CN105123507A

CN105123507A - 源于长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7短片段易位系及其应用

Info

Publication number: CN105123507A
Application number: CN201510566355.1A
Authority: CN
Inventors: 孔令让; 郭军; 王宏伟; 李安飞
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2015-09-08
Filing date: 2015-09-08
Publication date: 2015-12-09

Abstract

本发明属于遗传学领域，具体提供了一种源于长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7短片段易位系及其应用，以中国春ph1bph1b为媒介，通过将其与携带长穗偃麦草染色体的种质KS24-2杂交和回交，并利用与Fhb7连锁的分子标记进行辅助选择，同时结合原位杂交和赤霉病抗性鉴定，创制小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系；最后，将创制的短片段易位系与我国大面积推广小麦品种(济麦22、良星99等)杂交，结合分子标记和原位杂交鉴定，选择携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的改良株系，并对其抗性进行鉴定，结果表明改良株系的赤霉病抗性显著提高，对于我国小麦抗赤霉病育种具有重要意义。

Description

源于长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7短片段易位系及其应用

技术领域：

本发明属于遗传育种领域，涉及源于长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7短片段易位系及其应用。

背景技术：

小麦(Triticumaestivum，2n＝6X＝42，BAD)是世界上最重要的粮食作物之一，其产量仅次于玉米和水稻，是第三大粮食作物。全世界小麦种植面积占全世界粮食种植总面积(2.17亿公顷)的17.0％，我国小麦常年种植面积在2500万公顷左右(FAO，2012；中国国家统计局，2014)。小麦之所以是最重要的粮食作物之一，原因是它养活着世界上40％的人口，并提供人类19％的能量和蛋白质供应。

小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌引起的一种重要的穗部病害，该病害(位列第6位)被评为植物十大真菌病害之三(Deanetal.,2012)。它不仅造成小麦产量的降低，而且还造成小麦品质的下降。目前，共计发现了130个II型抗性QTL，其中有11个QTL位点得到了证实，这些被证实的QTL中，有4个来自于苏麦3号及其衍生系，有5个来自于中国小麦地方品种望水白。抗源相对单一，亟需发掘新的赤霉病抗源(Buerstmayretal.,2009)。

十倍体长穗偃麦草(Thinopyrumponticum，2n＝10X＝70，E^eE^bE^xStSt)是小麦的近缘植物，抗病能力强，对小麦白粉病、锈病、条纹花叶病等高抗至免疫，且对赤霉病具有很强的抵抗能力(李振声等,1977；Friebeetal.,1996；Jinetal.,2008；Liuetal.,2010；Zhangetal.,2011；何方,2014)。研究表明，十倍体长穗偃麦草7el2染色体上携带有一个II型抗赤霉病基因，命名为Fhb7，能够解释～30％左右的表型变异，其抗性与Fhb1的抗性相当(Shenetal.,2004；ShenandOhm,2007；Milleretal.,2011；Zhangetal.,2011；Fuetal.,2012；Guoetal.2015)。然而，由于连锁累赘问题，至今Fhb7仍未在生产上得到应用，因此，如何创制小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系，并将其转移到我国大面积推广小麦品种(济麦22、良星99等)中是一个亟需解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明以中国春ph1bph1b为媒介，通过将其与携带长穗偃麦草染色体的种质KS24-2杂交和回交，并利用与Fhb7连锁的分子标记进行辅助选择，同时结合原位杂交和赤霉病抗性鉴定，创制小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系；最后，将创制的短片段易位系与我国大面积推广小麦品种(济麦22、良星99等)杂交，结合分子标记和原位杂交鉴定，选择携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的改良株系，并对其抗性进行鉴定，结果表明改良株系的赤霉病抗性显著提高，这说明源于十倍体长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的抗性强而稳定，并且能够稳定遗传，可以用于小麦抗赤霉病育种研究。本发明提供的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系对于我国小麦抗赤霉病育种具有重要意义。

