CN103183731B

CN103183731B - 石斛DnMYB类转录因子、编码基因、载体、工程菌及应用

Info

Publication number: CN103183731B
Application number: CN201310117190.0A
Authority: CN
Inventors: 孙玉强; 王慧中; 柯丽萍
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2013-04-03
Filing date: 2013-04-03
Publication date: 2014-10-15
Anticipated expiration: 2033-04-03
Also published as: CN103183731A

Abstract

本发明公开了一种石斛DnMYB类转录因子、编码基因、载体、工程菌及应用，所述石斛DnMYB类转录因子具有SEQ ID NO.3所示氨基酸序列95%以上同源性；本发明了提供了一种新的提高植物根系生长和表皮毛改变的石斛MYB类转录因子，提供了新的用于从遗传学角度改良根系结构和表皮刺毛及生物学产量的方法和技术。

Description

石斛DnMYB类转录因子、编码基因、载体、工程菌及应用

（一）技术领域

本发明涉及一种DNA片段的分离克隆和应用，特别涉及一种石斛DnMYB类转录因子、编码基因、载体、工程菌及应用。

（二）背景技术

石斛属（Dendrobium）植物是兰科（Orchidaceae）的附生植物，它是我国传统的名贵中药材，现代药理研究证明：石斛具有滋阴润肺、养胃生津、健脑明目、护肝利胆、清热解毒、补五脏之虚劳的神奇功效；对增强免疫力、抗衰老、抑制肿瘤、治疗糖尿病和萎缩性胃炎等都有确切疗效。

长期以来，药用石斛原料基本来源于野生资源，巨大的市场需求引起采挖过量，导致野生资源严重破坏，加上石斛自身的繁殖率低和生长缓慢等原因，致使野生石斛已处于濒危状态，价格也越来越昂贵。更为严重的是，由于乱挖滥采，野生石斛赖以生存的自然环境正面临毁灭性的破坏。

石斛属植物是以热带东南亚为中心向亚热带地区逐渐发展的类群，为附生植物，生长环境十分独特，常附生于海拔500-1800米的林中树干或湿润岩石上，对小气候环境要求十分严格，喜温暖湿润气候（陈心启等,1999）。石斛属植物属于菌根植物，根常与真菌共生生长，依靠共生真菌固定空气中的氮素供其生长利用，并依靠其气生根从潮湿的空气中吸收水分和养分；茎大多数呈肥大的假鳞茎，使其具有一定的耐旱和耐瘠薄能力，可以以其贮存水分和养分。

自然条件下，石斛生长极缓慢。近年来，由于人类过度采挖及环境的不断恶化，药材资源日趋枯竭。为保护利用这一珍稀中药材，增加产量，不少学者进行了石斛组织培养快繁研究，并取得了一定的进展。但试管苗移栽成活率低，产量低，目前还没能应用试管苗进行大面积栽培，不能满足药材市场的需求。因此石斛药源一直处于相当紧张状态，亟待解决。所以，石斛广泛的人工培育的前提，需要改良其根系，以满足移栽，存活和快速生长。

高等植物一系列调控逆境、激素、病原反应、生长发育等相关基因大多数是转录因子。转录因子又叫做反式作用因子，是指能够与真核基因启动子区域的顺式作用元件(cis-acting element)发生特异相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的作用，激活或抑制转录，调控对基因的表达。在植物的生长发育过程中，之所以各细胞之间出现了特定的分化，就是因为细胞内基因的表达存在时空的差异。而导致这种差异的主要原因之一就是转录因子在转录水平或转录后水平上的调节作用。

MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)转录因子是最大的植物转录因子家族成员之一，参与了细胞分化、细胞周期的调节，激素和环境因子应答，并对植物次生代谢以及叶片等器官形态建成具有重要的调节作用。大多数植物的MYB以在其N端含有一段约51～52个氨基组成的MYB结构域为共同特征，MYB蛋白的分类主要是根据这个高度保守的DNA结合结构域，这个结构域通常是由至多四个氨基酸残基序列的重复（R）组成，每一个都形成三个ａ-螺旋，每一个重复的第二个和第三个螺旋形成一个带有三个有规律的间隔色氨酸残基（或疏水的）的螺旋-转角-螺旋(HTH)结构，形成一个3D HTH疏水核心结构，对维持HTH的构型有极为重要的意义。

