CN109295068B - 一种三七类甜蛋白基因PnTLP2及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三七类甜蛋白基因PnTLP2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码如SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的类甜蛋白；本发明采用分子生物学及反向遗传学相关技术证实PnTLP2基因具有提高植物抗真菌的功能，将本发明抗真菌PnTLP2基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，结果转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性，超表达PnTLP2的转基因烟草对尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、人参链格孢、核盘菌以及稻黑孢霉等五种植物病原真菌的生长具有显著的抑制作用。

Description

一种三七类甜蛋白基因PnTLP2及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌活性的三七类甜蛋白基因PnTLP2及应用。

背景技术

植物在人类的生产和生活中起重要作用，一些植物是经济作物、粮食作物，很多植物还具有重要的药用价值。植物在生长过程中或多或少会遭受着生物或者非生物因子的胁迫，从而影响植物经济性状或产量性状的形成。在多种逆胁迫因子中，由细菌、真菌、病毒等引起的病害是危害植物生长发育的主要因素。传统的病害防治方法取得了一定成效，一是依靠传统育种方法培育抗性品种，二是化学农药的使用，三是采取轮作等耕作制度。然而，这些方法都存在或多或少的弊端，如抗性品种培育的周期长、化学农药残留高且极易造成环境污染、耕作制度调整则费时费力。显然，上述方法均不能彻底解决植物病害问题。随着重组DNA技术的创立和发展，利用基因工程技术来培育抗病植物新品种已取得初步成效，且有望从根本上解决病害问题。

类甜蛋白(Thanmatin-1ike proteins，TLPs)是病程相关蛋白(Pathogenesis-related protein，PR)中第5家族蛋白，即PR-5蛋白，其与西非雨林中一种竹芋科多年生草本植物(Thaumatococcus daniellii)产生的甜蛋白的氨基酸序列高度同源，故称之为类甜蛋白。但是与甜蛋白相比，TLPs并没有甜味，但具有甜蛋白没有的抗真菌活性。目前国内外对类甜蛋白的研究非常广泛，在单子叶植物、双子叶植物、裸子植物，甚至在线虫、节肢动物中都发现了类甜蛋白。

TLPs蛋白一般约含200个氨基酸残基，其中含有16个保守的半胱氨酸残基，可形成8对二硫键。这些半胱氨酸残基所形成的二硫键使TLPs具有了相对稳定的化学结构，能够抵抗高温、高低pH值和蛋白酶的降解 (李文娴, 刘迪秋, 等. 类甜蛋白的结构特征以及功能研究进展. 中国生物工程杂志, 2010, 30 (3) :100-104)。多数TLPs分子的大小为21～26kDa，但一些来自于松柏类和谷物类植物的TLPs分子量较小，约为16～17 kDa，这类蛋白缺少了约四分之一的氨基酸，仅有约10个保守的半胱氨酸残基，但它们仍具有抗真菌活性。TLPs分子的三级结构通常由3个典型的结构域组成，分别为Domain I、II和III。Domain I主要由若干个β-sheet反向平行折叠形成，是整个分子的核心结构。Domain II和Domain III分别位于Domain I的两侧，主要由α螺旋构成（D Liu, X He, et al. Molecular cloningof a thaumatin-like protein gene from pyrus pyrifolia, and overexpression ofthis gene in tobacco increased resistance to pathogenic fungi. Plant CellTissue & Organ Culture, 2012, 111(1):29-39.）。TLPs每个结构域都含有由保守的半胱氨酸残基形成的二硫键，并以此来维持其稳定结构。TLPs另一个结构特征是，在Domain I和Domain II之问有一个明显的“V”字形凹槽，该结构特征在类甜蛋白中被认为是高度保守的。一级结构显示该凹槽中含有4个强酸性氨基酸残基(1个Glu和3个Asp)，从而使其呈酸性，带负电荷。具有类似酸性“V”字形凹槽的类甜蛋白具有抗真菌活性，而同样具有相似的碱性“V”字形凹槽的甜蛋白却不具有抗真菌活性，推测TLPs的酸性“V”字形凹槽与其抗真菌活性有关（刘潮, 韩利红等. 胡萝卜类甜蛋白家族鉴定与生物信息学分析. 中国蔬菜,2017(2):38-44.）。

