CN105441444A - 杨梅est-ssr分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供杨梅EST-SSR分子标记，是4个具有多态性的EST-SSR分子标记，其序列如SEQ？ID？NO：1-8所示。根据杨梅转录组序列信息，选择其中以三碱基为重复基元的SSR位点，采用Primer5.0设计EST-SSR引物。进行PCR扩增后，测量产物的片段大小，得到引物的多态性信息。本发明筛选出的4个多态性高的EST-SSR分子标记，能有效地对24个杨梅品种进行区分，这些分子标记可用于杨梅的品种鉴定、遗传多样性分析以及分子辅助选育等领域。

Description

杨梅EST-SSR分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记技术，具体涉及杨梅品种4个EST-SSR分子标记技术及其应用。
背景技术
杨梅(Morellarubra)是我国南方特色水果，其果实色泽鲜艳、风味独特，且具有丰富的营养价值，深受消费者喜爱。
分子标记在种质资源多样性研究和分子辅助育种中有着广泛的应用。其中简单重复序列(Simplesequencerepeat，SSR)广泛存在于真核生物的基因组中，数量众多，重复性高，是最常用的分子标记之一。SSR可从表达序列标签(Expresssequencetag，EST)库或转录组测序数据中挖掘，称之为EST-SSR。与基因组SSR相比，EST-SSR开发相对较易，但其多态性相对较低。筛选高多态性的EST-SSR分子标记对于遗传研究与育种实践均具有重要的价值。
杨梅具有丰富的种质资源，但遗传多样性研究和育种工作受到分子标记不足的限制。近年来，Terakawa等(2006)、张水明等(2009)、谢让金等(2011)、谢小波等(2011)、焦云等(2012)、张绍阳等(2012)以及贾慧敏等(2014)先后开发了一些杨梅SSR或EST-SSR分子标记，为杨梅种质资源研究奠定了良好的基础。但是现有的杨梅EST-SSR分子标记数量还不足以满足种质资源遗传多样性系统分析和遗传图谱构建的需要，更多的具高多态性的EST-SSR标记有待开发。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供4个新的杨梅EST-SSR标记。为了解决技术问题，增加杨梅分子标记的数量应用到今后的杨梅资源多样性分析和品种鉴别等工作中。本发明提供了4个杨梅EST-SSR分子标记，所述杨梅EST-SSR标记分别是四组引物对，其序列依次如SEQIDNO:1至SEQIDNO:8所示。
本发明提供的4个杨梅分子标记，其特征如表1所示。
表1杨梅EST-SSR标记特征(SEQIDNO:1-8)
本发明的4个杨梅EST-SSR标记是通过以下方法得到的：
(1)利用先前研究获得的杨梅EST序列和MISA软件设计引物，引物设计的原则为：PCR产物长度100-350bp；GC含量40％-70％，最适为50％；退火温度50-65℃；引物长度18-22bp；避免出现引物二聚体。在设计好的正向引物的5’端统一加18个bp的尾巴(M13-TGTAAAACGACGGCCAGT)，另合成加了FAM和HEX两种不同荧光基团标识的M13尾巴引物，引物委托上海生工生物工程有限公司合成；
(2)用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyltrimethylammoniumbromide)法提取杨梅品种基因组DNA；
(3)采用SSR分子标记方法进行杨梅分子标记的筛选：以‘荸荠’杨梅的基因组DNA为模板进行PCR扩增：在20μl反应体系中分别加入10×ExTaqBuffer(含Mg2+)，1.6μl的2.5mMdNTP，5units/μlExTaqDNApolymerase0.1μl，正向引物4pmol，反向引物5pmol，M13通用荧光引物1pmol，10ng/μlDNA模板1μl，ddH2O补充体系至20μl。使用EppendorfMastercycler进行DNA扩增，具体步骤为：94℃预变性5min,，然后94℃(30s)/60℃(30s)/72℃(30s)循环20次，之后94℃(30s)/55℃(30s)/72℃(30s)循环12次，最后72℃延伸15min。产物检测：在含有0.5％μg/μlEB的3％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察并照相记录结果；
(4)将初步筛选的有扩增产物的引物在另外23个杨梅品种上进行扩增，于ABI遗传分析仪上进行分析，并使用PowerMarkerV3.25,Tree32和GenALE×6.501读取数据并分析结果。
本发明的另一个目的是提供所述的4个杨梅EST-SSR分子标记在杨梅种质资源遗传多样性分析以及品种鉴别中的应用。