一些R2R3-MYB转录因子在植物的一种重要的次生代谢产物类黄酮的生物合成中起作用，例如，AtMYB11/PFG1等调控植物体所有组织的黄酮醇的生物合成(Frampton,2004)。杨文杰(2008)等人利用RACE技术从大豆栽培品种中豆27中克隆出了两个新的MYB基因命名为GmMYBZ1、GmMYBZ2，并通过酵母系统检测和实时定量PCR功能研究表明，GmMYBZ2可能也参与植物体类黄酮的生物合成调控。AtMYB75/PAP1等控制植物体营养组织中花青素的生物合成，AtMYB123/TT2、TT1与一个R2R3-MYB转录因子在拟南芥的次生代谢产物生物合成起协同调控作用，一同控制种皮中的原花青素(Pas)的生物合成(Ingo et al.,2011;Kangaet al.,2009)，PyMYB10、Purple、CsMYC2、NtAn2、MrMYB1等MYB转录因子基因在各种植物的幼苗期到成熟期等各个时期的花青素的生物合成中均起调控作用(Ban et al.,2007;Chiu et al.,2010;Cultrone et al.,2010;Pattanaik et al.,2011;Niu et al.,2010;Feng et al.,2010)。

拟南芥中的三个R2R3-MYB转录因子MYB28、MYB29和MYB76相互协同，共同调控脂肪族GLS的生物合成(Sonderby et al.,2010)。PtrMYB3和PtrMYB20与拟南芥中的MYB46和MYB83的功能相似，并且直接调控白杨的PtrWND2合成，表明它们在白杨中参与了木质素的生物合成的调控过程(McCarthy et al.,2010)。表皮细胞类型的形成所需要的R2R3-MYB蛋白是由AtMYB0/GL1，AtMYB23和AtMYB66/WER共同编码的。雄性生殖细胞系特异的R2R3-MYB转录因子DUO1/POLLEN1(DUO1)在精细胞的特化过程中是必须的，DUO1调节子在生殖细胞分化为精子细胞的过程中起重要功能(Borg et al.,2011)。

R2R3-MYB基因AtMYB21等控制拟南芥花粉囊的发育和功能(Chenget al.,2009)。AtMYB125/DUO1是一个控制雄性生殖细胞的分裂和分化的花粉特异因子(Mandaokar et al.,2009)。AtMYB33和AtMYB65对花粉囊和花粉都具有促进发育的作用(Brownfield et al.,2009)。在幼苗中，AtMYB38和AtMYB18/LAF1分别对蓝光和远红外光的反应下调控下胚轴的伸长(Lee et al.,2009)，AtMYB115和AtMYB118/PGA37在胚胎发育中起作用(Yang et al.,2009)。AtMYB59通过控制根尖的细胞周期过程来调节根的发育(Wang et al.,2008)，AtMYB77通过调节生长素诱导的基因表达来调控晚期根的形成(Mu et al.,2009)。AtMYB68是一个根生长特异的调控子，使整个植株在不利的条件下完成发育。与拟南芥的根毛伸长有关的植物特异的R2R3-MYB家族成员maMYB蛋白与根毛的伸长有关(Slabaugh et al.,2011)。水稻R1R2R3-MYB转录因子基因OsMYB3R-2在拟南芥中过量表达，转基因阳性植株对冻害、干旱和高盐的耐受性显著提高(Dai et al.,2007)。

同类MYB转录因子在同一植株的不同器官组织或在同一器官组织的不同发育阶段的表达模式都不尽相同，例如三种R2R3-MYB转录因子CaMYB1、CaMYB2和CaMYB3都是从同一种甜辣椒(Capsicum annuum.L)中分离得到的，在果实的发育期、花和叶的各个时期都能检测到这三种转录因子基因，但三种CaMYB转录因子在果实的成熟阶段的表达量是不同的，花青素生物合成基因的表达模式在幼叶、花和果实的发育的四个阶段都不尽相同(Li et al.,2011)。

MYB转录因子在植物发育和代谢的各个方面都起着重要的调控作用，其主要功能是调节次生代谢、控制细胞形态建成等。MYB转录因子对基因表达调控机制的研究还不够透彻，例如多数MYB转录因子正向调控花色素的积累(Paz-Ares et al.,1987;Elomaa et al.,2003;Espley et al.,2007)，而少数却抑制花色素的合成(Aharoni et al.,2001)；MYB转录因子与其他转录因子如何协同作用调控植物生长发育过程还知之甚少。植物中存在成千上万的MYB类转录因子，但它们的功能并不是冗余的，可能存在重叠效应(Jin and Martin,1999)。目前，还没有研究表明，MYB基因，尤其是中草药石斛的MYB基因克隆，并能促进根系生长发育的研究报道。水稻根系主要由大量的不定根及其侧根组成，基因WOX11可以控制不定根生长发育，WOX11基因通过介导植物生长素和细胞分裂素的信号传导来调控水稻不定根的生长发育(Zhao et al.,2009)。C2H2型锌指蛋白ZFP5是拟南芥中根毛起始和形态建成的关键调控因子，ZFP5直接促进CAPRICE基因表达而影响根毛发育，而且ZFP5基因可以被细胞分裂素诱导，介导细胞分裂素和乙烯影响根毛形成和生长。

