CN108085405A - 一种用于鉴别蜡杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴别蜡杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用。所述分子标记，为蜡杨梅雌性特异的基因片段MC‑FT1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。所述引物对，包括上游引物和下游引物，核苷酸序列为：上游引物：5′‑GGATCCTGATGCGCCCAGTCC‑3′；下游引物：5′‑GAAAAGATCGATTTGATAC‑3′。利用本发明引物对进行PCR鉴定蜡杨梅性别，对蜡杨梅的幼苗鉴定，尽早排除雄株，有效降低蜡杨梅雄株对人们健康的威胁，同时能避免栽培杨梅受到蜡杨梅花粉的影响，优化栽培杨梅的生长环境，以保证其果实质量和商品价值。

Description

一种用于鉴别蜡杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用

技术领域

本发明涉及分子鉴别技术领域，特别是涉及一种用于鉴别蜡杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用。

背景技术

蜡杨梅(Myrica cerifera L.或者Morella cerifera)属于杨梅科杨梅属植物，原产于美国海滨地区，是常绿灌木或小乔木，高2-3m，为雌雄异株植物。叶片蜡质，叶被充满黄色腺孔，具有浓烈香气；雌花为葇荑花序，自3月下旬至4月上旬开放，4月上旬为盛花期，花期约30天，雄花为复葇荑花序，自3月下旬至4月下旬陆续开放，4月中旬为盛花期，花期约50天，比杨梅花期略晚；果实蓝色，外被蜡质层，直径3mm左右，冬季不落。蜡杨梅为滨海植物，喜光，具有一定的耐盐碱、耐寒、耐水湿的能力，适生于沿海地区和滩涂地，目前，蜡杨梅在浙江余姚，慈溪等地均有栽培，生长旺盛，绿化效果好。

杨梅(Myrica rubra Sieb.&Zucc.)属于杨梅科杨梅属植物，原产于我国东南各省及云贵高原，栽培历史悠久，是我国南方的特色水果，目前杨梅主栽品种分布在我国浙江，江苏、福建、江西、湖南、广东、贵州和云南等省，其中浙江省的栽培面积、产量、质地等均为最佳。杨梅果实成熟期(6月份)恰逢一年中的水果淡季，能够有效填补市场上的水果空缺期，再加上杨梅果色艳丽，风味独特，同时富含花青苷，具有较高的营养价值，深受消费者的喜爱。

杨梅喜土质疏松、排水良好、富含石砾的土层深厚的土壤，不适宜在偏盐碱的滩涂地生长。有研究证明，以蜡杨梅为砧木，荸荠、东魁、晚稻杨梅为接穗，成活率均大于90％，使得这些栽培杨梅能够充分利用土地资源，逐渐形成沿海经济林树种，将绿化与生产有机结合在一起，具有较大的经济效益。

不过，蜡杨梅为雌雄异株植物，雄株花期比较长，花粉大量产生，其花粉能不能使栽培杨梅正常结实。此外，部分人群对蜡杨梅的花粉存在过敏现象，所以在生产上引种时应尽量避免雄株的产生，减少潜在的过敏原。开发一种方法，在蜡杨梅幼期快速鉴别其雌雄，从而尽早排除雄株，有效降低蜡杨梅雄株对人们健康的威胁，同时能避免栽培杨梅受到蜡杨梅花粉的影响，优化栽培杨梅的生长环境，以保证其果实质量和商品价值。

发明内容

本发明针对现有技术中缺乏有效手段对蜡杨梅进行早期性别鉴定，提供了一种用于鉴别蜡杨梅雌雄的分子标记，以及基于该分子标记设计的一种引物对，利用该引物对能够有效地对蜡杨梅植株进行早期性别鉴定。

一种用于鉴别蜡杨梅雌雄的分子标记，为蜡杨梅雌性特异的基因MC-FT1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

引物对，包括上游引物和下游引物，核苷酸序列为：

上游引物：5′-GGATCCTGATGCGCCCAGTCC-3′；

下游引物：5′-GAAAAGATCGATTTGATAC-3′。

本发明又提供了所述引物对在鉴别蜡杨梅性别中的应用。

所述蜡杨梅为蜡杨梅幼苗。

本发明又提供了所述引物对在制备用于鉴别蜡杨梅性别的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种包含所述引物对的试剂盒。

