CN108410947A - 一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法 - Google Patents

一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法，包括以下步骤：对水稻进行纹枯病菌株接种；选出具有抗纹枯病性状的水稻进行自交，得到F1；对F1进行纹枯病菌株接种，选出具有抗纹枯病性状的水稻；提取水葫芦基因组DNA进行酶切，获得酶切水葫芦基因组DNA；将获得的酶切水葫芦基因组DNA导入具有抗纹枯病性状的F1水稻中，将F1进行育种，得到F2；提取F2基因组DNA，以分子标记所示的引物进行PCR扩增，PCR扩增的产物在6%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测目标基因的存在。通过本发明育种得到的水稻具有极高的抗纹枯病能力，大大提高了育种效率，在分子育种技术上选育抗病型水稻具有积极的意义。

Description

一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法。
背景技术
纹枯病，水稻纹枯病又称云纹病，俗名花足秆、烂脚瘟、眉目斑，是由立枯丝核菌侵染引起的一种真菌病害，是水稻发生最为普遍的主要病害之一，一般早稻重于晚稻，往往造成谷粒不饱满，空壳率增加，严重的可引起植株倒伏枯死。
该病使水稻不能抽穗，或抽穗的秕谷较多，粒重下降。苗期至穗期都可发病。叶鞘染病 在近水面处产生暗绿色水浸状边缘模糊小斑，后渐扩大呈椭圆形或云纹形，中部呈灰绿或灰褐色，湿度低时中部呈淡黄或灰白色，中部组织破坏呈半透明状，边缘暗褐。发病严重时数个病斑融合形成大病斑，呈不规则状云纹斑，常致叶片发黄枯死。叶片染病病斑也呈云纹状，边缘褪黄，发病快时病斑呈污绿色，叶片很快腐烂，茎秆受害症状似叶片，后期呈黄褐色，易折。
申请公布日为2015年06月03日的专利CN104663746 ，公开了一种水稻纹枯病的生物防治方法，采用了质量分数为0.1%-5%的水葫芦种子提取物浸膏，来对水稻的纹枯病进行生物防治，并取得了一定的效果。然而在实际使用中，提取物浸膏难以在不同环境中难以保持其抗病的稳定性，例如当气温等因素，且实际的水稻种植环境也容易受外界的影响，一旦水葫芦种子提取物浸膏的性质受到环境影响，其防治效果将大大下降。
发明内容
为解决上述背景技术中提到的生物防治方法的防治效果受环境因素影响大的问题，本发明提供一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法，包括以下步骤：
步骤A、对“南粳0212”水稻进行纹枯病菌株接种；
步骤B、选出具有抗纹枯病性状的“南粳0212”水稻进行自交，得到F1；
步骤C、对F1进行纹枯病菌株接种，选出具有抗纹枯病性状的“南粳0212”；
步骤D、提取水葫芦基因组DNA，并用限制性内切酶进行酶切，获得酶切水葫芦基因组DNA；
步骤E、采用花粉管通道法将步骤D获得的酶切水葫芦基因组DNA导入具有抗纹枯病性状的“南粳0212”F1水稻中，将F1进行育种，得到F2；
步骤F、提取F2基因组DNA，以分子标记sh1443-1所示的引物进行PCR扩增，PCR扩增的产物在6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的分子标记片段，标志着目标基因的存在。
进一步地，步骤D中，所述限制性内切酶为NheI和XbaI。
进一步地，所述sh1443-1所示的引物为：
sh1443-1F：5’-GCTATTAACTAACCAGCTCAT-3’;
sh1443-1R：5’-CTAGTTGGGCGCAACGATGA-3’。
进一步地，步骤F中，对应分子标记片段的大小为640bp。
进一步地，步骤E中，所述酶切水葫芦基因组DNA溶液的浓度为100-200μg/ml。
进一步地，步骤D中，提取水葫芦基因组DNA的方法包括：
d1、取水葫芦种子置于45℃-70℃的烘箱中干燥4-8小时后，用粉碎机粉碎；
d2、将粉碎后的水葫芦种子用液氮研磨，加入2倍CTAB提取缓冲液混匀后，涡旋震荡1-3min，加入1倍CTAB缓冲液，55-65℃恒浴30min；
d2、向步骤d1获得的溶液中加入体积比为2:1-4：1的氯仿和异戊醇，混合后离心；
d3、向步骤d2获得的上清液中用体积比为2:1-4：1的氯仿和异戊醇再抽提1 次；
d4、向步骤d3获得的上清液中加入2.5 倍体积的冷冻异丙醇，离心，得到的沉淀用高盐缓冲液溶解后离心；
d5、向步骤d4获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀加入NaCl，重新溶解，再加入等体积的氯仿/异戊醇抽提；