植物激素细胞分裂素是已知控制顶端分生组织活力的重要因子。以往的研究揭示，在可提高粒数的水稻基因座中，包含着突变的OsCKX2基因。OsCKX2表达减少，可导致花序分生组织CK累积，提高生殖器官数量，提高产量。锌指转录因子DST可直接调控生殖分生组织中的OsCKX2表达，提高产量，然而DST的一个半显性等位基因DSTreg1可以扰乱生殖顶端分生组织中DST引导的OsCKX2表达调控，提高CK水平，导致分生组织活力增高，促进圆锥花序分支，提高粒数(Li et al.,2013)。控制水稻粒重的数量性状基因GW2，作为一个新的E3泛素连接酶可能参与降解促进细胞分裂的蛋白，从而调控水稻颖壳大小、控制粒重以及产量；当GW2的功能缺失或降低时，该基因降解可能与细胞分裂相关蛋白的能力下降，从而加快细胞分裂，增加谷粒颖壳的细胞数目，进而显著增加水稻谷粒的宽度、加快籽粒灌浆速度、增加粒重以及产量(Song et al.,2009)。

目前为止，尚没有可以有效地改良石斛根系的方法。因此本领域迫切需要挖掘一写有效的促进根系生长发育的基因，进行遗传改良。从石斛中克隆分离抗逆基因、促生长生根基因等具有潜在经济价值的目的基因可提高中草药石斛和水稻等作物的产量和品质。

（三）发明内容

本发明要解决的技术问题是利用功能基因和转基因技术，克服现有技术的不足，提供一种提高植物根系生长或影响表皮毛生长及生物学产量的石斛DnMYB类转录因子、编码基因、载体、工程菌及应用；所述的石斛DnMYB类转录因子（DNA片段）能够促进植物根系生长、减少叶表皮刺毛和提高生物学产量，将该DNA片段与组成型启动子或与其他启动子相连后导入除植物中，转基因植株的根系明显增多、叶表皮刺毛明显变化和生物学产量明显提高。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种石斛DnMYB类转录因子，所述转录因子具有SEQID NO.3所示氨基酸序列95%以上同源性，优选所述转录因子的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

所述SEQ ID NO.3为：

MET Asp Gln Ile Ser Asn Glu Asp Phe Val Asn Ser Ile Glu Glu Lys Ser Gln Ser Leu

1 5 10 15 20

Lys Pro Glu Phe Ser Glu Gln Glu Val Asp Leu Ile Ser Arg MET Tyr Lys Leu Ile Gly

25 30 35 40

Glu Lys Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Val Pro Gly Arg Thr Ala Glu Glu Ile Glu Lys

45 50 55 60

Tyr Arg Lys Leu Lys Asp His Arg Asn Ser Ser Ser Ser

65 70

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO：3所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明还提供一种所述石斛DnMYB类转录因子的编码基因，所述编码基因具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列95%以上同源性，优选所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

