CN112746120A - 一种基于kasp技术水稻抗稻瘟病基因标记体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，具体涉及一种基于KASP技术水稻抗稻瘟病基因标记体系及其应用。本发明提供20种水稻抗稻瘟病基因SNP标记，用于扩增该SNP标记的KASP引物组序列如SEQ ID No.1‑60所示。采用本发明提供的KASP引物组可用于水稻分子标记辅助抗病育种，通过导入单个或聚合多个抗稻瘟病基因，实现水稻品种抗病性的定向改良或是培育新的抗病品种；也可对现有水稻品种和资源携带的抗稻瘟病基因类型、数量和组合进行全面系统地检测，为抗病基因及其供体的高效利用和水稻品种的合理布局提供数据支撑。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学及作物育种技术领域，具体地说，涉及一种基于KASP技术用于水稻抗稻瘟病基因分型的引物组合及其应用。
背景技术
水稻是中国乃至世界上最重要的粮食作物之一，世界上有一半以上的人口以稻米为主食。稻瘟病被称为水稻的癌症，是对水稻生产危害最严重的病害之一。为防治稻瘟病，大量的杀菌剂被用于水稻生产环节，杀菌剂的使用一定程度上降低了稻瘟病对水稻生产的危害，但造成了水稻生产成本的升高、环境污染等问题，同时长期使用导致稻瘟病菌易产生抗药性。实践证明培育与种植抗病品种是防治稻瘟病最为经济、安全、环保和高效的方法。
常规育种方法选育抗病品种周期较长，加之稻瘟病菌生理小种致病性变异频繁、群体结构复杂，育出的含单一抗性基因的抗病品种抗性丧失比较快，很难实现抗病品种的持久抗性。因此对广谱、不同抗性机理抗稻瘟病基因的利用以及结合分子标记辅助选择进行多基因的聚合是应对抗稻瘟病品种抗性快速衰退的重要途径。
KASP基因分型技术是一项独特的竞争型等位基因特异性PCR，可对各种基因组核酸样品进行SNP和插入缺失高精度双等位基因分型，技术操作简单，分析稳定、准确，并且成本较低，易于实现高通量和自动化。目前在水稻品种中鉴定到近100个稻瘟病抗性位点，其中至少有35个稻瘟病抗性基因或等位基因被成功克隆。对已克隆定位的常用稻瘟病抗性等位基因进行KASP标记鉴定体系开发，对资源或育种材料的抗稻瘟病基因位点进行有利等位基因的鉴别以及组合筛选，可以在抗稻瘟病分子设计育种高效实现特定有利基因的转育和聚合，提升品种稻瘟病抗性水平，对加快抗性品种的选育进度，避免传统育种中的盲目性，节省育种成本，增加育种选择的准确性和效率具有重要应用意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于KASP技术水稻抗稻瘟病基因标记体系及其应用。为实现上述目的，本发明第一方面开发出水稻抗稻瘟病基因的功能型SNP标记组合，所述组合含有20个SNP标记，分别命名为：Bsrd1_7518、Pb17864、Pi16426、Pi2_1215、 Pi3/5_7330、Pi9_9084、Pi35_4909、Pi36_6707、Pi65(t)_5285、Pia_1254、Pid2_1791、 Pid3_5819、Pigm_4623、Pii_2424、Pii/5/3_3840、Pit_2651、Piz_7313、Piz-t_7798、 Pi20_2903、Pita_7554。
本发明所提供的水稻抗稻瘟病基因的功能型SNP标记，可分别通过SEQ ID No.1-3、 SEQ ID No.4-6、SEQ ID No.7-9、SEQ ID No.10-12、SEQ ID No.13-15、SEQ ID No.16-18、 SEQ ID No.19-21、SEQ ID No.22-24、SEQ ID No.25-27、SEQ ID No.28-30、SEQ IDNo.31-33、SEQ ID No.34-36、SEQ ID No.37-39、SEQ ID No.40-42、SEQ ID No.43-45、 SEQID No.46-48、SEQ ID No.49-51、SEQ ID No.52-54、SEQ ID No.55-57、SEQ ID No.58-60所示引物序列扩增得到。
本发明第二方面提供用于检测水稻抗稻瘟病基因功能型SNP标记组合的KASP引物组，包含SEQ ID No.1-3、SEQ ID No.4-6、SEQ ID No.7-9、SEQ ID No.10-12、SEQ IDNo.13-15、SEQ ID No.16-18、SEQ ID No.19-21、SEQ ID No.22-24、SEQ ID No.25-27、 SEQID No.28-30、SEQ ID No.31-33、SEQ ID No.34-36、SEQ ID No.37-39、SEQ ID No.40-42、SEQ ID No.43-45、SEQ ID No.46-48、SEQ ID No.49-51、SEQ ID No.52-54、 SEQ IDNo.55-57、SEQ ID No.58-60中的两组或多组。
