CN110885894A - 一种水稻分蘖角度基因tac1的分子标记方法及其专用引物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物技术领域，公开了一种水稻分蘖角度基因TAC1的分子标记方法，包括如下步骤：S1、提取水稻植株的基因组DNA；S2、PCR扩增：将3条水稻分蘖角度基因TAC1特异引物TAC1‑Fg、TAC1‑Fa和TAC1‑R及#1、#2两条通用引物同时加入到PCR反应体系中进行扩增；S3、对所述的水稻植株中的TAC1基因进行扩增；S4、将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将获得基因型结果；S5、根据荧光信号值进行分析，还公开其专用引物。本发明，利用5条引物形成的扩增受阻体系，检测样品只通过一次PCR扩增，而直接在原板上用荧光扫描仪获取扩增数据，可在水稻生长的任何时期检测，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。

Description

一种水稻分蘖角度基因TAC1的分子标记方法及其专用引物
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体是一种控制水稻分蘖角度性状的基因TAC1的荧光分子标记及其专用引物。
背景技术
水稻(Oryza sativa)栽培过程中的一个关键步骤是密集种植，较大的分蘖角度会增加叶片遮荫并降低光合作用效率，而较小的分蘖角度会使植物结构更有效。合理的分蘖角度是培育理想株型、达到高产育种的一个关键因素，高产水稻群体要求株型松散适中。TAC1(Tiller Angle Controlling)是水稻中调控分蘖角度的主效基因(Yu et al.,2007)，位于水稻第9染色体上长臂上。来自IR24的TAC1由5个外显子和4个内含子组成，编码一个由259个氨基酸组成的蛋白产物。同源性检索表明，该蛋白可能为禾本科植物所特有。基因结构比较表明：来自紧凑株型的水稻品种IL55的tac1基因在对应于松散株型的IR24的TAC1第4内含子的3'拼接点处发生了一个A→G的SNP变异，基因组序列由"agga"突变为"ggga"，导致该内含子在mRNA加工过程中不能正常剪切，poly(A)加尾提前，最终导致TAC1与tac1cDNA虽然编码相同的氨基酸序列，但具有完全不同的3'非翻译区。"ggga"序列的tac1等位基因类型的水稻材料一般表现为株型紧凑，而"agga"序列的TAC1等位基因类型的水稻材料一般表现为株型松散。
目前与本发明相似的以区分的检测基因SNP变异的分子标记技术方法主要有2种：1基于PCR扩增后的酶切及琼脂糖电泳，该方法根据水稻基因SNP变异的连接区域二侧设计引物，PCR扩增后，用限制性内切酶消化扩增产物，消化后的产物染色后在UV灯光下中观察。2设计三条引物，通过引物错配，扩增得到不同长度的片段，用聚丙烯酰胺凝胶检测，经银染、显色后在观察条带位置大小判断基因型。水稻分蘖角度基因TAC1的功能分子标记开发的相关专利尚未搜索到。
然而现有技术存在缺点是：1、基于PCR扩增后的酶切及琼脂糖电泳检测基因的SNP变异的技术方法，在PCR扩增完成后需要进行酶切、转移到琼脂糖电泳检测，再利用凝胶成像系统观察和统计，该方法酶切耗时长，内切酶成本高昂，并且操作复杂，过程中使用有毒的核酸染料。2、通过引物错配扩增不同片段大小来区分基因型。由于所扩增的片段差异较小，必须用分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶跑胶检测条带差异。聚丙稀酰胺凝胶制作过程复杂，并且所使用的试剂丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒剂，对人体伤害很大。凝胶电泳之后，需要用硝酸银和甲醛染色，以上试剂都为有毒试剂和致癌物，对环境和人体有很大的伤害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻分蘖角度基因TAC1的分子标记方法及其专用引物，解决水稻分蘖角度基因TAC1的功能标记开发以便其在水稻育种上应用，目前使用的方法存在实施过程耗时长，过程繁琐，效率低并且使用有毒物质的缺点。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种水稻分蘖角度基因TAC1的分子标记专用引物，包括两条通用引物,两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：
#1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-FAM，
#2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-HEX。
还包括3条特异引物，其中2条正向引物中有下划线的部分分别与#1和#2两条通用引物序列一致，：