所述SEQ ID NO.1为：

CTCCTCATTC CTCAAGCTCT TTCACAGTAT CCTTCTAAGA TAATTCTCAT GCATGGATCA 60

GATCTCAAAT GAGGATTTTG TTAATTCCAT AGGTGCTTAT TCGTTGAATT ATTTGCCTGT 120

CTGTAGAAGG AAAGTCCAAC CTGTTTTTAT ATATTTCCTT CCTTTTCAAG TAAATTTACA 180

TGACCTTCTG TTGTTTTGGT GCAGAAGAGA AGAGTCAGAG TTTAAAGCCT GAGTTCTCAG 240

AGCAGGAAGT GGATCTCATT TCCAGGATGT ATAAACTGAT TGGAGAGAAG TTTGTAACCT 300

TTCTCCTGCT TTTCTTCTAC AGATTACTGC AGAAAATTTC ATTTTTTTTT TTTGTTGAAC 360

ATATATTTCA GATGGTCTCT GATTGCTGGT AGAGTTCCAG GAAGAACAGC TGAGGAGATT 420

GAGAAGTACT GGAAGCTGAA AGACCATCGT AACAGTAGCA GTAGCTGAGG AGATAATTAG 480

GATAAAATGG TTAGACAATA ACATCTAATA TGTCATTTAT GACGTATGTG AAAACTGAGT 540

ACTGTTACAT CAATGATTTA GAAATTTACT TGAAATTATT GAGCCCGGGC ATTTCTCTCA 600

TTGGTGCTGC TTGGTTCCAG CCGTTGGAAG TTTAATTTTG TGTTCATCTT GTACTCATCT 660

TGAC 664

所述SEQ ID NO.2为：

GGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGGGGGGGG GGGGGGAAGA ACTCCTCATT CCTCAAGCTC 60

TTTCACAGTA TCCTTCTAAG ATAATTCTCA TGCATGGATC AGATCTCAAA TGAGGATTTT 120

GTTAATTCCA TAGAAGAGAA GAGTCAGAGT TTAAAGCCTG AGTTCTCAGA GCAGGAAGTA 180

GATCTCATTT CCAGGATGTA TAAACTGATT GGAGAGAAAT GGTCTCTGAT TGCTGGTAGA 240

GTTCCAGGAA GAACAGCTGA GGAGATTGAG AAGTACCGGA AGCTGAAAGA CCATCGTAAC 300

AGTAGCAGTA GCTGAGGAGA TAATTAGGAT AAAATGATTA GACAATAACA TCTAATATGT 360

CATTCATGAC GTATGTGAAA ACTGAGTACT GTTACATCAA TGATTTAGAA ATTTACTTGA 420

AATTATTGAG CCCAGGCATT TCTTTCACTG GCGCTGCTTG GTTCCAGCCG TTGGAAGTTT 480

ATTTTTGTGT TCATCTTGTA CTCATCTTGA CATTTTAAAG GATGTAAACT CTCTTAGAGT 540

CTGCCTCTTT TTTCTTGAGG CCTTAGTTTT TTAGAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 600

AAAA 604

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO：1或SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

本发明涉及一种含所述石斛DnMYB类转录因子的编码基因的重组载体。

本发明还涉及一种由所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本发明提供一种所述重组基因工程菌在提高植物根系生长中的应用。将所述重组基因工程菌导入植物（如中草药石斛，拟南芥，水稻等）中，转基因植株的根系明显增多、叶表皮刺毛明显减少和生物学产量明显提高。

本发明还涉及所述重组基因工程菌在增加植物表皮毛长度中的应用，所述应用为：将所述重组基因工程菌转入到棉花中，棉花纤维发育受到明显的影响，导致棉纤维增长。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明了提供了一种新的提高植物根系生长的石斛MYB类转录因子，提供了新的用于从遗传学角度改良根系结构、叶表皮刺毛及生物学产量的方法和技术。

（四）附图说明

图1：DnMYB基因克隆检测电泳图；（泳道1：DnMYB基因；泳道2：DNA marker）。

图2：DnMYB基因的全长cDNA超表达载体示意图；(LB,RB:T-DNA左边界和右边界；Bar:抗除草剂基因；T35S：终止子；P35S：启动子)。

图3：DnMYB基因超表达载体示意图；(LB,RB:T-DNA左边界和右边界；Bar:抗除草剂基因；T35S：终止子；P35S：启动子)。

图4：T2代转基因拟南芥的部分基因型分析电泳图片；（泳道1，2：拟南芥野生型对照；泳道3-23：转DnMYB基因过量表达株系；泳道M：DNA marker）。

图5：转DnMYB基因的拟南芥过量表达植株，RNAi植株根系和刺毛发育突变体tri及野生型拟南芥根系发育显微照片比较图；（tri:刺毛发育突变体，表皮毛增多，根毛减少；WT：拟南芥野生型Col;RNAi：DnMYB基因RNAi干涉植株；cDNA OX:DnMYB基因的全长cDNA过量表达植株;G OX:DnMYB基因过量表达植株；横向第一排（A）：叶片表皮毛；横向第二排（B）：植株生长表型；横向第三（C）、四排（D）：根系和侧根显微图）。

图6：过量表达的拟南芥地上部分与野生型比较照片；(OX：过量表达植株；WT:拟南芥野生型Col)。

图7过量表达的拟南芥地根系与野生型比较照片；(OX：过量表达植株；WT:拟南芥野生型Col)。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，在Ausubel编写的由John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols inMolecular Biology和J.Sambrook等编写的由Cold Spring HarborLaboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Laboratory Mannual,3^rd ED.等文献均有详细的说明。以下施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市售购买产品。

实施例1：石斛DnMYB类基因的克隆和载体构建

1）石斛DnMYB类基因的克隆

从本实验室构建的金钗石斛（Dendrobium nobile）cDNA文库中获得部分片段（核苷酸序列如SEQ ID NO:4）作为参照，设计特异引物如表1，利用Tail-PCR技术从铁皮石斛基因组DNA扩增出全长的基因DnMYB，碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

