CN105695484B - 甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs，涉及油菜育种技术领域。甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。其应用是：①用于甘蓝型油菜温敏型显性核不育系的选育；②用于甘蓝型油菜温敏型显性核不育系、保持系和恢复系的分子标记辅助选育。本发明利用BnaAtsMs基因序列结合基因工程技术可开发出油菜智能不育系统；利用BnaAtsMs基因序列信息可以实现分子标记辅助选择育种；可实现油菜及相关作物两系杂交制种。

Description

甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs
技术领域
本发明涉及油菜育种技术领域，尤其涉及一种甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs；具体地说，涉及一个油菜温敏型显性细胞核雄性不育基因BnaAtsMs的分离克隆、功能验证和应用，可以加快油菜等作物细胞核雄性不育两系法的选育，从而在繁殖制种时获得100％不育的群体。
背景技术
雄性不育可以分为细胞质雄性不育(CMS)和细胞核雄性不育(GMS)。细胞质雄性不育为人类所知已有100多年的历史，并且在水稻、玉米和油菜等作物中广泛地用于生产杂交种。油菜杂种优势利用是解决油菜产业目前面临问题的有效途径之一。杂种优势利用的关键问题是如何以经济有效的方法实现杂交亲本雌雄配子发生融合、形成杂交种的同时，并阻止杂交亲本自花授粉。目前，世界上可以用于油菜杂种优势利用的CMS系统有ogu、kos、tour和波里马。其中，波里马CMS是目前国际上公认的最有实用价值的CMS系统(1)，但是波里马不育系育性受到温度的影响表现不稳定，制种风险较大，其应用受到了一定的限制。
而细胞核雄性不育系统不育性稳定彻底，不存在不育胞质负效应和胞质单一化的潜在风险，一般不受恢保关系的限制，很容易获得强优势组合，在杂种优势利用中具有广阔的前景(2)。但是，目前油菜细胞核雄性不育系统在油菜杂种优势利用中的主要困难是，在制种过程中不育系存在50％的可育株必须人工拔除，由此不仅增加了制种的成本，而且往往由于可育株清除不彻底，影响制种纯度，增加了生产的风险。而以水稻光敏核不育“农垦58S”大规模应用为标志，光、温敏细胞核雄性不育作为作物杂种优势利用的有效途径之一已得到广泛应用。如果油菜杂种优势利用也能按照水稻育种“三系法→两系法”(3)的趋势发展，将成为培育优质超高产杂交油菜品种、打破我国油菜杂种优势利用瓶颈的有效途径。
目前，国内已报道了大量甘蓝型油菜光、温敏细胞核雄性不育材料：温敏核不育湘91S(4)、Huiyou50S(5-6)；光温敏核不育系H90S(7)、501-8S(8)、N196S(9)；环境敏感核不育系373S(10)；光敏型核不育HY50S(11)。并已经利用光温敏细胞质雄性不育系501-8S成功选育出国内第一个应用于生产上的生态型雄性不育两系杂交油菜组合“两优586”(9)，利用湘91S选育的两系杂交种湘杂油5号和湘杂油7号已通过品种审定，表明两系杂交油菜在实际生产应用中具有广阔前景。但是，甘蓝型油菜光、温敏型细胞核雄性不育的基础研究严重滞后，有关甘蓝型油菜光、温敏型细胞核雄性不育基因的克隆和调控机理的研究尚属空白。而BnaAtsMs基因的克隆为甘蓝型油菜温敏型细胞核雄性不育系在甘蓝型油菜杂种优势利用中的应用提供理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs，具体地是克隆一个甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs，利用该基因使其保持系败育，或作为新的核不育系和保持系选育的分子标记，以加快甘蓝型油菜核不育系和保持系的选育。
本发明的目的是这样实现的：
一、甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs
其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
二、甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs的获得方法
通过分离和克隆技术，从甘蓝型油菜中分离得到；
采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。
