CN109385466A - 一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP功能分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP功能分子标记及其应用，涉及水稻育种技术领域。该KASP功能分子标记为Pi2基因的第787位、第788位密码子上的变异GCA GGA/GTG TTA。利用本发明的KASP功能分子标记及其引物与试剂盒，可在早期(种子或苗期)检测育种材料的稻瘟病抗性基因Pi2的等位基因型，预测育种材料的稻瘟病抗性，对育种材料进行准确筛选，不需要将育种材料种到病圃鉴定。从而促进抗稻瘟病水稻品种的遗传改良，提高品种培育效率。本发明采用KASP方法检测SNP位点，检测方法操作简单，成本低，检测结果准确可靠，环境友好，对人体不产生危害，适用于高通量规模化的商业化育种应用。

Description

一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP功能分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP功能分子标记及其应用。

背景技术

稻瘟病是一种世界性的水稻病害，每年可造成10～30％减产。抗病品种的选育和种植，是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是传统的杂交结合表型的选育方法往往因为宏观上表型把握不准而需要加大回交群体，这极大的增加了育种工作量与成本。

分子标记辅助(marker-assisted selection，MAS)可以从遗传基础上跟踪目标性状，选择含有目标基因的单株进行杂交(回交)，这样不但能准确的进行目标性状方向的育种，而且能减小回交群体的大小，节省成本。Pi2是一个对稻瘟病生理小种具有广谱抗性的基因，对于水稻的稻瘟病抗性育种具有非常重要的应用价值，但目前针对该基因的分子标记辅助选择育种所开发的分子标记操作繁杂，难以实现批量以及准确检测，严重阻碍了该基因在水稻MAS育种过程中的大量应用。并且这些标记检测过程中使用的EB或者聚丙烯酰胺易对环境造成污染，对人体产生危害。开发抗稻瘟病基因Pi2的功能基因标记，并建立高效、环境友好的检测体系，对促进该基因的商业化育种中的应用具有重要意义。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。它是生物可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP数量多，分布广泛，适于快速、规模化筛查，易于基因分型，在分子育种领域有着广泛的应用。现阶段，适用于SNP检测的方法主要有凝胶电泳、荧光定量PCR、基因芯片和竞争性等位基因PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)。Kasp的基因分型方法是通过计算PCR过程中产生的荧光信号，实现对变异位点的检测，检测结果与表现型一致，检测过程无需电泳，减少了实验操作过程对环境的污染和人体的伤害。该方法已普遍用于分子标记辅助育种、目标性状基因定位、种子纯度及真实性鉴定等工作，具有成本低、通量高、实验操作安全和基因型数据采集准确的优势。因此，开发一种标记适用于KASP方法检测SNP位点是具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP功能分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述KASP功能分子标记的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP功能分子标记，所述KASP功能分子标记为W-Pi2，所述分子标记W-Pi2为Pi2基因的第787位、第788位密码子上的变异GCAGGA/GTG TTA，所述分子标记W-Pi2为高抗稻瘟病品种黄广油占与高感稻瘟病品种广陆矮4号在该KASP功能分子标记多态性差异CAG/TGT。

用于扩增所述KASP功能分子标记W-Pi2的引物序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

本发明提供一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP引物，其序列如SEQ ID No.1、SEQID No.2和SEQ ID No.3所示。

本发明提供一种用于改良水稻稻瘟病抗性的试剂盒，包含上述KASP引物。

本发明提供一种所述KASP功能分子标记、KASP引物或试剂盒在筛选Pi2抗性等位基因水稻品种中的应用。

本发明提供一种所述KASP功能分子标记、KASP引物或试剂盒在水稻稻瘟病抗性改良育种中的应用。

利用本发明的KASP功能分子标记及其引物序列与试剂盒，可在早期(种子或苗期)检测育种材料的稻瘟病抗性基因Pi2的等位基因型，预测育种材料的稻瘟病抗性，对育种材料进行准确筛选，不需要将育种材料种到病圃鉴定。从而促进抗稻瘟病水稻品种的遗传改良，提高品种培育效率。

表1标记引物序列表

编号	名称	序列(5′-3′)
			SEQ ID No.1	W-Pi2-fam-F	gaaggtgaccaagttcatgctTCTCCATGTGGATGCTGCAG
SEQ ID No.2	W-Pi2-hex-F	gaaggtcggagtcaacggattTCTCTATGTGAATGCTGTGT
			SEQ ID No.3	W-Pi2-R	TGTCCTTAGTAGGGGAGGAGG

其中，引物W-Pi2-fam-F中小写字母部分为FAM通用荧光标签序列，引物W-Pi2-hex-F中小写字母部分为HEX通用荧光标签序列。所述的通用荧光标签序列还可以采用其他本领域通用的通用荧光标签序列。

