CN103993011A

CN103993011A - 芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记及制备方法和应用

Info

Publication number: CN103993011A
Application number: CN201410111566.1A
Authority: CN
Inventors: 刘红艳; 赵应忠; 吴坤; 杨敏敏
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2014-03-24
Filing date: 2014-03-24
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2034-03-24
Also published as: CN103993011B

Abstract

本发明公开了一种芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记及制备方法和应用，所述的标记GB50的正向引物序列为：ATGGGTTTATGGCAGGCT，反向引物序列为：GGACTACTCCTCCTCCCCA；SBM298的正向引物的序列为：CCCCTTTTCACTTACGTACAGCAG，反向引物的序列为：CTCTTCCTCCACCATCTCCTCTTC。步骤是：A、在苗期对显性细胞核雄性不育兄妹交分离群体各编号，分单株采集幼嫩叶片，经液氮处理后冰箱储存备用；B、利用EST-SSR引物SBM系列，生物合成；C、采用PCR程序进行扩增；D、PCR扩增与产物检测；E、多态性标记的获得；F、与雄性不育相关分子标记的获得。获得100%雄性不育的群体，显著提高芝麻轮回选择的效率，避免了利用形态特征只有等到花期才能拔除50%可育株的麻烦。本发明效果明显、成本低、无公害，应用前景十分广阔。

Description

芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记及制备方法和应用

技术领域

本发明属于芝麻遗传育种和分子生物学领域，更具体涉及一种芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记，同时还涉及一种芝麻显性细胞核雄性不育相关分子标记的制备方法，还涉及一种芝麻显性细胞核雄性不育分子标记在分子标记辅助选择中的应用，以提高利用芝麻显性细胞核雄性不育基因进行高产育种的效率。

背景技术

芝麻是我国主要油料作物之一，芝麻油芳香纯正，营养价值高，素有“油中之王”的美誉。我国芝麻年种植面积60万公顷左右，占世界总面积的十分之一，总产60-70万吨，占世界总产的四分之一，其总产和单产均居世界首位（杨湄，黄凤洪．中国芝麻产业现状与存在问题、发展趋势与对策建议．中国油脂，2009，34（1）：7-12），是农业结构调整的优势作物，也是传统的出口创汇作物。但近十年来，国内芝麻消费量大幅度上升，年均消费芝麻籽80万吨以上，其中20万吨靠进口，芝麻已经转变为纯进口作物。因此，进一步提高芝麻单产和总产以满足国内消费需求是当前的紧迫任务。

芝麻在全国各地均可种植，但主要集中在河南、湖北、安徽、江西四省。我国芝麻产业发展中存在的主要问题有：①产量常常低而不稳，长期徘徊在亩产70公斤的水平（杨湄，黄凤洪．中国芝麻产业现状与存在问题、发展趋势与对策建议．中国油脂，2009，34（1）：7-12）；②抗病性差，易发生茎点枯病、枯萎病，且目前未发现免疫或高抗材料（Zhang X R, Zhao Y Z, Cheng Y, Feng X F, et al. Establishment of sesame germplasm core collection in China. Genetic Resources and Crop Evolution, 2000, 47: 273-279）；③外观品质差，含油量低，市场竞争力不强。因此开展高产、优质、抗病芝麻新品种选育是当前的主要育种目标。

芝麻具有很强的杂种优势，通过杂种优势利用可以大幅度提高芝麻的产量（屠礼传，柳家荣，梁秀银．芝麻杂种优势研究．中国油料，1988（2）：8-12；乐美旺，曹开蔚，张冬仙等．黑芝麻杂种优势研究．江西农业学报，2006，18（1）：1-5）。作物杂种优势利用途径主要有：细胞质雄性不育、细胞核雄性不育、化学杀雄、自交不亲和等（傅廷栋主编．杂交油菜的育种与利用(第二版)．武汉：湖北科学技术出版社，2000；刘后利主编，作物育种学论丛．北京：中国农业大学出版社，2002）。在芝麻中，目前杂种优势利用的主要方式为隐性细胞核雄性不育，尚未见到显性细胞核不育的报道。利用芝麻隐性细胞核雄性不育虽然育成了一些杂交品种，但芝麻隐性核不育的缺点是缺乏完全的保持系，只能以两型系的形式加以利用，在生产杂交种时存在着必须及时拔除两型系中50%可育株的问题，较费时费力，人工成本高，因此限制了其在芝麻生产上的应用。