本发明第三方面提供检测上述功能型SNP标记组合的试剂盒，其特征在于，包含上述KASP引物组。
根据本领域技术人员的理解，上述水稻抗稻瘟病基因功能型SNP标记组合或上述KASP引物组的或上述试剂盒在以下的应用，也属于本发明所要求保护的范围：
(1)在鉴定抗稻瘟病水稻品种中的应用；
(2)在改良水稻品种中的应用；
(3)在水稻分子标记辅助育种中的应用；
(4)在水稻抗稻瘟病基因等位功能变异检测中的应用；
(5)在水稻抗稻瘟病基因分型中的应用；
(6)在水稻稻瘟病抗性预测中的应用。
本发明所提供的KASP引物组，在32份水稻育种材料中均有多态性，可用于水稻育种材料的抗稻瘟病基因分型；使用本发明所提供的KASP引物组，可对稻瘟病抗性水稻的抗性基因、综合抗性指数进行全面的分析。
在使用本发明所述的KASP引物组的组合或上述试剂盒进行水稻抗稻瘟病基因分型及稻瘟病抗性预测时，KASP引物混合液的比例为Fam：Hex：Com＝1∶1∶2；KASP反应混合液的比例为KASP引物混合液：KASP master mix＝1∶36。
本发明的有益效果是：
(1)利用本发明提供的成套KASP标记及其引物组合能够快速检测水稻种质中抗稻瘟病基因的功能等位基因的组合方式，检测结果准确可靠，操作简单，成本低。
(2)本发明方法能够实现水稻育种材料的重要抗稻瘟病功能基因的检测，为水稻抗稻瘟病新品种选育、改良提供科学指导。
附图说明
图1是本发明Bsr-d1_7518标记分型图。
图2是本发明Pi3/Pi5_7330标记分型图。
图3是本发明Pb1_7864标记分型图。
图4是本发明Pi1_6426标记分型图。
图5是本发明Pi2_1215标记分型图。
图6是本发明Pi9_9084标记分型图。
图7是本发明Pi20_2930标记分型图。
图8是本发明Pi35_4909标记分型图。
图9是本发明Pi36_6707标记分型图。
图10是本发明Pi65(t)_5285标记分型图。
图11是本发明Pia_1254标记分型图。
图12是本发明Pid2_2152标记分型图。
图13是本发明Pid3_5819标记分型图。
图14是本发明Pigm_5354标记分型图。
图15是本发明Pii_2424标记分型图。
图16是本发明Pii/Pi3/Pi5_3840标记分型图。
图17是本发明Pit_2651标记分型图。
图18是本发明Pita_7554标记分型图。
图19是本发明Piz_7313标记分型图。
图20是本发明Piz-t_7798标记分型图。
图21是本发明抗性基因数量与综合抗性指数及穗瘟最高损失率的趋势图。
图22是本发明隆两优与晶两优系列品种稻瘟病抗性主要来源分析图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1水稻重要抗稻瘟病基因标记的开发与验证
标记开发流程：
1、搜集相关基因定位克隆文章，获取影响基因功能的变异位点；如无功能性变异位点，则获取已定位克隆基因在参考基因组上位置，对于已克隆基因利用NCBI搜索对应基因序列，对基因序列进行NCBI blast分析，获取基因特异变异位点，利用3000水稻重测序数据库分析基因变异位点有利等位型的分布频率，选取基因有利等位变异频率极低(或无)或稀有的位点为标记位点；
2、对于基因内部不存在稀有变异的功能基因位点，对基因供体材料进行二代全基因组重测序获取供体材料全基因组SNP或插入缺失变异信息，以基因定位区间为中心，向基因两侧各50kb进行延伸，提取供体材料该区间变异信息，结合3000份水稻重测序数据库筛选基因特有变异位点或单倍型作为标记位点；
3、对筛选获取的标记位点，利用Sanger测序分析目标基因在供体和不含该基因水稻材料间等位型情况，对标记进行验证；
通过上述步骤，获取了20个抗稻瘟病功能基因或位点功能或共分离标记，具体信息如表1所示。
表1 20个抗稻瘟病功能基因或位点功能或共分离标记
注：表中物理位置参考日本晴基因组版本IRGSP1.0。
基于标记位置信息，通过python-vcf包批量获取标记变异位点在参考基因组上下游序列信息，再以获取的序列信息为模板利用python引物设计包primer3-py对序列进行KASP引物批量设计，引物信息如表2所示：
表2引物信息
实施例2水稻重要抗稻瘟病基因标记体系在育种亲本及资源鉴定中的应用
1、利用20个水稻抗稻瘟病基因KASP标记引物组，对32份水稻育种材料或资源进行KASP反应，测试标记分型情况。32份材料名称见表3或表4所示。
2、DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。
