CN104946644A - 玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于作物分子标记领域的玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记，该分子标记由SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成。本发明还公开了由SEQ ID No：2和SEQ ID No：3组成的用于扩增上述分子标记的SCAR引物对。此外，本发明还公开了利用上述分子标记进行回交和轮回选择育种的方法。本发明分子标记不受时间和环境条件的限制，可在苗期对玉米摩擦禾单体附加系核不育基因进行鉴定和筛选，易于进行选择和淘汰，节省大量人力和物力，提高了育种效率，缩短了育种进程和时间，显著降低了育种成本；此外，本发明还可作为大规模进行玉米轮回选择的工具，不断扩大玉米遗传基础，有利于选出突破性的玉米品种。
Description
技术领域
本发明属于作物分子标记领域，具体涉及玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记，以及该核不育基因分子标记的应用。
背景技术
玉米核不育又称为基因雄性不育(Male Sterility，简写为MS或ms)，是指由细胞核基因控制的雄性不育。自1921年Eyster(Eyster L.A.,Journalof Heredity,1921.12:138-141)发现玉米核不育基因以来，到目前为止已报道的核不育基因有92个(孙庆泉等.植物学通报.2003.20(2):248-2530)。但是由于核不育基因的杂交后代中总有育性的分离，因此，玉米核不育很难在玉米生产中直接应用。
摩擦禾(Tripsacum)是玉米(Zea mays)的近缘属，具有抗病虫、优质、无融合生殖特性等优点，但是由于玉米与摩擦禾之间存在的生殖隔离，将摩擦禾中的有益性状导入玉米的远缘杂交很难成功。20世纪30年代以来，通过一些特殊手段成功创制了摩擦禾与玉米的杂种(Mangelsdorf等.Heredity.1931.22:329-343；Leblanc等.Heredity.1996.87(2):108-111；Sokolov等.Genetika.1998.34:499-506)，并在连续回交的衍生后代中获得了系列包含整套玉米染色体和一条额外摩擦禾染色体的玉米-摩擦禾单体附加系，其中有2个玉米摩擦禾单体附加系被稳定地保存下来(Marjorie.Genetics.1963.48:1185-1194)。玉米摩擦禾单体附加系220B(引自美国USDA)即为其中一个，在正常全套玉米染色体的基础之上额外附加了一条易位的摩擦禾染色体，植株生长正常，但是雄穗发育异常，花粉可染率仅为4％，基本不育且不散粉，而雌穗发育正常(Marjorie..Genetics.1957.42:473-486；李志龙.四川农业大学硕士论文.2011)。200B存在的花粉败育不彻底问题，限制了该材料的应用。
分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)是指借助分子标记对目标性状进行选择。分子标记辅助选择不受时间和环境条件的限制，可以直接对性状的基因型进行选择，提高了育种效率，缩短了育种进程，因而越来越受到育种者的重视和应用。目前公开了一些与核不育基因连锁的分子标记如RFLP、AFLP、SCAR、SSR等(梁业红等.作物学报.2000.26(3):266-271；刘福霞等.遗传学报.2005.32(7):753-757；李式昭等.高技术通讯.2007.l7(8):869-873；李玉玲等.河南农业大学学报.2008.42(3):245-249,254；张琳碧等.玉米科学.2012.20(5):50-53,58)，有些分子标记已在核不育后代选择中得到应用，节省了大量的人力、物力，并加快了育种进程。
经检索，没有发现将分子标记用于玉米摩擦禾单体附加系核不育基因辅助选择的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记。
本发明另一目的在于提供用于扩增上述分子标记的SCAR引物对。
本发明第三目的在于提供用于检测上述玉米摩擦禾单体附加系核不育基因分子标记的试剂盒。
本发明第四目的在于提供上述分子标记在玉米摩擦禾单体附加系核不育基因辅助选择上的用途。
本发明第五目的在于提供利用上述玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记回交转育玉米雄性不育系的方法。
本发明第六目的在于提供利用上述玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记进行玉米轮回选择育种的方法。
本发明第七目的在于提供利用玉米摩擦禾单体附加系回交转育玉米雄性不育系的方法。
本发明第八目的在于提供利用玉米摩擦禾单体附加系进行玉米轮回选择育种的方法。
实现本发明的技术方案如下：