本发明通过RNA-Seq得到杨梅EST序列，用MISA软件寻找SSR位点，合成了17对引物，并对24个杨梅栽培品种开展PCR扩增、测序和片段长度分析，获得4个未被报道的具有高多态性的EST-SSR标记。本发明的有益之处是：(1)本发明的4个分子标记在24个杨梅品种中有多态性，在24个杨梅品种中进行遗传多样性分析与杨梅植物分类常识相吻合(图1)，是稳定存在的新标记，可以直接将本发明所提供的4个引物对应用于更多杨梅材料上，进行种质资源和遗传多样性分析。(2)本发明的4个分子标记均来自杨梅EST序列，可应用于杨梅的品种鉴定、遗传多样性分析以及分子辅助选育等工作。
附图说明
图1为基于4个EST-SSR标记构建的24份杨梅种质资源遗传相似系数的UPGMA聚类图。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1：CTAB法提取基因组DNA.
(1)配制CTAB缓冲液(十六烷基三乙基溴化铵，Hexadecyltrimethylammoniumbromide)的配方为：2％CTAB，0.1MTris，20mMEDTA，1.4MNaCl，pH值8.0.TE缓冲液(10mMTris,1mMEDTA,pH8.0)。
(2)采杨梅幼嫩叶片，杨梅品种信息如图1所示。
(3)放入液氮中充分研磨至粉末状，称取0.7g左右转入盛有4mlCTAB溶液与80μlβ-巯基乙醇(65℃预热)的10ml离心管中，65℃水浴1h；加入4ml氯仿/异戊醇(24:1,v/v)，混匀，12000rpm离心10min，取上清液并再次加入4ml氯仿/异戊醇(24:1,v/v)，混匀，12000rpm离心10min。吸取上清液，加入2ml5MNaCl，4ml异丙醇(-20℃预冷)，混匀，放入-20℃2h。12000rpm离心15min，弃上清，沉淀用75％乙醇漂洗2次，晾干。加入100μl含10μg/mlRNaseA的TE缓冲液溶解沉淀，37℃水浴1h以降解RNA。用分光光度计法检测DNA浓度，用电泳法检测质量，保存于-20℃。
实施例2：设计EST-SSR引物
本发明通过RNA-Seq得到杨梅EST序列并开发EST-SSR引物。引物设计软件为：NCBIPrimer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHomeAd)。引物设计的具体条件为：PCR产物长度100-350bp；引物长度18-25bp；避免出现引物二聚体。引物合成中在正向引物的5’端加上18bp的M13-tail(序列为TGTAAAACGACGGCCAGT)。共开发了17对EST-SSR引物，序列如表2所示。
表2杨梅EST-SSR标记特征
实施例3：有多态性引物筛选
用实施例1中抽提的杨梅叶片DNA为模板，用实施例2中设计的17对引物进行扩增。
1、PCR反应体系：10×ExTaqBuffer(含Mg2+)，1.6μl的2.5mMdNTP，5units/μlExTaqDNApolymerase0.1μl，正向引物2pmol，反向引物8pmol，M13通用荧光引物6pmol，10ng/μlDNA模板1μl，ddH2O补充体系至20μl。
2、利用EppendorfMastercycler(EppendorfScientific,Inc.)PCR仪扩增。反应程序为：94℃预变性5min,，然后94℃(30s)/60℃(30s)/72℃(30s)循环20次，之后94℃(30s)/55℃(30s)/72℃(30s)循环12次，最后72℃延伸15min。
3、电泳检测：取5μlPCR产物加入1μl6×loadingbuffer，在浓度为1％的琼脂糖凝胶上检测，并拍照记录。
4、STR片段长度分析：将上述电泳检测中条带长度在合理范围内的PCR产物进行STR片段长度分析，得到不同杨梅品种的SSR位点的具体长度，收集4个引物多态性信息。并用POWERMARKER软件和MEGA软件构建UPGMA聚类图。

Claims (5)

1.一种杨梅EST-SSR标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。
2.一种杨梅EST-SSR标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。
3.一种杨梅EST-SSR标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。
4.一种杨梅EST-SSR标记，其特征在于，该标记是一组引物对，其序列如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。
5.根据权利要求1-4任一所述的杨梅EST-SSR标记在杨梅植物种质资源遗传多样性分析以及品种鉴定和分子辅助育种中的应用。
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