本发明还提供了所述试剂盒在鉴别蜡杨梅性别中的应用。

本发明还提供了一种鉴别蜡杨梅性别的方法，包括以下步骤：

(1)对待检测蜡杨梅植株取样并提取基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增；

(3)PCR扩增产物进行电泳检测，

若电泳检测结果在159bp和197bp处均有特异性条带，则待检测蜡杨梅植株为雌株；

若电泳检测结果只在197bp处有特异性条带，则待检测蜡杨梅植株为雄株。

所述PCR扩增的体系为：

所述PCR扩增的条件为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸10min。

本发明通过对雌雄杨梅植株的基因组测序，发现了雌株特异性基因FT1以及与FT1基因具有较高序列同源性的雌雄植株共有的FT2基因，通过序列分析，针对保守区域设计引物，然后扩增蜡杨梅基因组获得蜡杨梅中的同源基因序列片段，其中MC-FT1为蜡杨梅雌株特异性基因片段，MC-FT2为雌雄共有基因片段，对MC-FT1和MC-FT2进行对比分析，设计获得本发明引物对MC-F，利用引物对MC-F对大量蜡杨梅雌雄植株进行检测，发现利用本发明引物对来鉴别蜡杨梅植株的性别，其预测雌株的准确性接近100％。利用本发明引物对进行PCR鉴定蜡杨梅性别，对蜡杨梅的幼苗鉴定，尽早排除雄株，有效降低蜡杨梅雄株对人们健康的威胁，同时能避免栽培杨梅受到蜡杨梅花粉的影响，优化栽培杨梅的生长环境，以保证其果实质量和商品价值

附图说明

图1为实施例6中部分植株的电泳结果图，其中，M为DL2000DNA Markers；泳道1～8为雌株个体；泳道9～16为雄株个体。

具体实施方式

实施例1

杨梅基因组DNA的提取。

用改良的CTAB法分别提取197份(雄株100份，雌株97份)杨梅品种的基因组DNA，具体方法如下：

1、配制缓冲液

CTAB缓冲液：2％CTAB，0.1M Tris，20mM EDTA，1.4M NaCl，pH 8.0；

DNA溶解缓冲液TE：10mM Tris；1mM EDTA；pH 8.0。

2、提取杨梅基因组DNA

①用天平迅速称取约1.0g贮藏于-80℃冰箱中的杨梅幼嫩叶片组织，加少许PVP防止氧化，用液氮于研钵中充分研磨后将粉末快速转入盛有在65℃预热的4mL CTAB溶液与80μLβ-巯基乙醇的10mL离心管中，65℃水浴1h；

②将步骤①混合物中加入4mL氯仿/异戊醇(24∶1)，涡旋混匀，12000rpm离心10min，取上清液于新10mL管中，再次加入4mL氯仿/异戊醇(24∶1)，涡旋混匀，12000rpm离心10min；

③将步骤②离心后所得的上清液转入新10mL管，并加入等体积-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀，在-20℃放置30min至DNA沉淀。10000rpm离心2min，去上清液；

④用75％的乙醇清洗步骤③DNA沉淀物3次；

⑤将步骤④洗涤后的DNA晾干并溶于200μL的TE缓冲液中，加入2μL RNA酶(10mg/mL)以除去RNA；DNA检测采用紫外分光光度计(Beckman coulter，USA)，确定其浓度和质量，同时取1μL用TE缓冲液稀释5倍后在1.0％的琼脂糖凝胶上检测。DNA原液保存于-20℃，工作液稀释为30ng/μL备用。

实施例2

根据杨梅基因组参考序列，测序分析雌、雄各100个混池，发现雌性特异的基因组区段，2号染色体(chr2)上具有一个与开花相关的功能基因FT1(SEQ ID No.1)，与此序列80％同源的基因序列FT2(SEQ ID No.2)在雌雄中都存在。根据两者序列比较，针对保守区域设计PCR引物Mr-F2，委托杭州金百奥生物科技有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1

