CN105950743B

CN105950743B - 一种稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记及其应用

Info

Publication number: CN105950743B
Application number: CN201610380721.9A
Authority: CN
Inventors: 杨立明; 罗玉明; 唐成; 方继朝; 刘永锋
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2016-05-31
Filing date: 2016-05-31
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2036-05-31
Also published as: CN105950743A

Abstract

一种稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记及其应用，命名为Pi9InDel，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。该分子标记Pi9InDel是通过引物对F1和R1从携带有稻瘟病抗性基因Pi9的稻瘟病抗性品种的总DNA中扩增出来得到得与稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型的核苷酸片段I。该分子标记是第一个针对Pi9基因内部序列所开发的Pi9基因特异性InDel标记，具有如下优点：特异性高；在实际应用中，低成本、高通量；能广泛应用于遗传背景不同的群体中。利用该分子标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

Description

一种稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地涉及稻瘟病技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记及其应用。

背景技术

由稻瘟病菌(Magnapothe oryzae)引发的稻瘟病是水稻生产过程中最常见、最严重的病害之一，引起稻米品质下降，且每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的角度来看，选育与利用抗病品种是防治稻瘟病最安全有效的方法。此外，由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，导致单一抗性品种的抗性会在种植后的3-5年时间里逐渐丧失(殷得所等，2011)。因此，挖掘和合理利用广谱抗性基因是获得持久、广谱抗病品种的重要途径。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者具备丰富的经验，而且鉴定结果也极易受到环境及人为因素的影响，从而导致目标抗性基因的选育效率降低。随着分子标记技术的产生及发展，其便捷、直接、不受环境影响等优点使其应用价值及应用前景越来越受到关注。为了更好地开展稻瘟病抗性育种工作，研究者们对水稻稻瘟病抗性分子机理进行了大量的研究，并开发出一些与主效抗性基因紧密连锁的DNA分子标记(Hittalmani et al.，2000；Jena and Mackill，2008)。DNA分子标记在抗性基因的定位以及基于分子标记辅助选择(MAS)技术的抗性育种中起着越来越重要的作用。然而与目的基因紧密连锁的分子标记在应用过程中有可能受到遗传背景的限制，在不同群体中需对亲本的多态性进行检测；此外，在减数分裂过程中，该类型的分子标记仍然存在着因染色体发生交换而失去了与目的基因紧密连锁关系的可能性，这使得在目的基因鉴定过程中会出现错选或漏选(Hayashi et al.，2006；Ingvardsen et al.，2008)。同时，越来越多的研究表明，同一个抗性位点存在着多个抗谱不同的功能性等位基因，它们在序列上高度相似(Zhou etal.，2006；Ashikawa et al.，2008；Yuan et al.，2011；Zhai et al.，2011；Hua et al.，2012)。因此，在基因聚合工作中，与目的基因紧密连锁的分子标记很难对功能性等位基因进行准确的鉴定与筛选。然而，基于基因内部序列所开发的基因特异性分子标记可以使上述问题得到有效的解决，从而提高抗性基因的利用效率，加快稻瘟病抗性育种的进程。

