CN105506127A - 检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法 - Google Patents

检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测技术，具体公开了一种检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法。本发明通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pigm的等位基因与“谷梅4号”近等基因系序列做比对的方法，分析得到能区别于其感病等位基因的1个碱基差异位点，再通过设计筛选，得到最佳引物S1806GC-F、S1806GC-R和最佳探针S1806-VIC、S1806-FAM。本发明还公开了利用上述引物和探针对水稻抗稻瘟病基因Pigm进行基因分型方法。本发明应用荧光实时PCR技术进行基因分型分析，不需要酶切、电泳及测序，操作简便、省时、省力且对环境安全友好。

Description

检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术，具体地说，涉及一种检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法。
背景技术
由稻瘟病菌(Magnapotheoryzae)引起的水稻稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年可造成的10～30％减产。选育与利用抗病品种，是防治稻瘟病最安全有效的方法。经湖南稻瘟病病圃多年鉴定，水稻品种“谷梅4号”一直为高抗品种。以“谷梅4号”为供体，选育并推广的水稻品种已广泛应用于商业化育种中，其抗稻瘟病性表现稳定高抗。
“谷梅4号”所携带的Pigm基因是抗谱广且抗性持久的基因之一。Pigm基因被定位于水稻品种“谷梅4号”第6号染色体10367284～10421563的片段内。目前，用于检测该基因的分子标记多为显性或非紧密连锁标记，检测结果易引起误判；检测过程中使用的EB或聚炳烯酰胺易对环境造成污染、对人体产生危害。开发与抗稻瘟病基因Pigm共分离的特异性分子标记及建立高效、环境友好的相关检测体系，则对促进Pigm基因在商业化育种中的应用具有重要意义。基于TaqMan探针的基因分型方法是通过计算机记录并分析PCR过程中产生的荧光信号，实现对突变位点监测。检测结果与表现型一致；检测过程无需电泳，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染、甲醛对人体的危害。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种快速、可靠、灵敏度高、特异性强和成本低的检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明按照如下方法获取探针及引物：
a.采用植物DNA提取方法获得水稻基因组DNA，作为下游实验的模板；
b.对多个水稻稻瘟病抗性基因Pigm的等位基因与“谷梅4号”近等基因系序列做比对的方法，分析得到能区别于其感病等位基因的1个碱基差异位点；
c.根据TaqManMGB探针的设计原理和设计方法，针对上述位点设计TaqManMGB分型探针、引物；
d.对所设计的探针、引物进行筛选，从中筛选出优化地特异性探针、引物；并优化出合适的PCR反应体系和反应条件。
本发明选定的用于检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的Taqman定性基因型分析PCR引物包括：
上游引物S1806GC-F：5’-ACTCCTTTCATCCCATAAAATACAAACGT-3’；
下游引物S1806GC-R：5’-CGCCTCTCCAGATTTGCAGTAT-3’。
本发明选定的配合上述引物使用的探针包括：
S1806-VIC：5’-CCCAAATGTTAGAGATCATA-3’；
S1806-FAM：5’-CCCAAATGTTAGACATCATA-3’。
其中，VIC、FAM均为荧光报告基团。
本发明还提供了采用前述探针和引物制成的用于水稻抗稻瘟病Pigm基因分型检测的试剂盒。
进一步地，本发明还提供一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的Taqman定性基因型分析方法，该方法包括以下步骤：
1)提取待测水稻的基因组DNA，调整浓度至20-25ng/μl左右；
2)利用前述探针和引物，通过TaqMan实时荧光PCR仪ABI7500对水稻基因组DNA进行基因分型检测，获得多组分图谱和基因分型图；根据多组分图谱，判断是否有荧光信号收集；根据基因分型图，判断基因类型：基因分型结果为GG或GC的水稻基因组，表明存在抗稻瘟病基因Pigm。
本发明优选的PCR反应体系以20μl计为：2×TaqManGenotypingMasterMix10μl，20×TaqManSNPGenotypingAssays1μl，20-25ng/μlDNA4μl，ddH2O补足至20μl。
其中，TaqManGenotypingMasterMix和TaqManSNPGenotypingAssays分别自ThermoFisher公司(产品编号4371353)及Invitrogen公司(产品编号4332077)购得。
本发明优选的PCR反应程序为：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共40个循环；60℃保持1分钟。