实施例3

蜡杨梅基因组DNA的提取。

用Plant Mini Kit(Qiagen，德国)试剂盒分别提取97份(雄株49份，雌株48份)蜡杨梅品种的基因组DNA，具体方法如下：

a)称取0.1g鲜样或者0.02g冷冻干燥叶片，在液氮中快速研磨，置于2mL灭菌的离心管中；

b)加400μL Buffer AP1缓冲液和4μL RNaseA到上述离心管中，涡旋混匀，65℃水浴10min，并且在水浴过程中上下颠倒2-3次；

c)加130μL Buffer P3缓冲液到混合液中混匀，冰浴5min；

d)15-25℃，14000rpm离心5min；

e)吸取上清到QIAshredder离心柱(置于2mL回收管中)中，15-25℃，14000rpm离心2min；

f)转移回收管中的液体到2mL新管中(如果有颗粒，请不要振荡以免进入新的离心管中)，加1.5倍的Buffer AW1缓冲液并吸打混匀；

g)吸取650μL混合液加到置于2mL回收管中的DNeasy Mini离心柱中，15-25℃，8000rpm离心1min，倒掉回收管中的液体

h)将步骤f的剩余混合液重复步骤g；

i)将DNeasy Mini离心柱置于新的2mL回收管中，加500μL Buffer AW2缓冲液，15-25℃，8000rpm离心1min，弃管中液体，留回收管；

j)加500μL Buffer AW2缓冲液到DNeasy Mini离心柱，15-25℃，14000rpm，2min(注：小心将离心柱拿出，以免接触弃液)并弃回收管；

k)将DNeasy Mini离心柱放入2mL离心管中，加100μL Buffer AE缓冲液洗脱，室温放置5min后(15-25℃)，8000rpm离心1min；

l)洗脱产物倒回离心柱中重复洗脱一次。

蜡杨梅基因组DNA提取后，采用微量分光光度计(Biodrop，UK)确定其浓度；取1μL用Buffer AE稀释5倍后在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，DNA原液保存于-20℃，工作液稀释为30ng/μL备用。

实施例4

蜡杨梅基因组中与杨梅FT1基因同源的确定。

(1)以蜡杨梅基因组DNA为模板，以实施例2中Mr-F2引物进行PCR扩增，扩增产物电泳检测后，经过TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit(TaKaRa，Japan)纯化回收试剂盒进行凝胶回收；

(2)将回收产物利用Simple Cloning Kit(Transgen，China)试剂盒进行连接、转化；

(3)将菌液均匀涂在含有IPTG、X-gal、氨苄的LB培养基上，37℃培养箱中过夜培养；

(4)在LB培养基上筛选出大小均匀的6-8个白色单克隆菌斑，经过菌液PCR扩增筛选出阳性克隆，过夜摇菌后，取1.0mL送上海华津生物科技有限公司测序；

(5)利用DNAMAN软件对测序结果分析，发现蜡杨梅雌雄植株存在差异区域。

蜡杨梅雌性特异序列MC-FT1(SEQ ID No.3)，长度为371bp；和雌雄共有的序列MC-FT2(SEQ ID No.4)，长度为413bp。

比对MC-FT1序列和MC-FT2序列，跨区域重新设计引物MC-F，由杭州金百奥生物科技有限公司合成，引物信息如表2所示。

表2

实施例5

PCR扩增。

①反应体系：

②反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸10min。

③产物在2.0％琼脂糖凝胶上电泳检测，紫外灯下观察并照相记录结果。

实施例6

以实施例3中提取的基因组DNA为模板，利用实施例4中设计的引物(MC-F)，按照实施例5中的PCR扩增方法进行扩增检测。部分植株的电泳结果如图1所示。

100份(雄株49份，雌株51份)蜡杨梅群体检测结果如表3所示。结果显示：用MC-F引物扩增，雌株基因型为159/197bp(159bp片段序列如SEQ ID No.5所示，197bp片段序列如SEQ ID No.6所示)，雄株基因型为197bp，将97份蜡杨梅植株的性别与扩增基因型相对应，结果除一株雌株样本未获得扩增产物外，其余均正确，利用MC-F引物预测蜡杨梅植株雌性的准确率100％。

表3

注：片段大小：bp；♀-雌；-雄。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种用于鉴别蜡杨梅雌雄的分子标记、引物对及其应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2635

