CN106755471B

CN106755471B - 水稻抗稻瘟病基因Pilk(t)的连锁标记及其专用引物

Info

Publication number: CN106755471B
Application number: CN201710032746.4A
Authority: CN
Inventors: 王依然; 赵家铭; 于果; 马作斌
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-01-08
Filing date: 2017-01-08
Publication date: 2017-12-08
Anticipated expiration: 2037-01-08
Also published as: CN106755471A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种抗稻瘟病基因的分子标记及其专用引物。所述分子标记是一种水稻抗稻瘟病基因Pilk(t)的共显性分子标记Indel‑lk，它是用引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2从水稻总DNA中扩增出的核苷酸序列，可以应用于水稻稻瘟病抗性育种中Pilk(t)的分子标记辅助选择，以提高抗病品种选育的效率，减少田间鉴定的工作量。

Description

水稻抗稻瘟病基因Pilk(t)的连锁标记及其专用引物

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种抗稻瘟病基因的分子标记及其专用引物。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，世界上超过一半的人口以稻米为食。中国水稻种植约占全国耕地面积的25％，产量约占全国粮食总产量的50％，水稻是中国粮食安全和农业可持续发展的重要战略资源。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae无性态：Pyricularia)引起的稻瘟病，是水稻生产上最具毁灭性的病害之一，也是世界性的真菌病害。该病既可降低水稻产量，也可降低水稻的品质，已成为限制水稻生产的重要因素。研究表明，选育抗病水稻品种是防控稻瘟病的根本途径，而利用抗病基因的分子标记辅助选择抗病个体则是广为育种家采用的高效技术手段。但由于稻瘟病为小种特异性病害，病原菌和水稻互作遵循“基因对基因”模式，如果品种所携带的抗病基因对稻瘟病菌的抗谱狭窄，且品种单一化、集中化种植现象普遍，这样一旦稻瘟菌流行小种发生变化，品种对稻瘟病的抗性便迅速下降。因此，利用广谱抗性基因选育高抗水稻品种尤为必要。

辽开79为1991年由辽宁省稻作研究所育成的水稻品种，自育成以来，20多年在辽宁多个地区均对稻瘟病表现高抗性(http://www.ricedata.cn/variety/varis/602474.htm)，表明其携带具广谱抗性的抗稻瘟病基因，本发明在研究过程中将其与感病品种辽盐241杂交，通过单粒传的方式构建重组自交系群体(RIL6)，人工接种鉴定群体各个单系对稻瘟病的抗性，利用SLAF-BSA技术，最终从辽开79中定位到一个广谱抗病新基因Pilk(t)，位于第6染色体8.26-8.98Mb区间内(IRGSP 1.0)，并筛选到一个与该基因紧密连锁的分子标记Indel-lk。

发明内容

为了选育抗稻瘟病水稻品种，有针对性的、特异性的选择含Pilk(t)基因的后代材料，本发明提供一种用于检测水稻抗稻瘟病基因Pilk(t)的共显性分子标记Indel-lk，该分子标记根据Pilk(t)定位的区域在抗感亲本间的序列差异设计，多态性好，可高效用于Pilk(t)基因的辅助选择，以提高抗病品种选育的效率。

本发明提供如下解决方案：

一种用于检测水稻抗稻瘟病基因Pilk(t)是否存在的分子标记的引物对，如SEQID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

一种检测水稻亲本(作为亲本，基因是纯合的)中是否存在抗稻瘟病基因Pilk(t)的方法，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列为引物，扩增待检测基因组DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，获得片段长度为581bp扩增子的即为含有抗稻瘟病基因Pilk(t)。更进一步的，扩增子片段长度为403bp的水稻亲本即为不含有水稻抗稻瘟病基因Pilk(t)而含有其感病等位基因。