TLPs通过改变真菌细胞膜的渗透压来破坏其细胞膜的完整性，具有抑制真菌生长、抑制孢子裂解以及减少孢子数目或降低孢子发育能力的作用（R Velazhahan, SMuthukrishnan. Transgenic tobacco plants constitutively overexpressing a ricethaumatin-like protein (PR-5) show enhanced resistance to alternaria alternata. Biologia Plantarum, 2004, 47(3):347-354.）。TLPs参与多种植物病原真菌侵染之后的主动防御反应，如水稻纹枯病菌（Rhizocotonia solani）的侵染可诱导水稻 TLPs 基因表达，增强它对该病原菌的抗性（D Fu, N A Tisserat, et al.Overexpression of rice TLPD34 enhances dollar-spot resistance in transgenicbentgrass. Plant Science, 2005, 168(3):671-680.）。烟草逆渗透蛋白具有裂解致病疫霉(Phytophthora infestans)孢子、抑制菌丝生长的功能(LR Abad, MP D'Urzo, D Liu,et al. Antifungal activity of tobacco osmotin has specificity and involvesplasma membrane permeabilization. Plant Science, 2005, 168(3):671-680.)。目前已发现的很多具有抗真菌活性的TLPs也同时具有葡聚糖酶活性，即结合并切断多聚葡聚糖( Polymeric glucans)的能力（L Menubouaouiche, C Vriet, et al. A molecularbasis for the endo-beta 1,3-glucanase activity of the thaumatin-like proteinsfrom edible fruits. Biochimie, 2003, 85(1):123-131.）。大麦(Hordeum vulgare)的TLPs具有β-1,3-葡聚糖酶活性，能够结合并水解β-1,3-葡聚糖。TLPs与线性β-1,3-葡聚糖的结合发生于裂缝区域，裂缝区域内的几个残基与真菌细胞壁的碳水化合物形成氢键，并且芳香族氨基酸在裂缝处参与形成堆积力共同破坏了真菌细胞壁的结构，使TLPs与细胞膜接触，造成真菌细胞死亡。TLPs的抗真菌机制不仅与真菌细胞壁破坏和真菌细胞膜透性改变有关之外，还与木质素、植保素等抗性物质的合成以及抗性结构的形成有关，植物TLPs表现的抗真菌活性很可能是与这些防御机制协同作用的结果(姜晓玲，黄秋娴等. 植物类甜蛋白基因家族研究进展. 浙江农林大学学报, 2012, 29(2):279-287.)。

本发明的类甜蛋白基因PnTLP2来自三七(Panax notoginseng)。三七主产于云南文山州砚山县、马关、西畴、广南、麻栗坡、富宁、邱北等，另外，广西田阳、靖西、田东、德保等地也有种植。三七是传统的珍贵中药，也是云南省的重要中药资源，具有“生打熟补”的功效。三七生长周期长，性喜温暖阴湿，病害严重，特别是根腐病、黑斑病、圆斑病等真菌病害是危害三七产业可持续发展的主要因素。

发明内容

本发明提供了一种从三七中克隆获得的具有抗真菌活性的类甜蛋白基因PnTLP2，三七类甜蛋白基因PnTLP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因cDNA全长序列为834bp，包含一个738 bp的开放阅读框、38 bp的5’非翻译区、58 bp的3’非翻译区，编码如SEQID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明分离克隆三七的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草以及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为PnTLP2。