<212> DNA

<213> 杨梅（Myrica rubra Sieb. & Zucc.）

<400> 1

atggccaggg aaagggacac tctcgctgtt gggcgtgtta taggagatgt gctggacccc 60

tttacaaggt ccattgctct gagggcaatt tataacagta gggaggttaa caacggttgt 120

gagctcaaac cctctcaggt tgtcaaccaa cctagggttg atgttggtgg tgaagatcta 180

aggacgttct atactctggt aaatgtatct tacctctttt ttcctttgct aagcgtcttt 240

ctcttcaact agcttttccc tcaagttgac caccattttt ctcatgagca tttttggttc 300

ttgatatttg acttatgatc atgtccactg cagcttatgg tggatcctga tgcgcccagt 360

ccaagtgatc ccaacctcag ggagtacttg cattggtgag cactctctct ctcattccac 420

aaatacacaa gcacattgca aaggtatcaa atcgatcttt tctctgccct cgatcgtctc 480

tgcgacataa atgcgtagac atccgtttct gactctctat ttgacttccc tcccttcata 540

aaaggactgg taggcggtat agtaatcagg attccatcaa aagctggtta gaagggctca 600

gcattttaaa aaataaatct aatgattgat cccaagtcaa acaaaaaact ctctttattt 660

catctcatta aataaatgaa atggttaaat tcaggccctt ggatttattt tttaaaatct 720

tgacccctcc ttgcaataac ttagaacaaa tgtccttatg atggaaccct ttggcatata 780

ggttggccaa aagaagagag agagaggaaa aagtgatgag aaccggaata ttcttgtttc 840

aattgttcag cctcttttcg ggaaagtagt tcatgcatct tacagaagaa agcaatccaa 900

aataggtagc tgtcgagggc gggatggcgg cggagccaga cattaatatt tgagaaacct 960

ctcgcaatgt actaattgtt taatacgttt aaaaattatg gttaattagt agatttattg 1020

accaacagga tcgatcgaaa gcctaagggg aagcaaaagg acaaggaaga agagttcccc 1080

ctgttgtgat ttttagataa gatacttttt ttcctttaag aagtttttga gcaaaagaaa 1140

aattagattt taaaaaaatt tcttgatttt taagaaaaat ctatacatat atttctatgt 1200

acctatgttg tccttttatt ttattttaat aatcaccaga aagcccaagt actggttttt 1260

tgtgtgaaat tgacaaatat ctttgtcctt ttgttttgct tcctggttga ccgattgagg 1320

gcacgtatga tctctcatgg aaagaaatca tttggaggac cactactaaa gtatctcagg 1380

atatataaag tttctgggat atgcaatgga accgtacatg catgtacgta ccaattacca 1440

tgatacagcc aacaatattg tcatcgtgct ttactcctat attctctccc aggctgtcct 1500

tttccttgtt tctttctctt tgcagttttg tctcctttct ttctcttata cgtacgcacg 1560

tacgtaattc ttcttattcc attgggtagt gatagactct ggaacgtcgc atgttgaata 1620

tttccacatc tgatgacttg tatagtagtg ttgatcgact accatgacaa aggctatcaa 1680

ctctccttaa tatattagag tgatttggca gccagttaat tattgtccgc tgtttaaatc 1740

tgccattgct aatgtaaata ttgcatttaa caaactaatt aattaagaaa ctgtctttaa 1800

gaggacttca agtgataatt tagttgccaa attactgaga agtactctct cgttctttgt 1860

agctattcta tcactattat tatttcttct tggcctttct taactcttgc gataattgtt 1920

aactttttgt catatattta tatatagtga tcaatgatta accgttacca aggcatcggg 1980

tgctattatt gtaacctttc tactttagtt tcatttgaag gtccatttgt cgtagttatg 2040

attttatatt ttgtctagga gaaatttgat attatccgta actgttactt ctactaagtt 2100

tttcaaaatt aagattaatt tgtcgtctcc ctctggtttg ttaggttggt gactgatatt 2160

ccagaaacta cgggggcaag ctttggtgag tatactacac atgcacatgt ggtttagtaa 2220

attatcaaga gttaaagaca cctctcttga gacatgcaaa gcactgtcgt acggcaaaca 2280

atgcttgtat ggctttgtga gaaggccaag catttgtagg gatagtttga tctagcagta 2340

ctattattgt ttgtatcttc atgagtaaca tgtatatatg atctatggcc aaattttttt 2400

gggcgtaggg caagaggttg tgtgctacga aagtccacga ccagtggtag ggatccatcg 2460

gtttgttttc gtgttgttcc gtcaactggg taggcagaca gtatatgcac cagggtggcg 2520

