CN113293227A - 鉴定杨梅果实颜色性状的snp分子标记引物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组鉴定杨梅果实颜色性状的SNP分子标记引物及其应用，以期应用于杨梅果实颜色性状分子标记辅助选择。本发明提供一组可以快速鉴定杨梅果实颜色性状的分子标记引物，所述引物包括C2‑2021‑51‑F和C2‑2021‑51‑R，适用于荧光定量PCR仪等高通量分型检测平台，灵敏度高，可用于杨梅果实颜色性状的早期快速鉴定。本发明基于开发的分子标记引物组合提供用于辅助筛选优良杨梅种质资源的方法，在杨梅果实颜色性状表型预测上有重要的指导意义，具有操作简单、高效快速和成本低等优点。

Description

鉴定杨梅果实颜色性状的SNP分子标记引物及其应用
技术领域
本发明涉及一组快速鉴定杨梅果实颜色性状的SNP分子标记引物及其应用，属于分子生物学领域。
背景技术
杨梅(Myrica rubra Sieb.and Zucc.)是原产我国南方的特色果树，果实富含花色素苷，具有较高的营养价值，鲜食与加工兼宜。根据杨梅果实成熟时表面颜色可分为白梅类、粉红梅类、红梅类、乌梅类等四类。其中，白杨梅果实发育过程中其果实直观颜色变化不明显，成熟时为白色，而白杨梅中品质佳者诸如‘水晶’杨梅品种，其果实扁圆球形，果面乳白色带光泽，风味佳，品质上等，市场售价普遍高于普通红梅类、乌梅类品种，发展前景好。因此，当前以选育优良白色杨梅品种为主要育种目标之一。然而，由于杨梅童期长(实生繁殖定植后8年以上)，在其进入结果期之前，尚无形态特征差异可以明示其果实颜色。因此，若通过常规手段确定杨梅白色果实育种材料是一件十分耗时的工作。现代生物技术的发展为杨梅果实颜色的早期预测鉴定提供一种有效的方法——DNA分子标记，利用与颜色相关的特异DNA分子标记完全有可能在短时间内对杨梅育种材料的果实颜色进行早期鉴定，从而可以大大加速育种的进程。因此，建立一种有效的分子标记组合及其检测方法，并实现高通量分型检测辅助筛选，成为本领域研究人员急需解决的问题之一。
相关研究(申请号：201811167375.1)基于杨梅花青苷生物合成转录因子MrMYB1基因型特征已成功开发了可以检测杨梅果实颜色性状的CAPS分子标记，但是由于该标记技术体系涉及酶切过程，技术门槛较高，操作过程繁琐，效率低，成本高；再者，该标记普适性仅通过少量杨梅品种样本群体验证，鉴于杨梅种质遗传背景差异较大，该标记是否适用大样本群体尚不可知。本发明中的杨梅果实颜色性状特异位点是经过杨梅当前地方主栽品种及优株群体(大于100份)DNA重测序结果，并展开全基因组关联分析(Genome wideassociation study，GWAS)获得，经过了较大样本杨梅品种群体验证，其鉴定准确性较为可靠。
发明内容
本发明的目的是提供一组可用于鉴定杨梅果实颜色性状的SNP分子标记引物及其应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：鉴定杨梅果实颜色性状的分子标记引物，其特征在于所述引物包括C2-2021-51-F和C2-2021-51-R，具体序列为：
C2-2021-51-F：5’-CTTATGTTTCAGGTTTTGTGGCTTA-3’，
C2-2021-51-R：5’-AGTACTGTAAGAGTGGCAAAAATG-3’。
本发明还公开了上述的分子标记引物组合在鉴定杨梅果实颜色性状中的应用。
其步骤包括：
(1)引物合成：合成权利要求1所述的引物C2-2021-51-F和C2-2021-51-R；
(2)DNA的提取：提取杨梅叶片的基因组DNA；
(3)PCR扩增：基于上述杨梅叶片基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物C2-2021-51-F和C2-2021-51-R进行PCR扩增，预先加入两个已确定果实颜色为白色的样本DNA作为内参；
(4)扩增产物检测与分析：对PCR产物进行基因型检测分析，若有PCR扩增产物出现且与内参样本聚集为一组者即可视为同一果实颜色类型，若没有任何PCR扩增产物出现者视为其他颜色类型，从而确定杨梅果实颜色性状。
其详细步骤为：
(1)引物合成：委托生物技术公司合成引物C2-2021-51；
(2)DNA的提取：
A、用液氮研磨0.2g左右的杨梅幼叶成粉末状置于2mL离心管中；
B、使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(EZ-10 Spin Column Plant GenomicDNA Purification Kit，上海生工生物工程股份有限公司)提取上述样品基因组DNA，具体操作步骤按照其说明书进行；
C、取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，将DNA原液稀释成浓度为20ng/μl的工作液备后续使用；
(3)PCR扩增反应体系为：样品基因组DNA模板2.0μL(20ng/μL)，2×SG Fast qPCRMaster Mix(Low Rox，上海生工生物工程股份有限公司)5μL，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，ddH2O补足至10μL即可。
(4)PCR扩增产物检测与分析：PCR扩增为两步法程序，即95℃3min，(95℃3s，60℃30s)20个循环；待PCR反应结束后可直接由ABI Q6 Flex实时荧光定量PCR系统平台Genotyping功能模块自动分析结果(Allelic Discrimination Plot)便可知样本果实颜色性状，无需其他流程；其中，若有PCR扩增产物出现(分别各加入2个已确定果实颜色为白色的杨梅种质样本作为内参)且与内参样本聚集为一组者即可视为同一果实颜色性状，即白色杨梅类型；否则，若没有任何PCR扩增产物出现者等均视为其他果实颜色类型。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明中分子标记引物C2-2021-51扩增产物片段仅为104bp，尤其适用于荧光定量PCR仪等高通量分型检测平台，其应用过程中的PCR扩增耗时短，循环数仅为20；从PCR扩增到最终分型结果数据的获取为全程闭管操作，无需再进行后续凝胶电泳检测，实现零污染；同时，样品基因组DNA模板量仅需40ng即可获得分型检测结果，具有快速、高通量和高灵敏度及准确性高的特点。
本发明下面结合实施例和说明书附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
附图说明
图1为杨梅种质资源DNA样本的C2-2021-51引物在荧光定量PCR仪平台上的分型效果。
具体实施方式
实施例1
一组鉴定杨梅果实颜色性状的分子标记引物组合及其应用，其详细步骤为：
(1)引物合成：按照表1中序列信息，委托生工生物工程(上海)股份有限公司分别合成引物C2-2021-51；
表1：C2-2021-51引物序列信息
Figure BDA0003155371480000031
(2)待测杨梅种质资源样品叶片DNA的提取：
A、用液氮研磨0.2g左右的杨梅幼叶成粉末状置于2mL离心管中；
B、使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(EZ-10Spin Column Plant GenomicDNA Purification Kit，上海生工生物工程股份有限公司)提取上述样品基因组DNA，具体操作步骤按照其说明书进行；
C、取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，将DNA原液稀释成浓度为10ng/μl的工作液备后续使用；
(3)PCR扩增反应体系为：样品基因组DNA模板2.0μL(20ng/μL)，2×SG Fast qPCRMaster Mix(Low Rox，上海生工生物工程股份有限公司)5μL，正向引物(10μM)0.5μL，反向引物(10μM)0.5μL，ddH2O补足至10μL即可。
(4)PCR扩增产物检测与分析：PCR扩增为两步法程序，即95℃3min，(95℃3s，60℃30s)20个循环；待PCR反应结束后可直接由ABI Q6 Flex实时荧光定量PCR系统平台Genotyping功能模块自动分析结果(Allelic Discrimination Plot)便可知样本果实颜色性状，无需其他流程；其中，若有PCR扩增产物出现(预先加入2个已确定果实颜色为白色的杨梅种质样本DNA作为内参)且与内参样本聚集为一组者即可视为白色类型，为阳性，以“+”标记；其他基因型或者若没有任何PCR扩增产物出现者均视为其他果实颜色类型，为阴性，以“-”标记。最后，使用表格记录所有杨梅种质样品性别鉴定结果(表2)，后续经过结果期观察确定其真实果实颜色性状，仅有5份杨梅种质果实颜色鉴定错误，因此，最终的杨梅果实颜色性状鉴定准确率达到95％，具体分型效果见图1。同时，也可以将上述引物制成试剂盒或生物制剂，用于杨梅果实颜色的早期辅助鉴定。
本实例中荧光定量平台96孔加热模块可根据需要进行更换为384孔以及流体芯片等，以满足更高通量分型检测需求。
表2本发明实例中所用到的95份杨梅种质资源果实颜色性状鉴定结果
Figure BDA0003155371480000041
Figure BDA0003155371480000051
Figure BDA0003155371480000061
注：*分型结果图中与白色杨梅果实颜色内参样品聚为一类者用“+”，其余样品均用“-”表示。

