CN113621734A - 快速鉴定杨梅超大果型性状的分子标记引物组合及其应用 - Google Patents

快速鉴定杨梅超大果型性状的分子标记引物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组可以快速鉴定杨梅超大果型性状的分子标记引物组合及其应用，以期应用于杨梅果实大小形态性状早期辅助选择。本发明提供一组可以快速鉴定杨梅果实超大果型性状的分子标记引物组合，为BS16‑25856，适用于荧光定量PCR仪等高通量分型检测平台，扩增片段较短，省时且灵敏度高。本发明基于开发的分子标记引物组合提供用于辅助筛选优良杨梅种质资源的方法，在杨梅果实形态性状表型预测及杂交育种工作上有重要的指导意义，具有操作简单、高效快速和成本低等优点。

Description

快速鉴定杨梅超大果型性状的分子标记引物组合及其应用
技术领域
本发明涉及一组快速鉴定杨梅超大果型性状的分子标记引物组合及其应用，属于分子生物学领域。
背景技术
现代农业的快速发展使得人们消费方式向优质化、多样化、多元化的转变，对杨梅的果型大小、内在品质等提出了越来越高的要求。因此，应确立以大果型、优质、稳产、耐贮运性强等为当前杨梅育种的主要目标之一。
杨梅(Myrica rubra Sieb.and Zucc.)是原产我国，属于江南八大珍果之一。其果实富含花色苷，具有较高的营养价值，鲜食与加工兼宜。根据杨梅果实大小形态主要可分为小、中、大和超大等类型。其中，仙居东魁杨梅，号称梅中之王，它比普通杨梅大两三倍，属于超大果型，以果大、色艳、味美享誉天下。2020年的仙居杨梅王单果重达54克，受央视热捧，精品杨梅售价为100元/斤。因此，选育出品质优、丰产稳产的杨梅超大果型优良品种，可以提高杨梅栽培的综合效益，满足市场需求，为杨梅产业的可持续发展提供品种支撑。
然而，由于杨梅童期长(实生繁殖定植后8年以上)，其果实大小形态尚未可知且无其他特征可以明示其成年阶段的果实大小形态类型，严重滞后杨梅果型定向育种进程。有鉴于此，现代分子育种是利用与目标性状基因紧密连锁的分子标记进行间接选择，是对目标性状在分子水平的选择，不受栽培技术、土壤条件及环境气候影响，选择结果稳定可靠，可有效地加速育种进程。基于上述理论，利用与杨梅果实大小形态相关的分子标记完全有可能在短时间内对杨梅育种材料的果实大小形态进行早期鉴定。本课题组前期已收集国内主栽杨梅品种及优株达100余份，并开展了基因组重测序与关联分析，最终获得了与杨梅果实大小形态关联的特异位点，通过该位点进行超大果型早期鉴定，其准确性较为可靠。
发明内容
本发明的目的是提供一组可用于快速鉴定杨梅超大果型性状的分子标记引物组合。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一组快速鉴定杨梅超大果型性状的分子标记引物组合，包括BS16-25856-F和BS16-25856-R，具体序列为：
BS16-25856-F：5’-GTATGAAATTGTATATGGACAATTATG-3’，
BS16-25856-R：5’-CCTACATCCACTGTTGCCACTTTTGTC-3’。
本发明还公开了上述的分子标记引物组合在快速鉴定杨梅果实大小形态性状中的应用。
应用的步骤包括：
(1)引物合成：合成权利要求1所述的引物组合BS16-25856-F及BS16-25856-R；
(2)DNA的提取：提取杨梅叶片的基因组DNA；
(3)PCR扩增：基于上述杨梅叶片基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物BS16-25856-F和BS16-25856-R进行PCR扩增，预先加入至少一个已确定杨梅果实大小形态类型为超大果型的样本DNA作为内参；
(4)扩增产物检测与分析：对PCR产物进行基因型检测分析，若有PCR扩增产物出现且与内参样本聚集为一组者即可视为同一果型大小形态类型，即为超大果型杨梅；若没有任何PCR扩增产物出现者视为其他果型。
其详细步骤为：
(1)引物合成：委托生物技术公司合成引物BS16-25856；
(2)DNA的提取：
A、用液氮研磨0.2g左右的杨梅幼叶成粉末状置于2mL离心管中；
B、使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(EZ-10Spin Column Plant GenomicDNA Purification Kit，上海生工生物工程股份有限公司)提取上述样品基因组DNA，具体操作步骤按照其说明书进行；
C、取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，将DNA原液稀释成浓度为20ng/μl的工作液备后续使用；
(3)PCR扩增反应体系为：样品基因组DNA模板1.0μL(20ng/μL)，2×SG Fast qPCRMaster Mix(Low Rox，上海生工生物工程股份有限公司)5μL，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，ddH2O补足至10μL即可。
(4)PCR扩增产物检测与分析：PCR扩增为两步法程序，即95℃3min，(95℃3s，60℃30s)32个循环；待PCR反应结束后可直接由ABI Q6 Flex实时荧光定量PCR系统平台Genotyping功能模块自动分析结果(Allelic Discrimination Plot)便可知样本果实大小形态性状，无需其他流程；其中，若有PCR扩增产物出现(加入1个已确定为“超大果型”的杨梅种质样本作为内参)且与内参样本聚集为一组者即可视为同一果型性状，即为超大果型；此外，若没有任何PCR扩增产物出现者视为其他果实形态类型。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明中分子标记引物基于杨梅基因组DNA开发设计而成，适用于直接使用DNA模板进行分型检测，其操作技术环节较为简单，同时，该位点经过杨梅自然群体验证，灵敏度和准确度较高，稳定性强，不易受到环境条件影响；再者，该分子标记BS16-25856扩增产物片段仅为82bp，PCR反应耗时短，尤其适用于荧光定量PCR仪等高通量分型检测平台，所需样品基因组DNA模板量仅需20ng即可获得分型检测结果。此外，本发明中从提取杨梅叶片样本DNA开始直至获得最终鉴定结果，仅需1.5小时；并且从PCR扩增到最终分型结果数据的获取为全程闭管操作，无需再进行后续凝胶电泳检测，实现零污染，具有快速、高通量和高灵敏度及准确性高的特点。
附图说明
图1为杨梅果实大小形状分类图(左起分别为小果型、中果型和超大果型)。
图2为杨梅种质资源DNA样本的BS16-25856引物在荧光定量PCR仪平台上的分型效果图。
具体实施方式
下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
实施例1
一组鉴定杨梅超大果型性状的分子标记引物组合及其应用，其详细步骤为：
(1)引物合成：按照表1中序列信息，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物BS16-25856；
表1：BS16-25856引物序列信息
Figure BDA0003260895280000031
(2)待测杨梅种质资源样品叶片DNA的提取：
A、用液氮研磨0.2g左右的杨梅幼叶成粉末状置于2mL离心管中；
B、使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(EZ-10Spin Column Plant GenomicDNA Purification Kit，上海生工生物工程股份有限公司)提取上述样品基因组DNA，具体操作步骤按照其说明书进行；
C、取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，将DNA原液稀释成浓度为20ng/μl的工作液备后续使用；
(3)PCR扩增反应体系为：样品基因组DNA模板1.0μL(20ng/μL)，2×SG Fast qPCRMaster Mix(Low Rox，上海生工生物工程股份有限公司)5μL，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，ddH2O补足至10μL即可。
(4)PCR扩增产物检测与分析：PCR扩增为两步法程序，即95℃3min，(95℃3s，60℃30s)28个循环；待PCR反应结束后可直接由ABI Q6 Flex实时荧光定量PCR系统平台Genotyping功能模块自动分析结果(Allelic Discrimination Plot)便可知样本果实是否为超大果型性状，无需其他流程；其中，若有PCR扩增产物出现(预先加入1个已确定为超大果型的杨梅种质样本DNA作为内参)且与内参样本聚集为一组者即可视为同一果型类型，即为超大果型者，呈现为阳性，以“+”标记；若没有任何PCR扩增产物出现或者为其他基因型者均视为其他果型，为阴性，以“-”标记。最后，使用表格记录所有杨梅种质样品果实大小形态鉴定结果(表2)，后续经过结果期观察确定其真实果实大小形态性状，仅有3份杨梅种质果型大小形态鉴定错误，因此，最终的杨梅果实大小形态性状鉴定准确率约96.8％，具体分型效果见图1。同时，也可以将上述引物制成试剂盒或生物制剂，用于杨梅果实大小形态的早期辅助鉴定。
其中杨梅果型大小分类可参考NY/T 2761-2015。
本实例中荧光定量平台96孔加热模块可根据需要进行更换为384孔以及流体芯片等，以满足更高通量分型检测需求。
表2本发明实例中所用到的96份杨梅种质资源果实大小形态性状鉴定结果
Figure BDA0003260895280000041
Figure BDA0003260895280000051
Figure BDA0003260895280000061
注：*分型结果图中与“超大果型”杨梅果实形态内参样品聚为一类者用“+”，其余样品均用“-”表示。