本发明一种玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记，命名为Mst1，所述的分子标记由SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成。
上述分子标记中所述的玉米摩擦禾单体附加系是指MTchr2或其带有附加染色体的MTchr2的衍生系。
上述分子标记中所述的玉米摩擦禾单体附加系是指玉米(Zea mays)MTchr2，已于2014年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCC No.9552。
所述的玉米摩擦禾单体附加系(或简称为：单体附加系)MTchr2是由美国USDA引进的玉米摩擦禾单体附加系220B(编号：220B)改良获得；其中含有21条染色体的为玉米摩擦禾单体附加系(2n＝20+1)，该玉米摩擦禾单体附加系除了含有来自玉米的20条常规染色体外，还有一条玉米第2号染色体与摩擦禾染色体易位的附加染色体，其花粉完全败育，所述的核不育基因即位于该易位的附加染色体上；其次，提交保藏的MTchr2中还有由20条常规染色体(2n＝20)组成的普通玉米，其花粉完全可育。
本发明所述的玉米摩擦禾单体附加系玉米(Zea mays)MTchr2的培育过程：(一)、材料引进及研究：2007年从美国USDA引进玉米摩擦禾单体附加系220B(编号：220B)。该单体附加系中含有21条染色体的为玉米摩擦禾单体附加系(2n＝20+1)，在正常全套玉米染色体的基础之上额外附加了一条玉米与摩擦禾易位的染色体，其植株生长正常，但是雄穗发育异常，花粉可染率仅为4％，基本不育且不散粉，而雌穗发育正常，可以通过杂交正常结实，这种雄性不育的性状紧密伴随着附加的染色体，说明在这条附加的易位染色体上存在一个显性基因控制着花粉育性(Marjorie..Genetics.1957.42:473-486；李志龙.四川农业大学硕士论文.2011)。不育性状通过杂交可以在后代中传递，平均传递率为46％(李志龙,四川农业大学硕士论文.2011)。前人所发现的玉米核不育基因均存在于玉米基因组中，而玉米摩擦禾单体附加系220B中的核不育基因独立于玉米整套的基因组而存在于附加的染色体上，因此，在回交转育中可以很好地实现遗传背景的替换，排除与玉米基因组中基因的连锁累赘。(二)MTchr2的育种过程：2012年3月将220B种植于四川省雅安市，2012年6月在抽丝散粉期选择花粉几乎完全不育的玉米摩擦禾单体附加系220B单株作为母本，玉米自交系Mo17作为父本杂交，获得杂种F1代；2012年10月将每个单株获得的单个果穗作为一个株系在云南西双版纳基地进行种植，利用根尖染色体压片技术鉴定每个株系中的玉米摩擦禾单体附加系植株，计算传递率，抽雄期通过花粉育性检测发现花粉可染率为0％，完全败育；以杂种F1代中附加染色体传递率高的玉米摩擦禾单体附加系单株(2n＝20+1)作为母本，玉米自交系Mo17作为父本回交，获得的回交一代材料，经检测，其所得的单体附加系(2n＝20+1)的花粉败育率100％，命名为MTchr2。其中包含有21条染色体的玉米摩擦禾单体附加系种子(2n＝20+1)和20条染色体的普通玉米(2n＝20)。相对于原始的玉米摩擦禾单体附加系220B，MTchr2植株整体长势更好，单体附加系MTchr2植株花粉败育率比220B更彻底，其败育率为100％。
上述分子标记中所述的核不育基因Mst1，该基因位于附加的玉米摩擦禾易位染色体上。
本发明用于扩增上述分子标记的SCAR引物对，由SEQ ID No：2(命名为：Mst1-F)和SEQ ID No：3(命名为：Mst1-R)所示的核苷酸序列组成；其核苷酸序列分别为：
Mst1-F:5'-GTAGCAGTTACACATCAAAATCCG-3'(SEQ ID No：2)；
Mst1-R:5'-TGTCTTGCTTATACCCATCTAAAGG-3'(SEQ ID No：3)。
本发明用于检测上述分子标记的试剂盒，含有由SEQ ID No：2(Mst1-F)和SEQ ID No：3(Mst1-R)所示的核苷酸序列组成的SCAR引物对。
上述试剂盒，还包括Taq聚合酶、MgCl2、dNTPmix、10×Taq Buffer和ddH2O。
上述分子标记在玉米摩擦禾单体附加系核不育基因辅助选择上的应用。
利用上述玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记回交转育玉米雄性不育系的方法，包括如下步骤：
(1)、种植玉米摩擦禾单体附加系，同时分批种植农艺性状优良的玉米自交系；在5～6叶期提取玉米摩擦禾单体附加系叶片基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以Mst1-F和Mst1-R为引物进行PCR扩增，电泳，保留带有Mst1标记的植株，拔除不带Mst1标记的植株；在抽丝散粉期，以带有Mst1标记的植株(2n＝20+1)为母本，以农艺性状优良的玉米自交系(2n＝20)为父本杂交，得杂交F1代；