一种检测水稻杂交后代中是否存在抗稻瘟病基因Pilk(t)的方法，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示序列为引物，扩增待检测基因组DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，只获得片段长度为581bp扩增子的即为含有纯合抗稻瘟病基因Pilk(t)。更进一步的，扩增子包含长度分别为581bp及403bp两条片段的水稻杂交后代含有杂合抗稻瘟病基因Pilk(t)，而只获得片段长度为403bp扩增子的即为含有抗稻瘟病基因Pilk(t)的感病等位基因。

上述引物对优选对水稻苗期所提取的DNA进行标记鉴定，检测是否携带抗稻瘟病基因Pilk(t)，由于上述引物对是基于序列的插入缺失多态性设计的，因此检测方便，准确率高，该分子标记可以作为水稻稻瘟病抗病育种中Pilk(t)基因分子标记辅助选择的应用。

附图说明

图1是分子标记Indel-lk在抗稻瘟病基因Pilk(t)供体品种辽开79和7个感病水稻品种中扩增产物的琼脂糖凝胶电泳电泳图。

其中，M：2000bp分子量标记(Takara DL2000)，200ng；片段长度分别为：100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。

1：辽开79；2：辽盐241；3：辽星1号；4：丰锦；5：辽粳287；6：营8433；7：C418；8：丽江新团黑谷。

其中抗病基因供体品种辽开79扩增产物片段大小为581bp，而感病等位基因扩增产物片段长度为403bp。

图2是分子标记Indel-lk在以辽开79/辽星1号的F2群体中基因型分离的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

实施例1：DNA提取、PCR扩增和电泳分析

一、DNA提取(CTAB法)：

称取0.1～0.2g水稻叶片并剪成1cm长，在液氮中研磨，待液氮蒸发完后(注意：勿使样品融化)，迅速转入含65℃预热过的提取液(1M Tris pH 8.0，100mM；5M NaCl，1.0M；0.5M EDTA，20mM；10％CTAB，2.0％)400μL的离心管中。轻轻摇匀。

60～65℃水浴30～60分钟，每10分钟轻轻摇动均匀。

加等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，温和摇动，使成乳状液。

室温下(温度不低于15℃)，12000r/min离心5min，取上清液。

用大孔Tip头小心抽取上清液200μL加入预冷的2倍体积的无水乙醇，-20℃的条件下放置20分钟以上，5000r/min离心5分钟，收集沉淀。

70％乙醇洗涤沉淀1～2次。

打开管盖，放洁净场所晾干，乳白色的DNA沉淀透明即可。

100μLTE(Tris-Hcl 10mM，PH8.0；EDTA 1mM，PH8.0)溶解沉淀，并稀释至100μg/mL，-20℃保存备用。

二、PCR扩增：

PCR扩增反应在PCR扩增仪上进行。

1.反应体系如下：

2×Taq PCR Master Mix(艾德莱PC0902)10μL，10μM的引物各0.5μL，100μg/mL的模板DNA 1μL，ddH₂O 8μL。

3.PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸70s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

三、PCR产物检测

取4μL PCR产物，在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，经goldenview染色，应用凝胶成像系统记录试验结果。

实施例2：利用分子标记Indel-lk检测水稻育种亲本中是否存在抗稻瘟病基因Pilk(t)

以抗稻瘟病基因Pilk(t)供体品种辽开79和8个感病水稻品种(辽盐241，辽星1号，丰锦，辽粳287，营8433，C418，丽江新团黑谷)为试材，种植于温室。将辽宁地区流行的稻瘟病菌生理小种ZA1移植于燕麦片番茄汁琼脂培养基上，25～27℃条件下培养5～7d，待菌丝长满，用灭菌的棉签擦掉气生菌丝后保湿培养，稻瘟病菌大量产孢。待9个品种稻苗长至5叶1心时，将上述扩繁培养的各菌株分生孢子分别用120ml无菌水清洗，用双层纱布过滤装入三角瓶中，配制孢子悬液(浓度为120倍显微镜视野下有20个左右孢子)，分别隔离喷雾接种。接种后24h，用塑料膜覆于塑料盘上方的铁架上保湿，在塑料膜上覆盖遮阳网防止阳光直射。于接种后10d调查，致病反应型和小种确定按全国稻瘟病菌生理小种联合试验组(1980)统一标准进行评定。