Claims (5)

1.一组鉴定杨梅果实颜色性状的SNP分子标记引物，其特征在于所述引物包括C2-2021-51-F和C2-2021-51-R，具体序列为：
C2-2021-51-F：5’-CTTATGTTTCAGGTTTTGTGGCTTA-3’，
C2-2021-51-R：5’-AGTACTGTAAGAGTGGCAAAAATG-3’。
2.权利要求1所述的SNP分子标记引物在鉴定杨梅果实颜色性状中的应用。
3.权利要求2所述的应用，其步骤包括：
(1)引物合成：合成权利要求1所述的引物C2-2021-51-F和C2-2021-51-R；
(2)DNA的提取：提取杨梅叶片的基因组DNA；
(3)PCR扩增：基于上述杨梅叶片基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物C2-2021-51-F和C2-2021-51-R进行PCR扩增，预先加入两个已确定果实颜色为白色的样本DNA作为内参；
(4)扩增产物检测与分析：对PCR产物进行基因型检测分析，若有PCR扩增产物出现且与内参样本聚集为一组者即可视为同一果实颜色类型，若没有任何PCR扩增产物出现者视为其他颜色类型，从而确定杨梅果实颜色性状。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(3)中PCR扩增反应体系为：20ng/μL的样品基因组DNA模板2.0μL，2×SG Fast qPCR Master Mix 5μL，10μM的C2-2021-51-F 0.5μL，10μM的C2-2021-51-R 0.5μL，ddH2O补足至10μL即可；PCR扩增为两步法程序，即95℃3min，然后95℃3s，60℃30s进行20个循环。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤(4)中采用ABI Q6 Flex实时荧光定量PCR系统平台Genotyping功能模块自动分析结果。
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