正向引物TAC1-Fg：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCCCTTTCACCTTTTGCG；
正向引物TAC1-Fa：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTCCCTTTCACCTTTTGCA；
反向引物TAC1-R：TGCATGGATGTTTCTCTTGAGC。
一种水稻分蘖角度基因TAC1的分子标记方法，包括如下步骤：
S1、提取水稻植株的基因组DNA；
S2、PCR扩增：将上述所述的3条特异引物TAC1-Fg、TAC1-Fa和TAC1-R及2条通用引物#1、#2，同时加入到PCR反应体系中进行扩增；
S3、对所述的水稻植株中的TAC1基因进行扩增；
S4、将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果；
S5、根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号的是紧凑株型的tac1等位基因(G)类型材料，描获得HEX荧光信号的是松散株型TAC1等位基因(A)类型材料，荧光扫扫描结果为红色信号，则表示该样品为杂合状态。
作为本发明进一步的方案：S2中，PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS mastermix，0.15μL10 mM TAC1-Fg标记引物，0.15μL10 mM TAC1-Fa标记引物，0.4μL10 mM TAC1-R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH2O。
作为本发明再进一步的方案：所述PCR反应程序为：94℃，3min；然后10个循环94℃，20sec，65℃，-0.8℃每循环，1min；然后30个循环94℃，20sec，57℃，1min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
利用5条引物形成的扩增受阻体系，检测样品只通过一次PCR扩增，不需要电泳检测，而直接在原板上用荧光扫描仪获取扩增数据，经过软件分析，获得水稻TAC1的基因型数据。该发明可在水稻生长的任何时期检测，并且操作简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。因此，在解决目前使用的方法因实施过程耗时长、过程繁琐、效率低并且使用有毒物质的缺点的同时，成功开发了水稻分蘖角度基因TAC1的功能标记，便于TAC1基因在水稻育种上的应用。
附图说明
图1为本发明鉴定水稻分蘖角度基因TAC1等位基因的扩增示意图。
图2为本发明分子标记检测93份水稻品种材料的基因分型结果图。
图3为本发明中紧凑株型的tac1等位基因型示意图。
图4为本发明中松散株型的TAC1等位基因型示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
我们根据TAC1基因第4内含子的3'拼接点处A→G的SNP变异，设计了1个PARMS分子标记PM-TAC1，该标记由3条引物构成：
1.正向引物TAC1-Fg：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCCCTTTCACCTTTTGCG(3#)；
2.正向引物TAC1-Fa：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTCCCTTTCACCTTTTGCA(4#)；
3.反向引物TAC1-R：TGCATGGATGTTTCTCTTGAGC(5#)。
正向引物TAC1-Fg末端对应的是紧凑株型的tac1等位基因(G)类型，正向引物TAC1-Fa末端对应的是松散株型TAC1等位基因(A)类型。
另外包含两条通用引物，分别与两条正向引物中有下划线的部分一致，两条通用引物尾部加有不同的荧光标记：
#1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-FAM，
#2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-HEX。
#1标记序列与引物TAC1-Fg中的下划线部分一致，#2标记序列与引物TAC1-Fa中的下划线部分一致。用于PCR扩增的引物设计如图1(注：#1，Allele 1HEX荧光通用引物；#2，Allele 2FAM荧光通用引物；#3，SNP Allele 1特异扩增引物(标记引物TAC1-Fg)；#4，SNPAllele 2特异扩增引物(标记引物TAC1-Fa)；#5，通用反向引物(标记引物TAC1-R))所示，水稻DNA模板经扩增后，荧光扫描获得FAM荧光信号的是紧凑株型的tac1等位基因(G)类型材料，荧光扫描获得HEX荧光信号的是松散株型TAC1等位基因(A)类型材料。