d6、取步骤d5获得上清液加入1.0-3.0倍体积70%冷乙醇于-40℃环境中沉淀后离心；
d7、将步骤d6获得的沉淀用用70%的酒精清洗2 次，抽干后，用TE缓冲液溶解，即获得水葫芦基因组DNA。
进一步地，所述的PCR 扩增的反应体系为：5×Taq PCR Master Mix13 .5μL，3pmol/μl的所述分子标记引物对1μl，2.5 mM dNTPs 0.2μl，5U/μl的Taq 酶0.1μl，10 ng/μl基因组模板DNA1μl，加ddH2O至总体积20μL ；
反应程序为：DNA 95 ℃预变性 5 min后；94 ℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；最后72℃延伸10min。
本发明提供的利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法，先通过环境筛选，选育出具有较高抗纹枯病性状的水稻，之后导入水葫芦的特定基因，通过分子标记筛选出成功导入水葫芦特定基因的水稻。通过本发明提供的水稻纹枯病的生物防治方法育种得到的水稻具有极高的抗纹枯病能力，且大大提高了育种效率，由于采用了基因育种的方式，其抗病性能具有更高的稳定性，在分子育种技术上选育抗病型水稻具有积极的意义。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供以下实施例：
1.育苗
选取“南粳0212”水稻，于5月中旬前将参鉴品种用药剂浸种2天后，催芽2天，进行播种，行距为15厘米，不同品种间空出一行。保温、保水、培养一个月后间苗，同时播种对照品种。田间肥、水管理与常规生产一致。接种前和接种后15天内应避免施用任何农药。
2.接种
（1）接种体准备
采用上一年鉴定的江苏省水稻纹枯病菌中等致病力RH-2菌株。接种前，将上述菌株分别移植在马铃薯液体培养基，在25°C下培养96小时后，待菌丝长满整个培养皿时，取出培养皿中长满菌丝的牙签接种。
（2）接种时期
水稻分蘖期，在阴天或傍晚时分接种。
（3）接种方法
把长有菌丝的牙签插入水稻中下部的叶鞘内。
3.病情调查
孕穗末期调查（抽穗后30天）试验结果，从接种的水稻叶片中选取外观完整的植株测量病斑长度和该稻株本身的高度。病情调查时以水稻基部向上扩展的病斑为准，观测病斑在稻株上的垂直扩展程度。当水稻的上部某一叶片（如剑叶）上具有纹枯病病斑，而其叶鞘以及以下 2～3片叶未发病，则该叶片上的病斑不作为病情记载，因为此病斑极有可能为叶片接触其余稻株发病部位而形成。部分可疑病株（如可能由虫害或其它病害引起的病株）不记入调查结果。
表1为病情评价标准，其中比值=病斑扩展长度/对应植株高度。
表1
抗性类型 比值
抗病 <=0.2
中抗 0.21-0.4
感病 0.41-0.6
高感 >0.6
筛选 “南粳0212”水稻时，以抗病类型（即比值小于等于0.2）为具有抗纹枯病性状的样本；
本发明提供的利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法，首先采用传统的环境性状选择，筛选出本身具有高比例抗纹枯病性状的水稻。发明人通过大量研究和实验，利用水葫芦中具有抗纹枯病的基因以及分子标记法，对“南粳0212”水稻进行了抗病选育种，具体实施例如下：
实施例一
1、提取水葫芦基因组DNA：
d1、取水葫芦种子置于60℃的烘箱中干燥6小时后，用粉碎机粉碎；
d2、将粉碎后的水葫芦种子用液氮研磨，加入2倍CTAB提取缓冲液混匀后，涡旋震荡3min，加入1倍CTAB缓冲液，55℃恒浴30min；
d2、向步骤d1获得的溶液中加入体积比为2:1的氯仿和异戊醇，混合后离心；
d3、向步骤d2获得的上清液中用体积比为2:1的氯仿和异戊醇再抽提1 次；
d4、向步骤d3获得的上清液中加入2.5 倍体积的冷冻异丙醇，离心，得到的沉淀用高盐缓冲液溶解后离心；
d5、向步骤d4获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀加入NaCl，重新溶解，再加入等体积的氯仿/异戊醇抽提；
d6、取步骤d5获得上清液加入1.5倍体积70%冷乙醇于-40℃环境中沉淀后离心；
d7、将步骤d6获得的沉淀用用70%的酒精清洗2 次，抽干后，用TE缓冲液溶解，即获得水葫芦基因组DNA。
2、将获得的水葫芦基因组DNA用限制性内切酶所述限制性内切酶为NheI和XbaI进行酶切，获得特定的酶切水葫芦基因组DNA。
3、采用花粉管通道法将步骤D获得的酶切水葫芦基因组DNA导入具有抗纹枯病性状（抗病类型，即比值小于等于0.2）的“南粳0212”F1水稻中，将F1进行育种，得到F2；