(2)、种植杂交F1代，同时分批种植步骤(1)中所述的农艺性状优良的玉米自交系；按照步骤(1)中所述的方法对F1代植株进行PCR扩增，保留带有Mst1标记的植株，拔除不带Mst1标记的植株；在抽丝散粉期，用农艺性状优良的玉米自交系给带有Mst1标记的F1代植株(2n＝20+1)授粉，得BC1代；
(3)、重复步骤(2)连续回交4～6次，即得含有21条染色体的相应农艺性状优良的玉米自交系的不育系；所得的不育系的植株表型与步骤(1)中的农艺性状优良的玉米自交系基本相同，但花粉完全败育；此外，还同时产生相应的含有20条染色体的花粉可育的常规种子。
上述方法步骤(1)中所述的玉米摩擦禾单体附加系是指MTchr2或带有附加染色体的MTchr2的衍生系。
上述方法步骤(1)中所述的玉米自交系是指生产上广泛应用的农艺性状优良的自交系，如B73、郑58或昌7-2等，这属于本领域技术人员熟知的常识。
上述方法步骤(1)中所述的PCR扩增的反应体系为：10×Taq Buffer 2.5μl，MgCl21.5μl，dNTPmix 2μl(2.5mM，each)，Taq聚合酶0.7μl(2.5u/μl)，引物Mst1-F和Mst1-R各1μl，DNA 1.5ul(50ng/μl)，ddH2O 14.8μl，总体系为25ul。
上述方法步骤(1)中所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，38个循环；72℃终延伸7min，4℃保存。
利用上述玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记进行玉米轮回选择育种的方法，包括如下步骤：
(1)、种植玉米摩擦禾单体附加系，在抽雄散粉期，将其中的雄性可育株(2n＝20)剔除，以雄性不育株(2n＝20+1)为母本，以符合育种目标的农艺性状优良的10～30个玉米材料(2n＝20)为父本，分别进行人工杂交，得杂交F1代；
(2)、按照组合种植F1代，并分批种植步骤(1)中所述的玉米材料；以F1代中的不育株(2n＝20+1)为母本，以步骤(1)中所述的玉米材料为父本分别进行回交，收获不育株上的种子，获得BC1代；
(3)、在隔离条件下按照组合种植BC1代；在5～6叶期提取BC1代叶片总DNA，然后以叶片总DNA为模板，以Mst1-F和Mst1-R为引物进行PCR扩增，保留带有Mst1标记的植株，拔除不带Mst1标记的植株；在开花散粉期自由授粉，收获农艺性状优良的不育株上的果穗，然后将种子等量混合，建立基础群体C0；
(4)、在隔离条件下种植C0群体100～5000株；在5～6叶期提取C0代叶片总DNA，然后以叶片总DNA为模板，以Mst1-F和Mst1-R为引物进行PCR扩增，保留带有Mst1标记的植株，拔除不带Mst1标记的植株；在开花散粉期自由授粉，收获农艺性状优良的不育株上的果穗，然后将种子等量混合，形成第一轮群体C1；
(5)、重复步骤(4)3～5次，可得群体C4～C6；
(6)、在步骤(5)所得的C4～C6群体中选择符合育种目标的可育单株，进入系谱法育种程序，按照育种目标进行选株自交，培育出新的品种。
上述方法中可以轮回选择群体中的不育株为基础材料，随时添加新的玉米材料，再继续进行轮回选择。
上述方法步骤(1)中所述的玉米摩擦禾单体附加系是指MTchr2(Zeamays)或带有附加染色体的MTchr2的衍生系。
上述轮回选择育种的方法步骤(1)中所述的育种目标是本领域技术人员熟知的概念，主要是指农艺性状、品质、抗性性状或适应性等性状优良，具体侧重哪些性状，要根据群体的具体情况而定。
上述方法步骤(3)或(4)中所述的在隔离条件下是指群体的种植需要采取适当的隔离措施，以避免来自非本群体的花粉串粉。
上述方法步骤(4)中所述的群体大小可以为500～2000株。
上述方法步骤(6)中所述的系谱法育种程序属于本领域技术人员公知的常识。
利用玉米摩擦禾单体附加系回交转育玉米雄性不育系的方法，包括如下步骤：
(1)、种植玉米摩擦禾单体附加系，同时分批种植需要转育的农艺性状优良的玉米自交系；在抽丝散粉期，以雄性不育的玉米摩擦禾单体附加系植株(2n＝20+1)为母本，以农艺性状优良的玉米自交系(2n＝20)为父本杂交，得杂交F1代。
(2)、种植杂交F1代，同时分批种植步骤(1)中所述的农艺性状优良的玉米自交系；在抽丝散粉期，以雄性不育的植株(2n＝20+1)为母本，以步骤(1)中所述的玉米自交系(2n＝20)为父本杂交，得BC1代；
(3)、重复步骤(2)连续回交4～6次，得相应农艺性状优良的玉米自交系的不育系(2n＝20+1)；所得的雄性不育系植株表型与步骤(1)中的农艺性状优良的玉米自交系基本相同，但花粉完全败育；此外，还同时产生相应的含有20条染色体的花粉可育的普通玉米。
上述方法步骤(1)中所述的玉米摩擦禾单体附加系是指MTchr2或带有附加染色体的MTchr2的衍生系。
上述方法步骤(1)中所述的玉米自交系是指生产上广泛应用的农艺性状优良的自交系，如B73、郑58或昌7-2等等，这属于本领域技术人员熟知的常识。
利用玉米摩擦禾单体附加系进行玉米轮回选择育种的方法，包括如下步骤：
(1)、种植玉米摩擦禾单体附加系，剔除可育植株(2n＝20)，以雄性不育的玉米摩擦禾单体附加系(2n＝20+1)为母本，以符合育种目标的农艺性状优良的10～30个玉米材料(2n＝20)为父本，分别进行人工杂交，得杂交F1代；