利用5条引物形成的扩增受阻体系，检测样品只通过一次PCR扩增，不需要电泳检测，而直接在原板上用荧光扫描仪获取扩增数据，经过软件分析，获得水稻TAC1的基因型数据。该发明可在水稻生长的任何时期检测，并且操作简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。
采用此技术方案，标记的3条根据TAC1基因序列设计的引物及两条通用荧光引物同时加入到PCR反应体系进行扩增。TAC1的等位基因序列可以根据SNP差异与正向引物TAC1-Fg匹配而扩增获得FAM荧光信号值，与正向引物TAC1-Fa匹配而扩增获得HEX荧光信号值。如果水稻样品在该位点为杂合状态，则两种正向引物同时扩增，分析结果见图2(注：检测到FAM荧光信号的(右侧点)为含有tac1基因型的紧凑株型水稻品种，检测到HEX荧光信号的(左侧点)为含有TAC1基因型的松散株型水稻品种，红色点为位点为杂合状态。灰色点为阴性对照CK)。
一种水稻分蘖角度基因TAC1的功能标记采用以下步骤进行分子标记检测：
S1、提取水稻植株的基因组DNA；
S2、PCR扩增：将所述的3条引物TAC1-Fg、TAC1-Fa和TAC1-R及#1、#2两条通用引物同时加入到PCR反应体系中，上述PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS master mix(该试剂购买于武汉市景肽生物科技有限公司，主要包含2条通用荧光引物，buffer，DNTP以及Taq酶，内标ROX等)，0.15μL10 mM TAC1-Fg标记引物，0.15μL10 mM TAC1-Fa标记引物，0.4μL10mM TAC1-R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH2O。
S3、对所述的水稻植株中的TAC1基因进行扩增；所述PCR反应程序为：94℃，3min；然后10个循环94℃，20sec，65℃(-0.8℃每循环)，1min；然后30个循环94℃，20sec，57℃，1min；
S4、将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果；
S5、根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号(蓝色)的是紧凑株型的tac1等位基因(G)类型材料，描获得HEX荧光信号(绿色)的是松散株型TAC1等位基因(A)类型材料，荧光扫扫描结果为红色信号，则表示该样品为杂合状态。
实例：利用分子标记PM-TAC1检测93份水稻品种材料的TAC1等位基因
PCR反应体系为10ul：5μL 2×PARMS master mix(包含2条通用荧光引物)，0.15μL10 mM TAC1-Fg标记引物，0.15μL10 mM TAC1-Fa标记引物，0.4μL10 mM TAC1-R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH2O。PCR反应程序：94℃，3min；然后10个循环94℃，20sec，65℃(-0.8℃每循环)，1min；然后30个循环94℃，20sec，57℃，1min。扩增产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果，如图3、图4所示。
其具体实施步骤如下：
(1)提取水稻基因组DNA
分别取种植于南宁的93份水稻品种材料的叶片，通过CTAB提取法(十六烷基三甲基溴化铵法)获得水稻的基因组DNA；
(2)PCR扩增
PCR反应体系为10ul：5μL 2×PARMS master mix，0.15μL10 mM alk-Ftt标记引物，0.15μL10 mM alk-Fgc标记引物，0.4μL10 mM alk-R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μLddH2O。PCR反应程序：94℃，3min；然后10个循环94℃，20sec，65℃(-0.8℃每循环)，1min；然后30个循环94℃，20sec，57℃，1min；
(3)将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果；
(4)根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号(蓝色)的是紧凑株型的tac1等位基因(G)类型材料，描获得HEX荧光信号(绿色)的是松散株型TAC1等位基因(A)类型材料，荧光扫扫描结果为红色信号，则表示该样品为杂合状态。
(5)结果与分析
93份水稻品种材料的分子标记的基因分型检测详见图2、图3及图4。由图可见：检测到FAM荧光信号的蓝色圆点的是紧凑株型的tac1等位基因(G)类型材料，检测到HEX荧光信号的绿色圆点的是松散株型TAC1等位基因(A)类型材料，荧光扫扫描结果为红色信号，则表示该位点为杂合状态的材料。
