CN110408719A - 一种鉴定水稻抗稻瘟病基因Pigm的四引物分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鉴定水稻抗稻瘟病基因Pigm的四引物分子标记方法，属于生物技术工程领域。根据谷梅4号与测序籼、粳品种在Pigm位点Pigm‑R2基因起始密码子上游515bp处和已测序的籼、粳稻品种存在G‑C的碱基变异，设计四条分子标记引物，加入同一PCR反应体系并对不同水稻DNA进行扩增并进行电泳检测，不同大小的DNA条带代表Pigm不同基因型的纯合体和杂合体。本发明方法仅通过一次PCR的扩增和电泳就能准确、快速的鉴定水稻种质资源或育种群体中Pigm的不同基因型，在育种中能提高对含Pigm基因抗病水稻的选择效率，加快抗稻瘟病水稻品种的育种进程。

Description

一种鉴定水稻抗稻瘟病基因Pigm的四引物分子标记方法

一、技术领域

本发明涉及一种鉴定水稻抗稻瘟病基因Pigm的四引物分子标记方法，属于生物技术工程领域，专用含Pigm基因水稻抗病种质资源鉴定和品种选育。

二、背景技术

由子囊菌(Magnaporthe oryzae(Hebert)Barr.，无性态Pyricularia oryaeCav.)引发的稻瘟病是水稻最严重的真菌性病害之一。该病发生具有突发性、流行性和毁灭性等特点，特别是在丘陵地、山区等高温、高湿的环境条件下，其病情蔓延极为迅速，从而给水稻生产造成严重威胁(Ou S H.Rice Disease(2nd edn)[M].England，UK：CommonwealthAgricultural Bureaux，1985，63-64)。目前，稻瘟病在全球85个水稻种植国均有发生。据统计，全世界每年因稻瘟病造成的产量损失占粮食总产的11～30％，足以养活6千万人口。我国一直是稻瘟病危害的重灾区，多次发生全国性的大流行，一般年份受害面积也达300万～600万公顷，稻谷损失70万～125万吨(Zeigler R S,et al.,Rice Blast Disease[M].England,UK,CAB international,1994，321-331)。实践证明，利用品种抗性是防治稻瘟病最根本、有效的方法。因此，育种和品种审定过程中，稻瘟病抗性已成为评价品种优劣的关键指标。

由于稻瘟病菌致病性存在广泛变异，生理小种不仅在地区和年份间差别较大，而且在同一地区不同品种的病株上中也有变化。即使是同一水稻品种，其不同时期叶瘟和穗颈瘟生理小种的组成同样具有差异(黄富等，稻瘟病菌致病性变异研究，西南农业学报，1999，12(4)：69-73)。因此，稻瘟病菌丰富的遗传变异给抗病育种带来很大的困难。

随着分子标记技术的发展和水稻基因组测序的完成，已有大量的稻瘟病抗性基因被定位。迄今，至少报道了69个位点的100多个稻瘟病抗性主效基因，其中约45％来源于粳稻，51％来源于籼稻，4％来源于野生稻(Sharma T R et al.,Rice blast managementthrough host-plant resistance:retrospect and prospects.Agric Res,2012,1(1):37-52)。采用图位克隆等方法，迄今已成功分离出30多个稻瘟病抗性基因(袁熹等，水稻对稻瘟病的广谱抗性：分子机制及其育种应用，植物生理学报，2017，53(8)：1348-1358)。虽然目前已发掘的稻瘟病抗性基因很多，但多数都存在抗谱窄、抗性不强等缺陷，难以进行育种利用。

Pigm是来源于我国四川籼稻地方品种谷梅4号中的一个广谱、持久抗性基因，它对不同国家和地区收集的29个强致病菌株表现出高抗和免疫，其抗谱比同基因簇的Pi2、P40、Pi9、Piz、Pizt更广(Wu Y Y et al.,Development and evaluation of Near-isogeniclines with different blast resistance alleles at the Piz locus injaponicarice from the lower region ofthe Yangtze River)。同时，研究也表明Pigm基因对农艺性状的影响不大，即使降低千粒重也能通过提高结实率从而保证水稻不减产(Deng Y W etal.,Epigenetic regulation of antagonistic receptors confers rice blastresistance with yield balance,Science,2017,355(6328):962-965)。由于Pigm基因具有广谱、持久抗性且不影响产量的优点，因此在育种中得到应用。