(2)、按照组合种植F1代，并分批种植步骤(1)中所述的玉米材料；以F1代中的不育株(2n＝20+1)为母本，以所述的玉米材料为父本分别进行回交，收获不育株上的种子，获得BC1代；
(3)、在隔离条件下按照组合种植BC1代；在抽丝期，拔除不符合育种目标的不育株和可育株；在开花散粉期自由授粉，收获农艺性状优良的不育株上的果穗，然后将种子等量混合，建立基础群体C0；
(4)在隔离条件下种植C0群体100～5000株；在抽丝期，拔除不符合育种目标的不育株和可育株；在开花散粉期自由授粉，收获农艺性状优良的不育株上的果穗，然后将种子等量混合，形成第一轮群体C1；
(5)、重复步骤(4)3～5次，可得群体C4～C6；
(6)、在步骤(5)所得的C4～C6群体中选择符合育种目标的可育单株，进入系谱法育种程序，按照育种目标进行选株自交，培育出新的品种。
上述方法中可以轮回选择群体中的不育株为基础材料，随时添加新的材料，再继续进行轮回选择。
上述方法步骤(1)中所述的雄性不育的玉米摩擦禾单体附加系是指MTchr2或带有附加染色体的MTchr2的衍生系。
上述方法步骤(4)中所述的群体大小可以为500～2000株。
上述方法步骤(1)中所述的育种目标是本领域技术人员熟知的概念，主要是指农艺性状、品质、抗性性状或适应性等性状优良，具体侧重哪些性状，要根据群体的具体情况而定。
上述方法步骤(3)和(4)中所述的在隔离条件下是指群体的种植需要采取适当的隔离措施，以避免来自非本群体的花粉串粉。
上述方法步骤(6)中所述的系谱法育种程序属于本领域技术人员公知的常识。
本发明具有的优点和积极效果：(1)、本发明为玉米摩擦禾单体附加系核不育基因提供了一个辅助选择分子标记，使玉米摩擦禾单体附件系(不育株)在室内进行选择和苗期进行选择成为可能，大大节约劳力；(2)本发明核不育基因的分子标记，不受时间和环境条件的限制，可以直接对基因型进行鉴定，易于进行选择和淘汰。(3)、本发明利用分子标记对不育株进行选择，提高了回交转育效率，大大缩短了育种进程和时间，显著降低了育种成本。(4)、本发明中核不育基因独立于玉米整套的基因组存在于附加的染色体上，不存在与玉米基因组中的基因连锁累赘，对玉米的生长发育没有影响，可以快速有效实现核不育的转育。(5)、尽管玉米去雄比较容易，但是轮回选择育种中大量的授粉工作仍然是进行玉米轮回选择的限制因素，本发明提供的不育材料以及辅助选择标记使进行大规模的杂交成为可能，从而可以大大丰富了育种材料的遗传基础，有利于选出突破性的品种；(6)、利用本发明轮回选择的方法可以对玉米材料不断地进行改良，可以根据需要在不同时期灵活的加入所需要的资源，从而充分利用各种优异的玉米种质资源，不断地改良群体性状，不断地选育出新的品种；(7)、本发明利用玉米摩擦禾单体附加系核不育材料，不必进行人工去雄和授粉工作，节省大量人力和物力。
附图说明
图1.玉米摩擦禾单体附加系220B中单体附加系染色体(2n＝20+1)照片。
图2.玉米摩擦禾单体附加系220B中单体附加系染色体(2n＝20+1)照片。
图3.玉米摩擦禾单体附加系220B中普通植株染色体(2n＝20)照片。
图4.玉米摩擦禾单体附加系220B中普通植株染色体(2n＝20)照片。
图5.随机引物B16的RAPD扩增产物电泳图谱；其中1、2、3为普通植株(2n＝20)样品，4、5、6为单体附加系单株(2n＝20+1)样品，7为普通植株(2n＝20)混合样品，8为单体附加系植株(2n＝20+1)混合样品，白色箭头所指为特异条带。
图6.本发明分子标记的PCR扩增产物电泳图谱；其中1、2和3为单体附加系植株(2n＝20+1)样品；4、5和6为普通植株(2n＝20)样品。
图7.MTchr2植株分子标记的PCR扩增产物电泳图谱；其中2、3、4、9和15为单体附加系(2n＝20+1)植株，1、5、6、7、8、10、11、12、13、14和16为普通植株(2n＝20)。
具体实施方式
以下用实施例进一步说明本发明，但不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记的筛选试验
按照如下方法进行：
(1)、2012年3月下旬，在四川农业大学成都校区，分别取摩擦禾(Tripscaum)种子10粒和从美国USDA引进的玉米摩擦禾单体附加系220B种子50粒种植在发芽盒中，基质为粗河沙，置于温度为28℃、湿度为70％的人工气候箱中进行催芽，植株生长至三叶一心时，移栽到口径为30cm，高度为25cm的塑料花盆中。
(2)、当玉米摩擦禾单体附加系220B植株高达30cm时，在阳光明媚的中午10:00～14:00且温度高于25℃时切取0.5cm左右的根尖，并用饱和α-溴萘水溶液进行避光预处理2h，将预处理后的根尖在室温下用双蒸水低渗30min，然后用新鲜固定液(甲醇:冰乙酸＝3:1)固定12h以上。再将固定后的根尖置于70％无水乙醇中，保存在4℃；用双蒸水洗净根尖上的固定液，用等量混合的6％纤维素酶(Yakult)与1％果胶酶(Yakult)，在37℃酶解根尖2h，酶解后的根尖用改良的卡宝品红染色进行压片，显微镜照相并统计染色体数目，每个单株至少鉴定50个细胞。玉米摩擦禾单体附加系220B群体植株中包含有附加系植株染色体数为21条(见图1和图2)和普通植株染色体数为20条(见图3和图4)，对鉴定出的附加系植株和普通植株分别进行挂牌标记。