ccaaaatttc aacaccagag acttcgctga gcaatacaat ctcggattgc cagtggctgc 2580

actttacttt aactgccaga gggaaagcgg ctgtggtgga aggagaagat tgtga 2635

<210> 2

<211> 2620

<212> DNA

<213> 杨梅（Myrica rubra Sieb. & Zucc.）

<400> 2

atggctaggg aaagggaccc tctcactgtt gggcgtgtta taggagatgt gttggacccc 60

tttacgagat ccatcgctat gagggcaatt tataacagta gggaggttaa caacggttgt 120

gagctcaaac cctctcaggt tgtcaaccaa cctagggttg atattggtgg tgaagatctc 180

aggacgttct atactctggt aaatgtatct taccctcttt cttcctttgc cgtgcgtctt 240

tctcttcagc tagctcttcc ctcaagttga ccacctttct tttttctcat gagctttttt 300

ggttcttgat attttactta tgatcatgtc cactgcagct tatggtggat cctgatgcgc 360

ccagtccaag tgatcccagc ctcagggagt acttgcattg gtgagctctc tctctctctc 420

tctctcccca aaatacacaa gccctttgca aaggtactat atatatatag atatattttt 480

cttgtaaaga tgggggaaca tatatttttt cttcttgtaa agatgggaac atatatagta 540

tcaaatcgat cttttctctg ccctcgatcg tctctgcaat ataattccat atacatctgt 600

ttctgactct ctatttgaca tccctagctc cctccataaa acgactggta ggcggtatat 660

aggtcggcca aaaaaaaaaa cagagagagc aagaagagag aagaaccaga atattcttgt 720

ttcagtcgtt cagcctcttt ccgggaaagt agttcatctt ggagcatcaa taatcagcag 780

aaagcaatcc aaaataggta gctgttgagg acgtacggga tggcggcgga tccagaaatt 840

aatatttgag aaacctcgta atatactaat tatttatata cgtttttata gaatatatat 900

ttcttgatct ctcctatatg tatatataac gatagaaaaa ggtagggata taattcaaaa 960

tttaaaaatt atcgatgata tatagattta ttgaccaaca ggatcgatcg aaagcctaag 1020

gggaagcaaa aggacaagga agaagaaatc cccctattgt gattttcaga taagatactt 1080

tttgtttcct tttagaagtt tttgagcaaa agaaaaattg gattttcaaa atatttcttg 1140

atttttaaca aaaatctata catattatat atttctatgt atttatcagc ttgtcctttt 1200

gttttatttt aataattacc agaaagccca agtgctgttt tttcgtgtga aattgacaaa 1260

tatctcttgt ccttttgttt tgcttcctgc ctgatcgatt gagggcacgt atctctcatg 1320

gatgtgaaat tattggagga ccactactaa agtatctttc gatttataag gtttctggga 1380

tatgcatgca tatacgtacc atgataaagc caacaatatt gtcatcgtac gtgctttact 1440

cctatcttct ctccccgtcc ttttccttgt ttgatctttc tccttgaagt tttgtctcct 1500

ttctttctct tatattaata cgtacgcgcg tacgtaattc tccttattct tttttttttc 1560

ttcttgaaaa ttattctcct ttttccattg ggtagtgata gactctggaa cgcatataga 1620

atatttcccc atctaaggac ttgcatatat agtgttaatc gactaccatg ataagggcta 1680

tcaactctct ccttaatata ttagagtgat ttggcagcca gttaaatatt attgcccgct 1740

gtttaaatct agctagctac catgcattgc taatattgta aatatatatt gcatttaaca 1800

aactaagaaa ccatttttaa aaggacttca agtgataaac tattattttc ttcttggcct 1860

ttcttaactc ttacgataac tttttaactt ttgaattata tttatacttt tttgtggtat 1920

tgtcatacat acatatatat atatatatat ataaccgtca ctaaggtgtc aggatttatt 1980

attgtaaact ttctaattta gttttatttg aaggtgcata tgccgtagtt atgattattt 2040

tgtccagtta ggagaaattt gagattattc gtaacagttc tatacaaagt ttttcaaaac 2100

taaaattaat tccctctggt taatttgtca ggttggtgac tgatattcca gcaactacgg 2160

ggacaagctt tggtgagtat tatactatac atgcatgcac atgtggttta ttaaattatc 2220

aagagttaaa gacacctctc ttgagacatg gaaagcaatg tcgtacggga aacaatgctt 2280

gcatggcttt gtgagaatta ggccaagcat ttgtagggat agtttgatta gcactattat 2340