本发明还提供了前述试剂盒在水稻抗稻瘟病Pigm基因分型检测中的应用。
本发明还提供了前述引物和探针以及前述试剂盒在抗稻瘟病水稻选育方面的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的引物、试剂盒及基因分型方法。采用本发明的探针和引物进行TaqMan探针分型检测，每个实时荧光PCR反应中包括本发明的两个引物和探针对，通过两种不同荧光物质进行双通道同步检测，实现对每个检测样品的SNP位点的基因型判定，能够克服现有的形态学鉴定方法检测周期长、需要丰富经验和PCR、RAPD、PCR-RFLP、Southern杂交等检测方法操作复杂或检测灵敏度不高、或特异性不强、或重复性不好等缺点，彻底杜绝了PCR产物的气溶胶污染和EB对环境的污染、甲醛对人体的危害，具有简便、可靠、快速、特异性强、灵敏度高、环境友好的显著优点。
附图说明
图1为本发明实施例5中利用标记S1806GC检测各供试水稻材料的基因分型图；其中，GG为携带Pigm的检测结果，包括谷梅4号、谷梅2号及近等基因系B170、B195；CC为未携带Pigm的检测结果，包括9113、R8006、R1128、黄华占、魔王谷、湘资3150、316B、Dular、培S、Y58S、广湘24S、广占63S、中广丝苗、R608、4302A、CBB23、4155S、明恢63、2855、1141、HY12、R299、IR24、2338、H611、9311；GC为杂合的检测结果，谷梅4号与9311的混合DNA；■为空白对照。
图2为本发明实施例6中利用标记S1806GC检测近等基因系B170与R1128杂交后代F2群体的基因分型图；其中，GG为携带Pigm的检测结果，包括11个个体；CC为未携带Pigm的检测结果，包括7个个体；GC为杂合的检测结果，包括11个个体；■为空白对照。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件；所用原料均为市售商品。
实施例1
本实施例旨在说明本发明所述引物和探针的筛选过程
1、实验材料及来源
共选择10个供试水稻材料，具体为：谷梅4号、9311、R1128、黄华占、中广丝苗、R608、华占以及以谷梅4号为供体、9311为轮回亲本，经杂交、多代回交所得的近等基因系B170、B195、Z2752(BC6F2单株)。其中，谷梅4号、B170、B195对稻瘟病菌株67表现抗病，Z2752、9311、R1128、黄华占、中广丝苗、R608、华占表现感病。以上材料均由湖南亚华种业科学研究院提供。
2、DNA提取
对10个供试材料，于幼苗期分别取少许叶片利用CTAB法提取基因组DNA。NaroDrop2000微量测量DNA浓度，并将浓度调至50ng/μl左右。
3、测序及序列比对
根据Pigm基因定位信息，在可能的抗病基元内设计多对引物，通过扩增、测序及拼接，获得10个材料的等位片段序列；利用GeneDoc对序列进行比对分析，获得与表型一致的SNP位点106个。
4、探针合成及筛选
根据Pita、PiK等功能SNP信息，选择5个SNP位点设计引物及探针，具体包括S1088TG、S1806GC、S1914GA、S15390GT及S17137CT，其中，在S1088TG、S1806GC及S15390GT位点处合成引物与探针。通过对10个供试材料进行基因分型分析，发现S1088TG-FAM、S15390GT-FAM及S15390GT-VIC均未能收集到荧光信号，因此，仅在SNP位点S1806GC处设计并合成的引物及探针合适用于Pigm的基因型分析。
实施例2一种用于检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的Taqman定性基因型分析PCR引物
本实施例旨在提供一种用于检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的Taqman定性基因型分析PCR引物，所述引物包括：
上游引物S1806GC-F：5’-ACTCCTTTCATCCCATAAAATACAAACGT-3’；
下游引物S1806GC-R：5’-CGCCTCTCCAGATTTGCAGTAT-3’。实施例3配合实施例2所述引物使用的探针
本实施例旨在提供一种配合实施例2所述引物使用的探针，所述探针包括：
S1806-VIC：5’-CCCAAATGTTAGAGATCATA-3’；
S1806-FAM：5’-CCCAAATGTTAGACATCATA-3’。
其中，VIC、FAM均为荧光报告基团。
实施例4一种用于水稻抗稻瘟病Pigm基因分型检测的试剂盒
本实施例旨在提供一种用于水稻抗稻瘟病Pigm基因分型检测的试剂盒，所述试剂盒包括如下成分：
上游引物S1806GC-F：5’-ACTCCTTTCATCCCATAAAATACAAACGT-3’。
下游引物S1806GC-R：5’-CGCCTCTCCAGATTTGCAGTAT-3’。
探针S1806-VIC：5’-CCCAAATGTTAGAGATCATA-3’。
探针S1806-FAM：5’-CCCAAATGTTAGACATCATA-3’。
TaqManGenotypingMasterMix：产品编号4371353；
TaqManSNPGenotypingAssays：产品编号4332077。
实施例5水稻抗稻瘟病基因Pigm的Taqman定性分析不同基因型水稻材料
本实施例旨在提供一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的Taqman定性基因型分析方法
1、实验材料及来源