显性核不育是杂种优势利用的另外一条重要途径，在油菜、白菜等作物中已经被广泛应用。本发明申请人通过种间杂交，首次创制出芝麻显性细胞核雄性不育两型系W1098AB，其不育系败育彻底、稳定、无不良胞质效应。通过前期研究表明，W1098AB兄妹交群体的育性分离比例稳定在1：1，可育株自交后代全部可育，而且利用17份芝麻地方品种与不育株测交，所有F1代均发生育性分离。上述结果进一步说明，W1098AB为显性核不育，可能受1对基因控制，绝大部分品种为其保持系。该雄性不育在芝麻轮回选择育种中是一个很好的材料，可进行广泛的基因重组和品种选育。但轮回选择一般需于初花期及时拔除不育系中50%的可育株（张立森，江庆芬，泰立芳. 太谷显性核不育小麦轮回选择育种简报. 河北农业大学学报，1989，12（4）：143-144），而芝麻W1098AB不育株与可育株的形态特征十分相似，在营养生长期无法区别，只能等到开花后根据花粉有无进行区分，十分费时费力，去除不及时将产生大量花粉污染，影响选择效率。针对上述问题，本发明利用分子标记技术，开发出多个与育性紧密连锁的分子标记，在苗期即可对可育株进行准确识别和拔除，获得100%雄性不育的群体，显著提高芝麻轮回选择的效率，应用前景广阔。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记，开发出多个与育性紧密连锁的分子标记，在苗期即可对可育株进行准确识别和拔除，获得100%雄性不育的群体，显著提高芝麻轮回选择的效率，避免了利用形态特征只有等到花期才能拔除50%可育株的麻烦。本发明效果明显、成本低、无公害，应用前景十分广阔。

本发明的另一个目的是在于提供了一种芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记的制备方法，方法易行，操作性强，其特点是特异性强，扩增重复性好，可以确定植株或品系中是否有不育基因的存在，从而在早期鉴定芝麻植株的育性。

本发明的再一个目的是在于提供了一种芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记在芝麻亲本选择中的应用，通过分子标记辅助选择，鉴定和筛选不育材料速度快，极大地减轻了在鉴定过程中必需经过测交及后代种植观察的工作量，有效提高了选择的效率和准确性，从而大大提高了芝麻显性细胞核雄性不育基因选育的速度与鉴定效率，加快了杂交种选育的进程。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记的制备方法，其步骤是：

A、在苗期首先对显性细胞核雄性不育兄妹交分离群体各单株编号挂牌，然后分单株采集幼嫩叶片，经液氮处理后于-70℃超低温冰箱储存备用。在盛花期，利用田间观察和室内醋酸洋红染色等方法（刘绚霞，醋酸洋红染色法测定油菜花粉的生活力．陕西农业科学，1998，（1）：23-24），综合调查群体的花粉育性，将其准确划分为可育株或不育株。

B、利用本课题组开发的EST-SSR引物SBM系列（Kun Wu, Minmin Yang, Hongyan Liu, Ye Tao, Ju Mei, Yingzhong Zhao. Genetic analysis and molecular characterization of Chinese sesame (SesamumindicumL.) cultivars using Insertion-Deletion (InDel) and Simple sequence repeat (SSR) markers. BMC Genetics, 2014, 15），并根据文献（张鹏，张海洋，郭旺珍，郑永战，魏利斌，张天真. 以SRAP和EST-SSR标记分析芝麻种质资源的遗传多样性. 作物学报，2007，33（10）：1696-1702；Dixit A, Jin M H, Chung J W, Yu J W, Chung H K, Ma K H, Park Y J, Cho E G. Development of polymorphic microsatellite markers in sesame (Sesamumindicum L.). Molecular Ecology Notes, 2005, 5: 736-738）下载SSR引物序列，共1500多对，委托上海英骏生物合成公司合成。