到目前为止，至少有9个稻瘟病抗性基因(Pi2、Piz、Piz-t、Pi40、Pigm、Pi9、Pi26、Pi50、Ρi2-2)已经被定位在水稻第6染色体短臂端的Pi2/Pi9基因簇内(Jiang etal.2012)，其中Pi9、Pi2、Piz-t以及Pi50已经被成功克隆(Qu et al.2006，Zhou etal.2006，Su et al.2015)。研究结果表明，Pi2和Piz-t在氨基酸水平上只存在着8个氨基酸残基的差异，二者与Pi9相比，氨基酸序列一致性分别都高达96％(Qu et al.，2006；Zhouet al.，2006)。抗性基因Pi9来源于野生稻，能抵抗来自13个国家和地区的43个稻瘟病生理小种的侵染(Liu et al.2002)。国际水稻所用超过100个来自菲律宾的稻瘟病生理小种对携带有抗性基因Pi9的水稻品种75-1-127进行接种鉴定，并没有发现亲和菌株(Qu et al.，2006)。张国民等(2010)分析了24个单基因系对黑龙江优势菌群的抗性表现，其中携带有Pi9的单基因系对所有优势菌株和强致病力小种抗谱达100％。抗性基因Pi9所表现出的稻瘟病广谱抗性使其在稻瘟病抗性育种工作中具有极大的应用价值。为了加快抗性基因Pi9在抗性育种中的应用，研究者已经开发出一些与Pi9连锁的、基于PCR技术的分子标记(倪大虎等，2005；Tacconi et al.，2010；殷得所等，2011；陈松彪等，2014)用于分子标记辅助选择育种工作。然而，这些标记位于抗性基因Pi9的侧翼，与目标基因存在着一定的物理距离。因此，这些标记所在的位点在减数分裂过程中存在着与目标基因发生交换的风险，在抗性育种工作中容易发生错选或漏选的情况。华丽霞等(2013)开发了Pi9SNP标记，尽管该标记回避了非功能标记的缺点，但由于该标记需要酶切等多个步骤，不适合大规模抗性筛选及分子聚合选育。为了能更准确、有效地将稻瘟病广谱抗性基因Pi9应用到水稻抗性育种工作中，有必要在抗性基因Pi9的基因序列内部开发出Ρi9特异的InDel分子标记，这种基因特异性分子标记能对目标基因筛选的准确率理论值达100％。

发明内容

解决的技术问题：为了能更快、更有效地将稻瘟病抗性基因Pi9应用到抗性育种项目中，本发明的首要目的在于提供一种稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9InDel。该分子标记Pi9InDel基于基因序列插入缺失的差异(Insertion-deletion，InDel)研究得到，其能提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

本发明的另一发明目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9InDel的应用。

技术方案：一种稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记，命名为Pi9InDel，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。具体序列为：

GGTTTATCTGGGGAGAAGGAAAAGGAGAGGGAGGGGGGGGGAGGGTCCACTTCCAGCT

上述携带有稻瘟病抗性基因Pi9的稻瘟病抗性品种为水稻抗病品种IRBL9-W。

上述分子标记在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因中的应用。

上述应用包含如下步骤:(1)扩增:利用SEQ ID NO.2所述引物Fl和SEQ ID NO.3所述Rl对待检测的水稻品种的基因组进行PCR；(2)检测:PCR结果如下:①若PCR结果为其它大小的带型，则待检测的水稻品种没有携带有稻瘟病抗性基因Pi9；②若PCR结果为58bp，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pi9。

上述的分子标记在鉴别Pi2/9基因簇区域不同的稻瘟病抗性基因中的应用。

用于扩增所述分子标记的引物对，核酸序列如下所示：

SEQ ID NO.2：Fl:5’-GGTTTATCTGGGGAGAAGG-3’；

SEQ ID NO.3：Rl:5’-AGCTGGAAGTGGACCCTC-3’。

一种鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的试剂盒，含有核酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pi9InDel，以及如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的引物对。

上述的稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9InDel的制备方法，包含以下步骤:

(1)从公共数据库中下载得到已经公开发表的Pi9及Pi2水稻供体品种的部分基因组序列以及测序品种日本晴(Nipponbare)相对应区域的基因组序列，针对Pi9位点进行序列比对，筛查Pi9特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的插入缺失(InDel)位点；

(2)利用步骤(I)获得的SNP信息，根据InDel标记的设计原理，在所述InDel位点上下游100～200bp处设计基因特异性引物，引物对碱基序列如下:

Fl:5’-GGTTTATCTGGGGAGAAGG-3’；

Rl:5’-AGCTGGAAGTGGACCCTC-3’；

(3)以携带有稻瘟病抗性基因Pi9的稻瘟病抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增，所获得的PCR产物进行电泳检测DNA片段，即为稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记Pi9InDel。