在常规育种中，对稻瘟病抗病单株的选择主要是依赖充分发病条件下植株的发病情况来进行表型选择，如果发病不充分则选择的准确性很低。因此，利用分子标记对基因型选择是提高抗稻瘟病水稻育种效率的重要技术手段。为提高Pigm基因的选择效率，已有研究者利用不同类型的分子标记来检测其基因型。Deng等在Pigm定位克隆的过程中开发了连锁标记S29742、S95477和显性标记M26205、M80375、M80410，上述标记有些在不同亲本中多态性差，准确性低，有些则无法有效区分抗病纯合和杂合基因型，因此，在实际应用方面存在诸多不便(Deng Y W et al.,Epigenetic regulation of antagonistic receptorsconfers rice blast resistance with yield balance,Science,2017,355(6328):962-965)。2018年，江苏丘陵地区镇江农业科学研究所通过测序获得谷梅4号基因组的一段特异序列，并开发出插入/缺失标记，实现对Pigm基因的检测，但涉及聚丙烯酰胺电泳检测，过程相对繁琐(曾生元等，Pigm特异性选择标记的开发及其在粳稻穗颈瘟抗性育种中的利用，中国水稻科学，2018，32(5)：453-461)。如何提高Pigm基因型的检测效率和准确是育种者一直关心的焦点。

四引物扩增受阻突变体系PCR技术(Tetra-primer Amplification RefractoryMutation System PCR,Tetra-primer ARMS-PCR)是在普通PCR技术上发展起来专用于检测单核苷酸突变的衍生技术。该技术的基本思路是针对每个单核苷酸变异位点设计2条延伸方向相反的内侧引物和2条外侧引物，用该4条引物在同一个PCR反应中进行扩增，仅通过一次PCR、电泳就可以直接达到区分不同基因型的目的。由于具有快速、简便、费用低等特点，目前在水稻育种中得到广泛应用(管峰等，一种SNP检测的新方法：四引物扩增受阻突变体系PCR技术，生命的化学，2004，24(6)：514-516；田孟祥等，基于四引物扩增受阻突变体系PCR快速鉴定水稻S5基因的籼粳属性，作物杂志，2015，6：48-53；陈涛等，ALS抑制剂类除草剂抗性水稻功能标记的开发与验证，中国水稻科学，2018，32(2)：137-145)。

本发明拟采用四引物扩增受阻突变体系PCR技术这种新的基因分型方法来开发分子标记，对准确、高效的对Pigm的基因型进行区分，从而有效提高含Pigm基因稻瘟病抗病种质资源鉴定和品种选育效率。

三、发明内容

技术问题：本发明针对育种中稻瘟病抗性鉴定费时耗力且极易受环境干扰准确性不高，难以通过表型进行有效区分Pigm的基因型，以及已开发的连锁、显性、插入、缺失分子标记在不同亲本间多态性差、准确性不高、检测过程繁琐等问题。通过生物信息学的方法，找到在含Pigm基因谷梅4号中单碱基变异，根据四引物扩增受阻突变体系的基本原理设计四条特异性引物并采取一步PCR的方法来快速、准确的鉴定水稻Pigm基因型，达到抗稻瘟病种质资源筛选、鉴定以及抗病品种选育的目的。

技术方案：

1、一种鉴定水稻抗稻瘟病基因Pigm的四引物分子标记方法，其特征在于：

用Pigm基因特异性四引物为：

正向外引物Pigm-O-F序列为5’-TAAGAATTGAGGTGGTTAGTTGAACGGAGA-3’

反向外引物Pigm-O-R序列为5’-TTGCATGGCTCCACTACCCACTATAAG-3’

正向内引物Pigm-I-F序列为5’-TGAAAATAAAAATGGTATGATGGTTACG-3’

反向内引物Pigm-I-R序列5’-TAGGGATGAAACGGCTCGAAAACGATCG-3’

用所述的Pigm基因特异性四引物Pigm-O-F、Pigm-O-R、Pigm-I-F和Pigm-I-R扩增水稻基因组DNA，如果同时有684bp和295bp两条特征条带，则为含Pigm基因的纯合体，具有广谱稻瘟病抗性；如果同时有684bp和444bp两条特征条带，则为不含Pigm基因的纯合体，不具有广谱稻瘟病抗性；如果同时存在684bp、444bp和295bp三条特征条带，则为含Pigm基因杂合体，同样具有广谱稻瘟病抗性。