调查记载标准：

0级无病...........................................................................高抗(HR)

1级仅有针尖大小的褐点.............................................................抗(R)

2级稍大的褐点.....................................................................抗(R)

3级圆形稍大的灰色小病斑，边缘褐色，病斑直径1～2mm.................................中抗(MR)

4级典型纺锤形病斑，长1～2cm，通常局限于两条主脉之间。为害面积2％以

下.................................................................................中感(MS)

5级典型病斑，为害面积3％～10％....................................................中感(MS)

6级典型病斑，为害面积11％～25％...................................................感(S)

7级典型病斑，为害面积26％～50％...................................................感(S)

8级典型病斑，为害面积51％～75％...................................................高感(HS)

9级全部叶片枯死...................................................................高感(HS)

接种鉴定结果表明，抗稻瘟病基因Pilk(t)供体品种辽开79对辽宁地区流行的稻瘟病菌生理小种ZA1表现为抗病(R)，而辽盐241、辽星1号、丰锦、辽粳287、营8433、C418、辽粳371和丽江新团黑谷对ZA1表现为感病(S)。

在苗期按实施例1所述方法提取DNA，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物进行PCR扩增，扩增结果如图1所示：Pilk(t)供体品种辽开79的扩增子长度为581bp，而另外7个感病品种扩增子长度均为403bp。

以上结果表明，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为引物进行PCR扩增的片段可以作为检测水稻品种中抗稻瘟病基因Pilk(t)是否存在的标记。含有1条581bp片段的品种可确定为携带抗稻瘟病基因Pilk(t)，而含有1条片段长度为403bp的品种不携带该抗病基因。

结论：用分子标记Indel-lk可以可靠地的检测水稻育种亲本中抗稻瘟病基因Pilk(t)的存在。

实施例3：利用分子标记Indel-lk从杂交后代中筛选携带纯合抗稻瘟病基因Pilk(t)的个体。

以抗稻瘟病基因Pilk(t)供体品种辽开79为父本，以感病品种辽星1号为母本，F₁代自交获F₂代，F₂群体正常栽植于温室，于5叶1心期按实施例2所述方法对群体中每个个体进行接种鉴定，于6叶期按实施例1所述方法提取F₂代群体各单株DNA，以SEQ ID NO：1和SEQID NO：2为引物进行PCR扩增，扩增结果如图2所示。接种鉴定及基因扩增的结果表明，F₂群体中凡扩增子为1条长度约581bp片段的个体对稻瘟病均表现抗病。

结论：Indel-lk可以高效地用于杂交后代中携带抗稻瘟病基因Pilk(t)纯合个体的筛选。

Claims

1.一种用于检测水稻抗稻瘟病基因Pilk(t)是否存在的分子标记的引物对，如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示。

2.一种检测水稻亲本中是否存在抗稻瘟病基因Pilk(t)的方法，以SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示序列为引物，扩增待检测基因组DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，获得片段长度为581bp扩增子的即为含有抗稻瘟病基因Pilk(t)。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，扩增子长度为403bp的水稻亲本即为不含有水稻抗稻瘟病基因Pilk(t)而含有其感病等位基因。

4.一种检测水稻杂交后代DNA中是否存在纯合抗稻瘟病基因Pilk(t)的方法，以SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示序列为引物，扩增待检测基因组DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，只获得片段长度为581bp扩增子的即为含有纯合抗稻瘟病基因Pilk(t)。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，只获得扩增子长度为403bp的水稻杂交后代即为不含有抗稻瘟病基因Pilk(t)而含有其感病等位基因。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，获得片段长度为581和403bp两个扩增子的水稻杂交后代即为含有杂合抗稻瘟病基因Pilk(t)。