C、用CTAB法（Doyle J. DNA protocols for plants — CTAB total DNA isolation. In: Hewitt G M, Johnston A. Molecular Techniques in Taxonomy, Berlin: Springer-Verlag, 1991. P283-293）提取芝麻显性细胞核雄性不育系兄妹交群体中的可育株与不育株叶片DNA，采用PCR程序（刘红艳，杨敏敏，左阳，舒岩，赵应忠．芝麻SSR检测体系的优化与应用．中国农学通报，2011，27(21):138-143）进行扩增，所用PCR仪型号为ABI9700。

D、PCR产物的检测根据所需的分辨率不同可采用两种不同的方法，第一种为在1%～1.5%浓度（g/v）的琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕后，进行溴化乙啶染色，凝胶成像系统拍照保存，记录多态性结果。第二种为在聚丙烯酰胺凝胶中点样，电泳完毕后，用2%浓度（g/v）AgNO₃银染，普通蒸馏水漂洗，显影液中显影，及时用凝胶成像系统拍照保存，并记录多态性结果。

E、由于所用材料是显性细胞核雄性不育兄妹交后代，电泳时差异条带呈现出可育（基因型为msms）为无带，不育（基因型为Msms）为有带。为方便记录，在相同迁移率位置上，将有带记为“1”，无带记为“0”，并统计SSR扩增产物。为保证数据准确、可靠，每胶板均由2人独立记录（仅记录主带），然后比对确认。

F、利用能检测出多态性的引物对全部单株逐一进行检测，将所得数据输入电脑，并用JoinMap3.0软件（Van Ooijen J W, Voorips R E. JoinMap Version 3.0: Software for the Calculation of Genetic Linkage Maps[M]. Wageningen, The Netherlands: Plant Research International, 2001）进行分析，遗传图距用Kosambi函数加以转换（Kosambi D D. The estimation of map distance from recombination values. Annals of Eugenics, 1944, 12:172-175），两个性状（标记）间的重组交换率由以下公式计算：交换率（%）=重组型的配子数/总配子数×100。

G、将重组交换率高于15%的标记予以剔除（因为它们与不育基因呈松散的连锁关系），找出重组交换率为15%以内、特异扩增片段大小为100-500bp的标记。

H、将所得标记检测结果使用JoinMap软件（Van Ooijen J W, Voorips R E. JoinMap Version 3.0: Software for the Calculation of Genetic Linkage Maps[M]. Wageningen, The Netherlands: Plant Research International, 2001）分析，设定LOD值为2.0，如果发现所有标记都分为一组，随后将LOD值设置为最高值10.0，如果这些标记仍然没有分开，则表明它们之间是紧密连锁的。运行“Calculate Map”命令，即可获得一个遗传连锁图。从这张遗传连锁图上可以看出每个标记与不育基因间的遗传距离及方向，以及各个标记间的距离与方向。通过本方法目前已获得了13个与不育基因紧密连锁的标记（请见表1），其中标记SBM298和GB50距离不育基因最近。标记GB50的正向引物的序列为：ATGGGTTTATGGCAGGCT，反向引物的序列为：GGACTACTCCTCCTCCCCA；SBM298的正向引物的序列为：CCCCTTTTCACTTACGTACAGCAG，反向引物的序列为：CTCTTCCTCCACCATCTCCTCTTC。SBM298标记的引物为本实验室开发。

表1 多态性引物序列

引物编号	正向引物序列（5’→3’）	反向引物序列（3’→5’）
			SBM298	CCCCTTTTCACTTACGTACAGCAG	CTCTTCCTCCACCATCTCCTCTTC
GB50	ATGGGTTTATGGCAGGCT	GGACTACTCCTCCTCCCCA
			GB47	GACACTCATTGGCTGGGA	CCCACTGGCAGAGACTGT
HS117	GCTCTTCCCTCAACACCATT	CGCAGGTCTGGTGATAGAAC
			HS011	TAAACCAACGGAAGACACCA	AGAGAGAGAGAGAGCACGGC
HS002	CCATTAAATTCTTGCTCCCC	CTGGTCGTATGCAGCATCTT
			HS291	CATTCTCCTCAACCCATCCT	GTGAGCTTCGCAGTCGTAAG
HS003	ACTTGGCCTACGAACAGCTT	GGAAAAACACCTCGGAAGAA
			HS216	TGAGAGAGGTTAATTGGGGG	TGGCTCCCATGTATTTACCA
SBI058	CAGTGGAAATCGGACGG	AAACTAACGAACCCTCTCTCTC
			HS135	GTTGGAGTTGTGTTGGCATC	ATAACCATCCCATTCCCTCG
HS006	TGAAAAGCTGAGGAAGAGCA	ACAGTGGAGGGAGACGACTT
			HS045	TCCCAGTCCCTTGAAAGAAG	TGGGGAGAGAAAGGAAAGAA