(3)、随机选取摩擦禾植株以及步骤(2)中鉴定出的单体附加系植株(2n＝20+1)、普通植株(2n＝20)各3株，采用混合取样和单株取样两种方式利用2×CTAB法提取叶片基因组DNA。混合取样时分别将3株摩擦禾、单体附加系植株(2n＝20+1)、普通植株(2n＝20)的幼嫩叶片各自混合在一起提取基因组DNA；单株取样时，将每个材料的3株单株的幼嫩叶片分别单独提取基因组DNA。RAPD扩增时，选取单体附加系植株(2n＝20+1)、普通植株(2n＝20)分别单独提取的基因组DNA各3份和混合提取基因组DNA各1份作为模板进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系为：10×Taq Buffer 2.5μl，MgCl21.5μl，dNTPmix 2μl(2.5mM，each)，Taq聚合酶0.4μl(2.5u/μl)，引物1μl，DNA 1ul(50ng/μl)，ddH2O 16.6μl，总体系为25ul。PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，38℃退火1min，72℃延伸1.5min，38个循环；72℃终延伸7min，4℃保存。PCR扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，加样量为PCR扩增产物15ul和0.25％溴酚蓝指示剂1.0ul。电泳结束后在紫外灯下用凝胶成像系统拍照。本试验共选用126个RAPD随机引物进行扩增，其中122个引物扩增效果和重复性较好，其中编号为B16的引物在玉米摩擦禾单体附加系样品(2n＝20+1)中扩增出特异条带(见图5)。B16的引物序列为：TTTGCCCGGA(SEQ ID No：4)。
(4)、将引物B16在玉米摩擦禾单体附加系220B中扩增出的特异片段在紫外灯下切取，采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)将步骤(3)中所得的特异片段进行回收、纯化，具体操作按照说明书进行。取回收的DNA片段2ul加0.25％溴酚蓝指示剂1.5ul在1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得单一目标条带，条带大小与引物B16在玉米摩擦禾附加系样品(2n＝20+1)中扩增出特征性条带一致，说明条带回收成功。
(5)、将步骤(4)中回收的特异DNA片段与T载体连接。具体方法如下：将步骤(4)中回收产物与pMD19-T Simple Vector载体(宝生物工程(大连)有限公司)进行连接，在200ul离心管中按如下体系操作：回收DNA 4.5μL，pMD19-T Vector 0.5μL，SolutionⅠ5.0μL，混匀以上混合物，16℃连接过夜。
(6)、转化感受态细胞、菌落PCR检测、测序。具体方法如下：A.转化感受态细胞：将步骤(5)所得的连接产物加入到100μL的DH5α感受态中，冰浴30min，然后在42℃水浴锅中热击90s，快速移至冰上放置3min，再加入1mL未加抗生素的LB液体培养基，37℃150r/min振荡培养4h，取200μL菌液进行涂板，在37℃恒温培养箱中倒置培养12～16h；B.菌落PCR检测：挑取白色菌落溶于无菌水中，作为模板进行菌落PCR，反应体系和PCR反应程序同步骤(3)中所述，扩增产物用2％的琼脂糖凝胶检测；C.对阳性菌落进行培养，吸取1ml菌液到1.5ml灭菌的离心管中，密封，送往上海英骏生物技术有限公司测序(至少3个重复)，测序结果表明该序列全长691bp(SEQ ID No：5)，利用NCBI/MaizeGDB进行序列比对分析发现该段序列与公布的序列相似度较低仅为78％，是一段来自摩擦禾基因组的新序列。
(7)、根据步骤(6)的测序结果，按照SCAR引物的设计原则，用软件Primer 5.0设计引物，共设计5对SCAR分子标记引物(见表1)，引物由华大基因科技股份有限公司合成。SCAR分子标记PCR扩增的反应体系为：10×Taq Buffer 2.5μl，MgCl21.5μl，dNTPmix 2μl(2.5mM，each)，Taq聚合酶0.7μl(2.5u/μl)，引物F和R各1μl，DNA 1.5ul(50ng/μl)，ddH2O 14.8μl，总体系为25ul。PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，退火1min(退火温度根据引物序列设定)，72℃延伸1.5min，38个循环；72℃终延伸7min，4℃保存。扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，加样量为扩增产物15ul加0.25％溴酚蓝指示剂1.0ul。电泳结束后在紫外灯下用凝胶成像系统拍照。结果表明，仅有编号为4的引物在玉米摩擦禾单体附加系中扩增出了特异条带(见图6)。
