CN102599047A

CN102599047A - 一种分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法

Info

Publication number: CN102599047A
Application number: CN2012100851796A
Authority: CN
Inventors: 马正强; 薛树林; 李国强; 郜忠霞
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2012-07-25

Abstract

本发明公开了一种分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法。以携带抗扩展QTL的重组自交家系为供体，以综合性状优良但感赤霉病的品系为受体，进行杂交并回交。在每个回交世代利用与目标QTL紧密连锁的两侧标记进行前景选择，同时利用分布于整个小麦基因组的150对SSR标记对携带有目标QTL的单株进行背景选择，选择背景回复率最高的单株用于下一代回交。连续回交3代再自交2代后可以获得抗性得到明显改善，其它性状与轮回亲本基本一致的近等基因系。本发明通过提取回交后代苗期叶片的DNA，并进行标记基因型分析，可获得目标单株，有效解决了表型选择中赤霉病抗性易受环境条件影响以及抗病表型要到开花期才能鉴定的问题；同时还能减少群体规模，降低育种成本，快速有效地改良小麦品系的抗赤霉病扩展性。

Description

一种分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法

一、技术领域

本发明一种分子标记辅助回交快速提高小麦抗赤霉病扩展性的方法，属于作物分子育种领域，专用于小麦抗赤霉病扩展种质的选育与鉴定。

二、背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，其产品对人类的食品安全不可或缺。由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)引起的赤霉病是小麦生产上的一种重要病害，广泛发生于温暖潮湿和半潮湿地区。其危害包括不育、种子饱满度降低，致使产量严重下降，一般减产10～15％，有时可高达50％。病麦粒中还含有毒素(主要是脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON)，食用后会直接危害人、畜的健康。由于全球气候变暖和耕作制度的改变，赤霉病正从传统的流行麦区如长江中下游麦区、南部沿海麦区、黑龙江东部麦区逐渐向其它麦区如华北的山东、山西、河南、河北，西南的四川，西北的宁夏、甘肃、青海等省份扩展。近十年来，即使加强了对赤霉病的防治，我国平均每年仍有30万吨以上的小麦因该病而受损。2003年，安徽省小麦赤霉病发病面积达1,500万亩，产量损失约6亿公斤，同年江苏省也发生赤霉病大流行。近五年来，在长江中下游麦区，赤霉病发生异常频繁，都达到了中等偏重的程度。鉴于小麦赤霉病对粮食安全和食品安全构成的严重威胁，提高小麦对赤霉病的抗性成为亟待解决的重大科学问题。

小麦对赤霉病的抗性包含五种类型：抗扩展(type I)、抗扩展(type II)、降解毒素(type III)、降低籽粒病粒率(type IV)和减少产量损失或耐病性(type V)。其中抗扩展是到目前为止研究的最多的一种抗性类型，在降低赤霉病对小麦产量和品质的影响中起着重要的作用。但是，高抗赤霉病的小麦种质资源非常匮乏，目前许多抗扩展遗传研究都集中在苏麦3号及其衍生系上。望水白是我国特有的抗赤霉病种质，其抗赤霉病扩展表现甚至要优于苏麦3号。在望水白的3B染色体上存在1个主效抗扩展QTL Qfhs.nau-3B，在各次实验中均可以解释20％以上的表型变异(Ma et al.2005)。

运用回交手段对一些优良小麦品系的个别缺点进行改良是一个十分有效的措施。但是对于小麦赤霉病抗性的改良来说存在很多困难：首先，小麦赤霉病抗性是一种非常复杂的数量性状，由多基因控制且受环境条件影响较大，表型鉴定非常困难。其次，小麦赤霉病是一种穗部病害，要等到开花后才能评价是否抗病，而此时已无法直接配置杂交组合。再次，有些抗赤霉病QTL属于隐性遗传，回交一代后必须自交一代，鉴定出抗病单株后才能继续回交。因此，采用传统的回交育种方法改良小麦的赤霉病抗性费时费力，这严重阻碍了抗源在抗赤霉病育种中的有效利用。