一种芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记在芝麻亲本选择中的应用，其步骤是：

A、芝麻显性细胞核雄性不育育性分离群体的构建：选取人工套袋杂交多代的显性细胞核雄性不育系中的可育株和不育株再进行兄妹交，得到F₀代种子，对F₁植株套大蚊帐进行生殖隔离种植，获得育性分离群体。

B、育性鉴定：芝麻盛花期，在田间对兄妹交分离群体的每个单株挂牌进行育性鉴定，由于该不育系不育花药和可育花药肉眼看基本没有差别，手捏花药后根据花粉量的多少难以确定各个单株是可育株还是不育株，因此取每个挂牌植株中部花朵，在实验室用醋酸洋红法染色，每植株看2朵花，每朵花看3个视野，饱满的、染色深的即为可育花粉，皱瘪的、染色浅或不染色的即为不育花粉，最后统计花粉可育率。可育率高于80%的即为可育株，可育率低于20%的即为不育株。

C、取样并提取单株DNA：将不育株和可育株分别按单株取样，在各个单株上摘取1-2片刚长出的幼嫩心叶，液氮处理后于-70℃超低温冰箱保存。在室内用CTAB法提取单株基因组DNA。

D、利用与芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记进行鉴定：采用实施例1所开发的芝麻显性细胞核雄性不育基因的特异引物对随机挑选的224个F1单株（其中不育株107株，可育株117株）进行鉴定，结果发现几乎所有不育株都可扩增出分子量为500bp左右的特异片段，而几乎所有可育株都未扩增出该特异片段，验证了该基因的分子标记与雄性不育基因紧密连锁。

E、扩大芝麻显性细胞核雄性不育F1分离群体至1982株，利用SSR标记SBM298和GB50分别对群体单株抽提基因组DNA，采用实施例2所开发的与芝麻显性细胞核雄性不育基因紧密连锁的特异引物进行PCR扩增，进行分子标记的逐个检测，发现利用分子标记SBM298检测到30个杂合株，准确率可达98.5%，利用分子标记GB50检测到69个杂合株，准确率可达96.5%。如果利用这两个分子标记同时进行检测，则准确率可达99.9%。因此利用筛选到的与雄性不育紧密连锁的分子标记SBM298和GB50能够有效检测某个体是否含有雄性不育基因。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

① DNA分子标记不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。

② 不受环境影响。环境只影响基因表达（转录与翻译），而不改变基因结构即DNA的核苷酸序列。

③ 标记数量多，遍及整个基因组。

④ 多态性高，自然存在许多等位变异。

⑤ 有许多标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息。

⑥ DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化。

⑦ 提取的DNA样品，在适宜条件下可长期保存，这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。

鉴于此，本发明开发出多个与育性紧密连锁的分子标记，在苗期即可对可育株进行准确识别和拔除，获得100%雄性不育的群体，显著提高芝麻轮回选择的效率，避免了利用形态特征只有等到花期才能拔除50%可育株的麻烦。本发明效果明显、成本低、无公害，应用前景十分广阔。

本发明通过雄性不育基因获得芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记，并利用分子标记辅助选择不育系，其特点是特异性强，扩增重复性好，方法易行，操作性强，可以确定植株或品系中是否有不育基因存在，从而可以在早期鉴定芝麻显性细胞核雄性不育性。通过分子标记辅助选择，极大地减轻了不育性鉴定必需经过测交及后代种植观察的工作量，有效提高选择的效率和准确性，有助于加快芝麻显性细胞核雄性不育三系配套及其在遗传改良中的应用。

本发明利用筛选的分子标记SBM298和GB50分别对显性细胞核雄性不育分离群体幼苗进行单株DNA检测，共检测224个单株，花期用醋酸洋红法检测各单株花粉育性，使之一一对应，结果发现分子标记SBM298检测准确率达98.5%，分子标记GB50检测准确率达96.5%，利用这两个标记同时检测准确率可达99.9%，因此分子标记辅助选择不育系效果好。