PnTLP2基因编码具有245个氨基酸残基的蛋白质，其蛋白质分子质量约为26.3KD，等电点（pI）为8.99，表明该蛋白为碱性蛋白。PnTLP2蛋白包括12个酸性氨基酸（D，E）、30个碱性氨基酸（K，R，H）、106个疏水氨基酸和139个亲水性氨基酸。使用DNAMAN的ProteinHydrophobicity工具对PnTLP2基因编码蛋白质的疏水性进行分析，发现该蛋白N端有一个明显的疏水结构域。用Protein Secondary Structure工具对PnTLP2基因编码的蛋白质的二级结构进行分析，结果表明该蛋白的二级结构中11.43%为α螺旋（Helix）、14.69%为β折叠（Stand）、73.88%为环（loop）。氨基酸序列的同源性分析表明，PnTLP2基因编码的蛋白质序列与胡萝卜(Daucus carota)、栓皮栎（Quercus variabilis）、苦瓜（Momordica charantia）TLP蛋白相似性分别为91%、91%和87%。

本发明将三七类甜蛋白基因PnTLP2应用在提高烟草对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄腐镰刀菌（F. solani）、人参链格孢（Alternaria panax）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）以及稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）抗性中，具体操作如下：

（1）采用异硫氰酸胍法提取三七幼嫩叶片的总RNA，以提取的RNA为模板，以oligo(dT)15为反转录引物，通过逆转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerasechain reaction，RT-PCR)扩增出PnTLP2的编码区，然后将其连接到pMD-18T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

（2）用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切pMD-18T-PnTLP2，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pCAMBIA2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得PnTLP2基因片段与pCAMBIA2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

（3）以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植物蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明中来自三七的PnTLP2基因能增强植物对多种病原真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产药用植物、粮食作物、观赏植物等提供方便，减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减少环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明部分PnTLP2转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果示意图，图中：Marker为DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；阳性对照为质粒pMD-18T-PnTLP2为模板的PCR结产物；WT为非转基因烟草(野生型)总DNA为模板PCR的产物；

图2是本发明部分阳性PnTLP2转基因烟草中PnTLP2转录水平的表达分析结果图；图中：Marker是DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；WT是非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；阳性对照是质粒pMD-18T-PnTLP2为模板的PCR产物；

图3是本发明部分PnTLP2转基因烟草体外抑菌活性效果图；图中a、b、c、d、e分别是人参链格孢、核盘菌、稻黑孢霉、尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌；WT为野生型烟草的总蛋白；Buffer为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：PnTLP2全长基因克隆以及序列分析

取三年生三七幼嫩叶片提取总RNA，用液氮将三七叶片研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA，采用逆转录酶M-MLV (Promega)以总RNA为模板合成第一链cDNA，反应体系和操作过程为：取5 μg Total RNA，依次加入50 ng oligo（dT），2 μLdNTP（2.5 mM each）、DEPC水至反应体积为14.5 μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-stand buffer、0.5 μL RNasin（200U）、1 μLM-MLV（200U），混匀并短时离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应。第一链cDNA合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因PnTLP2，所用上下游引物序列分别为5’TATCAGAACAGCTATGGAAGTAATG3’及5’TAAACTAAGCTAGACTAATGGTGA3’。采用Advantage^TM 2PCR Enzyme（Clontech）扩增出目的基因；PCR反应条件：95℃ 2 min；95℃ 30 s，54℃ 30s，72℃ 1 min，30个循环；72℃10 min；反应体系（20 μL）为1 μL cDNA、2 μL 10×Advantage 2 PCR Buffer、1.8 μL 50×dNTP Mix （10mM each）、0.2 μL正向引物（10 μM）、0.2μL反向引物（10 μM）、0.2 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.6 μL PCR-Gradewater；PCR结束后，取5 μL用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到PCR产物只有一条DNA带，因此直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pMD18-T vector kit（大连宝生物），反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pMD18-T vector（50 ng/μL）和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中。使用含有氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增PnTLP2的特异引物鉴定出多克隆位点插入PnTLP2的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的PnTLP2全长cDNA为834 bp，通过NCBI ORF finder （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个738 bp的开放读码框（见序列表），PnTLP2编码一个含245个氨基酸的蛋白质PnTLP2，其蛋白质分子质量为26.3 KD，等电点(p I)为8.99。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工）提取插入PnTLP2的大肠杆菌质粒pMD-18T-PnTLP2以及植物表达载体pCAMBIA2300s的质粒，取1μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶BamHI（TaKaRa）和EcoRI（TaKaRa）分别对质粒pMD-18T-PnTLP2和pCAMBIA2300s进行双酶切（100μL体系），反应体系和操作过程为：取20 μL pMD-18T-PnTLP2和pCAMBIA2300s质粒、依次加入10 μL 10×Kbuffer、5 μL BamHI、5 μL EcoRI、60 μL ddH₂O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对PnTLP2片段和pCAMBIA2300s载体大片段分别进行胶回收（SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒），取1μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。