三、甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs的应用
①用于甘蓝型油菜温敏型显性核不育系的选育；
②用于甘蓝型油菜温敏型显性核不育系、保持系和恢复系的分子标记辅助选育。
本发明具有下列优点和积极效果：
①利用BnaAtsMs基因序列结合基因工程技术可开发出油菜智能不育系统；
②利用BnaAtsMs基因序列信息可以实现分子标记辅助选择育种；
③可实现油菜及相关作物两系杂交制种。
附图说明
图1是覆盖甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs区段的物理图谱，图中：
虚线椭圆表示定位的BnaAtsMs基因区段标记相对应的拟南芥同源性基因，
虚线圆表示定位的BnaAtsMs基因区段候选基因相对应的白菜同源性基因，
浅色字表示预测的甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs的候选基因。
图2是甘蓝型油菜功能互补测验表达载体pC2300-BnaAtsMs的构建图。
图3是具有TE5遗传背景的T0代遗传转化甘蓝型油菜植株开花后育性表型与TE5表型的比较图；
TE5遗传转化T0代植株携带显性基因BnaAtsMs的候选基因，表现为花丝退化，育性败育，KI染色无正常花粉。
图4是甘蓝型油菜温敏细胞核显性不育系TE5A半薄和超薄切片显微解剖结构图，图中：
a、b、c、g、h和i分别是正常花药花粉母细胞时期、四分体时期、单核早期、单核靠边期和成熟期半薄切片显微照片；d、e、f、j、k和l分别是不育花药对应时期的半薄切片显微照片；E：外表皮；EN：中层；Md：内表皮；MC：小孢子母细胞；T：绒毡层；MMC：花粉母细胞；PCW：胼胝质壁；Tds：四分体；Msp：小孢子；PG：成熟花粉粒。
图5是甘蓝型油菜温敏细胞核显性不育系TE5A超薄切片显微解剖结构图，图中：
e、f、g和h分别是正常花药四分体时期、小孢子时期、小孢子、成熟花粉时期细胞结构；a、b、c和d分别是不育花药对应时期的细胞结构；T：绒毡层细胞；MMC：花粉母细胞；MC：小孢子母细胞；PG：成熟花粉粒。
图6是甘蓝型油菜温敏细胞核显性不育系TE5A胼胝质观察图，图中：
e、f和g分别是正常花药花粉母细胞时期、四分体时期和单核期用苯胺蓝染色后观察胼胝质荧光的显微照片；a、b、c分别是不育花药对应时期的胼胝质荧光的显微照片；d是不育花药成熟花粉粒时期用苯胺蓝染色后观察胼胝质荧光的显微照片。
具体实施方式
以下结合附图和实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆：实验室指南》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory,1989)中所述的条件，或者按照生产厂商提供的操作手册中建议的条件。
一、实施例1：甘蓝型油菜温敏细胞核显性不育材料遗传规律分析
1、实验材料
本实验所用的材料为甘蓝型油菜温敏细胞核显性两型系TE5AB(12)，其中不育株称为TE5A，可育株称为TE5B。甘蓝型油菜温敏细胞核显性两型系TE5AB材料来源：在甘蓝型油菜自交系TE5中获得2株不育单株，将不育单株与甘蓝型油菜自交系TE1杂交，杂交一代F1自交获得杂交二代F2，并用TE1作为轮回亲本回交获得近等基因系。
2、温敏细胞核显性不育材料遗传规律
采用经典遗传学方法，对温敏型不育材料TE5A与育性正常甘蓝型油菜TE1的正反杂交F1、F2和回交分离群体进行分析。测验结果表明(表1)：温敏型不育材料TE5A的不育性状受一对显性细胞核基因控制，无细胞质效应。
表1 温敏型显性细胞核雄性不育系TE5A遗传分析
二、实施例2：构建含甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs区段的遗传图谱
1、实验材料
温敏显性细胞核不育基因的定位群体TE5AB是由其对应的亲本TE1连续回交后构建的近等基因系群体(12)。2012年春播种于西宁，2012年夏天提取700个来源于TE5AB近等基因系的不育单株的DNA(13)，用于基因的精细定位。
2、精细定位甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs
根据初步定位的结果该基因位于油菜N08连锁群的SCAR(Sequencecharacterized amplified region)标记SC1和SC10之间。即BnaAtsMs位点位于SC1和SC10之间。
设计引物的核苷酸序列如下所示：
SC1正向引物：ACCTTGTCGATCTTCTGCAG，
SC1反向引物：CCGGGTGGCAGGTTAAG；
SC10正向引物：GATTCTTTTGGTTCTTGAATTC，
SC10反向引物：TTCGTTTCTCCAACAGTTAA。
为了进一步缩小目标基因区域的范围，基于内含子的多态性，本发明根据目标区域的序列设计了25对特异引物(或称之为标分子记)，发现7个IP分子标记(或称引物)在亲本间表现多态性。分子标记IP004和IP470在TE5AB近等基因系群体的700个不育单株中分别检测到2个和1个交换单株，这些单株在标记和BnaAtsMs位点间发生了重组(图1)。对与目标区段共线的拟南芥和白菜基因组区域进行分析，发现该区域内有24个白菜候选基因。用于精细定位的引物多的核苷酸序列见表2所示。
表2 精细定位的引物多的核苷酸序列
注：引物序列中前面英文字母含义分别为：F为正向引物；R为反向引物。
三、实施例3：甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs的分离和功能验证
1、BnaAtsMs候选基因的确定
本实施例中采用模式生物拟南芥和白菜基因组网站(http://www.arabidopsis.org/blast、http://brassicadb.org/brad/index.php)中的Blast软件对分子标记IP004和IP470之间、包含BnaAtsMs或其同源的Bra.tsMs,来源于油菜或白菜的序列进行分析，显示该区段存在六个可能与雄蕊发育相关基因Bra018441，Bra018443，Bra018446，Bra018449，Bra018451和Bra018457，以及三个白菜特有基因Bra018452，Bra018455和Bra018456。通过白菜基因组网站(http://brassicadb.org/brad/index.php)中的Blast软件分析确定这九个基因的转录起始位点，分别以TE5A和TE5的cDNA为模板利用高保真PCR聚合酶(PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerse,来自New England Biolads公司)扩增九个候选基因的cDNA，将扩增片段克隆到pMD18-T(购自宝生物工程大连有限公司)载体上进行测序。根据测序结果分离每个候选基因的不同拷贝进行分析比较，结果表明在TE5A与TE5之间只有白菜基因Bra018456对应的甘蓝型油菜基因Bna-Bra018456编码区存在一个碱基变异，因此我们将Bna-Bra018456基因确定为BnaAtsMs基因的候选基因。
2、BnaAtsMs油菜转基因实验
本实施例采用植物表达载体pCAMBIA2300(华中农业大学作物遗传改良国家实验室林拥军教授赠送的)作为甘蓝型油菜转基因载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kan’)、CaMV35S启动子、NOS基因的终止子以及限制性内切酶多克隆位点。通过分析携带候选基因的BAC克隆序列的酶切位点和候选基因的关系，利用引物ZT2-1L、ZT2-1R和高保真PCR技术(PhusionTM High-Fidelity DNA Polymerse,来自NewEngland Biolads公司)扩增获得一个3.951kb的片段，
ZT2-1L(正向引物)：CCGGAATTCCTATTAATAAATTAATGACTCAGCT；
ZT2-1R(反向引物)：CAACTGCAGCCAAGAAGAGAATTGATTCCACA。
该片段包含Ecol I和Pst I酶切位点。片段包括基因上游非翻译区1,417bp的序列、基因区间1,394bp的序列和下游非翻译区的1,124bp的序列。扩增片段用胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)回收,用Ecol I和Pst I双酶切后回收3.94kb的片段,连接到经Ecol I和Pst I双酶切的表达载体pCAMBIA2300上(图2)，连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，并用通过测序检测确定核苷酸序列完全正确，成功构建了转化植株的载体pc2300-BnaAtsMs(图2)。