本发明的原理:插入/缺失(insertion-deletion，InDel)是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列插入或缺失了一个或多个碱基(Weber et al，2002)。InDel是同源序列比对产生空位(gap)的现象，但大多数情况下无法获知祖先序列(Fan et al，2007)，难判断空位位点是哪个序列发生了插入突变，或哪个序列发生了缺失突变，所以一般统称它们为插入/缺失突变。InDel标记基于PCR扩增技术，本质上属于长度多态性标记(Hyten et al，2010)。InDel标记因其稳定性好、多态性高、分型系统简单(Jander et al，2002)，开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。本发明通过多序列比对的方法寻找Pi9基因序列上出现的InDel，据此位点的上下游设计引物对F1/R1，用其进行常规PCR扩增，携带有Pi9的水稻品种所得到的扩增产物分子量大小为58bp，在本发明所要求的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，携带Pi9的水稻品种的酶切产物分子量为58bp，而不携带Pi9的水稻品种的酶切产物分子量以高于58bp或低于58bp带呈现。

有益效果:(1)本发明提供的分子标记特异性高:Pi9所在的基因组区域存在着包括Pi9在内的6个具有抗性基因特征的候选基因，这些候选基因在序列上高度同源，彼此之间在核苷酸水平上的序列一致性范围为71.8％～98.6％(Qu et al.，2006)；此外，Pi9与该位点上已经克隆的稻瘟病抗性基因Pi2、Piz-t在氨基酸水平上的序列一致性都为96％(Zhou et al.，2006)。本发明提供的分子标记是本发明发明人经过不断的进行序列多态性搜查并通过实验验证得到的，能明显地将Pi9与存在于该基因组区域内与Pi9高度同源的旁系同源基因进行区分；也能成功区分Pi2、Piz-t、Ρi-gm以及被定位在Pi2/9位点上的其它稻瘟病抗性基因。

(2)本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量:InDel检测简单便捷，对仪器设备和技术要求较低，在电泳技术平台上即可进行。本发明提供的InDel分子标记的扩增产物带型清晰简单，其稳定性和产物分离效果较好；由于扩增产物较短，对DNA质量要求较低，且对样品量要求较少，甚至能扩增高度降解的DNA，特别适用于生产实践。

(3)本发明是第一个针对Pi9基因内部序列所开发的Pi9基因特异性InDel标记。本发明能通过电泳检测的方法成功地将Pi9与定位在该位点上的其它稻瘟病抗性基因(Piz-t，Pi2，Piz，Ρi40，Pigm)区分开，到目前为止，还没有有关这类标记的报道。本发明所提供的Pi9特异性分子标记Pi9InDel是一个共显性标记，在实际应用过程中其可靠性及准确性优于显性标记。本发明可应用于种质资源分析、Pi9转基因鉴定，基因聚合(尤其是序列高度同源的等位基因的聚合)以及基于MAS技术的水稻抗性育种工作中。该标记存在于Pi9基因内部，因此对Pi9的筛选能力理论值可达100％，这样的筛选能力优于已报道的与Pi9连锁的分子标记。

(4)本发明提供的分子标记能广泛应用于遗传背景不同的群体中。现有的与Pi9连锁的分子标记大部分都是针对同一个群体2个不同亲本的序列多态性所开发的，这些标记在其它群体中的适用性有限。本发明适用于任何遗传背景下的种质资源分析、转基因育种、基因聚合以及基于MAS技术的抗性育种，无需重复进行亲本多态性的筛选，大大提高了育种效率。

因此，本发明所提供的稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记具有重要的应用价值，利用此标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