附图说明

图1为一种SSR引物SBM298特异性片段的扩增结果。

SSR引物SBM298在群体中的扩增情况，前18孔为育性分离群体中的可育株，后18孔为育性分离群体中的不育株，M为D2000 Maker，箭头所指为扩增目的片段。

具体实施方式

实施例1：

1、芝麻显性细胞核雄性不育相关片段的获得：

A、实验材料及群体构建：2002年从印度引进了5份芝麻野生资源，其中的一份资源“野芝2号”（SesamummalabaricumBurm, 2n=26）能正常生长发育并与栽培种“鄂芝1号”杂交成功。从远缘杂交（野芝2号×鄂芝1号）F₁代选取不育率最高的几个植株分别与鄂芝1号回交，如此反复2代，然后在获得的BC₂群体中选最优不育株与可育株做兄妹交，后代重点选择不育株率接近50%的群体再连续兄妹交4代左右，育成了新的芝麻雄性不育两型系W1098AB。

B、利用本实验室开发的有关SSR引物SBM序列（Kun Wu, Minmin Yang, Hongyan Liu, Ye Tao, Ju Mei, Yingzhong Zhao. Genetic analysis and molecular characterization of Chinese sesame (SesamumindicumL.) cultivars using Insertion-Deletion (InDel) and Simple sequence repeat (SSR) markers. BMC Genetics, 2014, 15），同时下载已发表文章（Dixit A, Jin M H, Chung J W, Yu J W, Chung H K, Ma K H, Park Y J, Cho E G. Development of polymorphic microsatellite markers in sesame (Sesamumindicum L.). Molecular Ecology Notes, 2005,5:736-738；张鹏，张海洋，郭旺珍，郑永战，魏利斌，张天真. 以SRAP和EST-SSR标记分析芝麻种质资源的遗传多样性. 作物学报，2007，33（10）：1696-1702）中用到的SSR引物序列，共1500多对。引物序列由上海英骏生物技术公司合成。

C、DNA提取及电泳检测：用CTAB法提取芝麻显性细胞核雄性不育两型系中不育株和可育株叶片DNA，具体步骤为：

a）将芝麻叶片加入液氮，迅速研磨成粉末状，转移至2ml离心管中。

b）加入CTAB裂解缓冲液1ml，充分混匀。

c）60℃水浴50min，期间每隔5min混匀一次，使其充分裂解。

d）冷却至室温（20－25℃），加入等体积氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀，20min后，12000r/min离心20min。

e）移上清至1.5ml离心管中，加入等体积的冰冻无水乙醇，混匀，-20℃静置10min。

f）3000r/min离心3min，弃上清。

g）用75%（体积比）乙醇浸泡冲洗2-3次至DNA为白色，酒精清澈为止。

h）转移至1.5ml离心管中，将剩余的液体尽量吸尽并干燥，加入TE（即Tris-EDTA，一种溶解DNA的缓冲液）。

i）待DNA溶解后，加入2μl浓度为10mg/ml的RNAase，并在37℃下处理30-60min，除去RNA。

j）进行浓度和纯度测定，另取3-5μl进行琼脂糖凝胶电泳检测。

D、PCR扩增：反应体系为：10×Buffer 1.0μl，Mg²⁺0.6μl，dNTP 0.2μl，Taq酶0.1μl（5U），正反向引物各1μl(10μm/l)，ddH₂O 5.1μl，模板DNA 1μl（50ng/μl）。反应程序为：94℃ 5 min；94℃30s，58℃40 s，72℃50 s，共37个循环，72℃延伸10 min。PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶（40% PAGE 4ml，5×TBE 4ml，ddH₂O 12ml，AP 134μl，TEMED 16μl）电泳分离，银染（2g AgNO₃用蒸馏水定容至2L）后显影（30g NaOH用蒸馏水定容至1L，用前加入15ml甲醛，轻轻混匀即可）检测。1500多对SSR引物对不同材料的模板DNA进行扩增。多数引物能扩增出清晰的条带，但大多数引物扩增出的条带在不同的材料间没有差异，少数引物扩增出的条带微弱或不清晰。在这1500多对SSR引物中，发现能扩增出清晰条带、且不育/可育间差异明显的引物共13对。利用这13对引物在不育株和可育株中进行扩增（请见表1），发现在不育株中多数能扩增出特异片段（图1），这说明这些不育株均含有显性雄性不育基因，因此可以用来进一步发掘与雄性不育基因连锁的分子标记。获得了GB50的正向引物的序列为：ATGGGTTTATGGCAGGCT，反向引物的序列为：GGACTACTCCTCCTCCCCA；获得了SBM298的正向引物的序列为：CCCCTTTTCACTTACGTACAGCAG，反向引物的序列为：CTCTTCCTCCACCATCTCCTCTTC。SBM298标记的引物为本实验室开发。