所述的方法，其特征在于：

(1)水稻植株基因组DNA的提取；

(2)将所述的四条分子标记引物Pigm-O-F、Pigm-O-R、Pigm-I-F和Pigm-I-R加入同一PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；

20μL PCR体系包括10ng/μL DNA 2.0μL，4pmol/μL正反向引物2.0μL，其中引物Pigm-O-F、Pigm-O-R、Pigm-I-F和Pigm-I-R各0.5μL，含25mmol/L MgCl₂的10×缓冲液2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 0.4μL，5U/μL的Taq 0.5μL，ddH₂O 13.1μL；

反应程序包括：95℃下预变性5min，95℃下变性30s，55℃下复性30s，72℃下延伸1min，循环35次后，72℃下延伸7min，10℃冷却10min，将扩增产物加入上样缓冲液终止反应；

(3)反应产物在质量比浓度为3.0％的琼脂糖凝胶上130V电泳30min，经DuRed核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。

所述的方法可以用于鉴定水稻抗稻瘟病基因Pigm的存在。可用于含Pigm基因抗稻瘟病水稻育种。

有益效果

不同品种Pigm基因核苷酸变异位点很多，因此要找到不同品种间的共同的功能的变异位点就比较难。以籼、粳测序品种93-11和日本晴为例，它们与谷梅4号对应的Pigm-R2基因序列在核苷酸上的一致性仅为94～95％(基因序列约为8500bp)，这意味着谷梅4号与日本晴、93-11的核苷酸变异位点为425～510个，而不同品种间的核苷酸变异更为复杂，某个核苷酸变异可能在某个品种中有差异，而在另一个品种中则可能没有差异，需要大量的比对，以及后期利用该特异性位点开发标记在不同品种间的通用性需要进行验证。同时也需要一点运气的成分才能找到。

本发明通过引进含Pigm基因抗稻瘟病地方籼稻品种谷梅4号，在对谷梅4号与4个测序籼、粳品种(日本晴、93-11、珍汕97、明恢63)Pigm位点Pigm-R2基因组序列比对的基础上，寻找特异性核苷酸变异位点，发现谷梅4号与上述4个品种具有共同变异的核苷酸位点有23个，其中12个为1～3个核苷酸插入/缺失，不适合进行四引物分子标记设计，而剩余的11个位点则具有和谷梅4号不同的单核苷酸差异，针对其中10个位点设计的四引物分子标记，均未能检测到有差异的带型，推测这些位点在不同品种中还存在其它同源的核苷酸序列。

幸运的是，根据含Pigm基因谷梅4号中Pigm-R2基因起始密码子上游515bp处和已测序不含Pigm基因水稻品种存在一个单碱基变异(G/C)设计的四引物分子标记出现了带型差异，进一步通过对48份水稻品种的检测，证实利用该标记方法不仅能快速、准确的鉴定水稻种质资源或育种群体中Pigm的不同基因型，而且能实现对较多待测样品的高通量检测，与常规分子标记技术相比具有更加快捷的优点。因此，在育种中能进一步提高对含Pigm抗病纯合基因型的选择效率，加快抗稻瘟病水稻品种的育种进程。

本发明提供的“一种鉴定水稻抗稻瘟病抗性基因Pigm的四引物分子标记方法”，具有以下优点：

(1)本发明提供的分子标记方法能有效用于含Pigm稻瘟病抗病水稻品种的辅助育种。由于传统育种中对稻瘟病抗性的鉴定结果主要是通过自然发病和人工接种的方法在充分发病的条件下根据植株发病表型进行观察得出的，这种方式不仅受植株生长发育阶段的影响，而且费时耗力、易受环境干扰准确性不高。而利用本发明分子标记方法可以在种子发芽后提取DNA进行基因型检测，而无需通过田间种植鉴定，从而缩短育种周期。

(2)本发明提供的分子标记是根据Pigm基因的特异序列差异进行开发的，利用其方法可以实现对Pigm基因的准确鉴定，能有效的将Pigm基因和其它表型类似稻瘟病抗病基因进行有效区分，而不需要通过测序以及大量、复杂的遗传试验来确定其变异位点；