本发明还提供一种利用所述分子标记进行基因分型的方法，包括如下步骤：

以植物基因组DNA为模板，采用所述分子标记的引物进行PCR(聚合酶链式反应)，待反应完成后，将PCR扩增的产物借助荧光信号采集仪器，获取对应的产物荧光信号值，最终完成基因分型。

所述反应的体系包括20～30ng/μL、DNA 2μL，所述的分子标记的引物各0.28μL和2×KASP Master mixture。

所述反应的条件为：94℃15min；94℃20sec，63℃～55℃1min，每个循环降0.8℃，共10个循环；94℃20sec，55℃1min，共26个循环。

所述荧光信号值的读取条件为16℃，20S。

所述的荧光信号采集仪器包括但不限于荧光定量PCR仪。

本发明还提供了一种基于所述分子标记鉴定水稻品种稻瘟病抗性基因Pi2基因型的方法，包括以下步骤：

1)提取待鉴定水稻品种的DNA样本；

2)以利用所述分子标记进行KASP检测；

3)根据荧光信号结果，判断待检测水稻品种的Pi2等位基因型：若只检测到FAM荧光信号，则待测水稻品种为Pi2抗性等位基因型CAG；若只检测到HEX荧光信号，则待测水稻品种为Pi2感病等位基因型TGT；若同时检测到两种荧光信号，则待测水稻品种为Pi2杂合基因型。

本发明还提供了一种基于所述分子标记改良水稻品种稻瘟病抗性的方法，包括以下步骤：

1)以感稻瘟病的Pi2基因型为感病等位基因型TGT的待改良品种为受体亲本，以高抗稻瘟病的Pi2基因型为抗性等位基因型CAG的品种为供体亲本；

2)将受体亲本与供体亲本杂交，获得杂交种F1；

3)将受体亲本作为目标，与步骤2)获得的杂交种F1单株做杂交，获得回交种子BC1F1；

4)在步骤3)获得的BC1F1植株苗期，提取DNA样品，利用所述分子标记进行分子标记辅助选择，筛选含有Pi2抗性等位基因型CAG的植株，将其作为父本继续与受体亲本进行杂交，获得BC2F1种子；

5)在步骤4)获得的BC2F1植株苗期，提取DNA样品，重复步骤4)获得BC3F1种子；

6)将步骤5)获得的BC3F1杂交单株种植成行，自交，收获杂交种BC3F2；

7)将步骤6)获得的BC3F2种植成500株的分离群体，在苗期提取DNA，利用所述分子标记筛选，获得Pi2纯合抗性等位基因型的单株；

8)将步骤7)获得的单株，连续自交至农艺性状稳定，获得符合育种目标的品系。

本发明还提供了一种基于所述分子标记改良水稻品种稻瘟病抗性的方法，包括以下步骤：

(1)以感稻瘟病的Pi2基因型为感病等位基因型TGT的待改良品种为受体亲本，以高抗稻瘟病的Pi2基因型为抗性等位基因型CAG的品种为供体亲本；

(2)将受体亲本与供体亲本杂交，获得杂交种F1；

(3)种植步骤(2)获得的F1种子得到F2群体，在植株苗期提取每个单株DNA样品，利用所述分子标记进行分子标记辅助选择，筛选含有Pi2抗性等位基因型CAG的植株；

(4)将步骤(3)获得的植株种植成行，自交，筛选符合育种目标农艺性状的株系，连续自交至农艺性状稳定，获得符合育种目标的品系。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)利用本发明的KASP功能分子标记及其引物序列与试剂盒，可在早期(种子或苗期)检测育种材料的稻瘟病抗性基因Pi2的等位基因型，预测育种材料的稻瘟病抗性，对育种材料进行准确筛选，不需要将育种材料种到病圃鉴定。从而促进抗稻瘟病水稻品种的遗传改良，提高品种培育效率。并且与现有的Pi2基因分子标记相比，KASP功能分子标记W-Pi2实验操作简单快捷，只需要进行PCR检测，检测过程无需使用EB或者聚丙烯酰胺等对环境造成污染的试剂，对人体不产生危害，检测体系高效、环境友好，具有较好商业化应用前景。

(2)本发明采用KASP方法检测SNP位点，检测方法操作简单，成本低，检测结果准确可靠，适用于高通量规模化的商业化育种应用。

附图说明

图1是本发明实施例1提供分子标记制备及基因型分型图。

图2是实施例2提供分子标记鉴定品种稻瘟病抗性的基因型分型图。

其中，Allele2为抗性等位基因型CAG；Allele1为感病等位基因型TGT；None为阴性对照(超纯水)；Heterozygote为杂合基因型。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