附图说明

图1是Pi9基因特异性分子标记Pi9SNP在Pi2/9基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的验证结果图，其中:自左往右，泳道M为DNA ladder，泳道1～7的DNA模板依次为抗性品种IRBL9-W(Pi9)、抗性品种C101A51(Pi2)、抗性品种谷梅4号(Pigm)、抗性品种IRBLzt-T(Piz-t)、抗性品种IRBLz-Fu(Piz)、感病品种日本晴(Nip)、感病品种LTH。

图2是Pi9基因特异性分子标记Pi9SNP在其它水稻品种中的验证结果图，其中:自左往右，泳道M为DNA ladder，泳道1～12的DNA模板依次为抗性基因供体品种IRBL9-ff(Pi9)、博白B、陆财号、南芒早粳、六十早、二九南1号、黑粳2号、南特号、特青2号、镇恢129、盐恢559、R524。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1:稻瘟病抗性基因Pi9基因特异性分子标记及其引物设计与检测

(I)Pi9插入/缺失(insertion-deletion，InDel)位点的分析:

从公共数据库中下载得到已经公开发表的Pi9及Pi2水稻供体品种的部分基因组序列(Genebank收录号分别为:DQ285630，DQ352453)以及测序品种日本晴(Nipponbare)相对应区域的基因组序列，针对Pi9位点进行序列比对，筛查Pi9特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的插入/缺失(InDel)差异位点。具有基因特异性InDel的水稻稻瘟病抗性基因Pi9与C101A51-Pi9、Nip-Pi9的多序列比对结果如下所示:

IRBL9-W-Pi9:

GGTTTATCTGGGGAGAAGGAAAAGGAGAGGGAGGGGGGGG◆GAGGGTCCACTTCCAGCT；

CIOIA51-Pi9:

GGTTTATCTGGGGAGAAGGAAAAGGAGAGGGAGGGGGGGGGGGAGGGTCCACTTCCAGCT；

Nip-Pi9:

GGTTTATCTGGGGAGAAGGAAAAGGAGAGGGAGGGGGGGGAGGGTCCACTTCCAGCT；

其中，加◆即为鉴定到的Pi9基因特异性单碱基差异(SNP)；

(2)设计引物:

根据InDel标记的设计原理，在所述InDel位点处的上下游设计引物，引物对碱基序列如下所示:

Fl:5’-GGTTTATCTGGGGAGAAGG-3’；

Rl:5’-AGCTGGAAGTGGACCCTC-3’。

(3)选择水稻代表品种:

选择携带有Pi9基因以及Pi2/9基因族等位基因的代表品种如下:

水稻品种IRBL9-W，为Pi9供体品种(Tsunematsu et al.，2000.)，为阳性对照；

水稻品种IRBLzt-T，为Piz-t供体品种(Zhou et al.，2006)；

水稻品种C101A51，为Pi2供体品种(Inukai et al.，1994)；

水稻品种IRBLz-Fu，为Piz供体品种(Kobayashi et al.，2007)；

水稻品种谷梅4号，为Pigm供体品种(Deng et al.，2006)；

感病对照品种:日本晴(http://www.ricedata.cn/variety/varis/602979.htm？602979)；

感病对照品种:丽江新团黑谷(LTH，凌忠专等，2001)；

(4)PCR扩增，获得含有Pi9基因特异性SNP的片段

利用上述引物对Fl和R1，以上述水稻品种的总DNA为模板，进行常规PCR扩增，扩增得到的片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到的结果如图1所示。

扩增反应体系如下:

10×PCR buffer(Mg²⁺Plus):2μL

dNTPs(2.5mM each):1.6μL

引物Fl(10μΜ):1μL

引物Rl(10μΜ):1μL

TaKaRa Taq^TM(5U/μL):0.1μL

DNA模板(20_50ng/μL):IμL

ddH₂O:补足至25μL。

PCR温度循环条件如下:94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃I分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。

PCR反应结束后，取适量酶切样品在12％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为180V，1小时。