表1 多态性引物序列

实施例2：

D、利用与芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记进行鉴定：采用实施实例1所开发的芝麻显性细胞核雄性不育基因的特异引物对随机挑选的224个F1单株（其中不育株107株，可育株117株）进行鉴定，结果发现几乎所有不育株都可扩增出分子量为500bp左右的特异片段，而几乎所有可育株都未扩增出该特异片段，验证了该基因的分子标记与雄性不育基因紧密连锁。

E、扩大芝麻显性细胞核雄性不育F1分离群体至1982株，利用SSR标记SBM298和GB50分别对群体单株抽提基因组DNA，采用实施实例2所开发的与芝麻显性细胞核雄性不育基因紧密连锁的特异引物进行PCR扩增，进行分子标记的逐个检测，发现利用分子标记SBM298检测到30个杂合株，准确率可达98.5%，利用分子标记GB50检测到69个杂合株，准确率可达96.5%。如果利用这两个分子标记同时进行检测，则准确率可达99.9%。因此利用筛选到的与雄性不育紧密连锁的分子标记SBM298和GB50能够有效检测某个体是否含有雄性不育基因。

Claims

1.一种芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记，其特征在于：标记GB50的正向引物序列为：ATGGGTTTATGGCAGGCT，反向引物序列为：GGACTACTCCTCCTCCCCA；SBM298的正向引物的序列为：CCCCTTTTCACTTACGTACAGCAG，反向引物的序列为：CTCTTCCTCCACCATCTCCTCTTC。

2.权利要求1所述的一种芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记的制备方法，其步骤是：

A、在苗期对显性细胞核雄性不育兄妹交分离群体各单株编号挂牌，然后分单株采集幼嫩叶片，经液氮处理后于-70℃超低温冰箱储存备用，在盛花期，利用田间观察和室内醋酸洋红染色方法，调查群体各单株的花粉育性，将其划分为可育株或不育株；

B、利用EST-SSR引物SBM系列，并根据文献下载SSR引物序列，生物合成；

C、用CTAB法提取芝麻显性细胞核雄性不育系兄妹交群体中的可育株与不育株叶片DNA，采用PCR程序进行扩增；

D、PCR产物的检测根据分辨率不同采用两种不同的方法，第一种为在1%～1.5%浓度g/v的琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕后，进行溴化乙啶染色，凝胶成像系统拍照保存，记录多态性结果；第二种为在聚丙烯酰胺凝胶中点样，电泳完毕后，用2%浓度g/v的AgNO₃银染，普通蒸馏水漂洗，显影液中显影，用凝胶成像系统拍照保存，并记录多态性结果；

E、所用材料是显性细胞核雄性不育兄妹交后代，电泳时差异条带呈现出可育为无带，不育为有带；

F、利用能检测出多态性的引物对全部单株逐一进行检测，将所得数据输入电脑，并用JoinMap3.0软件进行分析，遗传图距用Kosambi函数加以转换，两个性状间的重组交换率由以下公式计算：交换率%=重组型的配子数/总配子数×100；

G、将重组交换率高于15%的标记予以剔除，找出重组交换率为15%以内、特异扩增片段大小为100-500bp的标记；

H、将所得标记检测结果使用JoinMap软件分析，设定LOD值为2.0，发现所有标记都分为一组，随后将LOD值设置为最高值10.0，这些标记没有分开，表明它们之间紧密连锁，获得一个遗传连锁图，标明每个标记与不育基因间的遗传距离及方向，及各个标记间的距离与方向，最终获得了13个与不育基因紧密连锁的标记。

3.权利要求1所述的一种芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记在芝麻亲本选择中的应用。