(3)与现有Pigm基因连锁、显性分子标记相比，本发明提供的分子标记是根据含Pigm基因品种谷梅4号与已测序不含Pigm基因品种存在的特异性单核苷酸变异设计的PCR分子标记开发的。因此，该标记是Pigm基因内部的特异性标记，而非连锁标记，不存在由于标记和基因间的遗传交换而造成基因型鉴定的误差。同时，能有效区分Pigm的不同纯合和杂合基因型，选择、淘汰大量非目标基因型的单株，从而有效提高含Pigm基因抗稻瘟病水稻品种的选择效率和减少育种成本；

(4)与现有Pigm基因插入/缺失分子标记相比，本发明分子标记方法只需琼脂糖电泳即可进行基因型检测，比插入/缺失标记聚丙烯酰胺电泳检测可节省约2个小时的时间，更为高效、快捷，适合于对大量水稻资源和育种材料进行鉴定和选择。

四、附图说明

图1用于检测谷梅4号Pigm位点中特异的单核苷酸变异的四引物PCR分子标记策略(数字表示碱基在谷梅4号Pigm基因组序列中的位置，阴影表示在谷梅4号、日本晴、明恢63、珍汕97和93-11存在差异的碱基，阴影斜体表示特异的单核苷酸变异；下划线字母表示四引物PCR分子标记的引物序列)。

图2四引物PCR分子标记对不同水稻品种(品系)Pigm基因型的电泳检测

(M：DNA分子量标准，100-2,000bp；1：含Pigm基因水稻品种谷梅4号；2-24：不含Pigm基因水稻品种(品系)依次为IRBL9-W(Pi9)、IRBLz5-CA-1(Pi2)、IRBLz-Fu(Piz)、IRBLzt-T(Piz-t)、镇恢084、93-11、中恢8006、成恢727、红恢589、先恢527、明恢63、广恢998、川香29B、荃93-11B、03S、培矮64S、日本晴、嘉58、淮稻9号、南粳9108、盐丰47、吉粳88、龙粳29)

图3四引物PCR分子标记对淮稻9号/谷梅4号F₂群体部分单株Pigm基因型的电泳检测(M：DNA分子量标准，100-2,000bp；1：谷梅4号；2：淮稻9号；3：淮稻9号/谷梅4号F₁；4～24－部分F₂分离单株)

图4感病品种淮稻9号、抗病品种谷梅4号及其F₁单株、F₂群体穗颈瘟人工接种鉴定的发病情况

(A：不含Pigm基因水稻品种淮稻9号；B：不含Pigm基因水稻品种谷梅4号；C：含Pigm杂合基因型淮稻9号/谷梅4号F₁植株；D:淮稻9号/谷梅4号F₂群体部分单株)

图5利用Pigm基因定向改良优良食味粳稻南粳505稻瘟病抗性的技术路线

图6南粳505和含Pigm基因抗病改良系在海南田间稻瘟病发病情况

(A：南粳505；B：抗病改良系)

五、具体实施方式

“一种鉴定水稻抗稻瘟病基因Pigm的四引物分子标记方法”其具体实施步骤如下：

(一)试验材料(以下材料均为公知公用，江苏省农业种质资源中期库可对外提供)