本发明是通过如下技术方案实现的：

提供携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片易位系SDAU1881和SDAU1886；

上述两个易位系发明人已在之前申请的申请号为2015100016023，发明名称为“一种快速检测长穗偃麦草抗赤霉病基因的分子标记及应用”的发明专利申请中公开，并保存于山东农业大学小麦分子育种研究室小麦种质保藏中心，保藏日期为2014.06.20，保藏编号分别为SDAU1881和SDAU1886，并对公众开放该种质资源。上述的小麦-长穗偃麦草短片段易位系是以中国春ph1bph1b为媒介，构建的小麦-长穗偃麦草染色体重组交换群体，结合分子标记辅助选择、原位杂交和赤霉病抗性鉴定，创制小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系，发明人在此不再赘述。

除此之外，发明人进一步公开了上述SDAU1881和SDAU1886在小麦抗赤霉病育种中的利用；

为了配合对获得的株系进行选择，本发明的发明人还提供了一个与十倍体长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁分子标记XsdauK66，其正向引物核苷酸序列如SEQIDNo.13所示；其反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示。利用该分子标记结合原位杂交技术对Fhb7进行分子标记辅助选择即可获得目标株系。

本发明还提供我国大面积推广小麦品种(济麦22、良星99等)背景下，携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的抗赤霉病改良株系SDAU2002、SDAU2003、SDAU2008、SDAU2014、SDAU2017、SDAU2028和SDAU2032及其在小麦抗赤霉病育种中的利用。

为方便进行研究，发明人将其保存于山东农业大学农学院小麦种质保藏中心，保藏日期为2015.07.10，保藏编号分别为SDAU2003、SDAU2008、SDAU2014、SDAU2017、SDAU2028和SDAU2032，并对公众开放这些种质资源。

本发明的有益效果主要在于：利用染色体工程的手段，结合分子标记技术、原位杂交鉴定技术和赤霉病抗性鉴定，创制了携带Fhb7的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系；利用创制的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系与我国大面积推广小麦品种(济麦22、良星99等)进行杂交、回交和自交，分子标记辅助选择、原位杂交和赤霉病抗性鉴定等技术创制抗赤霉病育种新材料。结果表明，与对照(济麦22、良星99等)相比，携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7改良株系的赤霉病抗性显著提高，这表明源于十倍体长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的抗性强而稳定，并且能够稳定遗传，可以用于小麦抗赤霉病育种研究。本发明创制的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系对于我国小麦抗赤霉病育种具有重要意义。

附图说明

图1A为小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系(SDAU1881和SDAU1886)的赤霉病抗性鉴定示意图；

图1B为图1A的彩色示意图；

结合图1可知，与对照中国春(CS)相比，携带十倍体长穗偃麦草短片段的两个株系(338-29和338-63)的赤霉病抗性水平显著提高，发病小穗数NDS分别为1.4和1.5(P＝0.05)，说明这两个株系均携带源于十倍体长穗偃麦草的抗赤霉病基因Fhb7，并将这两个株系命名为SDAU1881和SDAU188；

图2为小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系的原位杂交(GISH)鉴定结果图；图中A为CS；B为KS24-2；C为SDAU1881；D为SDAU1886；Bars,10μm；图中箭头所示绿色部分(亮灰色)是长穗偃麦草的染色体片段，蓝色部分(浅灰色)是小麦的染色体；由图2可见，鉴定结果表明与对照KS24-2相比(49％)，小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系SDAU1881和SDAU1886中外源染色质所占比例分别为16.1％和17.3％，说明这两个小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系均具有较小的外源染色体片段；

图3A为小麦-长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7遗传改良系SDAU2002(济麦22背景)的赤霉病抗性鉴定图；

结果表明与对照济麦22相比，SDAU2002、SDAU2003、SDAU2008、SDAU2014、SDAU2017、SDAU2028和SDAU2032的赤霉病抗性水平显著提高，说明源于十倍体长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的抗性能够在普通小麦背景下表达；