三、发明内容

本发明的目的在于针对背景技术提出的技术问题提供一种育种周期短、效率高的分子标记辅助选择培育抗赤霉病扩展小麦新品系的方法，该方法能快速有效地改良现有品系的赤霉病抗性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法，包括以下步骤：

1)以携带抗扩展QTL的重组自交家系为供体，以综合性状优良但感赤霉病的小麦品系为受体，进行常规有性杂交，所得的杂种F₁代再与轮回亲本回交，得到回交一代BC₁F₁分离群体，种植于田间；

2)在苗期提取BC₁F₁分离群体中各单株的DNA，并利用与目标QTL紧密连锁的SSR标记进行PCR检测，选择含有目标QTL的杂合型单株继续与轮回亲本杂交获得BC₂F₁分离群体；

3)在苗期提取BC₂F₁分离群体中各单株的DNA，继续利用与目标QTL紧密连锁的SSR标记进行PCR检测，筛选含有目标QTL的杂合型单株；再选择分布于整个小麦基因组的150对SSR标记对含有目标QTL的单株进行背景回复率分析，选择背景回复率最高的单株继续回交获得BC₃F₁分离群体；

4)重复步骤3)，获得携带目标QTL且背景回复率最高的BC₃F₁目标单株后自交获得BC₃F₂分离群体，种植于田间；

5)在苗期提取BC₃F₂分离群体中各单株的DNA，重复步骤3)，选择携带目标QTL且背景回复率最高的纯合单株自交，获得BC₃F₃纯合家系；

6)将中选BC₃F₃纯合家系与轮回亲本一起种植于田间进行多环境抗性表型鉴定。

上述的分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法，所述PCR检测的方法包括以下步骤：

1)用SDS法提取各世代群体中单株的DNA。

2)利用与目标QTL Qfhs.nau-3B紧密连锁的两侧SSR标记ZMB67和HBE383对上述基因组DNA进行PCR扩增。

3)对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析带型。在供体亲本中ZMB67的扩增条带为110bp，HBE383的扩增条带为245bp。凡呈现有与供体亲本相同大小的DNA条带的单株即为目标单株。

上述的分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法，利用随机选择的SSR标记进行背景选择包括以下步骤：

1)根据小麦遗传图谱(Xue SL，Zhang ZZ，Lin F，Kong ZX，Cao Y，Li CJ，Yi HY，Mei MF，Zhao DM，Zhu HL，Xu HB，Wu JZ，Tian DG，Zhang CQ，Ma ZQ(2008)A high-density intervarietal map of the wheat genome enriched with markers derived from expressed sequence tags.Theor Appl Genet 117：181-189)每隔20-30cM选择一个标记，共选择了分布于21条染色体的150对SSR标记用于目标单株的PCR扩增；

2)对PCR扩增产物进行凝胶电泳，分析带型，计算背景回复率；携带有最多的与受体亲本完全一致带型的单株即为目标单株，用于下一代回交或自交。

上述的分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法，所述的供体为从南大2419×望水白重组自交系群体中选出的携带抗扩展QTL Qfhs.nau-3B的家系SSD129；所述的受体为绵阳99-323，所述的轮回亲本为绵阳99-323。

本发明技术方案的详细步骤为：

1)根据Qfhs.nau-3B的两侧标记ZMB67和HBE383的标记基因型资料从南大2419×望水白重组自交系群体中选择携带目标QTL的株系SSD129作为供体亲本，选择来自四川的一个大穗、大粒新品系绵阳99-323作为轮回亲本，进行常规有性杂交，所得的杂种F₁代再与轮回亲本回交，得到回交一代BC₁F₁分离群体，种植于田间。

2)在苗期提取分离群体中各单株的DNA，并利用SSR引物ZMB67和HBE383进行PCR检测，选择含有目标等位基因的杂合型单株继续与轮回亲本杂交获得BC₂F₁分离群体。所用引物的序列信息如下：