实施例中所用的五山油占的审定编号：粤审稻2006004；美雅占的审定编号：粤审稻2009030；28占在国家水稻数据中心公开；黄软秀占的审定编号：粤审稻2013023；黄秀占的审定编号：粤审稻2010023；黄丰占的审定编号：粤审稻2012002；新黄占的审定编号：粤审稻2011026；丰太丝苗的审定编号：粤审稻2013003；丰粤华占的审定编号：粤审稻2013027；矮华丝苗的审定编号：粤审稻2013024；齐华占的审定编号：粤审稻2011021；五山美占的审定编号：粤审稻2014005；五山丰占的审定编号：粤审稻2014004；黄秀丝苗的审定编号：粤审稻2014023；黄广莉占的审定编号：粤审稻2015006；美丝占的审定编号：粤审稻2006046；黄广华占1号的审定编号：粤审稻2016031；五山软占的审定编号：粤审稻20170050；五山丝苗的审定编号：粤审稻2009031；黄银占的审定编号：粤审稻2013002；黄丝莉占的审定编号：粤审稻2015001；黄广华占2号的审定编号：粤审稻20180001；黄广农占由广东省农业科学院水稻研究所提供；五山丝占的审定编号：粤审稻20170051；黄软占的审定编号：粤审稻2011001；五广占的审定编号：粤审稻2011025；黄莉占的审定编号：粤审稻2008001；黄粤丝苗的审定编号：粤审稻2012025；美香占2号的审定编号：粤审稻2006009；浓香21由湖南省水稻研究所提供；马坝油占在国家水稻数据中心公开；丰矮占1号的审定编号：粤审稻1997002；茉莉新占的审定编号：粤审稻200105；黄软丝苗的审定编号：粤审稻2015009；黄粤占的审定编号：粤审稻2008037；农香32的审定编号：湘审稻2015009；玉晶91的审定编号：湘审稻2015034；湘早籼17号的审定编号：湘品审第152号；玉清香，江西省地方优质品种，由江西省农业科学院水稻研究所提供；百香优：广西壮族自治区地方优质品种，由广西农业科学院水稻研究所提供；黄广油占的审定编号：粤审稻2013001；广陆矮4号在国家水稻数据中心公开。上述所有水稻品种均可从广东省农业科学院水稻研究所获得。

实施例1

分子标记W-Pi2的引物开发制备方法，其步骤是：

根据已有文献报道，在Pi2基因的第787位、第788位密码子上存在核苷酸变异GCAGGA/GTG TTA，本发明发现在高抗稻瘟病品种黄广油占品种与感稻瘟病品种广陆矮4号在该位点存在多态性差异，黄广油占为GCA GGA基因型，广陆矮4号为GTG TTA基因型，于是提取该位点左右两侧各100bp的序列，开发标记W-Pi2，所述标记序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示。

1)提取黄广油占和广陆矮4号的DNA，作为抗性等位基因型和感病等位基因型的标准DNA样本，取两个品种的等量DNA混合，作为杂合基因型的标准DNA样本。

2)应用发明内容提供所述分子标记与基因分型的方法，对4组DNA样本(各3个重复)：黄广油占、广陆矮4号、杂合基因型、阴性对照(超纯水)，进行KASP检测，检测结果如图1所示。

3)X轴为HEX荧光信号坐标轴，Y轴为FAM荧光信号坐标轴，小方框为抗性等位基因型(黄广油占)分布点，小三角形为杂合基因型分布点，小圆点为感病等位基因型(广陆矮4号)分布点，小菱形为阴性对照分布点。说明该标记可以准确地区分抗性等位基因型、感病等位基因型和杂合基因型。

实施例2

分子标记W-Pi2对水稻品种的稻瘟病抗性基因等位基因型鉴定，其步骤是：

1)提取40个待测水稻品种的DNA；

2)应用发明内容提供所述分子标记与基因分型的方法，对40个待测水稻品种和实施例1中的4个标准样DNA进行KASP检测，检测结果如图2所示。

3)X轴为HEX荧光信号坐标轴，Y轴为FAM荧光信号坐标轴，小方框为抗性等位基因型分布点，小三角形为杂合基因型分布点，小圆点为感病等位基因型分布点，小菱形为阴性对照分布点。分型结果显示，28个品种标记基因型为CAG抗病等位基因型，其中抗性鉴定结果为中感的1个，其余都是抗以上级别；12个品种标记基因型为TGT感病等位基因型，其中抗性鉴定结果为高抗的1个，其余都是感以下级别，说明该标记与表型具有高度关联，详细基因型与品种抗性鉴定结果如表2所示。

表2待测水稻品种的W-Pi2标记的基因型与稻瘟病抗性

注：Allele2为抗性等位基因型CAG；Allele1为感病等位基因型TGT。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省农业科学院水稻研究所