图3B为图3A的彩色示意图；

图4为与Fhb7紧密连锁分子标记XsdauK66在SDAU1881、SDAU1886、CS、KS24-2、7el₂(7D)和十倍体长穗偃麦草中的扩增情况；

图中M为100bpladder；1为十倍体长穗偃麦草；2为7el2(7D)；3为KS24-2；4为SDAU1881；5为SDAU1886；6为中国春；7为Thatcher；8为K11463；9为K11695；

图5A为在济南17、泰山23等背景下携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7遗传改良系的赤霉病抗性鉴定图；

其中SDAU2040和SDAU2041是以济南17为背景的改良株系；SDAU2050是以良星99为背景的改良株系；SDAU2053是以山农14为背景的改良株系；SDAU2055是以山农22为背景的改良株系；SDAU2058以泰山23为背景的改良株系；

结果可知小麦-长穗偃麦草遗传改良系的赤霉病反应型NDS值均显著低于其亲本(LSD_0.05＝1.7)，但是在不同背景中，其抗性略有差异，这说明来自长穗偃麦草的抗赤霉病基因Fhb7可以在不同小麦背景下表达；

图5B为图5A的彩色示意图。

具体实施方式

实施例1小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系的创制(分子标记和赤霉病抗性鉴定)

具体方法为：

(1)将KS24-2与中国春Ph1b突变体(CSph1b)杂交，获得杂种F1。

(2)F1与中国春ph1bph1b回交，从BC1F1植株中提取基因组DNA，利用ph1b基因的特异分子标记Xpsr128(正向引物X1：(SEQIDNO.1)和反向引物X2:(SEQIDNO.2))，Xpsr574(正向引物X3：(SEQIDNO.3)和反向引物X4：(SEQIDNO.4))和XAWJL3(正向引物X5：(SEQIDNO.5)和反向引物X6：(SEQIDNO.6))(Robertsetal.,1999)和7el2L染色体的特异分子标记Xcfa2240(正向引物P1:(SEQIDNO.7)和反向引物P2:(SEQIDNO.8)),Xgwm333(正向引物P3:(SEQIDNO.9)和反向引物P4：(SEQIDNO.10)),Xswes130(正向引物P5：(SEQIDNO.11)和反向引物P6：(SEQIDNO.12)),XsdauK66(正向引物P7：(SEQIDNO.13)和反向引物P8：(SEQIDNO.14))和Xmag1759(正向引物P9：(SEQIDNO.15)和反向引物P10：(SEQIDNO.16))筛选ph1b基因纯合而7el2L染色体杂合的单株，这些单株自交后获得后代群体BC1F2。其中，分子标记Xcfa2240和XsdauK66与抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁(Guoetal.,2015)。

(3)利用上述7el2L染色体的特异分子标记(Xcfa2240、Xgwm333、Xswes130、XsdauK66和Xmag1759)对获得的208个BC1F2群体进行基因型分析，目的是获得仅含有分子标记Xcfa2240和XsdauK66携带偃麦草基因型的株系(其余标记均为小麦的基因型)。如表1所示，最终获得了两个潜在的携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的小麦-长穗偃麦草短片段易位系，株系编号分别为338-29和338-63。

(4)在PCR扩增反应体系中，PCR试剂组成为：含50-100ngDNA的2ul模板(从中国春ph1bph1b、KS24-2、7el₂(7D)、BC1F1中提取基因组DNA)，1.5ul10XPCRbuffer(含Mg²⁺)，1.2uldNTP，左右引物各1.0ul，0.15ulR-TaqDNApolymerase，8.15ulH₂O。

PCR扩增程序为94℃预变性5min；然后94℃变性50s，55℃复性30s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。PCR扩增反应后，扩增产物在丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺质量比39:1的非变性聚丙烯酰胺上电泳分离，再用银染法染色检测。