所述SEQ ID NO.4为：

AGGATGTATA AACTGATTGG AGAGAAATGG TCTCTGATTG CTGGTAGAGT TCCAGGAAGA 60

ACAGCTGAGG AGATTGAGAA GTACCGGAAG CTGAAAGACC ATCGTAACAG TAGCAGTAGC 120

TGAGGAGATA ATTAGGATAA AATGATTAGA CAATAACATC TAATATGTCA TTCATGACGT 180

ATGTGAAAAC TGAGTACTGT TACATCAATG ATTTAGAAAT TTACTTGAAA TTATTGAGCC 240

CAGGCATTTC TTTCACTGGC GCTGCTTGGT TCCAGCCGTT GGAAGTTTAT TTTTGTGTTC 300

ATCTTGTACT CATCTTGACA TTTTAAAGGA TGTAAACTCT CTTAGAGTCT GCCTCTTTTT 360

TCTTGAGGCC TTAGTTTTTT AGAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 412

以SEQ ID NO:1所示全长基因DnMYB信息设计引物，扩增出全长的编码序列DncMYB，碱基序列如SEQ ID NO:2所示。

石斛基因组总DNA提取操作步骤如下：

铁皮石斛培养于本实验室组培室，植物生长环境条件：温度为26℃，光周期为16（光照）/8（黑暗）小时。

①取石斛幼嫩叶片0.3g左右，加入液氮，迅速研磨至粉末状，并转移至1.5ml离心管中，加入1ml不含CTAB的抽提缓冲液（200mmol/LTris-HCl；50mmol/L EDTA;250mmol/L NaCl；2%β–巯基乙醇），混匀后冰上静置15min；

②于4℃，8000r/min离心10min；

③去上清，加入500μl65℃预热的抽提缓冲液（3%CTAB；100mmol/L Tris-HCl；25mmol/L EDTA；1.5mol/L NaCl；1%β-巯基乙醇），混匀、65℃水浴40min至1h；

④冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）轻轻颠倒混匀1-2min，室温静置5min；

⑤于4℃，10000r/min离心10min；

⑥取上清至一新的离心管，用酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)重复抽提一次；

⑦取上清至另一新的离心管中，加入0.5倍体积的5mol/L NaCl溶液，2倍体积的无水乙醇，轻微上下颠倒，室温静置20-30min；

⑧取白色沉淀至新的离心管中用体积浓度70%乙醇洗涤2次，去乙醇，自然风干，用50μl TE缓冲液溶解；

⑨加入1μl 10ng/ml RNase，37℃水浴10min，降解RNA；

⑩用等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提一次，然后方法同上，最后将沉淀（即石斛基因组总DNA）溶解于适量的TE缓冲液中。

DNA的检测

取2μl提取的石斛基因组总DNA，用Nonodrop 2000C分光光度计测定OD₂₆₀、OD₂₈₀的紫外吸收值和DNA浓度。将DNA用超纯水稀释到0.1-0.2ng/μl，备用；通过OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值确定DNA的纯度，比值在1.8-2.0范围内符合实验要求。

TAIL-PCR扩增基因组DNA

TAIL-PCR技术采用的是经过改进的Yao-Guang Liu(2007)的方法。具体步骤如下：

①将上述方法提取的石斛基因组总DNA浓度稀释至2-3ng/μl，并作为TAIL-PCR第一轮的模板，引物为DnMYB-GSP1和Tail-PCR的AD引物（Liu et al.1995），PCR体系按照表2中所示，Taq酶最后加入体系。

②第一轮PCR扩增程序：4℃ 2min；93℃ 1min；95℃ 1min；5个循环(94℃变性30s，62℃退火1min，72℃延伸2min30s)；94℃30s；25℃ 3min；按照1min升0.2℃的梯度升至72℃；72℃保持2min30s；15个循环(94℃ 10s，68℃1min，72℃ 2min30s，94℃ 10s，68℃1min，72℃ 2min30s，94℃ 10s，44℃ 1min，72℃ 2min30s)；72℃ 5min；4℃保存。

③第一轮PCR的产物稀释200倍作为第二轮PCR的模板，引物为DnMYB-GSP2和第一轮相同的AD引物，反应体系见表2。扩增程序为：4℃保持2min；12个循环(94℃ 10s，64℃1 min，72℃ 2min30s，94℃ 10s，64℃ 1min，72℃ 2min30s，94℃ 10s，44℃ 1min，72℃2min30s)；72℃ 5min；4℃保存。