利用T4 DNA Ligase（TaKaRa），将回收的PnTLP2 DNA片段和pCAMBIA2300s载体片段连接起来，反应体系（20 μL）和操作过程为：取10 μL PnTLP2 DNA片段依次加入2 μLpCAMBIA2300s载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μLddH₂O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50 mg/L卡那霉素（Kanamycin，Km）的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增PnTLP2的特异引物进行PCR，挑选出PnTLP2与pCAMBIA2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA2300s-PnTLP2质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300s-PnTLP2转入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取0.1 μg pCAMBIA2300s-PnTLP2质粒加入含有200 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5 min，随后转入液氮中冷冻1 min，然后迅速置于37℃水浴5 min，之后立即冰浴2 min，加入800 μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增PnTLP2的特异性引物进行PCR，检测pCAMBIA2300s-PnTLP2是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30 s，用无菌水洗涤后用0.1%的HgCl₂浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养6 d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16 h/d光照），以后每月用1/2MS培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300s-PnTLP2质粒的农杆菌LBA4404菌种，接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48 h；随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养2-3 h以活化农杆菌。

取烟草无菌苗叶子切成1 cm²左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，浸染时间为15 min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/Lsucrose+6 g/L琼脂，22℃无光条件下共培养2天。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L sucrose+6 g/L琼脂+50 mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素（Cefotaxime sodium salt，Cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16h/d光照，8h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200 mg/L Cef的MS培养基继代培养。将烟草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗进行PCR检测。

采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，将提取的基因组DNA取1 μL通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组DNA为模板用扩增PnTLP2的特异引物进行PCR，PCR结束后，取8 μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，PnTLP2转基因烟草共筛选到24株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中PnTLP2的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总RNA，逆转录生成第一链cDNA，并以此为模板用扩增PnTLP2的特异引物进行PCR，根据RT-PCR结果分析各转基因单株中PnTLP2转录水平的表达，总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同，PCR结束之后，取5 μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示。

将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基（200 g/L马铃薯，15 g/L琼脂，20g/L葡萄糖）上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作，首先取1 g转基因烟草单株（编号分别为7、15、18）及野生型叶片放入研钵中，加入1 mL蛋白提取液（1M NaCl，0.1M 乙酸钠，1% PVP，pH6），充分研磨；转入1.5 mL离心管中，混匀后4℃静置过夜，4℃离心30 min（12,000 g/min），取上清于新的1.5 mL离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至1 μg/μL，然后分别取20 μL滴于各真菌培养基的无菌滤纸上，在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照（提取蛋白所用的溶液），28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价PnTLP2转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，PnTLP2转基因烟草蛋白对尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、人参链格孢、核盘菌以及稻黑孢霉的生长具有很强的抑制作用。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 一种三七类甜蛋白基因PnTLP2及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 834