表1 SCAR分子标记引物设计
| SCAR标记引物 | SCAR标记引物序列 |
| 1 | F:5'TTTGCCCGGAGTGTAGCAGTTA3' |
| R:5'AGCCGCTACATGGCAGACAATA3' | |
| 2 | F:5'TTTGCCCGGAGTGTAGCAGTTA3' |
| R:5'AACTGAAGCAAGCCGCTACATG3' | |
| 3 | F:5'TTTGCCCGGAGTGTAGCAG3' |
| R:5'CCCGGATAGCATGGAAACTG3' | |
| 4 | F:5'GTAGCAGTTACACATCAAAATCCG3' |
| R:5'TGTCTTGCTTATACCCATCTAAAGG 3' | |
| 5 | F:5'GTAGCAGTTACACATCAAAATCCG3' |
| R:5'GAAACTGAAGCAAGCCGCTAC3' |
(8)、将编号为4的引物在玉米摩擦禾单体附加系220B中扩增出的特异片段在紫外灯下切取，采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行回收、纯化、连接、测序，具体方法同步骤(4)、(5)、(6)。测序结果显示该序列全长569bp(SEQ ID No：1)，将碱基序列与引物B16在玉米摩擦禾附加系中扩增出的特异片段(SEQ ID No：5)比对发现两条序列一致，说明两条特异片段来源于同一段DNA片段，RAPD序列成功转化为稳定的SCAR标记。
实施例2玉米摩擦禾单体附加系核不育基因分子标记的验证试验
按照如下方法进行：
2013年3月下旬，在四川农业大学成都校区，种植玉米摩擦禾单体附加系(简称：单体附加系)MTchr2(已于2014年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9552)种子50粒(其中包含有21条染色体的单体附加系种子和20条染色体的普通种子)，待植株长到5～6叶时，单株挂牌，提取叶片基因组DNA，并以Mst1-F和Mst1-R为引物进行PCR扩增，具体方法同实施例1步骤(7)。同时在开花散粉期对植株的雄性育性进行鉴定。结果在MTchr2中的不育株(2n＝20+1)可以稳定扩增出特异条带，而可育株(2n＝20)没有条带(见图7)，表明该分子标记可以用于玉米摩擦禾单体附加系核不育基因材料的鉴定筛选。
实施例3利用玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的SCAR标记回交转育玉米雄性不育系试验
(一)试验材料：
(1)、玉米摩擦禾单体附加系(Zea mays)MTchr2(已于2014年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9552)
(2)、玉米自交系：B73、郑58、昌7-2(均由四川农业大学玉米所提供)。
(二)试验地点：
四川农业大学成都校区和四川农业大学玉米研究所西双版纳试验基地
(三)、试验方法
(1)、2013年3月下旬，在四川农业大学成都校区，取玉米摩擦禾单体附加系MTchr2(已于2014年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9552)种子50粒(其中包含有21条染色体的附加系不育种子和20条染色体的可育种子)种植，同时取玉米自交系B73、郑58、昌7-2各40粒分两批播种，播种间隔为7天，在温度为28℃、湿度为70％的人工气候箱中进行催芽，植株生长至三叶一心时，移栽到口径为30cm、高度为25cm的塑料花盆中。
(2)、植株长到5～6叶时，单株挂牌，提取MTchr2植株叶片基因组DNA，进行SCAR标记检测，保留具有Mst1标记的单体附加系植株，同时剔除普通植株。SCAR引物对为Mst1-F和Mst1-R，其核苷酸序列分别为：
(Mst1F):5'-GTAGCAGTTACACATCAAAATCCG-3'(SEQ ID No：2)；
(Mst1R):5'-TGTCTTGCTTATACCCATCTAAAGG-3'(SEQ ID No：3)。
SCAR反应体系为：10×Taq Buffer 2.5μl，MgCl21.5μl，dNTPmix 2μl(2.5mM，each)，Taq聚合酶0.7μl(2.5u/μl)，引物Mst1-F和Mst1-R各1μl，DNA1.5ul(50ng/μl)，ddH2O 14.8μl，总体系为25ul。扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，38个循环；72℃终延伸7min，4℃保存。扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，加样量为扩增产物15ul加0.25％溴酚蓝指示剂1.0ul。电泳结束后在紫外灯下用凝胶成像系统拍照。保留带有Mst1标记的植株(即为不育的玉米摩擦禾单体附加系植株)，拔除不带Mst1标记的植株(可育株)。