4、步骤F、提取F2基因组DNA，以分子标记sh1443-1所示的引物进行PCR扩增，PCR扩增的产物在6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小（大小为640bp）的分子标记片段，标志着目标基因的存在。
实施例二
1、提取水葫芦基因组DNA：
d1、取水葫芦种子置于45℃的烘箱中干燥8小时后，用粉碎机粉碎；
d2、将粉碎后的水葫芦种子用液氮研磨，加入2倍CTAB提取缓冲液混匀后，涡旋震荡2min，加入1倍CTAB缓冲液，60℃恒浴30min；
d2、向步骤d1获得的溶液中加入体积比为3:1的氯仿和异戊醇，混合后离心；
d3、向步骤d2获得的上清液中用体积比为2:1的氯仿和异戊醇再抽提1 次；
d4、向步骤d3获得的上清液中加入2.5 倍体积的冷冻异丙醇，离心，得到的沉淀用高盐缓冲液溶解后离心；
d5、向步骤d4获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀加入NaCl，重新溶解，再加入等体积的氯仿/ 异戊醇抽提；
d6、取步骤d5获得上清液加入2倍体积70%冷乙醇于-40℃环境中沉淀后离心；
d7、将步骤d6获得的沉淀用用70%的酒精清洗2 次，抽干后，用TE缓冲液溶解，即获得水葫芦基因组DNA。
2、将获得的水葫芦基因组DNA用限制性内切酶所述限制性内切酶为NheI和XbaI进行酶切，获得特定的酶切水葫芦基因组DNA。
3、采用花粉管通道法将步骤D获得的酶切水葫芦基因组DNA导入具有抗纹枯病性状（抗病类型，即比值小于等于0.2）的“南粳0212”F1水稻中，将F1进行育种，得到F2；
4、步骤F、提取F2基因组DNA，以分子标记sh1443-1所示的引物进行PCR扩增，PCR扩增的产物在6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小（大小为640bp）的分子标记片段，标志着目标基因的存在。
实施例三
1、提取水葫芦基因组DNA：
d1、取水葫芦种子置于70℃的烘箱中干燥4小时后，用粉碎机粉碎；
d2、将粉碎后的水葫芦种子用液氮研磨，加入2倍CTAB提取缓冲液混匀后，涡旋震荡3min，加入1倍CTAB缓冲液，65℃恒浴30min；
d2、向步骤d1获得的溶液中加入体积比为4:1的氯仿和异戊醇，混合后离心；
d3、向步骤d2获得的上清液中用体积比为4:1的氯仿和异戊醇再抽提1 次；
d4、向步骤d3获得的上清液中加入2.5 倍体积的冷冻异丙醇，离心，得到的沉淀用高盐缓冲液溶解后离心；
d5、向步骤d4获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀加入NaCl，重新溶解，再加入等体积的氯仿/ 异戊醇抽提；
d6、取步骤d5获得上清液加入2倍体积70%冷乙醇于-40℃环境中沉淀后离心；
d7、将步骤d6获得的沉淀用用70%的酒精清洗2 次，抽干后，用TE缓冲液溶解，即获得水葫芦基因组DNA。
2、将获得的水葫芦基因组DNA用限制性内切酶所述限制性内切酶为NheI和XbaI进行酶切，获得特定的酶切水葫芦基因组DNA。
3、采用花粉管通道法将步骤D获得的酶切水葫芦基因组DNA导入具有抗纹枯病性状（抗病类型，即比值小于等于0.2）的“南粳0212”F1水稻中，将F1进行育种，得到F2；
4、步骤F、提取F2基因组DNA，以分子标记sh1443-1所示的引物进行PCR扩增，PCR扩增的产物在6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小（大小为640bp）的分子标记片段，标志着目标基因的存在。
将三个实施例通过分子筛选得到的抗纹枯病水稻和未经过选育的“南粳0212”水稻（对比例1）以及经过抗病表现性状选育得到的“南粳0212”F2（对比例2）进行抗纹枯病接种，并根据表1的评价标准进行评价，各实施例和对比例采用的样本均为50株，记录各抗性类型的数量（单位：株），结果如表2所示：
表2
抗性类型 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
抗病 49 50 50 3 12
中抗 1 0 0 5 8
感病 0 0 0 6 16
高感 0 0 0 36 14
将实施例一通过分子筛选得到的抗纹枯病水稻和专利CN104663746公布的一种水稻纹枯病的生物防治方法中质量分数为1%的水葫芦提取物的清水稀释液体（对比例3）进行处理的水稻，分别在不同温度下的对水稻抗性类型进行测试和统计，每个温度下的水稻各20株，结果如表3所示：
表3
发明人通过大量实验，在水葫芦基因组DNA中，通过引物：
sh1443-1F：5’-GCTATTAACTAACCAGCTCAT-3’;
sh1443-1R：5’-CTAGTTGGGCGCAACGATGA-3’