<120> 一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP功能分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> W-Pi2-fam-F

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc ttctccatgt ggatgctgca g 41

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> W-Pi2-hex-F

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat ttctctatgt gaatgctgtg t 41

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> W-Pi2-R

<400> 3

tgtccttagt aggggaggag g 21

Claims (10)

1.一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP功能分子标记，其特征在于：所述KASP功能分子标记为W-Pi2，所述分子标记W-Pi2为Pi2基因的第787位、第788位密码子上的变异GCA GGA/GTG TTA；

用于扩增所述KASP功能分子标记W-Pi2的引物序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQID No.3所示。

2.一种水稻稻瘟病抗性基因Pi2的KASP引物，其特征在于：所述KASP引物的序列如SEQID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

3.一种用于改良水稻稻瘟病抗性的试剂盒，其特征在于：包含权利要求3所述的KASP引物。

4.权利要求1所述的KASP功能分子标记、权利要求2所述的KASP引物或权利要求3所述的试剂盒在筛选Pi2抗性等位基因水稻品种中的应用。

5.权利要求1所述的KASP功能分子标记、权利要求2所述的KASP引物或权利要求3所述的试剂盒在水稻稻瘟病抗性改良育种中的应用。

6.一种利用KASP功能分子标记进行基因分型的方法，其特征在于：包括如下步骤：

以植物基因组DNA为模板，采用权利要求1所述KASP功能分子标记的引物进行PCR，待反应完成后，将PCR扩增的产物借助荧光信号采集仪器，获取对应的产物荧光信号值，最终完成基因分型。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述反应的体系包括20～30ng/μL、DNA 2μL，所述KASP功能分子标记的引物各0.28μL和2×KASP Master mixture；

所述反应的条件为：94℃15min；94℃20sec，63℃～55℃1min，每个循环降0.8℃，共10个循环；94℃20sec，55℃1min，共26个循环；

所述荧光信号值的读取条件为16℃，20S；

所述的荧光信号采集仪器包括但不限于荧光定量PCR仪。

8.一种基于KASP功能分子标记鉴定水稻品种稻瘟病抗性基因Pi2基因型的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)提取待鉴定水稻品种的DNA样本；

2)以利用权利要求1所述KASP功能分子标记进行KASP检测；

3)根据荧光信号结果，判断待检测水稻品种的Pi2等位基因型：若只检测到FAM荧光信号，则待测水稻品种为Pi2抗性等位基因型CAG；若只检测到HEX荧光信号，则待测水稻品种为Pi2感病等位基因型TGT；若同时检测到两种荧光信号，则待测水稻品种为Pi2杂合基因型。

9.一种基于KASP功能分子标记改良水稻品种稻瘟病抗性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)以感稻瘟病的Pi2基因型为感病等位基因型TGT的待改良品种为受体亲本，以高抗稻瘟病的Pi2基因型为抗性等位基因型CAG的品种为供体亲本；

2)将受体亲本与供体亲本杂交，获得杂交种F1；

3)将受体亲本作为目标，与步骤2)获得的杂交种F1单株做杂交，获得回交种子BC1F1；

4)在步骤3)获得的BC1F1植株苗期，提取DNA样品，利用所述分子标记进行分子标记辅助选择，筛选含有Pi2抗性等位基因型CAG的植株，将其作为父本继续与受体亲本进行杂交，获得BC2F1种子；

5)在步骤4)获得的BC2F1植株苗期，提取DNA样品，重复步骤4)获得BC3F1种子；

6)将步骤5)获得的BC3F1杂交单株种植成行，自交，收获杂交种BC3F2；

7)将步骤6)获得的BC3F2种植成500株的分离群体，在苗期提取DNA，利用权利要求1所述KASP功能分子标记筛选，获得Pi2纯合抗性等位基因型的单株；

8)将步骤7)获得的单株，连续自交至农艺性状稳定，获得符合育种目标的品系。

10.一种基于KASP功能分子标记改良水稻品种稻瘟病抗性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)以感稻瘟病的Pi2基因型为感病等位基因型TGT的待改良品种为受体亲本，以高抗稻瘟病的Pi2基因型为抗性等位基因型CAG的品种为供体亲本；

(2)将受体亲本与供体亲本杂交，获得杂交种F1；

(3)种植步骤(2)获得的F1种子得到F2群体，在植株苗期提取每个单株DNA样品，利用权利要求1所述KASP功能分子标记进行分子标记辅助选择，筛选含有Pi2抗性等位基因型CAG的植株；

(4)将步骤(3)获得的植株种植成行，自交，筛选符合育种目标农艺性状的株系，连续自交至农艺性状稳定，获得符合育种目标的品系。