含Pigm纯合基因型材料：谷梅4号，四川籼稻地方品种。

不抗Pigm纯合基因型材料：普感品种丽江新团黑谷为轮回亲本的4个近等基因系IRBL9-W(Pi9)、IRBLz5-CA-1(Pi2)、IRBLz-Fu(Piz)、IRBLzt-T(Piz-t)(国际水稻所引，IRRI)，籼稻恢复系材料镇恢084(江苏丘陵地区镇江农业科学研究所)、93-11(江苏里下河地区农业科学研究所)、中恢8006(中国水稻研究所-浙江)、成恢727(四川农业科学院作物研究所)、宜恢1577(四川宜宾市农业科学院)、红恢589(贵州省水稻研究所)、先恢207(湖南杂交水稻研究中心)、明恢63(福建三明市农业科学研究所)、航1号(福建省农业科学院稻麦研究所)、金恢2号(广西杨立坚选育)、广恢998(广东省农业科学院水稻研究所)；籼稻保持系材料宁香1B(江苏省农业科学院粮食作物研究所)、川香29B(四川农业科学院作物研究所)、荃93-11B(安徽荃银高科种业股份有限公司)、珍汕97B(浙江温州市农业科学研究所)；籼稻两系不育系03S(安徽荃银农业高科技研究所)、Bph68S(湖北武汉大学生命科学院)、P88S(湖南杂交水稻研究中心)、培矮64S(湖南杂交水稻研究中心)；常规粳稻品种包括日本晴(日本爱知县农试场)、越光(日本福井县农业试验场)、一品(韩国)、珍富10号(韩国)、楚粳39(云南楚雄州农业科学研究所)、毕粳44(贵州省毕节地区农业科学研究所)、宝农34(上海市宝山区农业良种繁育场)、浙粳97(浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所)、嘉58(浙江省嘉兴市农业科学研究院)、南粳505(江苏省农业科学院粮食作物研究所)、南粳9108(江苏省农业科学院粮食作物研究所)、淮稻9号(江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所)、豫粳8号(河南省新乡市农业科学研究所)、临稻17(山东省沂南县水稻研究所)、圣稻20(山东省农业科学院水稻研究所)、宁粳40号(宁夏农林科学院农作物研究所)、伊粳12号(新疆伊犁州农业科学研究所)、新稻32号(新疆伊犁州农业科学研究所)、津稻263(天津市水稻研究所)、沈农265(辽宁省沈阳农业大学)、辽粳10号(辽宁省稻作研究所)、盐丰47(辽宁省盐碱地利用研究所)、吉粳88(吉林省农业科学院水稻研究所)、龙粳29(黑龙江省农业科学院水稻研究所)。

其它植物材料包括以感病粳稻品种淮稻9号为母本，抗病籼稻品种谷梅4号为父本杂交配组的F₁植株以及300个F₂单株。

穗颈瘟人工抗性接种鉴定所采用的含ZB₃生理小种的菌液由江苏省农业科学院植物保护研究所提供，孢子浓度约为5×10⁴个/mL。以上植物和稻瘟病菌株材料均为公知公用材料，植物材料江苏省农业种质资源中期库可免费提供，而含ZB3生理小种的菌液可由江苏省农业科学院植物保护研究所有偿提供。具体参考文献为：国家水稻数据中心(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)，Deng et al.,Genetic characterization andfine mapping of the blast resistance locus Pigm(t)tightly linked to Pi2 andPi9 in a broad-spectrum resistant Chinese variety,Theoretical andAppliedGenetics,2006,113(4):705-713；陈峰等，韩国引进水稻品种的鉴定与利用评价，山东农业科学，2016，48(11)：26-28；元东林等，水稻优质、高产、多抗新品种“珍富10号”的选育及推广，延边大学农学学报，2001，23(2)：111-114；付崇允等，丽江新团黑谷近等基因系抗稻瘟病分析，作物学报，2006，32(6):799-804；陆凡等，江苏省稻瘟病菌生理小种的演变及与水稻品种的相互关系，江苏省稻瘟病菌生理小种的演变及与水稻品种的相互关系，南京农业大学学报，1999，22(4)：31-34)

(二)核酸序列分析

(1)核酸序列分析

谷梅4号Pigm位点基因组序列全长178704bp，由13个NBS-LRR类抗病基因(Pigm-R1～Pigm-R13)和大量转元件(1个Ty3/gypsy类反转录转座子、13个长末端重复序列和33个DNA转座子)组成。由于Pigm位点中Pigm-R2基因广泛存在野生稻和栽培稻中，具有高度的保守性，同时考虑到Pigm-R2与Pigm-R4、Pigm-R6、Pigm-R8、Pi9、Pi2的编码序列同源性较高，因此选择从NCBI数据库和华中农业大学水稻数据库下载Pigm-R2基因5’端上游(10445～11580bp)序列和内含子序列与测序品种日本晴、明恢63、珍汕97和93-11基因组序列的基因组序列进行同源性比对(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，http://rice.hzau.edu.cn/)。发现谷梅4号和日本晴、明恢63、珍汕97和93-11在相关区域存在11个单核苷酸多态性变异(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。选择SNP位点上下游各200bp的序列，针对其中10个位点设计的四引物分子标记，均未能检测到有差异的带型，推测这些位点在不同品种中还存在其它同源的核苷酸序列。幸运的是，根据含Pigm基因谷梅4号中Pigm-R2基因起始密码子上游515bp处和已测序不含Pigm基因水稻品种存在一个单碱基变异(G/C)设计的四引物分子标记出现了带型差异。进一步对含Pi9、Pi2水稻品种75-1-127和C101A51相应位点的克隆序列进行比对(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，发现该SNP位点在其它品种中也存在差异。这表明该单核苷酸变异可能特异存在于谷梅4号Pigm位点基因组序列中(图1)。