④第二轮PCR的产物稀释100倍作为第三轮PCR的模板，引物为DnMYB-GSP3和第一、二轮相同的AD引物，反应体系见表2。扩增程序为：4℃ 2min；20个循环(94℃10s，44℃ 1min，72℃ 1min30s)；72℃ 5min；4℃保存。

⑤取第三轮PCR扩增产物中清晰的单条片段克隆，测序，结果为SEQ ID NO:1所示，设计引物克隆这条全长基因DnMYB。根据全长基因序列和部分cDNA序列设计引物（表3）扩增SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

表1进行Tail-PCR的DnMYB基因片段特异引物

DnMYB-GSP1	5’-TGACTCTTCTCTTCTATGG-3’
		DnMYB-GSP2	5’-GAAGAATACTGTGAAAGAGC-3’
DnMYB-GSP3	5’-AATGAGGAGTTCTTGATGTC-3’

表2三轮TAIL-PCR的反应体系

注：10×PCR buffer(100mM Tris-HCl pH8.8,100mM(NH₄)₂SO₄,100mM KCl,15mM MgCl₂)。简并AD引物的储存浓度为20μM，并需要稀释到TAIL-PCR反应中需要的工作浓度：

表3DnMYB和DncMYB基因克隆的引物

DnMYB-F	5’-CTCCTCATTCCTCAAGCTCT-3’
		DnMYB-R	5’-GTCAAGATGAGTACAAGATG-3’
DncMYB-F	5’-CTCCTCATTCCTCAAGCTCT-3’
		DncMYB-R	5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

Tail-PCR技术，参照Liu YG,Mitsukawa N,Oosumi T and Whittier RF(1995)Efficient isolation and mapping of Arabidopsis thaliana T-DNA insertjunctions by thermal asymmetric interlaced PCR.The Plant Journal,8:457–463.

表4PCR试剂

表5DNA提取及电泳检测试剂

实验溶液配方

（1）CTAB-free抽提液(灭菌后室温保存)

（2）3%CTAB抽提液（灭菌后室温保存）

2）中间载体的构建

在获得全长的DnMYB基因（SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2）后，利用Gateway(Invitrogen)系统，构建表达载体，整个流程参考：InstructionManual,Gateway Technology,Version D,2003。所需的attB PCR引物为：

克隆的基因组的DnMYB基因（SEQ ID NO.1）和DncMYB基因序列（SEQ ID NO.2），通过Gateway(Invitrogen)系统的BP和LR反应，装载到超表达载体pB7WG2D和RNAi干涉载体中，如图2，获得超表达载体pB7WG2D-DnMYB，pB7WG2D-DncMYB及RNAi干涉表达载体pB7GWIWG2(I)-DncMYB的。

本实验中构建载体方法采用的是Invitrogen公司的Gateway克隆技术，BP反应是一个置换反应，attB-目的基因和attP-DONR载体在BP克隆酶II的作用下将目的基因（SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2）置换到pNONR载体上。具体步骤如下：

①从基因组两端设计attB-引物，利用高保真酶来扩增石斛的基因组DNA，PCR体系与程序如下，扩增产物-20℃保存备用。

装载到pDONR载体上基因克隆所用的引物为:

高保真酶扩增基因组DNA体系：(采用的是FINNZYMES公司的2×Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Mix)

程序：

98℃ 5min；35个循环(98℃,30s，56℃ 30s，72℃ 1min)；72℃ 10min；4℃保存。

②BP反应体系：

attB-目的基因(最终量～15-150ng) 1-7μl

pDONR201载体(150ng/μl) 1μl

ddH₂O 加至8μl

③BP克隆酶II在冰上解冻约2分钟，短暂涡旋2次。

④在样品中加入1μl BP克隆酶II(Invitrogen)，涡旋2次以混匀，25℃温育1小时。

⑤在样品中加入1μl蛋白激酶K，37℃温育10分钟。

⑥取4μl的连接产物转到100μlDH-5α大肠杆菌感受态中，冰上放置30min。

⑦42℃热击45s，然后加入500μl SOC培养基（组份浓度：2%(W/V)胰蛋白胨，0.5%(W/V)酵母提取物，0.05%(W/V)NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖），37℃，220rpm摇菌1h。

⑧微离心，然后取100μl转移产物至卡那霉素(50mg/L，Sigma)LB（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，根据《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，DW拉塞尔著）选择性培养基上。