(3)、2013年6月，在步骤(2)入选的单体附加系不育植株吐丝前，将雌穗套袋，并在吐丝后剪短花丝至2～3cm，以B73、郑58、昌7-2为父本分别给不育的玉米摩擦禾单体附加系植株授粉，每个果穗重复授粉2次，并套袋做标记。种子成熟后，单穗单收并做记录，得F1代。
(4)、2013年8月，在四川农业大学玉米研究所西双版纳试验基地种植步骤(3)所得的F1代，同时分批播种B73、郑58、昌7-2。待F1代植株长到5～6叶时，单株挂牌，提取F1代叶片基因组DNA，按照步骤(2)所述方法进行SCAR标记检测，保留具有Mst1标记的单体附加系植株，同时剔除田间普通植株。2013年10月，在吐丝前，将带有Mst1标记的F1代雌穗套袋，并在吐丝后剪短花丝至2～3cm，以B73、郑58、昌7-2为父本分别给相应的F1代不育材料雌穗授粉，每个果穗重复授粉2次，并套袋做标记。种子成熟后，单穗单收并做记录，得BC1代。
(5)、2014年1月，在四川农业大学玉米研究所西双版纳试验基地播种步骤(4)所得BC1代，同时分批播种B73、郑58、昌7-2。按照步骤(4)所述的方法对BC1代材料进行鉴定筛选，分别进行回交，收获得BC2代。
(6)、2014年6月，在四川农业大学玉米研究所西双版纳试验基地播种BC2代种子，同时分批播种B73、郑58、昌7-2。按照步骤(4)所述的方法对BC2代材料进行鉴定筛选，分别进行回交，收获得BC3代。
(7)、2014年11月，在四川农业大学玉米研究所西双版纳试验基地播种BC3代，同时分批播种B73、郑58、昌7-2。按照步骤(4)所述的方法对BC3代材料进行鉴定筛选，分别进行回交，收获得BC4代。
(8)、2015年3月，在四川农业大学成都校区播种BC4代，同时分批播种B73、郑58、昌7-2。按照步骤(4)所述的方法对BC3代材料进行鉴定筛选，分别进行回交，收获得BC5代。至此，分别回交转育成含有21条染色体的相应的B73、郑58、昌7-2自交系的雄性不育系；同时还有20条染色体的普通玉米自交系。
实施例4、利用雄性不育的玉米摩擦禾单体附加系回交转育玉米雄性不育系试验
(一)试验材料：
(1)、玉米摩擦禾单体附加系(Zea mays)MTchr2(已于2014年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9552)
(2)、玉米自交系：B73、郑58、昌7-2(均由四川农业大学玉米所提供)。
(二)试验地点：
四川农业大学成都校区和四川农业大学玉米研究所西双版纳试验基地
(三)、试验方法
(1)、2013年3月，在四川农业大学成都校区种植玉米摩擦禾单体附加系MTchr2(已于2014年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9552)，同时分批种植农艺性状优良的玉米自交系B73、郑58、昌7-2；在抽丝散粉期，以雄性不育(直接以表现型判断雄穗的育性，以下同)的玉米摩擦禾单体附加系植株(2n＝20+1)为母本，分别以农艺性状优良的玉米自交系B73、郑58、昌7-2为父本杂交，得杂交F1代。
(2)2013年8月，在四川农业大学玉米研究所西双版纳试验基地种植步骤(1)所得的F1代，同时分批播种B73、郑58、昌7-2。在抽丝散粉期，以相应的雄性不育的F1代植株(2n＝20+1)为母本，以B73、郑58、昌7-2为父本分别进行回交，得BC1代；
(3)、2014年1月，在四川农业大学玉米研究所西双版纳试验基地播种步骤(2)所得BC1代，同时分批播种B73、郑58、昌7-2。在抽丝散粉期，以雄性不育的BC1代材料为母本，以相应的B73、郑58、昌7-2为父本分别进行回交，收获得BC2代。
(4)、2014年6月，在四川农业大学玉米研究所西双版纳试验基地播种步骤(3)所得的BC2代种子，同时分批播种B73、郑58、昌7-2。以雄性不育的BC2代材料为母本，以相应的B73、郑58、昌7-2为父本分别进行回交，收获得BC3代。
(5)、2014年11月，在四川农业大学玉米研究所西双版纳试验基地播种步骤(4)所得的BC3代，同时分批播种B73、郑58、昌7-2。以雄性不育的BC3代材料为母本，以相应的B73、郑58、昌7-2为父本回交，收获得BC4代。
(6)、2015年3月，在四川农业大学成都校区播种步骤(5)所得的BC4代，同时分批播种B73、郑58、昌7-2。以雄性不育的BC4代材料为母本，以相应的B73、郑58、昌7-2为父本分别进行回交，收获得BC5代。至此，分别回交转育成含有21条染色体的相应的B73、郑58、昌7-2的雄性不育系；同时还有20条染色体的普通玉米自交系。
Claims (12)
1.一种玉米摩擦禾单体附加系核不育基因的分子标记，其特征在于所述的分子标记由SEQ ID No：1所示的核苷酸序列组成。
2.按照权利要求1所述的分子标记，其特征在于所述的玉米摩擦禾单体附加系是指MTchr2或其带有附加染色体的MTchr2的衍生系。
3.按照权利要求1或2所述的分子标记，其特征在于所述的MTchr2，已于2014年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9552。