(三)分子标记的开发

下载Nipponbare Pigm基因的全长序列，根据Tetra-primer ARMS PCR技术的原理，选择特异单核苷酸变异位点上下游各500bp的序列，先确定正向(Pigm-I-F)和反向内引物(Pigm-I-R)，其中反向内引物的3’末端与谷梅4号Pigm位点中Pigm-R2基因起始密码子上游515bp处的碱基G相同，正向内引物的3’末端与品种日本晴、明恢63、珍汕97以及93-11Pigm-R2基因起始密码子上游515bp碱基C互补，同时为增强内引物的特异性，在内引物3’端第3位各引入一个人工错配碱基，即正向内引物Pigm-I-F由T变为A，而反向内引物Pigm-I-R则由A变T。同时，利用Primer Premier 5.0软件设计出多对正向和反向外引物，综合考虑四条引物的Tm(Melting Temperature)值、引物之间的互补情况以及差异片段是否能在琼脂糖凝胶上进行有效区分，最终确定了四条引物。从引物设计位置讲无论是否具有目标位点的碱基差异都能被正反向外引物扩增出具有阳性对照作用的684bp条带。除此之外，含Pigm基因纯合基因型的水稻还能扩增出295bp的特征条带，不含Pigm基因纯合基因型水稻则能扩增出444bp的特征条带，而杂合材料能同时扩增684bp、444bp以及295bp三条特征条带(图1)。

(四)分子标记检测基因型与抗性接种鉴定表现型的相互验证

(1)基因组DNA提取

在水稻移栽后30天，收集水稻品种(品系)、F₁杂种、F₂群体的新鲜幼嫩叶片，按CTAB法提取基因组DNA(Murray M G,et al.,Rapid isolation of high molecular weightplant DNA,NucleicAcids Res,1980,8(19):4321-4325)。具体步骤为：取2-3cm水稻嫩叶装入2mL的离心管中，液氮冷冻后用磨样棒磨成粉末；向研磨好的材料中加入65℃恒温水浴锅中预热30min的700μL含质量浓度比2％CTAB的DNA提取液，混匀后，放入35℃的恒温水浴锅中30min，期间每隔10min摇匀一次；取出离心管，在通风橱中每管加入24:1(氯仿：异戊醇＝24：1)700μL，充分混匀，放入离心机内1,2000rpm离心15min，使其分为三层；吸取上清液400μL与另一个1.5mL灭菌的离心管中，加入-20℃预冷的400μL异丙醇，缓慢混匀，在-20℃冰箱自由沉降30min。然后，10000rpm离心10min，弃上清；加入70％乙醇400μL洗涤1次，弃上清，风干；加入100-200μL的TE缓冲液，室温溶解成DNA溶液1-2d，置-20℃保存；

(2)分子标记的扩增和电泳电测

用Pigm基因特异性引物：

正向外引物Pigm-O-F序列为5’-TAAGAATTGAGGTGGTTAGTTGAACGGAGA-3’

反向外引物Pigm-O-R序列为5’-TTGCATGGCTCCACTACCCACTATAAG-3’

正向内引物Pigm-I-F序列为5’-TGAAAATAAAAATGGTATGATGGTTACG-3’

反向内引物Pigm-I-R序列5’-TAGGGATGAAACGGCTCGAAAACGATCG-3’

对不同水稻品种(品系)、F₁植株和F₂分离群体进行PCR扩增和电泳检测。

20μL PCR体系包括10ng/μLDNA2.0μL，4pmol/μL正反向引物2.0μL，其中引物Pigm-O-F、Pigm-O-R、Pigm-I-F和Pigm-I-R各0.5μL，含25mmol/L MgCl₂的10×缓冲液2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 0.4μL，5U/μL的Taq 0.5μL，ddH₂O 13.1μL；