表1引物序列信息

3)在苗期提取BC₂F₁分离群体中各单株的DNA，并利用与Qfhs.nau-3B紧密连锁的两侧标记进行PCR检测，选择含有目标QTL的杂合型单株。再选择分布于整个小麦基因组的150对SSR标记对含有目标QTL的单株进行背景回复率分析，选择背景回复率最高的单株继续与轮回亲本杂交获得BC₃F₁分离群体。

4)在苗期提取BC₃F₁分离群体中各单株的DNA，重复步骤3)。选择背景回复率最高且携带Qfhs.nau-3B的杂合单株进行自交获得BC₃F₂分离群体，种植于田间。

5)在苗期提取BC₃F₂分离群体中各单株的DNA，重复步骤3)。选择背景回复率最高且携带Qfhs.nau-3B的纯合单株自交，获得BC₃F₃纯合家系。

6)将中选BC₃F₃纯合家系与轮回亲本一起种植于田间，试验设置两年两点四个环境，每个环境设置两次重复。于开花期进行单花滴注法接种，接种后21天调查病小穗数(NDS)和病轴长度(LDR)，对所育近等基因系的抗赤霉病扩展性进行评价。

所述采用的PCR检测方法包括以下详细步骤：

1)在4-5叶期取叶片，用SDS法提取各世代群体中单株的DNA。

2)利用SSR引物对亲本及群体DNA进行PCR扩增：PCR反应体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl21.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，10μM引物(F/R)各0.5微升，Taq酶5单位/微升0.2微升，模板DNA 40纳克，加水至25微升；SSR反应体系为94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，52-60℃退火50秒，72℃延伸50秒，循环35次，最后72℃延伸5分钟。

3)在PTC-225扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后银染、照相，记录结果。

本发明的有益效果：

1)通过分子标记辅助选择在回交一代后不需要自交就可以进行下一代回交，因此育种周期短、费用低、效率高。

2)本发明用回交转育和分子标记相结合的手段，利用与目标QTL紧密连锁的分子标记进行辅助选择，快速成功地将Qfhs.nau-3B导入到优良品系绵阳99-323中，显著改善了其抗赤霉病扩展性。

3)本发明中在BC₂F₁、BC₃F₁以及BC₃F₂代都选择了分布于整个小麦基因组的150对SSR标记对中选单株进行遗传背景分析，回交3代即可获得背景回复率达99％以上的近等基因系材料，而常规方法需要7-8代才能达到这个回复率。使用本方法还能显著减少各世代群体的大小，仅需要40-50个单株就可以选到携带目标基因且背景回复率远超过理论值的单株，大大提高了育种选择效率。

4)本发明提出利用与抗赤霉病扩展QTL紧密连锁分子标记进行标记辅助回交，可以快速地将抗病基因导入到大面积推广的优良品种中，使其赤霉病抗性得到改良，从而加快新品种推广速度，更快地产生巨大的社会经济效益。

四、附图说明

图1ZMB67的扩增带型

M表示marker，SSD129、MY(绵阳99-323)为亲本，1-18为BC₃F₂群体中部分单株。

图2HBE383的扩增带型

图3利用CFD152进行背景回复率分析的扩增带型

M表示marker，SSD129、MY(绵阳99-323)为亲本，1-15为BC₃F₂群体中15个携带Qfhs.nau-3B的纯合单株。

图4采用单花滴注法接种21天后所育近等基因系与轮回亲本绵阳99-323的抗扩展表现

五、具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所用的试验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂公司。

以南大2419×望水白重组自交系群体中携带Qfhs.nau-3B的抗病家系SSD129为供体亲本，以来自四川省的一个半矮杆、茎秆粗壮、穗大粒重、中抗白粉病，但高感赤霉病的新品系绵阳99-323作为轮回亲本，配置杂交组合，并连续回交3次。在每一个回交世代利用与Qfhs.nau-3B紧密连锁的分子标记进行前景选择。从BC₂F₁到BC₃F₂世代选择分布于整个小麦基因组的150对SSR标记用于进行背景选择，加快除了目标QTL以外的区域向轮回亲本的恢复。在BC₃F₂世代，选择背景回复率最高且携带Qfhs.nau-3B的纯合型单株进行自交，对自交后代进行多环境抗病性鉴定，评价导入QTL的效应。