得到基因片段sh1443-1，经过反复测试，证实了导入片段的水稻具有一定的抗纹枯病效果；在此基础上，本发明先通过环境筛选，选育出具有较高抗纹枯病性状的水稻，之后导入水葫芦（中文学名：凤眼蓝；拉丁文名：Eichhornia crassipes (Mart.) Solms）的抗病基因sh1443-1，并采用分子标记筛选出成功导入水葫芦特定基因的水稻，通过以上测试可以看出，通过本发明提供的水稻纹枯病的生物防治方法育种得到的水稻具有极高的抗纹枯病能力，且大大提高了育种效率。对比例3的生物药物由于是在外部对水稻进行抗病处理，其药性容易收到外界环境的影响，而本发明实施例由于采用了基因育种的方式，使得抗病能力是以基因形式存在于水稻内部的，因此具有更高的稳定性，在分子育种技术上选育抗病型水稻具有积极的意义。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A、对“南粳0212”水稻进行纹枯病菌株接种；
步骤B、选出具有抗纹枯病性状的“南粳0212”水稻进行自交，得到F1；
步骤C、对F1进行纹枯病菌株接种，选出具有抗纹枯病性状的“南粳0212”；
步骤D、提取水葫芦基因组DNA，并用限制性内切酶进行酶切，获得特定酶切水葫芦基因组DNA；
步骤E、采用花粉管通道法将步骤D获得的酶切水葫芦基因组DNA导入具有抗纹枯病性状的“南粳0212”F1水稻中，将F1进行育种，得到F2；
步骤F、提取F2基因组DNA，以分子标记sh1443-1所示的引物进行PCR扩增，PCR扩增的产物在6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的分子标记片段，标志着目标基因的存在。
2.根据权利要求1所述的一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法，其特征在于：步骤D中，所述限制性内切酶为NheI和XbaI。
3.根据权利要求1所述的一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法，其特征在于，所述sh1443-1所示的引物为：
sh1443-1F：5’-GCTATTAACTAACCAGCTCAT-3’;
sh1443-1R：5’-CTAGTTGGGCGCAACGATGA-3’。
4.根据权利要求1所述的一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法，其特征在于：步骤F中，对应分子标记片段的大小为640bp。
5.根据权利要求1所述的一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法，其特征在于：步骤E中，所述酶切水葫芦基因组DNA溶液的浓度为100-200μg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法，其特征在于，步骤D中，提取水葫芦基因组DNA的方法包括：
d1、取水葫芦种子置于45℃-70℃的烘箱中干燥4-8小时后，用粉碎机粉碎；
d2、将粉碎后的水葫芦种子用液氮研磨，加入2倍CTAB提取缓冲液混匀后，涡旋震荡1-3min，加入1倍CTAB缓冲液，55-65℃恒浴30min；
d2、向步骤d1获得的溶液中加入体积比为2:1-4：1的氯仿和异戊醇，混合后离心；
d3、向步骤d2获得的上清液中用体积比为2:1-4：1的氯仿和异戊醇再抽提1 次；
d4、向步骤d3获得的上清液中加入2.5 倍体积的冷冻异丙醇，离心，得到的沉淀用高盐缓冲液溶解后离心；
d5、向步骤d4获得的上清液中加入异丙醇，离心，得到的沉淀加入NaCl，重新溶解，再加入等体积的氯仿/异戊醇抽提；
d6、取步骤d5获得上清液加入1.0-3.0倍体积70%冷乙醇于-40℃环境中沉淀后离心；
d7、将步骤d6获得的沉淀用用70%的酒精清洗2 次，抽干后，用TE缓冲液溶解，即获得水葫芦基因组DNA。
7.根据权利要求1所述的一种利用分子标记辅助选择抗纹枯病水稻的方法，其特征在于：
所述的PCR 扩增的反应体系为：5×Taq PCR Master Mix13 .5μL，3 pmol/μl的所述分子标记引物对1μl，2.5 mM dNTPs 0.2μl，5 U/μl的Taq 酶0.1μl，10ng/μl基因组模板DNA 1μl，加ddH2O至总体积20μL ；
反应程序为：DNA 95℃预变性5 min后；94℃变性30 s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环25次；最后72℃延10min。
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