本发明仅需要根据TAC1基因第4内含子的3'拼接点处A→G的SNP变异，设计了等长的仅有3'端A/G差异的引物，在引物末端中加入了两个不同的通用引物片段，同时扩增体系中通用荧光引物的参与，使得不同的基因型通过扩增后获得不同的荧光基团，进而直接在酶标仪上通过荧光基团的颜色对基因进行分型，另外，本发明只需要合成普通引物，费用低廉。扩增体系试剂(2×PARMS master mix)从公司购买，由于通用荧光引物的使用广泛，成本降低。本发明检测96孔PCR板的费用小于100元，大大节省了实验成本。
以下结合实施例对水稻分蘖角度基因TAC1的功能标记特异性进行说明。
实施例：
实验目的：检测93份水稻品种材料中TAC1基因的TAC1或tac1等位基因分型，并结合检测材料的表型分析验证该方案的准确性。
实施方案：根据文献报道，来自紧凑株型的水稻品种IL55的tac1基因在对应于松散株型的IR24的TAC1第4内含子的3'拼接点处发生了一个A→G的SNP变异，基因组序列由"agga"突变为"ggga"，导致该内含子在mRNA加工过程中不能正常剪切，poly(A)加尾提前，最终导致TAC1与tac1 cDNA虽然编码相同的氨基酸序列，但具有完全不同的3'非翻译区。"ggga"序列的tac1等位基因类型的水稻材料一般表现为株型紧凑，而"agga"序列的TAC1等位基因类型的水稻材料一般表现为株型松散。
本发明专利设计用以区分TAC1或tac1两种TAC1基因的等位基因类型的荧光分子标记并应用于收集的93份水稻品种材料进行检测，检测结果见图2及图3、图4。同时对相应的品种材料进行分蘖角度的观察，并与荧光标记的检测结果进行联合统计，统计结果显示分子标记与表型结果一致：松散株型的水稻品种材料荧光信号为HEX(TAC1)，紧凑株型的的水稻亲本材料荧光信号为FAM(tac1)(表1)。该项发明可应用于高效准确的选育合理株型的水稻品种，大大节约时间和工作量。
表1 93份水稻品种材料的株型及PM-TAC1检测分型
Figure BDA0002257774160000081
Figure BDA0002257774160000091
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (4)

1.一种水稻分蘖角度基因TAC1的分子标记专用引物，包括两条通用引物：
#1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT；#2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT；其特征在于，还包括3条TAC1基因的特异引物：
正向引物TAC1-Fg：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATTCCCTTTCACCTTTTGCG；
正向引物TAC1-Fa：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATTCCCTTTCACCTTTTGCA；
反向引物TAC1-R：TGCATGGATGTTTCTCTTGAGC。
2.一种水稻分蘖角度基因TAC1的分子标记方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、提取水稻植株的基因组DNA；
S2、PCR扩增：将权利要求1中所述的3条引物TAC1-Fg、TAC1-Fa和TAC1-R及#1、#2两条通用引物同时加入到PCR反应体系中进行扩增；
S3、对所述的水稻植株中的TAC1基因进行扩增；
S4、将PCR产物在包含FAM、HEX和ROX三种荧光检测通道的酶标仪中进行快速检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值文件通过SNP decoder工具，结合标记信息，自动进行基因分型，获得基因型结果；
S5、根据荧光信号值进行分析，荧光扫描获得FAM荧光信号的是紧凑株型的tac1等位基因(G)类型材料，描获得HEX荧光信号的是松散株型TAC1等位基因(A)类型材料，荧光扫描结果为红色信号，则表示该样品为杂合状态。
3.根据权利要求2所述的一种水稻分蘖角度基因TAC1的分子标记方法，其特征在于，S2中，PCR反应体系为10μL：5μL 2×PARMS master mix，0.15μL10mM TAC1-Fg标记引物，0.15μL10mM TAC1-Fa标记引物，0.4μL10mM TAC1-R通用反向引物，1μL模板DNA，3.3μL ddH2O。
4.根据权利要求2所述的一种水稻分蘖角度基因TAC1的分子标记方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：94℃，3min；然后10个循环94℃，20sec，65℃，-0.8℃每循环，1min；然后30个循环94℃，20sec，57℃，1min。
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