反应程序包括：95℃下预变性5min，95℃下变性30s，55℃下复性30s，72℃下延伸1min，循环35次后，72℃下延伸7min，10℃冷却10min，将扩增产物加入上样缓冲液终止反应；

反应产物在质量比浓度为3.0％的琼脂糖凝胶上130V电泳30min，经DuRed核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。

(3)淮稻9号/谷梅4号F₂群体单株穗颈瘟抗性鉴定和评价

穗颈稻瘟病人工抗性接种鉴定所采用的含ZB₃生理小种的菌液，孢子浓度约为5×10⁴个/mL。在水稻植株孕穗破口前5天，对淮稻9号/谷梅4号F₂群体的单株进行注射接种，每株注射3个稻穗，每穗接种1mL菌液。接种选择在当天下午3：00后，以避免菌液的蒸发，影响接种效果。穗颈瘟发病调查的损失率为3个穗子损失率的平均值，病情分级参照NY/T 2646-2014进行(中华人民共和国农业部.NY/T 2646-2014水稻品种试验稻瘟病抗性鉴定与评价技术规程.北京：中国标准出版社，2014)。其中，0级(高抗，HR)：无病；1级(抗，R)：小枝梗发病，穗平均损失率≤5％；3级(中抗，MR)：主轴或穗颈发病，5％＜穗平均损失率≤20％；5级(中感，MS)：主轴或穗颈发病，谷粒半瘪，20％＜穗平均损失率≤50％；7级(感，S)：穗颈发病，大部分瘪谷，50％＜穗平均损失率≤70％间；9级(高感，HS)：穗颈发病，穗平均损失率>70％，其中0、1、3级记为抗病，5、7、9级记为感病。

(4)结果分析

①四引物分子标记对不同品种(品系)Pigm基因型检测

利用四引物分子标记对48份籼、粳稻品种(品系)进行PCR扩增，产物经3.0％琼脂糖凝胶电泳显示出684bp、295bp以及684bp、444bp两种类型的条带(图2)。其中，由正向外引物Pigm-O-F和反向外引物Pigm-O-R扩增起阳性对照作用的684bp条带在每份品种中都出现，这说明所有样品的DNA都能进行有效扩增。除该条带外，所有材料中只有谷梅4号能检测出一条295bp的条带，它是由正向内引物Pigm-I-F和反向外引物Pigm-O-R扩增产生的，其特异扩增Pigm-R2基因起始密码子上游515bp核苷酸为G的等位位点，为纯合的PigmPigm基因型；而其它47份材料包括分别含有Pi9、Pi2、Piz和Piz-t基因的近等基因系，除684bp的条带外，则只能扩增出一条444bp，它是由正向外引物Pigm-O-F和反向内引物扩增产生，其特异扩增Pigm-R2基因起始密码子上游515bp核苷酸为C的等位位点，应为纯合的pigmpigm基因型。

②四引物分子标记对淮稻9号/谷梅4号F₂群体Pigm基因型检测

为验证四引物分子标记对杂合基因型的检测效果，在分蘖盛期，提取淮稻9号/谷梅4号F₂群体300个单株的DNA并进行扩增，其电泳产物出现三种类型的条带(图3)。其中，能扩增出和谷梅4号684bp、295bp带型一致的62株，同时具有684bp、444bp和295bp三种条带的166株，与淮稻9号684bp、444bp带型一致的72株(图3)。三种带型对应的基因型PigmPigm、Pigmpigm、pigmpigm比例为1∶2∶1，符合1对基因的分离规律(χ²＝4.08<χ² _0.05,2，0.10<P<0.25)。

③淮稻9号/谷梅4号F₂群体不同Pigm基因型单株与穗颈瘟抗性的关系

为研究四引物分子标记鉴定出的Pigm基因型与稻瘟病抗性之间的关系，采用穗颈瘟人工接种的方法对感病品种淮稻9号、抗病品种谷梅4号、杂交的F₁植株以及F₂群体的单株进行抗性鉴定。淮稻9号、谷梅4号及其F₁的穗损失率为82.65％、6.82％和7.65％，对应的病情等级分别为高感、抗、抗(图4)。通过对F₂群体300个单株进行病情等级的统计，发现标记鉴定出的Pigm-R2基因起始密码子上游515bp核苷酸等位变异为GG、GC，基因型为PigmPigm、Pigmpigm的228个单株全部表现为高抗、抗和中抗水平，而等位变异为CC，基因型为pigmpigm的72个单株中只有67个表现为中感、感和高感，而有5个单株表现出抗和中抗(图4、表1)。