Claims (5)

1.一组快速鉴定杨梅超大果型性状的分子标记引物组合，其特征在于所述引物组合包括BS16-25856-F和BS16-25856-R，具体序列为：
BS16-25856-F：5’-GTATGAAATTGTATATGGACAATTATG-3’，
BS16-25856-R：5’-CCTACATCCACTGTTGCCACTTTTGTC-3’。
2.权利要求1所述的分子标记引物组合在快速鉴定杨梅是否为超大果型性状上的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于其步骤包括：
(1)引物合成：合成权利要求1所述的引物组合BS16-25856-F及BS16-25856-R；
(2)DNA的提取：提取待测杨梅样本中的基因组DNA；
(3)PCR扩增：以上述杨梅基因组DNA作为模板，使用引物BS16-25856-F及BS16-25856-R进行PCR扩增，预先加入至少一个已确定杨梅果型大小性状为超大果型的样本基因组DNA作为内参；
(4)扩增产物检测与分析：使用荧光定量PCR仪进行基因型检测分析，若有PCR扩增产物出现且与内参样本聚集为一组者即可视为同一果型大小性状类型，即为超大果型；若没有任何PCR扩增产物出现者视为其他类型。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述内参样本为超大果样本，有PCR扩增产物出现且与内参样本聚集为一组者即可视为超大果性状类型，若没有任何PCR扩增产物出现者视为其他果实性状类型。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述步骤(3)中PCR扩增的体系为：20ng/μL的样本基因组DNA模板1.0μL，2×SG Fast qPCR Master Mix 5μL，10μM的BS16-25856-F引物0.5μL，10μM的BS16-25856-R引物0.5μL，ddH2O补足至10μL；扩增PCR程序如下：95℃3min，然后运行32个循环反应，每个循环为95℃ 3s，60℃ 30s。
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