⑨平板正面向上放置10min，然后倒置于37℃温箱中培养12～16h。

⑩挑斑，至含有卡那霉素的LB液体培养基(50mg/L，Sigma)中，37℃，220rpm摇菌6-12h，用pDONOR201引物进行PCR检测。剩余的菌液加入等体积的50%的无菌甘油，于-20℃保存备用。（注：过程中注意无菌操作）

3）农杆菌载体的构建

将BP反应中保存的菌液（如上面⑩）提取质粒，采用的是爱思进公司的质粒提取试剂盒，步骤同说明书。含有目的基因的pDONR载体，在LR克隆酶II(Invitrogen)的作用下将目的基因转移至表达载体pB7WG2D及pB7GWIWG2(I)中，构建过量表达载体（图3）和RNAi载体（图1）。然后用电激法导入农杆菌GV3001中。两种表达载体的抗性均为壮观霉素(Specinomycin)，所以LB液体培养基中添加壮观霉素（终浓度为50μg/ml）。

实施例2：根系显著增加的转基因拟南芥获得

装载了pB7WG2D-DnMYB，pB7WG2D-DncMYB及pB7GWIWG2(I)-DncMYB（实施例1中步骤2）的农杆菌GV3001，侵染拟南芥采用的是Clough(1998)的浸花法，具体步骤如下：

①转基因前3d，接种含有双元载体的农杆菌GV3001（Invitrogen）到5ml含Ti质粒和T-DNA质粒的选择性抗性的5ml LB培养基中，28℃，220rpm，摇菌。

②2d后，接种步骤①中的1ml菌液至200ml LB培养基中，28℃，220rpm继续培养24h。

（注：如使用YEP培养基可以得到更高浓度的农杆菌）

③停止对拟南芥进行浇水，使基质稍稍干燥，可以减少浸染过程中的脱落。

④室温条件下，GSA转子中6000rpm离心10min，此时沉淀为粉红色。

⑤将沉淀在400ml渗透培养基（1/2×MS大量元素，1/2×MS微量元素，1/2×铁盐母液，1×VB5，5%（w/v）蔗糖，50μl Silwet-77购自北京蓝博斯特生物技术有限公司，121℃，20min高温压灭菌）中重新悬浮。

⑥将农杆菌悬浮物转移到一个方便的容器中用来侵染拟南芥，比如烧杯，培养皿等。

⑦剪掉拟南芥苗上已结的荚果，将拟南芥的花浸润到悬液中，停留约30-45s。

⑧侵染过后，将拟南芥移入培养箱，其上罩一个透明的盖子24h，使农杆菌充分吸附在花蕾上。

⑨24h后，移除盖子，并还原原始培养条件。

⑩3-4星期后，收集种子。喷撒除草剂进行阳性植株筛选，并结合PCR的基因型筛选（图4），获得T2转基因纯合株系，在培养皿上同步种植拟南芥刺毛突变体(tri)，拟南芥野生型col(WT)，RNAi干涉转基因植株(RNAi)，cDNA过量表达植株(cDNA OX)，DnMYB过量表达载体(G OX)进行表型分析（图5）（从上到下分别是叶片表皮毛；植株；根系；根系放大图），过量表达的DnMYB基因和cDNA植株叶片的表皮毛全部消失，根系发达，侧根显著增多；RNAi干涉植株叶片表皮毛分布介于刺毛增生突变体tri和野生型之间，根系发育和侧根生长数量也介于突变体tri和野生型之间。对于过量表达植株地上部分的生物学产量也显著增加，表现为叶片增多，分枝增加（图6），此时转基因过量表达植株地下部分根系发达，侧根增多（图7）。

实施例3：用于培育根系显著增加的转基因水稻

1）载体的构建

根据SEQ ID NO.1的序列，分别合成两条引物（表6），从质粒中PCR扩增出MYB基因。

表6.扩增DnMYB基因的引物序列

PCR反应成分：

反应参数：

98℃，10秒，55℃，15秒，72℃，1分50秒，35个循环。72℃延伸5分钟。

PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后，以SmaI酶切含有组成型启动子Actin 1和NOS终止子的双T-DNA载体p1300-actin-nos，用Clontech的HD Cloning Kit将MYB克隆到p1300-actin-nos，用SmaI酶切鉴定，获得的阳性克隆再测序（PE公司，377测序仪；上海生工生物工程技术服务有限公司）验证，测序正确的载体命名为p1300-actin-MYB-nos。

2)转基因水稻的获得

转基因水稻的获得方法是采用现有的技术（Pan G.,et al.Map-basedcloning of a novel rice cytochrome P450 genes Cyp81A6 that confersresistance to two different classes of herbicides.Plant Molecular Biology,2006，61：933-943），选取饱满的水稻品种日本晴种子，去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。通过电激法将步骤1）中构建的载体p1300-actin-MYB-nos导入农杆菌EHA105。取含T-DNA载体p1300-actin-MYB-nos的农杆菌划板，挑单菌落在LB培养基中培养，为水稻转化准备农杆菌。