<212> DNA

<213> Panax notoginseng

<400> 1

gaggagaaag tcacactttc tttcttatca gaacagctat ggaagtaatg ctgctcagat 60

ctctcttctt tctgctcttt atctccctct tgacactcca catttcagcc acaacaataa 120

ccatatacaa caagtgcacc cacccagtgt ggcccggaat ccaacctggc gcaggcaagc 180

caatcctcgc ccggggcggc ttcaagcttc ggccgaagaa atcctacact ctgcatcttc 240

ccccagcttg gtccggccgg atctggggcc gtcacggctg tgcgtttgat gcctccggtc 300

gtggaaagtg cgccaccggt gattgtggcg gagccctatt ctgcaacggc atgggcggca 360

ctcctccggc cactcttgcc gaaatcaccc tcggcagcga ccaggacttc tatgatgtca 420

gccttgttga tgggtataac ttggccatct ccatcacccc tttcaaaggc tccggcaaat 480

gcacctatgc cggctgtgtt agtgatctga acatgatgtg cccagtggga cttcaggtgc 540

ggtctcatga caataggcga gtggtggcgt gcaagagtgc ttgctttgcc ttcaactccc 600

cgagatattg ctgtacagga agctttggga gtccgcaatc gtgcaagccg acagcgtact 660

cgaggatatt caagaccgcg tgtccaaagg cttattcata tgcttatgat gatcccacta 720

gtattgctac ttgcactggt ggtagttatt tcctcacctt ctgtcctcac cattagtcta 780

gcttagttta gttatatttt ctgtctctta ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 834

<210> 2

<211> 245

<212> PRT

<213> Panax notoginseng

<400> 2

Met Glu Val Met Leu Leu Arg Ser Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Ser

1 5 10 15

Leu Leu Thr Leu His Ile Ser Ala Thr Thr Ile Thr Ile Tyr Asn Lys

20 25 30

Cys Thr His Pro Val Trp Pro Gly Ile Gln Pro Gly Ala Gly Lys Pro

35 40 45

Ile Leu Ala Arg Gly Gly Phe Lys Leu Arg Pro Lys Lys Ser Tyr Thr

50 55 60

Leu His Leu Pro Pro Ala Trp Ser Gly Arg Ile Trp Gly Arg His Gly

65 70 75 80

Cys Ala Phe Asp Ala Ser Gly Arg Gly Lys Cys Ala Thr Gly Asp Cys

85 90 95

Gly Gly Ala Leu Phe Cys Asn Gly Met Gly Gly Thr Pro Pro Ala Thr

100 105 110

Leu Ala Glu Ile Thr Leu Gly Ser Asp Gln Asp Phe Tyr Asp Val Ser

115 120 125

Leu Val Asp Gly Tyr Asn Leu Ala Ile Ser Ile Thr Pro Phe Lys Gly

130 135 140

Ser Gly Lys Cys Thr Tyr Ala Gly Cys Val Ser Asp Leu Asn Met Met

145 150 155 160

Cys Pro Val Gly Leu Gln Val Arg Ser His Asp Asn Arg Arg Val Val

165 170 175

Ala Cys Lys Ser Ala Cys Phe Ala Phe Asn Ser Pro Arg Tyr Cys Cys

180 185 190

Thr Gly Ser Phe Gly Ser Pro Gln Ser Cys Lys Pro Thr Ala Tyr Ser

195 200 205

Arg Ile Phe Lys Thr Ala Cys Pro Lys Ala Tyr Ser Tyr Ala Tyr Asp

210 215 220

Asp Pro Thr Ser Ile Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ser Tyr Phe Leu Thr

225 230 235 240

Phe Cys Pro His His

245

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

tatcagaaca gctatggaag taatg 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

taaactaagc tagactaatg gtga 24

Claims (1)

1.三七类甜蛋白基因PnTLP2在提高烟草对茄腐镰刀菌（F. solani）、人参链格孢（Alternaria panax）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）抗性中的应用；

所述三七类甜蛋白基因PnTLP2的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

Images