实施例1用与目标QTL紧密连锁的SSR标记辅助回交提高小麦品系的抗扩展性

以小麦品系绵阳99-323为母本与抗赤霉病供体亲本SSD129杂交，得到F₁；再以绵阳99-323为轮回亲本回交，得到BC₁F₁。将BC₁F₁分离群体按单株方式种植于田间，苗期挂牌、提取各单株DNA，利用与目标QTL紧密连锁的SSR标记分析基因型，选择携带目标QTL的杂合型单株继续回交得到BC₂F₁。利用类似的方式选择单株继续回交得到BC₃F₁。在BC₃F₁分离群体中根据标记基因型选择携带目标QTL的纯合型单株自交获得近等基因系。一共包括1代杂交，3代回交和2代自交。

详细过程为：

1.根据Qfhs.nau-3B的两侧标记ZMB67和HBE383的标记基因型资料从南大2419×望水白重组自交系群体中选择携带目标QTL的株系SSD129作为供体亲本，选择来自四川的一个大穗、大粒新品系绵阳99-323作为轮回亲本，进行常规有性杂交，所得的杂种F₁代再与轮回亲本回交，得到回交一代BC₁F₁分离群体，种植于田间。

2.在苗期提取分离群体中各单株的DNA，并利用SSR标记ZMB67和HBE383进行PCR检测。PCR检测方法包括以下详细步骤：1)在4-5叶期取叶片，用SDS法提取各世代群体中单株的DNA。2)利用SSR引物对亲本及群体DNA进行PCR扩增：PCR反应体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl21.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，10μM引物(F/R)各0.5微升，Taq酶5单位/微升0.2微升，模板DNA40纳克，加水至25微升；SSR反应体系为94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，52-60℃退火50秒，72℃延伸50秒，循环35次，最后72℃延伸5分钟。3)在PTC-225扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后银染、照相，记录结果。选择含有Qfhs.nau-3B的杂合型单株继续与轮回亲本杂交获得BC₂F₁分离群体。所用引物的序列信息如表1。

3.在苗期提取BC₂F₁分离群体中各单株的DNA，并利用与Qfhs.nau-3B紧密连锁的两侧标记进行PCR检测(PCR检测方法同步骤2)，选择含有单个目标QTL的杂合型单株。再选择分布于整个小麦基因组的150对SSR标记对含有目标QTL的单株进行背景回复率分析，选择背景回复率最高的单株继续与轮回亲本杂交获得BC₃F₁分离群体。

4.在苗期提取BC₃F₁分离群体中各单株的DNA，重复步骤3，选择背景回复率最高且含有Qfhs.nau-3B的杂合单株进行自交获得BC₃F₂分离群体，种植于田间。

5.在苗期提取BC₃F₂分离群体中各单株的DNA，重复步骤3，选择背景回复率最高且携带Qfhs.nau-3B的纯合单株自交，获得BC₃F₃纯合家系。

6.将中选BC₃F₃纯合家系与轮回亲本一起种植于田间，试验设置两年两点四个环境，每个环境设置两次重复。于开花期进行单花滴注法接种，接种后21天调查病小穗数(NDS)和病轴长度(LDR)，对所育近等基因系的抗赤霉病扩展性进行评价。

结果显示：在BC₁F₁代选择到一个携带Qfhs.nau-3B的杂合型单株；在包含47个单株的BC₂F₁代分离群体中筛选到19个携带Qfhs.nau-3B的杂合型单株；选择背景回复率最高的单株继续回交获得BC₃F₁群体，并从中筛选到5个携带目标QTL的BC₃F₁单株。在BC₃F₂代，又筛选到15个携带Qfhs.nau-3B的纯合型单株(表2)。这说明运用两个诊断标记辅助回交育种培育近等基因系的选择效率特别高，根据分子标记的鉴定结果可以快速选择携带Qfhs.nau-3B的杂合型单株进行回交或自交。