将待转化的水稻愈伤组织在无菌滤纸上稍微吸干，将愈伤组织放入OD₆₀₀为0.5的农杆菌菌液中（含乙酰丁香酮，200μmol/L），室温下放置40分钟后弃菌液，再将水稻愈伤组织置于无菌滤纸上吸去多余菌液，把愈伤组织转移到共培养基上培养50-55小时，将表面没有很多农杆菌的愈伤组织转入抑菌培养基上培养5-7天，而后再将表面没有农杆菌的愈伤组织转入筛选培养基上培养6周（每两周继代一次）。把筛选后获得的抗性愈伤转移到预分化培养基上（先暗培养5-7天，而后16小时光照分化发芽）4-6周，待抗性幼苗长成后转移到生根培养基上生根，最后将再生植株洗去培养基于温室或田间培养，直至收获T1种子。

将T1代种子种于大田，用标记基因和目的基因的特异引物鉴定转基因后代中的标记基因和目的基因，获得无标记基因而根系明显增加的转基因水稻。

实施例4：用于培育纤维改良的棉花

1）载体构建，（如实施例1中步骤2）pB7WG2D-DnMYB，

pB7WG2D-DncMYB表达载体点击转入农杆菌LBA4404中，利用农杆菌介导的转基因方法。

2）转基因过程如下：利用农杆菌介导的棉花无菌苗下胚轴作为受体，进行转基因棉花改良。将棉籽壳去掉，用0.1％的升汞灭菌8～10分钟，无菌水冲洗3～4遍，接种于无菌苗培养基中（1/2MS大量元素+葡萄糖15g/L+琼脂粉7～8g/L，培养室培养，光照时间14/10（光/暗，）温度28±2℃（下列培养条件若未特别注明，培养时条件均相同）。2-3天暗培养，3-4天光照培养。选取无菌苗的下胚轴，用解剖刀切成0.5～0.6cm小段，准备和农杆菌共培。活化的农杆菌调整OD值到1.0-1.2，倒入培养皿中侵染切段的下胚轴。刚盖过表面为宜，静置20分钟，倒掉菌液，滤纸吸干残余菌液，吹5分钟使表面稍为干燥，薄层分散布于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21℃暗培养36-48小时，待滤纸和下胚轴出现不太明显的菌落结束共培养。把经过共培养的下胚轴连同滤纸一起取出浸入含500mg/LCef的无菌水中，把滤纸上的愈伤洗干净，倒掉洗液，用含500mg/L Cef的无菌水浸泡15-20min，期间多搅动；倒掉洗液，用无菌水清洗三遍，滤纸吸干水分，均匀接种于选择培养基上（MS无机盐+B₅有机物+2，4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L，葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L，500mg/LCef，卡那霉素50mg/L），吹10分钟使表面稍为干燥；弱光培养，培养20-30天，在下胚轴两段出现浅愈伤即为抗性愈伤。可以把抗性愈伤单克隆在选择培养基再继代一次以增加愈伤数量。从选择培养基上挑取单克隆抗性愈伤分别接种到分化培养基上（MS无机盐(硝酸钾加倍，硝酸铵减半)+B₅有机物+葡萄糖30g/L+phytagel2.5g/L+KT0.15mg/L+IBA0.5mg/L，卡那霉素50mg/L），20天左右继代一次，分化和成苗的过程中尽量把不同克隆之间区分清楚。

3）得到转基因棉花植株种植到试验田，待棉铃吐絮，进行棉花纤维考察和筛选。得到纤维伸长的转基因株系，和纤维增多的转基因株系，进行棉花陆地棉的遗传改良。

Claims

1.一种石斛DnMYB类转录因子，其特征在于所述转录因子的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。

2.一种权利要求1所述石斛DnMYB类转录因子的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

3.一种含权利要求2所述石斛DnMYB类转录因子的编码基因的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

5.一种权利要求4所述重组基因工程菌在提高植物根系生长中的应用，其特征在于所述重组基因工程菌是将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列装载入pB7WG2D表达载体中，然后通过转化得到重组基因工程菌。

6.一种权利要求4所述重组基因工程菌在增加植物表皮毛长度中的应用，其特征在于所述重组基因工程菌是将SEQ ID NO.2所示核苷酸序列装载入pB7GWIWG2(I)表达载体中，然后通过转化得到重组基因工程菌。