表1小麦-长穗偃麦草7DL-7elL染色体重组后代的分子鉴定

^a分子标记单体型；W代表仅含有小麦的基因位点；T代表十倍体长穗偃麦草和小麦染色体杂合的基因位点

(5)小麦赤霉病抗性鉴定是在山东农业大学温室完成的，鉴定时间为2012年冬季(2012W),2013冬季(2013W)和2014春季(2014S)。采用单花接种的方法，来评价供试材料对赤霉病的抗性(II型抗性)。接种剂量为每小花接种10ul(50,000-80,000个孢子/ml)，接种之后套袋72h，于接种后21d，调查发病小穗数NDS(Numberofdamagedspikelets)。利用统计软件SAS9.0对获得的数据进行统计分析，处理间的差异是用Duncan检验法来完成的。

(6)赤霉病抗性鉴定表明，如表2和图1所示，与对照中国春(CS)相比，携带十倍体长穗偃麦草短片段的两个株系(338-29和338-63)的赤霉病抗性水平显著提高，发病小穗数NDS分别为1.4和1.5(P＝0.05)，说明这两个株系均携带源于十倍体长穗偃麦草的抗赤霉病基因Fhb7，并将这两个株系命名为SDAU1881和SDAU1886。

表2小麦-长穗偃麦草7DL-7elL染色体短片段易位系的赤霉病抗性鉴定

^a具有相同字母的代表无显著性差异(P＝0.05)

实施例2小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系的创制(原位杂交鉴定)

(1)根尖有丝分裂中期染色体制片

室温下将小麦种子浸泡至露白后，放置于4℃冰箱72h，然后，将其放置于25℃下恒温培养，待根长到1.5-3.0cm时去根，将取下的根放入冰水中处理24-48h，利用90％冰乙酸固定10min，70％乙醇清洗，保存备用。

(2)杂交探针制备

从供试材料(十倍体长穗偃麦草)中，利用CTAB法，提取总DNA，经纯化后，利用缺口平移法进行探针标记制备。

缺口平移法反应体系如下：

配制好的体系混匀，稍离心，15℃水浴，反应1.5h-2.0h，加入1μl反应终止液(0.5MEDTA，pH8.0)，稍离心后将标记的探针放置于-20℃冰箱中储存备用。

(3)原位杂交(所有流程均在黑暗条件下进行或避免光直接照射的条件下进行)

准备杂交混合液(2XSSC，探针浓度：封阻DNA浓度＝1:10，一般来说每片所用探针量为0.5μl)，最终体积为10ul/片。将上述混合物滴到玻片上，并于120℃水浴变性10min。之后，将玻片放置于37℃潮湿培养箱中过夜(>10h)。

(4)信号检测

取出片子，在2XSSC中，将盖玻片洗掉，滴加DAPI(10-15μl/片)，盖上盖玻片，镜检。

(5)在显微镜下分别量取外源染色体片段长度和易位染色体总长度，外源染色质算占比例＝外源染色体片段长度/易位染色体的总长度*100％。

(6)如图2所示，基因组原位杂交(GISH)鉴定结果表明，与对照KS24-2相比(49％)，小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系SDAU1881和SDAU1886中外源染色质所占比例分别为16.1％和17.3％，说明这两个小麦-长穗偃麦草抗赤霉病易位系均具有较小的外源染色体片段。

实施例3源于十倍体长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的遗传特点研究

(1)利用创制的携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的短片段易位系SDAU1881与济麦22的F2分离群体，并利用与抗赤霉病基因紧密连锁的DNA标记XsdauK66(SEQIDNO.13和SEQIDNO.14；如图4所示)和原位杂交技术，对偃麦草染色体片段和抗赤霉病基因的遗传特点进行了分析。

(2)小麦赤霉病抗性鉴定是在山东农业大学温室鉴定的，鉴定时间为2014冬季(2014W)。采用单花接种的方法评价供试材料对赤霉病的抗性(II型抗性)。接种剂量为每小花接种10ul(50,000-80,000个孢子/ml)，之后套袋72h，于接种后21d，调查发病小穗数NDS(Numberofdamagedspikelets)。利用统计软件SPSS13.0对获得的数据进行统计分析，处理间的差异是用LSD法来表示的。