3、KASP基因分型：KASP反应测试在LGC IntelliQube基因分型平台上采用offline模式进行。在微孔反应板中加入0.8ul DNA样品，再加入0.8ul KASP反应混合液，KASP 反应混合液中：100mM浓度的引物按照引物Fam：Hex：Com＝1∶1∶2的比列进行预混，再按引物混合液：KASP master mix＝1：36的比列在KASP master mix液中加入引物配置 KASP反应混合液。PCR扩增在水浴热循环仪中完成。PCR反应条件为：94℃预变性15 分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后将阵列带Array Tape放回IntelliQube进行荧光检测并做基因分型。
4、育种亲本材料基因分型结果见表3、表4。
表3育种材料基因分型结果
表4育种材料基因分型结果
注：表中‘+’代表为有利基因型，‘-’代表为不利基因型。
结果显示，20个抗稻瘟病基因标记在32份材料存在多态性，20个基因位点标记在32份材料间基因分型图分别见图1-图20。
实施例3隆两优与晶两优系列杂交稻组合稻瘟病抗性与抗性基因分析
(1)试验材料
水稻材料为72个隆两优与晶两优系列杂交稻品种(累计120次通过国家审定)，具体见表5；
(2)稻瘟病抗性评价
本研究隆两优和与晶两优系列杂交稻组合稻瘟病抗性评价数据，均来源于国家水稻数据中心(http：//www.ricedata.cn/variety/index.htm)；
(3)基因型分析
利用本发明的20个抗稻瘟病基因KASP检测标记组合对试验材料进行分析，具体基因型检测步骤同实施例2中步骤1、2、3；
(4)结果分析
检测结果显示隆两优、晶两优系列品种中最少含有3个抗稻瘟病基因，最多含有7个抗稻瘟病基因；从隆两优与晶两优系列杂交稻组合携带抗性基因数量与稻瘟病抗性的关系来看，随着抗性基因数量的增加，综合抗性指数与穗瘟最高损失率平均值都呈现整体下降趋势(图21)，携带3个基因的组合综合抗性指数和穗瘟最高损失率均值分别为3.7和5.5，而携带7个基因的组合则降低至2.8和3.6，检测结果表明多基因聚合可有效提高品种抗性水平。采用R软件多元线性回归模型分析不同抗稻瘟病基因效应，结果显示抗稻瘟病基因Pi2表型贡献率达到26.6％，抗病基因Pigm贡献率为9.5％，该两个基因为隆两优与晶两优系列品种稻瘟病抗性主要来源(图22)。
表5隆两优晶两优系列抗品种国审区试鉴定抗性及其携带基因
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 袁隆平农业高科技股份有限公司 湖南隆平高科种业科学研究院有限公司 湖南亚华种业科学研究院
<120> 一种基于KASP技术水稻抗稻瘟病基因标记体系及其应用
<130> KHP201118555.8
<160> 60
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<400> 42
taattttgca acccatggaa ctcg 24
<210> 43
<211> 47
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gaaggtgacc aagttcatgc ttcttcctct atcttccaca tttcttc 47
<210> 44
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat ttcttcctct atcttccaca tttcttt 47
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcaacgacaa aggcgtgaga 20
<210> 46
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tgcactcttc tgttagatga tctctag 47
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<212> DNA
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<400> 47
gaaggtcgga gtcaacggat ttgcactctt ctgttagatg atctctac 48
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
tgatagcgga aactgctcgg 20
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gaaggtgacc aagttcatgc tcaacgactg cacttcatgt tcag 44
<210> 50
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tcaacgactg cacttcatgt tcaa 44
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actattgcat ctgcgccttt aatc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtgacc aagttcatgc tcgtggcttc tatctttacc tg 42