表2各世代选择的携带Qfhs.nau-3B的单株及其背景回复率

实施例2选择遍布于小麦基因组的SSR标记分析背景回复率

为了加快除了目标QTL以外的区域向轮回亲本恢复，从利用南大2419×望水白重组自交系群体构建的遗传图谱上(Xue SL，Zhang ZZ，Lin F，Kong ZX，Cao Y，Li CJ，Yi HY，Mei MF，Zhao DM，Zhu HL，Xu HB，Wu JZ，Tian DG，Zhang CQ，Ma ZQ(2008)A high-density intervarietal map of the wheat genome enriched with markers derived from expressed sequence tags.Theor Appl Genet 117：181-189)每隔20-30cM选择一个标记，共选择了分布于21条染色体的150对SSR标记用于各世代的背景回复率分析。

结果显示：在BC₂F₁代，从150对标记中随机选取了97对标记对带有Qfhs.nau-3B的19个杂合型单株进行遗传背景评价，选择到背景回复率为94.8％的单株SSD129-2-45，远高于回交二代87.5％的理论背景回复率(表2)。采用类似的方法，在BC₃F₁和BC₃F₂代都进行了背景回复率分析，最终选择到背景回复率为99.3％的纯合抗赤霉病扩展QTL近等基因系材料。调查了近等基因系和轮回亲本的株高、穗长、有效分蘖数、旗叶长、宽、开花期等农艺性状后也发现在这些性状上无显著差异。

实施例3育成近等基因系的田间抗赤霉病扩展性鉴定

田间抗性评价分别于2010年和2011年在南京农业大学江浦试验田及牌楼试验田进行。采用随机区组设计，每小区2行，行长1.5m，行距0.25m，株距0.1m，每行15株。在开花期采用单花滴注法接种，所用赤霉菌为强致病菌F4、F15、F17和F34菌株的混合物，孢子液浓度为1×10⁵个孢子/ml。开花后21天调查病小穗数(NDS)和病轴长度(LDR)，对所育近等基因系的抗赤霉病扩展性进行评价。

结果显示：与轮回亲本相比，所育近等基因系的病小穗数和病轴长度都有极显著降低。由于Qfhs.nau-3B的存在，使得病小穗数下降了65.4-84.7％，病轴长度下降了50.0-93.0％(表3)。

表3所育近等基因系及其轮回亲本在四个环境中的抗扩展表现

*与绵阳99-323的抗病性相比，在P＝0.001水平显著。

Claims

1.一种分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法，其特征是包括以下步骤：

2)在苗期提取BC₁F₁分离群体中各单株的DNA，并利用与目标QTL紧密连锁的SSR标记进行PCR检测，选择含有目标等位基因的杂合型单株继续与轮回亲本杂交获得BC₂F₁分离群体；

3)在苗期提取BC₂F₁分离群体中各单株的DNA，继续利用与目标QTL紧密连锁的SSR标记进行PCR检测，筛选含有目标QTL的杂合型单株；再选择分布于整个小麦基因组的150对SSR标记用于对含有目标QTL的单株进行背景回复率分析，选择背景回复率最高的单株继续回交获得BC₃F₁分离群体；

5)在苗期提取BC₃F₂分离群体中各单株的DNA，重复步骤3)，选择携带目标QTL且背景回复率最高的纯合型单株自交，获得BC₃F₃纯合家系。

2.根据权利要求1所述的分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法，其特征是所述PCR检测的方法包括以下步骤：

1)用SDS法提取各世代群体中单株的DNA。

3.根据权利要求1所述的分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法，其特征是利用随机选择的SSR标记进行背景选择包括以下步骤：

1)根据小麦遗传图谱选择分布于21条染色体的150对SSR标记用于目标单株的PCR扩增；

4.根据权利要求1所述的分子标记辅助回交提高小麦抗赤霉病扩展的方法，其特征是所述的供体为从南大2419×望水白重组自交系群体中选出的携带抗扩展QTL Qfhs.nau-3B的家系SSD129；所述的受体为绵阳99-323，所述的轮回亲本为绵阳99-323。