(3)如表3所示，在调查的63株F2群体中，长穗偃麦草染色体片段纯合的单株、长穗偃麦草染色体杂合的单株和不含有长穗偃麦草染色体片段的单株数分别为15，34和14株，基本符合1:2:1的分离比(χ² _1:2:1＝0.4,P＝0.8)，说明携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的染色体片段在杂交后代中具有类似于单基因的遗传特点。赤霉病抗性鉴定结果表明，不含有长穗偃麦草染色体片段的单株的赤霉病抗性与含有一条长穗偃麦草染色体片段的赤霉病抗性水平相当，而含有两条长穗偃麦草染色体片段的赤霉病抗性水平最高或赤霉病反应型NDS最小，说明Fhb7的抗性能够由亲本传递给后代。

表3携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的株系和不携带长穗偃麦草抗赤霉病基因的株系的赤霉病抗性鉴定(2014年温室)

^a具有相同字母的代表差异性不显著(P＝0.05)

实施例4济麦22、良星99等背景下携带Fhb7改良系的创制

(1)将创制的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系与我国大面积推广小麦品种(济麦22、良星99等)进行杂交，并利用与抗赤霉病基因紧密连锁的DNA标记XsdauK66(SEQIDNO.13和SEQIDNO.14)和原位杂交技术进行辅助选择鉴定，获得了济麦22背景下的11个遗传改良系。

(2)小麦赤霉病抗性鉴定是在山东农业大学温室完成的，鉴定时间为2013冬季(2013W),2014春季(2014S)和2014冬季(2014W)。均采用单花接种的方法评价供试材料对赤霉病的抗性(II型抗性)。接种剂量为每小花接种10ul(50,000-80,000个孢子/ml)，接种之后套袋72h，于接种后21d，调查发病小穗数NDS(Numberofdamagedspikelets)。利用统计软件SAS9.0、对获得的数据进行统计分析，处理间的差异是用Duncan检验法来表示的。

(3)如表4和图3所示，与对照济麦22相比，SDAU2002、SDAU2003、SDAU2008、SDAU2014、SDAU2017、SDAU2028和SDAU2032的赤霉病抗性水平显著提高，说明源于十倍体长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的抗性能够在普通小麦背景下表达。

表4携带长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的济麦22遗传改良株系的赤霉病抗性鉴定

^a具有相同字母的代表差异性不显著(P＝0.05)

(4)如表5和图5所示，为了进一步证明来自长穗偃麦草的抗赤霉病基因Fhb7在其它小麦背景下也能够表达，将济南17、良星99、泰山23、山农22和山农14分别和短片段易位系SDAU1881杂交，然后自交两次后，在F_2：3代利用与抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁的分子标记(XsdauK66)对Fhb7进行分子标记辅助选择，在上述背景中分别获得了18、2、4、1和2个株系，并对上述株系进行了赤霉病抗性鉴定。鉴定结果表明，这些小麦-长穗偃麦草遗传改良系的赤霉病反应型NDS值均显著低于其亲本(LSD_0.05＝1.7)，但是在不同背景中，其抗性略有差异，这说明来自长穗偃麦草的抗赤霉病基因Fhb7可以在不同小麦背景下表达。

(5)综上所述，源于十倍体长穗偃麦草的抗赤霉病基因Fhb7不仅能够将抗性由亲本传递给后代，而且在其它小麦背景下其抗性也能够表达，因此，携带该基因的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系可以用于我国小麦抗赤霉病新品种选育研究。

表5小麦-长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7遗传改良系的赤霉病抗性鉴定

^a*代表差异性显著(LSD_0.05＝1.7)

Claims

1.含有十倍体长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的小麦-长穗偃麦草抗赤霉病短片段易位系SDAU1881和SDAU1886在小麦抗赤霉病育种中的应用。

2.一种与十倍体长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7紧密连锁分子标记XsdauK66，其特征在于：其正向引物核苷酸序列如SEQIDNo.13所示；其反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.14所示。

3.普通小麦济麦22背景下，携带小麦-长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的遗传改良系在小麦抗赤霉病育种中的应用，其中所述的改良系选自SDAU2002或SDAU2003或SDAU2008或SDAU2014或SDAU2017或SDAU2028或SDAU2032。