其中，图1的泳道I为Pi9供体品种水稻品种IRBL9-W基因组为模板PCR得到的片段，呈现的是与稻瘟病抗性基因Pi9呈特异性带型，即泳道I为Pi9基因特异性分子标记Pi9InDel。图1的结果显示，Pi9基因特异性分子标记既能区分抗感等位基因，又能区分Pi2/Pi9位点上所鉴定到的其它抗性基因，电泳检测条带以不同的高低带呈现。

实施例2:抗性基因Pi9基因特异性分子标记在鉴别Pi2/9基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的应用。

根据多态性的PCR产物条带，可以把含有目标基因Pi9与其它Pi2/9基因簇上的抗性基因区分开来。如图1所示，根据条带位置可以将Pi9与该位点所鉴定到的其它抗性基因区分开来，58bp表示含有Pi9基因。可见试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pi9基因特异性分子标记可在鉴别Pi9基因与Ρi2/9基因族等位基因等方面得到应用。

实施例3:抗性基因Pi9基因特异性分子标记在其它水稻品种中的检测应用

选择11个重要水稻品种，依次为:IRBL9-ff(Pi9)、博白B、陆财号、南芒早粳、六十早、二九南1号、黑粳2号、南特号、特青2号、镇恢129、盐恢559、R524。

博B，选育单位：广西博白县农业科学研究所，

陆财号，选育单位：福建省仙游县陆财，

南芒早粳，上海早粳；

六十早，选育单位：湖南省益阳、华容一带；

二九南1号，选育单位：浙江省嘉兴市农业科学研究所；

黑粳2号，选育单位：黑龙江省黑河地区农业科学研究所；

南特号，选育单位：江西省农业科学院；江西省农业试验场；

特青2号，选育单位：广东省农业科学院水稻研究所；

镇恢129，选育单位：江苏丘陵地区镇江农业科学研究所；

盐恢559，选育单位：江苏沿海地区农业科学研究所；

R524，选育单位：湖南隆平高科农平种业有限公司。

分别提取其基因组DNA，并以此为模板，按照实施例1的方法，进行PCR扩增及电泳检测。根据产物(条带)的大小，可以把抗性基因Pi9与其他稻瘟病抗性基因区分开来。如图2所示，在抗谱表型为Pi9型的个体(携带有稻瘟病抗性基因Pi9的抗病品种IRBL9-W，泳道I的样品)中能检测到Pi9InDel基因特异性分子标记的存在，而其他的个体则不能检测到该大小的分子片段。可见，试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pi9基因特异性分子标记可在鉴别Pi9基因与其他稻瘟病抗性基因，包括Pi2/9基因簇等位基因等方面得到应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 淮阴师范学院, 江苏省农业科学院

<120> 一种稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记及其应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtttatctg gggagaagga aaaggagagg gagggggggg gagggtccac ttccagct 58

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtttatctg gggagaagg 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agctggaagt ggaccctc 18

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtttatctg gggagaagga aaaggagagg gagggggggg gggagggtcc acttccagct 60

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtttatctg gggagaagga aaaggagagg gagggggggg agggtccact tccagct 57

Claims

1.一种稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记，其特征在于命名为Pi9InDel，核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi9功能特异性分子标记，其特征在于携带有稻瘟病抗性基因Pi9的稻瘟病抗性品种为水稻抗病品种IRBL9-W。

3.权利要求1所述的分子标记在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因Pi9中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包含如下步骤: (1)扩增: 利用SEQ IDNO.2所示引物Fl和SEQ ID NO.3所示引物Rl对待检测的水稻品种的基因组进行PCR；(2)检测: PCR结果如下: ①若PCR结果为其它大小的带型，则待检测的水稻品种没有携带有稻瘟病抗性基因Pi9；②若PCR结果为58bp，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pi9 。

5.权利要求1所述的分子标记在鉴别Pi2/9基因簇区域不同的稻瘟病抗性基因中的应用。

6.一种鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的试剂盒，其特征在于核酸序列如SEQ ID NO.1所示的Pi9InDel，以及如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对。