共选择30个供试水稻亲本材料，具体为：谷梅4号、谷梅2号、B170、B195、9113、R8006、R1128、黄华占、魔王谷、湘资3150、316B、Dular、培S、Y58S、广湘24S、广占63S、中广丝苗、R608、4302A、CBB23、4155S、明恢63、2855、1141、HY12、R299、IR24、2338、H611、9311。其中谷梅4号携带Pigm基因；近等基因系B170、B195是以谷梅4号为供体、9311为轮回亲本，经杂交、多代回交所得的BC6F2单株。以上材料均由湖南亚华种业科学研究院提供。
2、DNA提取
对30个供试材料，于幼苗期分别取少许叶片利用CTAB法提取DNA。NaroDrop2000微量测量DNA浓度，并将浓度调至20-25ng/μl。
3、基因分型
基因分型体系为：2×TaqManGenotypingMasterMix10μl，20×TaqManSNPGenotypingAssays1μl，DNA4μl，加ddH2O补足至20μl。
荧光定性基因分型条件为：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共40个循环；60℃1分钟。
4、结果分析
检测水稻基因组DNA，如果基因分型的结果为GG或GC，则表示抗稻瘟病基因Pigm的存在，包括谷梅4号、谷梅2号、B170、B195；CC表示未携带Pigm，包括9113、R8006、R1128、黄华占、魔王谷、湘资3150、316B、Dular、培S、Y58S、广湘24S、广占63S、中广丝苗、R608、4302A、CBB23、4155S、明恢63、2855、1141、HY12、R299、IR24、2338、H611、9311(图1)。图1中，GC为谷梅4号与9311的基因组混合液。
实施例6抗稻瘟病基因Pigm的特异性分子标记检测与杂交组合病圃鉴定相关性分析
1、实验材料及来源
以谷梅4号近等基因系B170与R1128杂交，再自交获得F2群体，随机取500-1000粒种子，发芽后进行苗期接种鉴定。
2、病圃抗性鉴定
将群体材料种植于湖南浏阳大围山病圃基地，待幼苗长至3叶1心时，移入自制接种箱中，利用对谷梅4号、B170不致病，但对9311、R1128致病的稻瘟病菌株67进行喷雾接种，孢子悬浮液浓度约为1×105个孢子/ml。接种后7d，按6级分类法调查各个植株的反应型：0到2级为抗病反应，3到5级为感病反应。结果表明B170/R1128F2群体976个单株中，抗病单株共739个，感病单株共237个，抗感比符合为3:1(χ2＝4.61，P<0.05)。
3、分子标记检测
3.1取B170/R1128F2群体30份单株叶片(22份表现抗病，8份表现感病)，提取DNA并利用标记S1806GC进行基因型检测。DNA提取方法、荧光定性基因分型条件如实施例5中的描述。30份材料中，通过荧光定性基因分型检测到GG及GC型单株各11份，CC型单株8份(图2)。
以上结果表明，荧光定性基因分型检测与稻瘟病病圃鉴定结果完全一致，表明提供的分子标记为Pigm基因的共分离标记，可以有效地鉴定待测材料是否携带Pigm抗稻瘟病基因，从而准确应用于分子育种。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种用于检测水稻抗稻瘟病基因Pigm的Taqman定性基因型分析PCR引物，其特征在于，所述引物包括：
上游引物S1806GC-F：5’-ACTCCTTTCATCCCATAAAATACAAACGT-3’；
下游引物S1806GC-R：5’-CGCCTCTCCAGATTTGCAGTAT-3’。
2.配合权利要求1所述引物使用的探针，其特征在于，所述探针包括：
S1806-VIC：5’-CCCAAATGTTAGAGATCATA-3’；
S1806-FAM：5’-CCCAAATGTTAGACATCATA-3’；
其中，VIC、FAM均为荧光报告基团。
3.一种用于水稻抗稻瘟病Pigm基因分型检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针。
4.一种水稻抗稻瘟病基因Pigm的Taqman定性基因型分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)提取待测水稻的基因组DNA，调整浓度至20-25ng/μl左右；
2)利用权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针，对水稻基因组DNA进行基因分型检测，当基因分型结果为GG或GC，表明水稻基因组存在抗稻瘟病基因Pigm。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μl计为：2×TaqMan GenotypingMasterMix10μl，20×TaqMan SNPGenotypingAssays1μl，20-25ng/μlDNA4μl，ddH2O补足至20μl。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，PCR反应程序为：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共40个循环；60℃保持1分钟。
7.权利要求3所述的试剂盒在水稻抗稻瘟病Pigm基因分型检测中的应用。
8.权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针在抗稻瘟病水稻选育方面的应用。
9.权利要求3所述的试剂盒在抗稻瘟病水稻选育方面的应用。
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