菌共有7种：葡萄座腔菌(Botrosphaeria dothidea)，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，拟茎点霉属(Phomopsis sp.)真菌，链格孢属(Alternaria sp.)真菌，灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，胶孢炭疽菌(Colletorichum gloeosporioides)，串珠状赤霉菌(Gibberella moniliformis)。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作。首先取1 g转基因烟草单株(编号分别为2、7、10、15)及野生型叶片放入研钵中，加入1 mL蛋白提取液(1M NaCl，0.1M 乙酸钠，1% PVP，pH6)，充分研磨，转入1.5 mL离心管中，混匀后4℃静置过夜，4℃离心30 min (12,000 g)，取上清于新的1.5 mL离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度；将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2 μg/μL，然后分别取20 μL滴于各真菌培养基的无菌滤纸上；在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照(蛋白提取液)。28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价LrGSTU3转基因烟草的体外抗真菌活性。结果如图3所示，LrGSTU3转基因烟草蛋白对灰葡萄孢以及尖孢镰刀菌的生长具有明显的抑制作用。

序列表(SEQ ID)

<110> 昆明理工大学

<120> 一种岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTU3及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 828

<212> DNA

<213> Lilium regale

<220>

<221> gene

<222> (1)..(828)

<220>

<221> 5'UTR

<222> (1)..(16)

<220>

<221> CDS

<222> (17)..(736)

<220>

<221> 3'UTR

<222> (737)..(828)

<400> 1

atgggggtca ctcgaaatga aatcaatggt gggtgctcag gaggtgcagc tgctgggtac 60

atgggcgagc ccgtacgtga tacgtccaag gatagccctc aacctcaagg gggtgcccta 120

tgagttcctc cctcagccgg ccggccccga gcgcaactta gtccacaagc acaacccggc 180

tttcaagaag atcccagttc tcatccacaa cggcaagcct gtttctgagt ccatgataat 240

cgttcagtac attgacgagg tttggtcttc ctgtgcaccg gctatcctcc ccacaaactc 300

ttatgacagt gccaccgctc gcttctggac tgcctacttc gacgacaagt ggtttgatta 360

tttaaagtca gctgccatat tagcaactaa agagggagac aaagaggagg cgaccgagta 420

catgatcatg gtgctgcaac atctcgagga ggccttcaga agcagtaaca aaggaaagag 480

tggcttcttt ggtggcgaca ccatcgggta ccttgacatt gccgtgggca gccacttagg 540

gtggcttaag gctgcggaaa agatgactgg aatccaactg cttggtgaag agaagacacc 600

ggctctgctt gaatgggccg agaggttctg ctcccaccct gccgtgaagg aactgatgcc 660

cgagacagaa aagctgatag agttctccca aattctaagg gccaagctca tggctaaagt 720

tgctactagg aaataggaag ttttgtgata tagttaacgt tttcgcacgc tatgttgaga 780

gaattaataa ttttgtaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 828

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> Lilium regale

<400> 2

Met Lys Ser Met Val Gly Ala Gln Glu Val Gln Leu Leu Gly Thr Trp

1 5 10 15

Ala Ser Pro Tyr Val Ile Arg Pro Arg Ile Ala Leu Asn Leu Lys Gly

20 25 30

Val Pro Tyr Glu Phe Leu Pro Gln Pro Ala Gly Pro Glu Arg Asn Leu

35 40 45

Val His Lys His Asn Pro Ala Phe Lys Lys Ile Pro Val Leu Ile His

50 55 60

Asn Gly Lys Pro Val Ser Glu Ser Met Ile Ile Val Gln Tyr Ile Asp

65 70 75 80

Glu Val Trp Ser Ser Cys Ala Pro Ala Ile Leu Pro Thr Asn Ser Tyr

85 90 95

Asp Ser Ala Thr Ala Arg Phe Trp Thr Ala Tyr Phe Asp Asp Lys Trp

100 105 110

Phe Asp Tyr Leu Lys Ser Ala Ala Ile Leu Ala Thr Lys Glu Gly Asp

115 120 125

Lys Glu Glu Ala Thr Glu Tyr Met Ile Met Val Leu Gln His Leu Glu

130 135 140

Glu Ala Phe Arg Ser Ser Asn Lys Gly Lys Ser Gly Phe Phe Gly Gly

145 150 155 160

Asp Thr Ile Gly Tyr Leu Asp Ile Ala Val Gly Ser His Leu Gly Trp

165 170 175

Leu Lys Ala Ala Glu Lys Met Thr Gly Ile Gln Leu Leu Gly Glu Glu

180 185 190

Lys Thr Pro Ala Leu Leu Glu Trp Ala Glu Arg Phe Cys Ser His Pro

195 200 205

Ala Val Lys Glu Leu Met Pro Glu Thr Glu Lys Leu Ile Glu Phe Ser

210 215 220

Gln Ile Leu Arg Ala Lys Leu Met Ala Lys Val Ala Thr Arg Lys

225 230 235

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtcactcga aatgaaatca atgg 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttctctcaac atagcgtgcg aa 22

Claims

1.一种岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTU3，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTU3在提高烟草对灰葡萄孢、尖孢镰刀菌抗性中的应用。

3.根据权利要求2所述的岷江百合谷胱甘肽S-转移酶基因LrGSTU3的应用，其特征在于提高烟草的真菌抗性的具体操作如下：

(1) 将上述谷胱甘肽硫-转移酶基因与植物超表达载体pCAMBIA2300S连接，构建植物超表达载体；

(2) 将上述构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中；

(3) 以重组载体T-DNA上具有的抗性标记来筛选转化子，并通过聚合酶链式反应筛选获得真正的转基因植株，接种特定病原真菌，分析转基因烟草蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。