为排除由于接种不当造成的误判，继续收集5个单株的种子，2018年种成株系继续接种，每个株系接种5株，每株3穗，并统计病情等级，结果5个单株有4个表现为中感，1个表现为感。这不仅说明该四引物分子标记方法能快速、准确的对Pigm不同基因型进行鉴定，同时抗性分离比也证实谷梅4号中的抗性是由Pigm这对显性基因控制。

表1 2017年淮稻9号/谷梅4号F₂群体中3种Pigm基因型单株对穗颈瘟的抗性

(五)本发明分子标记方法用于含Pigm基因抗稻瘟病水稻育种

选用含广谱抗性基因Pigm水稻谷梅4号为供体，优良食味、感稻瘟病粳稻南粳505为受体，采用回交育种的策略，定向改良南粳505的稻瘟病抗性。在连续回交和自交的过程中，利用本发明的四引物PCR分子标记进行跟踪检测，并结合农艺性状的系统选择，至BC₃F₃代获得具有纯合稻瘟病抗性、其它农艺性状与原始亲本南粳505基本一致的改良品系(具体选育过程见图5)。2018年冬在海南田间自然充分发病情况下，抗性改良系的表现明显优于亲本南粳505(图6)。这表明利用本发明的分子标记方法能够对水稻Pigm基因进行选择，从而实现抗稻瘟病水稻品种的高效选育。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种鉴定水稻抗稻瘟病基因Pigm的四引物分子标记方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taagaattga ggtggttagt tgaacggaga 30

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgcatggct ccactaccca ctataag 27

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgaaaataaa aatggtatga tggttacg 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagggatgaa acggctcgaa aacgatcg 28

Claims (5)

1.一种鉴定水稻抗稻瘟病基因Pigm的四引物分子标记方法，其特征在于，

所用Pigm基因特异性引物为：

正向外引物Pigm-O-F序列为5’-TAAGAATTGAGGTGGTTAGTTGAACGGAGA-3’

反向外引物Pigm-O-R序列为5’-TTGCATGGCTCCACTACCCACTATAAG-3’

正向内引物Pigm-I-F序列为5’-TGAAAATAAAAATGGTATGATGGTTACG-3’

反向内引物Pigm-I-R序列5’-TAGGGATGAAACGGCTCGAAAACGATCG-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

用权利要求1所述的四引物正向外引物Pigm-O-F、反向外引物Pigm-O-R、正向内引物Pigm-I-F和反向内引物Pigm-I-R扩增水稻基因组DNA，如果同时有684bp和295bp两条特征条带，则为含Pigm基因的纯合体，具有广谱稻瘟病抗性；如果同时有684bp和444bp两条特征条带，则为不含Pigm基因的纯合体，不具有广谱稻瘟病抗性；如果同时存在684bp、444bp和295bp三条特征条带，则为含Pigm基因杂合体，同样具有广谱稻瘟病抗性。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

(1)水稻植株基因组DNA的提取；

(2)将权利要求1所述的四条分子标记引物Pigm-O-F、Pigm-O-R、Pigm-I-F和Pigm-I-R加入同一PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；

20μL PCR体系包括10ng/μL DNA2.0μL，4pmol/μL正反向引物2.0μL，其中引物Pigm-O-F、Pigm-O-R、Pigm-I-F和Pigm-I-R各0.5μL，含25mmol/L MgCl₂的10×缓冲液2.0μL，2.5mmol/L的dNTP0.4μL，5U/μL的Taq0.5μL，ddH₂O13.1μL；

反应程序包括：95℃下预变性5min，95℃下变性30s，55℃下复性30s，72℃下延伸1min，循环35次后，72℃下延伸7min，10℃冷却10min，将扩增产物加入上样缓冲液终止反应；

(3)反应产物在质量比浓度为3.0％的琼脂糖凝胶上130V电泳30min，经DuRed核酸染色并于凝胶成像系统下观察，记载。

4.权利要求1-3之一所述方法在鉴定水稻抗稻瘟病基因Pigm方面的应用。

5.权利要求1-3之一所述方法在含Pigm基因抗稻瘟病水稻育种方面的应用。