tgttggtatc cttgattgac atatgatgta ttggccaaat tcaatgggtg taggacaaga 2400

ggtggtgtgc tacgaaagtc cacgaccagt ggtagggatc catcggtttg ttttcgtgtt 2460

gttccgtcaa atgggtaggc agacagtata tgcaccgggg tggcgccaga atttcaacac 2520

caaggacttc gctgagctct acaatctcgg attgccagtg gctgcacatt acttcaactg 2580

ccagagggaa agcggttccg gtggaaggag aagatcgtga 2620

<210> 3

<211> 371

<212> DNA

<213> 蜡杨梅（Myrica cerifera L.）

<400> 3

cctctcaggt tgtcaaccaa cctagggttg atattggtgg tgaagatctc agaacgttct 60

atactctggt aaatgtatct tacctctttc ttccttggct atgtgtctct cttcagctag 120

ctcttccctc aagttgacca ccttcatttt tctcatgagc ttttttggtt cttgatattt 180

gacttatgat catgtccact gcagcttatg gtggatcctg atgcgcccag tccaagtgat 240

cccaacctca gggagtactt gcattggtga gcactctctc tctctctttc cacaaataca 300

caagcacatt gcaaaggtac atatttagac actaaagtgg aaattacata tagtatcaaa 360

tcgatctttt c 371

<210> 4

<211> 413

<212> DNA

<213> 蜡杨梅（Myrica cerifera L.）

<400> 4

cctctcaggt tgtcaaccaa cctagggttg atattggtgg tgaagatctc aggacgttct 60

atactctggt aaatgtatct taccctcttt cttcctttgc cgtgcgtctt tctcttcagc 120

tagctcttcc ctcaagttga ccacctttct tttttctcat gagctttttt ggttcttgat 180

attttactta tgatcatgtc cactgcagct tatggtggat cctgatgcgc ccagtccaag 240

tgatcccaac ctcagggagt acttgcattg gtgagctctc tctctctctc tccccaaaat 300

acacaagccc tttgcaaagg cactatattt tttttttctt ataaagatgg gggaacatat 360

attttttctt cttgtaaaga tgggaacatt tatagtatca aatcgatctt ttc 413

<210> 5

<211> 159

<212> DNA

<213> 蜡杨梅（Myrica cerifera L.）

<400> 5

ggatcctgat gcgcccagtc caagtgatcc caacctcagg gagtacttgc attggtgagc 60

actctctctc tctctttcca caaatacaca agcacattgc aaaggtacat atttagacac 120

taaagtggaa attacatata gtatcaaatc gatcttttc 159

<210> 6

<211> 197

<212> DNA

<213> 蜡杨梅（Myrica cerifera L.）

<400> 6

ggatcctgat gcgcccagtc caagtgatcc caacctcagg gagtacttgc attggtgagc 60

tctctctctc tctctcccca aaatacacaa gccctttgca aaggcactat attttttttt 120

tcttataaag atgggggaac atatattttt tcttcttgta aagatgggaa catttatagt 180

atcaaatcga tcttttc 197

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctctcaggt tgtcaaccaa 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaaaagatcg atttgatac 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggatcctgat gcgcccagtc c 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gaaaagatcg atttgatac 19

Claims (10)

1.一种用于鉴别蜡杨梅雌雄的分子标记，为蜡杨梅雌性特异的基因片段MC-FT1，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.引物对，包括上游引物和下游引物，其特征在于，核苷酸序列为：

上游引物：5′-GGATCCTGATGCGCCCAGTCC-3′；

下游引物：5′-GAAAAGATCGATTTGATAC-3′。

3.如权利要求2所述引物对在鉴别蜡杨梅性别中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述蜡杨梅为蜡杨梅幼苗。

5.如权利要求2所述引物对在制备用于鉴别蜡杨梅性别的试剂盒中的应用。

6.一种包含如权利要求2所述引物对的试剂盒。

7.如权利要求6所述试剂盒在鉴别蜡杨梅性别中的应用。

8.一种鉴别蜡杨梅性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对待检测蜡杨梅植株取样并提取基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物对进行PCR扩增；

(3)PCR扩增产物进行电泳检测，

若电泳检测结果在159bp和197bp处均有特异性条带，则待检测蜡杨梅植株为雌株；

若电泳检测结果只在197bp处有特异性条带，则待检测蜡杨梅植株为雄株。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为：

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：

94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃延伸10min。