<210> 53
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaggtcgga gtcaacggat tcgtggcttc tatctttacc tt 42
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ctgattcagg gtcacaaca 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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tccaactgac caagataacc aact 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cctcgcaacc aagtttccat ttta 24
Claims (10)
1.水稻抗稻瘟病基因的功能型SNP标记组合，其特征在于，所述功能型SNP标记组合含有20个SNP标记，分别为：Bsrd1_7518、Pb1_7864、Pi1_6426、Pi2_1215、Pi3/5_7330、Pi9_9084、Pi35_4909、Pi36_6707、Pi65(t)_5285、Pia_1254、Pid2_1791、Pid3_5819、Pigm_4623、Pii_2424、Pii/5/3_3840、Pit_2651、Piz_7313、Piz-t_7798、Pi20_2903、Pita_7554。
2.根据权利要求1所述的功能型SNP标记组合，其特征在于，可分别通过以下引物扩增得到：SEQ ID No.1-3、SEQ ID No.4-6、SEQ ID No.7-9、SEQ ID No.10-12、SEQ ID No.13-15、SEQ ID No.16-18、SEQ ID No.19-21、SEQ ID No.22-24、SEQ ID No.25-27、SEQ IDNo.28-30、SEQ ID No.31-33、SEQ ID No.34-36、SEQ ID No.37-39、SEQ ID No.40-42、SEQID No.43-45、SEQ ID No.46-48、SEQ ID No.49-51、SEQ ID No.52-54、SEQ ID No.55-57、SEQ ID No.58-60所示。
3.检测权利要求1或2所述功能型SNP标记组合的KASP引物组，其特征在于，包含SEQ IDNo.1-3、SEQ ID No.4-6、SEQ ID No.7-9、SEQ ID No.10-12、SEQ ID No.13-15、SEQ IDNo.16-18、SEQ ID No.19-21、SEQ ID No.22-24、SEQ ID No.25-27、SEQ ID No.28-30、SEQID No.31-33、SEQ ID No.34-36、SEQ ID No.37-39、SEQ ID No.40-42、SEQ ID No.43-45、SEQ ID No.46-48、SEQ ID No.49-51、SEQ ID No.52-54、SEQ ID No.55-57、SEQ ID No.58-60中的两组或多组。
4.检测权利要求1或2所述功能型SNP标记组合的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述的KASP引物组。
5.权利要求1或2所述的功能型SNP标记组合或权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的试剂盒在鉴定抗稻瘟病水稻品种中的应用。
6.权利要求1或2所述的功能型SNP标记组合或权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的试剂盒在改良水稻品种中的应用。
7.权利要求1或2所述的功能型SNP标记组合或权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的试剂盒在水稻分子标记辅助育种中的应用。
8.权利要求1或2所述的功能型SNP标记组合或权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的试剂盒在水稻抗稻瘟病基因等位功能变异检测中的应用。
9.权利要求1或2所述的功能型SNP标记组合或权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的试剂盒在水稻抗稻瘟病基因分型中的应用。
10.利要求1或2所述的功能型SNP标记组合或权利要求3所述的KASP引物组或权利要求4所述的试剂盒在水稻稻瘟病抗性预测中的应用。
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