正确的重组质粒通过冻融法(14)导入农杆菌菌株GV1301。油菜遗传转化采用常规的农杆菌转化法(14)转化油菜保持系系TE5，种子灭菌用70％浓度的酒精浸泡种子15min，0.1％升汞消毒15min，20％～30％的次氯酸钠消毒15min，无菌水清洗3次，每次间隔5min。将灭菌的种子播于Medium0培养基(配方见表3)，于25℃暗培养7d。在超净工作台内将获得的试管幼苗下胚轴切成0.5cm-0.8cm的小段，接种至含有农杆菌(悬浮过夜至对数生长期)的Medium1上(配方见表3)浸染25min-30min后，吸干液体，于25℃黑暗条件下共培养3d。将外植体转到Medium2上的愈伤组织诱导培养基(配方见表3)上，于25℃光照培养15-18d。在将外植体转入Medium3上分化培养基培养，每15-18d继代1次，直至分化出幼苗。当幼苗长至2-3cm高时，将幼苗转入Medium 4生根培养基上培养。转化植株生根后，假植于混有腐质土的细土纸杯中，保持70％相对湿度，一个月后移入大田。
提取阳性植株提取叶片总DNA(13)，用引物NPT-F和NPT-R通过PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T0代观察育性的表现，验证导入的候选基因的功能。结果显示在34株转基因T0代植株中，有11株表现为花丝变短，花药干瘪退化，败育(见图3)。
表3 在遗传转化步骤中所用的各种培养基的配方
四、实施例4：细胞学切片分析
为了进一步确定温敏细胞核显性不育系TE5A败育的细胞学特点，并阐明BnaAtsMs基因的功能，本发明对温敏细胞核显性不育系TE5A和保持系TE5花药进行半薄切片和超薄切片，重点观察了造孢细胞时期至二核花粉期过程中小孢子和绒毡层发育情况，比较了不育花药和可育花药绒毡层和小孢子在各时期发育的差异。比较发现：不育花药和可育花药在造孢细胞时期、花粉母细胞时期没有差异，不育花药的造孢细胞可以分化形成正常的花粉母细胞，绒毡层也发育正常(图4a和4d)。在减数分裂时期不育花药和可育花药的花粉母细胞均可以进行的减数分裂(图4b和4e)；可育花药绒毡层细胞与不育花药中的绒毡层细胞无明显差异(图4b和4e)。在四分体时期可育花药有四分体形成，且四分体均被胼胝质包裹(图4c，图5e和图6f)，可育花药绒毡层细胞壁降解，质体包裹在细胞核四周，细胞质中内质网发达(图5f)。而不育花药无四分体形成(图4f和图5b)，不育花药绒毡层细胞的发育进程与可育花药中无明显差异(图5b)。在花药发育后期，可育发药的绒毡层开始降解并分泌小孢子发育所需的酶和营养物质，胼胝质被降解，小孢子从四分体中释放出来(图4g、图4h和图6g)，绒毡层大量合成并形成脂质体包围在的小孢子细胞周围(图5g)，直至最后形成成熟花粉粒(图4i和图4h)。而不育花药中发育异常的花粉母细胞开始逐渐降解，到小孢子时期完全降解，绒毡层降解形成的大量脂质体包围在发育异常的花粉母细胞周围(图6c)。因此TE5A是由于在减数分裂时期，由于减数分裂异常，导致花粉母细胞无法形成正常的四分体，最终走向完全解体(图6d)。因此，BnaAtsMs基因的功能可能与花药发育早期花粉母细胞减数分裂相关。
在本发明所提及的所有文献都在本申请中引用作为参考文献，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明所讲述内容后，本领域的技术人员可以对本发明做各种改动或者修改，这些等价形式同样属于本申请所附的权利要求书所限定的范围。
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Claims (2)

1.一种甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs，其特征在于：
其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；
其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.按权利要求1所述甘蓝型油菜温敏型显性细胞核不育基因BnaAtsMs的应用，其特征在于：
①用于甘蓝型油菜温敏型显性核不育系的选育；
②用于甘蓝型油菜温敏型显性核不育系、保持系和恢复系的分子标记辅助选育。
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