4.用于扩增权利要求1所述的分子标记的SCAR引物对，其特征在于由SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示的核苷酸序列组成。
5.用于检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒，其特征在于含有由SEQ ID No：2和SEQ ID No：3所示的核苷酸序列组成的SCAR引物对。
6.权利要求1所述的分子标记在玉米摩擦禾单体附加系核不育基因辅助选择上的应用。
7.利用权利要求1所述的分子标记回交转育玉米雄性不育系的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)、种植玉米摩擦禾单体附加系，同时分批种植农艺性状优良的玉米自交系；在5～6叶期提取玉米摩擦禾单体附加系叶片基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以Mst1-F和Mst1-R为引物进行PCR扩增，电泳，保留带有Mst1标记的植株，拔除不带Mst1标记的植株；在抽丝散粉期，以带有Mst1标记的植株(2n＝20+1)为母本，以农艺性状优良的玉米自交系(2n＝20)为父本杂交，得杂交F1代；
(2)、种植杂交F1代，同时分批种植步骤(1)中所述的农艺性状优良的玉米自交系；按照步骤(1)中所述的方法对F1代植株进行PCR扩增，保留带有Mst1标记的植株，拔除不带Mst1标记的植株；在抽丝散粉期，用农艺性状优良的玉米自交系给带有Mst1标记的F1代植株(2n＝20+1)授粉，得BC1代；
(3)、重复步骤(2)连续回交4～6次，即得含有21条染色体的相应农艺性状优良的玉米自交系的不育系；所得的不育系的植株表型与步骤(1)中的农艺性状优良的玉米自交系基本相同，但花粉完全败育；此外，还同时产生相应的含有20条染色体的花粉可育的常规种子。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的玉米摩擦禾单体附加系是指MTchr2或带有附加染色体的MTchr2的衍生系。
9.利用权利要求1所述的分子标记进行玉米轮回选择育种的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)、种植玉米摩擦禾单体附加系，在抽雄散粉期，将其中的雄性可育株(2n＝20)剔除，以雄性不育株(2n＝20+1)为母本，以符合育种目标的农艺性状优良的10～30个玉米材料(2n＝20)为父本，分别进行人工杂交，得杂交F1代；
(2)、按照组合种植F1代，并分批种植步骤(1)中所述的玉米材料；以F1代中的不育株(2n＝20+1)为母本，以步骤(1)中所述的玉米材料为父本分别进行回交，收获不育株上的种子，获得BC1代；
(3)、在隔离条件下按照组合种植BC1代；在5～6叶期提取BC1代叶片总DNA，然后以叶片总DNA为模板，以Mst1-F和Mst1-R为引物进行PCR扩增，保留带有Mst1标记的植株，拔除不带Mst1标记的植株；在开花散粉期自由授粉，收获农艺性状优良的不育株上的果穗，然后将种子等量混合，建立基础群体C0；
(4)、在隔离条件下种植C0群体100～5000株；在5～6叶期提取C0代叶片总DNA，然后以叶片总DNA为模板，以Mst1-F和Mst1-R为引物进行PCR扩增，保留带有Mst1标记的植株，拔除不带Mst1标记的植株；在开花散粉期自由授粉，收获农艺性状优良的不育株上的果穗，然后将种子等量混合，形成第一轮群体C1；
(5)、重复步骤(4)3～5次，可得群体C4～C6；
(6)、在步骤(5)所得的C4～C6群体中选择符合育种目标的可育单株，进入系谱法育种程序，按照育种目标进行选株自交，培育出新的品种。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的玉米摩擦禾单体附加系是指MTchr2或带有附加染色体的MTchr2的衍生系。
11.利用玉米摩擦禾单体附加系回交转育玉米雄性不育系的方法，包括如下步骤：
(1)、种植玉米摩擦禾单体附加系，同时分批种植需要转育的农艺性状优良的玉米自交系；在抽丝散粉期，以雄性不育的玉米摩擦禾单体附加系植株(2n＝20+1)为母本，以农艺性状优良的玉米自交系(2n＝20)为父本杂交，得杂交F1代。
(2)、种植杂交F1代，同时分批种植步骤(1)中所述的农艺性状优良的玉米自交系；在抽丝散粉期，以雄性不育的植株(2n＝20+1)为母本，以步骤(1)中所述的玉米自交系(2n＝20)为父本杂交，得BC1代；
(3)、重复步骤(2)连续回交4～6次，得相应农艺性状优良的玉米自交系的不育系(2n＝20+1)；所得的雄性不育系植株表型与步骤(1)中的农艺性状优良的玉米自交系基本相同，但花粉完全败育；此外，还同时产生相应的含有20条染色体的雄性可育的普通玉米。
12.按照权利要求11所述的方法，其特征在于其步骤(1)中所述的玉米摩擦禾单体附加系是指MTchr2或带有附加染色体的MTchr2的衍生系。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |