CN102965391B - 扩繁植物雄性不育系的高效种子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效的种子标记方法，利用该方法可以扩繁植物雄性不育种子，为杂交制种带来便利。进一步，本发明利用控制植物雄性生育能力、胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)的核苷酸序列及转基因技术，发明了一种高效扩繁植物雄性不育系的方法。本发明将控制雄性生育能力的野生型核苷酸序列和胚乳成分的核苷酸序列连在一起转入常规玉米，再回交到纯合隐性雄性不育系中，利用获得的转基因植株与纯合隐性不育系杂交，可以同时得到大量不育系和保持系种子。由于控制胚乳成分核苷酸序列的作用，可通过胚乳成分区分不育系和保持系。其中成分正常的种子为不育系(不含转基因序列)，成分异常(如粉质胚乳)的为保持系。

Description

扩繁植物雄性不育系的高效种子标记方法

技术领域

本发明涉及一种扩繁植物雄性不育系的新方法，该方法利用细胞核雄性不育基因、控制胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)基因及转基因技术扩繁植物雄性不育系，属于植物遗传育种及种子生产领域。

背景技术

由于杂种优势的存在，使得杂交种的生物量、抗病虫能力、耐胁迫(干旱、高温、低温、盐碱等)能力较其双亲有相当的提升，如杂交玉米、杂交水稻的产量远远高于纯合的双亲。生产杂交种通常采用的方法为：将雌性亲本和雄性亲本种在一起，将雌性亲本的雄穗去除，而保留雄性亲本的雄穗，雌性亲本收获的种子即为杂交种。

自然界中的植物存在自花授粉、异花授粉及常异花授粉三种类型，自花授粉指一株植物的花粉，对同一个体的雌蕊进行授粉的现象。在两性花的植物中，又可分为同一花的雄蕊与雌蕊间进行授粉的同花授粉(菜豆属)和在一个花序(个体)中不同花间进行授粉的邻花授粉，以及同株不同花间进行授粉的同株异花授粉。有的植物雄蕊和雌蕊不长在同一朵花里，甚至不长在同一棵植株上，无法自花授粉，它们的雌蕊只能得到其他花的花粉，这叫做异花授粉。将天然杂交率高于50％且自交衰退的一类作物归为常异花授粉作物，如玉米。

玉米为雌雄同株，并且雌雄花位于植株的不同部位，玉米既可通过自花授粉也可通过异花授粉繁衍后代，自然条件下，当风将花粉从雄穗吹到雌穗的花丝上时即完成了天然授粉。

在玉米育种中首先应开发出纯合的玉米自交系，然后将两个自交系进行杂交，对杂交的后代进行产量、抗逆性等进行评估，以确定其是否具有商业化潜力。其中每个自交系都可能具有另一个自交系所缺乏的一种或多种优良性状，或补充另一个自交系的一种或多种不良性状。两个自交系杂交的第一代种子为F1代种子，F1代的种子发芽后获得F1代植株，F1代植株较两个自交系亲本(父母本)更健壮，同时拥有更多的生物量。

可以通过对母本人工去雄来生产杂交种，即将未散粉的母本(其可与父本在田间间隔播种，如播种5行母本，一行父本)雄穗去除，保留父本雄穗。随后，只要对外来玉米花粉进行隔离，母本雌穗只能接受父本的花粉，得到的种子即为杂交种(F1)，该杂交种即可用于农业生产。

在生产杂交种的过程中由于环境的变化可能导致去雄完成后植株又雄穗化，或去雄不完全，以上两种情况均能导致母本自交授粉，致使生产的杂交种中混杂了母本自交系的种子，母本自交系的产量远低于杂交种的产量，这样的种子为不合格产品，即会影响农民收入又会影响制种公司信誉，严重的将导致制种公司承担相应的赔偿责任。

也可采用机器对母本进行去雄，机器去雄和手工去雄的可靠性基本相同，但更快并且成本更低。然而，较之手工去雄，大多数去雄机器会对植株造成更大的破坏，因此，目前没有令人完全满意的去雄手段，人们仍在寻找成本更低，去雄更彻底的替换方法。

稳定的雄性不育系统提供了简单高效的手段，通过使用核-质互作雄性不育(CMS)自交系，可以在一些基因型中得以避免繁重的去雄工作。该手段包括三个主要材料，即不育系：雄性不育材料，保持系：可以为不育系提供花粉，使不育系的后代仍为不育系，恢复系：可以恢复不育系的育性。不育系与恢复系杂交产生F1，即用于农业生产的杂交种。更具体的说，核-质互作不育型，表现为核-质互作遗传。不但需要细胞质有不育基因S，而且需要细胞核里有纯合的不育基因(rfrf)，二者同时存在，方能使植株表现为雄性不育。如胞质基因为可育N，则不论核基因是可育(RfRf)还是不育(rfrf)，都表现为雄性可育。同样，如核里具有可育基因(RfRf)或(Rfrf)，则不论胞质基因是可育N还是不育S，也都表现为雄性可育。这种由核-质互作形成的雄性不育系，其遗传组成为S(rfrf)，不能产生正常的花粉，但可作为杂交母本。由于能找到保持系N(rfrf)[用它与不育系杂交，所产生的F1仍能保持雄性不育，即：S(rfrf)(♀)×N(rfrf)→S(rfrf)(不育)]并能接受恢复系S(RfRf)或N(RfRf)[用它们与不育系杂交，所产生的F1都是可育的，即：S(rfrf)(♀)×S(RfRf)→S(Rfrf)(F1)(可育)，或S(rfrf)(♀)×N(RfRf)→S(Rfrf)(F1)(可育)]的花粉，使F1恢复为雄性可育，F1植株自交产生F2，所以在农业生产上可以广泛应用。雄性不育系可以免除人工去雄，节约人力，降低种子成本，还可保证种子的纯度。目前水稻、玉米、高粱、洋葱、蓖麻、甜菜和油菜等作物已经利用核质互作雄性不育进行杂交种子的生产；对其他作物的核-质互作雄性不育系，也正在进行广泛的研究。

CMS也有它的缺陷，一是观察到个别CMS材料容易感病，二是恢复系比较难寻找，这些问题阻碍了CMS系统在制种中的广泛应用。

Brar et al的美国专利4654465和4727219中公开了一种类型的遗传不育性。但是，这种类型的遗传不育需要在基因组内的多个不同位点保持相应的基因型，需要每代对这些位点进行分子标记跟踪检测。Patterson还描述了一种可能有用的染色体易位基因系统，但该系统更为复杂(见美国专利No.3861709和3710511)。

人们一直在尝试对雄性不育系统进行优化，例如，Fabijanski，et al.开发了使植物雄性不育的方法(EPO 89/3010153.8公开号329308和作为WO 90/08828公开的PCT申请PCT/CA90/00037)。主要是通过以下两种途径抑制植株的雄花育性，一种方法是将雄性组织特意表达的启动子与细胞毒素基因相连转入植株中，使雄花不能正常散粉同时不影响其他性状；另一种是通过基因干扰手段，将已经克隆的控制植株雄花育性的基因通过转基因的手段将其干扰，从而使其不能正常行使功能。还有通过一些基因调控元件来抑制基因表达，从而影响植株育性的手段(WO90/08829)。

在多数情况下，只有控制雄性不育的核基因隐性纯合(msms)植株才会表现为雄性不育，由于雄性不育植株无法自交，因此只能通过杂合植株(Msms)与其杂交，才会得到雄性不育植株(msms)。并且在同一果穗上雄性不育籽粒(msms)与可育的杂合籽粒(Msms)同时存在，通过籽粒无法分辨哪些是不育籽粒，哪些是可育籽粒，只能通过播种后，植株散粉时才可分辨。

近年来，也有利用转基因的手段来保持雄性不育植株的不育性(US6743968)。该方法将花粉致死基因与雄性生育能力恢复基因构建在一个载体中，导入雄性不育植株中，转基因后代表现为可育，但只能产生不含恢复基因的花粉。当这样的植株与雄性不育植株杂交，便保持了隐性不育植株的纯合隐性状态。其首先构建一个转基因载体，该载体含有一个花粉细胞致死基因，同时该载体还含有一个恢复植株育性的显性基因。将该载体转入雄性不育植株，并且该载体在转基因植株中以杂合状态存在，由于恢复育性基因的存在使得植株可育，当其与雄性不育植株杂交，由于含有恢复基因的花粉(Msms)同时含有致死基因，使得花粉败育，因此只有不含恢复基因的花粉(ms)才能与雄性不育植株雌配子(ms)进行杂交，后代均为隐性纯合个体(msms)。

如前文所述，采用雄性不育系统制种的很多工作的一个重要问题在于如何利用雄性不育基因及如何分辨雄性不育种子及可育种子，同时还需要考虑如何将不育个体的不育性保持下来。

在玉米中已经鉴定了多种雄性不育突变体(Skibbe et al.2005)，具体见下表：

表一由核基因引起的雄性不育突变体

以上这些基因已经陆续被克隆，如ms45(Albertsen et al.1993)和ms26(PTC/US2006/024273)，同时，水稻中也有一些雄性不育基因被陆续克隆，如dpw(JingShi et al.2011)以及拟南芥中鉴定到的一些雄性不育基因，如(Aarts，et al.1993)。

本发明中，发明人利用控制植物雄性生育能力、胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)的核苷酸序列及转基因技术，发明了一种高效扩繁植物雄性不育系的新方法。控制植物雄性生育能力的基因包括表一中所列出的雄性不育基因及其他雄性不育基因以及其他物种的雄性不育基因。发明人首先构建了一个植物转化载体，该载体中包含恢复雄性生育能力基因的表达元件和控制胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)基因的表达元件，控制胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)的基因为一种显性基因或一段干扰序列，将该载体转入HiIIA×HiIIB玉米杂交种中，然后利用雄性不育植株对获得的转基因植株进行回交，从而将控制植物雄性生育能力、胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)的核苷酸序列导入雄性不育植株中。由于存在恢复基因，该植株表现为可育。当转基因杂合体植株(Msmsms)与雄性不育植株(msms)杂交时，会产生以下两种后代，一种为胚乳正常的雄性不育籽粒(不育系，基因型为msms)，该不育系可以被任意一种野生型植株恢复育性；另一种为胚乳异常的可育籽粒(保持系，基因型为Msmsms)，该保持系在控制雄性生育能力位点为隐性纯合，由于含有可以互补的转基因序列，该植株表现为可育，由于同时含有影响胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)的核苷酸序列，该胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)不同于野生型。

本发明的目的在于提供一种高效的种子标记方法，利用该方法可以扩繁植物雄性不育种子，为杂交制种节约人力，降低成本，保证种子纯度。

本发明的另一目的是提供一种通过胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)高效分辨可育籽粒及不育籽粒的方法。

本发明的又一目的是提供一种DNA构建物，该构建物可以恢复雄性不育突变体的育性，同时改变胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)。

本发明的还一目的是提供一种转基因植株，该植株可以保持雄性不育植株的不育性。

本发明的其他目的在下文说明书和权利要求书中将是显而易见的。

发明内容

本发明涉及控制雄性生育能力及胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)的核苷酸序列，及利用这些核苷酸序列和转基因技术开发的保持植物雄性不育的方法。

本发明利用一个控制雄性生育能力的基因，如表一中的ms45的野生型等位基因Ms45，这个控制雄性生育能力的基因不限于表一中列出的基因，玉米中或其他物种中控制雄性生育能力的基因也可达到本发明的目的，因此也在本发明的保护范围内。发明人构建了玉米Ms45基因的植物表达载体，将该载体转入雄性不育突变体ms45中，可以恢复该突变体的育性。

本发明构建了控制玉米胚乳成分的16-KDγ-醇溶蛋白基因(Cheol Soo Kim et al.2006)的载体。该载体会影响胚乳的发育，使玉米为粉质胚乳，粉质胚乳表现为不透明，该基因的突变体为Mucronate(Mc)。该基因沉默后不会影响植株的其他性状。在玉米受精过程中，含有该载体的配子受精后会影响胚乳的发育，从而导致胚乳不透明。

本发明的关键是将控制玉米雄性生育能力的基因Ms45与控制胚乳成分的Mc16-KD γ-醇溶蛋白基因构建在一个载体中，将该载体转入HiIIA×HiIIB玉米杂交种中，然后利用ms45雄性不育植株对获得的转基因植株进行回交，从而将Ms45恢复基因和Mc16-KDγ-醇溶蛋白基因同时导入雄性不育突变体ms45中。由于野生型Ms45基因的存在，转基因植株表现为可育。当转基因杂合体植株(Ms45ms45ms45)与雄性不育植株(ms45ms45)杂交时，会产生两种后代，一种为不含有转基因序列的雄性不育正常籽粒(不育系ms45ms45)，该不育系可以被任意一种野生型植株(Ms45Ms45)恢复育性，在制种过程中可作为不育系；另一种为胚乳不透明的可育籽粒(保持系Ms45ms45ms45)，该保持系在控制雄性生育能力位点为隐性纯合，由于含有互补的转基因序列，该植株表现为可育，由于同时含有影响胚乳成分的核苷酸序列，该籽粒胚乳不透明。

本发明公开了一种高效的种子标记方法，利用该方法可以扩繁植物雄性不育种子，为杂交制种带来便利。该体系主要是利用一个可以分辨胚乳主要营养物质成分(如淀粉含量、油份含量、是否粉质胚乳等)的核苷酸序列和一种细胞核雄性不育基因的野生型等位基因及转基因技术。转基因的籽粒可以通过胚乳成分分辨。

附图说明

图1.雄性生育力突变体ms45及野生型Ms45的雄花表型。

图2.控制籽粒成分基因16-KDγ-醇溶蛋白显性突变体籽粒表型。

图3.含有雄性生育力基因Ms45表达元件及控制籽粒成分基因16-KDγ-醇溶蛋白显性等位基因表达元件的植物表达载体。

图4.转化雄性生育力基因Ms45表达元件及控制籽粒成分基因16-KDγ-醇溶蛋白显性等位基因载体植株的雄花及籽粒表型。

图5.利用细胞核雄性不育基因、控制胚乳成分的基因及转基因技术制种的路线图。

图6.p1022载体图谱。

图7.玉米遗传转化试验流程图。

具体实施方式

本文所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义，除非特殊说明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公认的标准技术，材料，方法和例子仅作阐述，不加以限制。

细胞核雄性不育是由于小孢子形成过程中的关键基因被突变、抑制或受到其他影响的结果，这些基因被统称为雄性不育基因。花粉发育途径中受到很多基因的控制，因此很多基因的突变最终都会导致雄性不育，目前在玉米中鉴定了大量的雄性不育突变体(如表一所示)，每个雄性不育基因都有其特定的恢复基因，即每种雄性不育突变体，只能被其野生型等位基因恢复。

本发明以表一中的一个雄性不育突变体为例，如ms45，突变体雄花不能正常散粉(图1所示，A为雄性不育突变体，B为野生型)，该突变体育性可以被野生型植株恢复。本发明中野生型恢复基因来源于自交系B73，其序列见SEQ ID No：1。该序列包含Ms45基因的启动子和编码框序列。将SEQ ID No：1序列转入ms45雄性不育突变体后，突变体植株变现为可育。

本发明使用控制籽粒成分基因16-KDγ-醇溶蛋白的显性等位基因，16-KD γ-醇溶蛋白基因编码一种醇溶蛋白，突变体Mucronate(Mc)由于16-KD γ-醇溶蛋白基因438-476bp有38个碱基的缺失，该38bp的缺失改变了基因的编码框，从而使得翻译的蛋白较野生型有较大的差别。进而影响到籽粒胚乳的发育，导致胚乳不透明(图2所示，A为Mc 16-KDγ-醇溶蛋白突变体，B为野生型)，但并不影响胚和植株的发育。由于Mc为显性突变体，因此只要籽粒中含有Mc的显性等位基因该籽粒就会表现为不透明胚乳。我们通过转基因技术将Mc显性等位基因转入对野生型中，并确保该基因在植株中正常表达，就会表现出胚乳不透明的表型，图4中A所示，这种条件下，转化片段在单个籽粒个体中以杂合状态存在，我们就可以通过肉眼或借助仪器进行快速分辨。同理，也可以通过相同方法对影响胚乳成分发育的其他显性基因进行相同的操作，获得便于分辨的转基因籽粒。本发明中的16-KDγ-醇溶蛋白基因核苷酸序列来源于Mc突变体，具体序列见SEQID No：2所示，其中包含启动子序列以及基因的编码框序列，以上核苷酸序列不限于Mc突变体，同样可以来源于其他任何玉米胚乳突变体，或其他物种的同源基因，或人工合成的核苷酸序列。

本发明的关键是将雄性恢复基因Ms45及Mc 16-KDγ-醇溶蛋白胚乳标记基因构建在一个载体中，该载体可以恢复雄性不育突变体ms45的育性，同时使含有转基因序列的籽粒胚乳不透明，即对含有恢复基因的籽粒进行标记，以便区分可育籽粒(保持系)和不育籽粒(不育系)。本发明提供了一种高效的种子标记方法，该方法不仅适用于玉米(Zeamays)，同样适用于水稻(Oryza sativa)、高粱(Sorghum bicolor)、小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycine max)、棉花(Gossypium hirsutum)、向日葵(Helianthus annuus)等作物。

下文通过说明和阐述提供了更为详细的描述，这并非意欲对本发明的范围加以限制。

实施例1Ms45野生型等位基因的扩增

本发明以表一中的ms45雄性不育突变体为例，具体阐述实施方案。首先扩展ms45的野生型等位基因，该基因来源于自交系B73，其序列见SEQ ID No：1。我们以B73为模版，参考B73基因组序列(www.maizesequence.org)，设计引物对该基因的整个表达元件进行扩增，扩增引物如下：Ms45F：5’tgaattcTGCTGAGTTCTCCTTGGGTTATCC 3’，Ms45R：5’tcccgggGGTTGCGCATGAAATAGGGGT  3’。上游扩增引物的5’端添加了EcoRI酶切位点，下游扩增引物的5’端添加了SmaI酶切位点，扩增反应体系为：模版DNA 2μL，引物Ms45F0.5μL，引物Ms45R 0.5μL，dNTP 1.6μL，10×Buffer 2μL，高保真taq酶0.3μL，ddH2O 13.1μL。反应条件为95℃预变性5min，95℃变性45s，59℃退火45s，72℃延伸3min，32个循环，72℃后延伸10min。扩增的目标条带全长为3518bp，扩增后将该序列连接T-easy测序载体，将阳性克隆进行测序，从而克隆到Ms45野生型等位基因。

实施例2Mc突变体16-KDγ-醇溶蛋白基因的人工合成

本发明使用控制胚乳成分基因16-KDγ-醇溶蛋白的显性等位基因，16-KD γ-醇溶蛋白基因编码一种醇溶蛋白，突变体Mucronate(Mc)由于16-KDγ-醇溶蛋白基因438-476bp有38个碱基的缺失，该38bp的缺失改变了基因的编码框，从而使得翻译的蛋白较野生型有较大的差别。进而影响到籽粒胚乳的发育，导致胚乳不透明(图2所示)，但并不影响胚和植株的发育，根据(Cheol Soo Kim et al.2006)对该突变体的报道，及对该序列的说明(Gene accession no.DQ826676)我们对该基因进行了合成，合成序列见SEQID No：2，同时我们在合成该基因时5’端添加了HindIII酶切位点，3’端添加了BstEII酶切位点。

实施例3构建包含雄性生育力基因Ms45和Mc突变体16-KDγ-醇溶蛋白基因表达元件及选择标记基因的植物转化载体

以质粒pCAMBAI3301为骨架DNA，构建包含雄性生育力基因Ms45和Mc 16-KD γ-醇溶蛋白表达元件及选择标记基因bar的植物转化载体。我们首先利用BstEII和HindIII消化16-KDγ-醇溶蛋白基因和pCAMBAI3301空载体，将连个片段进行连接，检测阳性克隆，然后再利用EcoRI和SmaI双酶切阳性克隆和Ms45野生型等位基因，回收目标条带，将两片段进行连接，检测阳性克隆，获得包含雄性生育力基因Ms45和Mc 16-KDγ-醇溶蛋白表达元件及选择标记基因bar的植物转化载体，构建完成的载体如图3所示。

实施例4用实施例3的植物转化载体转化玉米

本发明通过农杆菌侵染玉米幼胚的方法获得转基因植株。将实施例3的植物转化载体转化农杆菌EHA105，再用含有目的基因的农杆菌侵染玉米幼胚，具体的转基因方法如下：

实验室在转基因过程中所用受体为自交系HiIIA和HiIIB的杂交F1代。首先在田间种植自交系HiIIA和HiIIB，到自交系散粉时分别套袋；然后准备授粉，有两种授粉方式：HiIIA作母本，HiIIB作父本；HiIIA作父本，HiIIB作母本，授粉后9-11天，取授粉果穗籽粒上的未成熟幼胚，然后在室内进行农杆菌侵染，将被农杆菌侵袭的幼胚放在选择培养基上进行多次筛选，获得抗性愈伤，将抗性愈伤再生成苗，得到转基因T0代植株。获得转基因T0代以后，用T0代转基因植株的花粉对一些制种母本及Ms45雄性不育材料进行杂交，并观察表型。具体试验流程见图7。

采用农杆菌侵染法将插入序列导入受体植株的幼胚，经除草剂双丙胺磷筛选后获得转基因植株。具体方法为：

一、剥离幼胚

1、去除苞叶。切除果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，这样可以以镊子当作把手，有利于操作，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可以在同一个烧杯里放4-6个果穗

2、向烧杯里加约700ml的消毒液(50％的漂白剂或5.25％的次氯酸钠，并加入一滴Tween 20)用来浸泡果穗，在消毒20分钟过程当中，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果，消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，在水里洗3次，然后准备剥胚

3、把消毒过果穗的一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部(1.5-1.8mm)，在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等

4、用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基，胚的密度大约是2X2cm(30个/皿)

5、用封口膜封住培养皿，28度暗培养2-3天

二、农杆菌浸染

1、农杆菌要在YEP(含Kana33mg/L和Str100mg/L抗生素)培养基上提前一周培养，并在4度冰箱保存一个月左右，长期保存要在-80度甘油保存

2、农杆菌要在YEP培养基上在19℃培养3天，同时加Kana(33mg/L)，Str(50mg/L)

3、3天以后，挑取农杆菌放入含有5mL浸染培养基的50ml离心管中，同时加100uMAS(inf+AS)，在室温(25度)转速75rpm摇菌2-4个小时

4、浸染幼胚，把刚剥离的幼胚放入含有inf+AS液体培养基(2ml)的离心管中，每管约20-100个幼胚，用这样的培养基洗涤2次，然后加入1-1.5ml特定浓度(OD550＝0.3-0.4)的农杆菌，轻轻颠倒离心管20次，然后直立放置在暗箱里5分钟，确保幼胚全部浸泡在农杆菌液体里，整个过程避免旋涡振荡

三、共培养

1、浸染以后，把浸染过的幼胚转移到共培养培养基(co-cultivation medium)，使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时驱除培养基表面多余的农杆菌

2、用封口膜封住培养皿，在20度条件下暗培养3天

四、Resting

1、共培养3天后，把幼胚转移到resting medium上面，同时用封口膜封住培养皿，放在28度条件下暗培养7天

五、选择

1、7天后，把所有的幼胚转移到选择培养基上面(35per plate)，培养两周，选择培养基含有bialaphos 1.5mg/L，两周后再进行亚培养bialaphos的浓度可以上升到3mg/L

2、浸染大约5周左右，含有转化子的细胞会长成可以看见的II型愈伤

六、转基因植株的再生

1、在再生培养基I上面长3周，然后在再生培养基II上面发芽(在光照培养室)(Frame et al，2000)

2、待再生苗生长出3-4片叶时，将其转移到温室，待其生长至吐丝散粉期时，对其进行授粉。

实施例5分析玉米转化子

针对植株整体形态对来自实施例4的转基因植株及其后代加以评估，针对花粉和籽粒表型着重进行分析。除了籽粒之外，在转基因植株与非转基因对照植株之间没有观察到其他形态的不同。当将转基因植株与ms45雄性不育材料进行杂交时，杂交后代中含有转基因成分的植株表现为可育，图4中C所示，而非转基因植株表现为完全不育。这表明Ms45基因的表达互补了隐性纯合ms45雄性不育表现，同时，含有Mc突变体16-KDγ-醇溶蛋白基因的转基因籽粒表现为胚乳不透明，表型同Mc突变体，图4中A所示。这表明Mc显性突变体等位基因在转基因植株中均能正常行使功能。同时我们对通过籽粒表型鉴定的胚乳不透明籽粒及正常籽粒播种到田间，这些籽粒均能够正常发芽，出芽率与正常籽粒没有显著差异。当植株生长至4-5片叶时，喷施200mM的双丙胺磷，胚乳不透明籽粒均能正常成活，并且生长不受到抑制。而正常籽粒出的苗全部死亡。这表明选择标记基因bar、Ms45雄性生育力基因及Mc 16-KD γ-醇溶蛋白基因均能正常行使功能，并且这三个基因连锁遗传。当转基因植株与雄性不育突变体ms45杂交产生的后代中，正常籽粒∶胚乳不透明籽粒为1∶1。

实施例6将Ms45Ms45野生型自交系转变为ms45ms45纯合隐性自交系

以ms45纯合隐性突变体为母本，与不同自交系(如郑58)杂交，获得的F1继续与郑58回交，对获得的BC1群体进行基因型分析，鉴定Ms45位点为杂合的植株继续与郑58回交，如此回交5-6代后，利用分子标记筛选Ms45位点为杂合，其他位点均为郑58的单株进行自交，从而获得ms45纯合隐性自交系郑58(郑58ms45ms45)，该自交系即可作为不育系。

实施例7将实施例3中的转化片段导入ms45纯合隐性自交系，并对后代进行分析

将实施例6中的ms45纯合隐性自交系与实施例5中的转基因植株杂交，然后再以ms45纯合隐性自交系为轮回亲本进行多代回交，将来自实施例6的转基因植株转变为含有转基因片段，且ms45位点为纯合隐性的自交系。

为达到以上目的，我们将实施例6中的T0代转基因植株与ms45纯合隐性自交系杂交，如与雄性不育的郑58(ms45ms45)杂交，从杂交后代中挑选胚乳不透明的籽粒播种到田间后喷施200mM的双丙胺磷，对存活的植株继续与郑58(ms45ms45)回交，如此回交5-6代后，利用分子标记筛选转基因位点为杂合，Ms45位点为隐性纯合，其他位点均为郑58背景的单株。该单株与郑58(ms45ms45)杂交，产生的后代不但有郑58(ms45ms45)，而且还有雄性不育郑58的保持系郑58(Ms45ms45ms45)，并且郑58(ms45ms45)的籽粒正常(图4中B所示)，而其保持系郑58(Ms45ms45ms45)籽粒为胚乳不透明(图4中A所示籽粒)。具体选育过程见附图5。

实施例8使用实施例7中的雄性不育保持系对ms45雄性不育自交系进行大规模扩繁

以郑58自交系为例，将实施例6中的雄性不育系郑58(ms45ms45)和实施例7中的雄性不育保持系郑58(Ms45ms45ms45)播种到田间，两个材料相隔播种，每播种1行保持系相应的播种5行不育系，确保繁种周边300米内无其他玉米播种，让不育系与保持系田间自然授粉。保持系只能接受自己的花粉，产生的后代中由于含有纯合的转基因成分的籽粒与杂合的籽粒无法辨别，这些籽粒予以丢弃，而正常的籽粒可以作为不育系。不育系材料接受了保持系的花粉，其后代中正常籽粒的为不含转基因成分的不育系，而胚乳不透明籽粒为含有转基因成分的保持系。保持系全部用于下一年扩繁不育系和保持系，而不育系中大部分用于生产商品种，剩余的小部分用于下一年扩繁不育系和保持系，具体生产流程如附图5所示。

实施例9利用实施例8中的雄性不育系大规模生产杂交种

在实施例8中生产的不育系为细胞核控制的隐性纯合不育系，该不育系可以被任意的野生型植株(Ms45Ms45)恢复育性。因此我们只要选择一个与雄性不育(ms45ms45)自交系，如雄性不育郑58(ms45ms45)配合力高的自交系，如昌7-2进行杂交，便可以生产出农艺性状优良的杂交种。为了达到以上目的，我们将雄性不育自交系与野生型自交系隔行播种于田间，确保繁种周边300米内无其他玉米播种，不育系的果穗只能接受野生型自交系的花粉，而野生型自交系只能自交。这样不育系果穗上所产生的种子为杂交种。

Claims (3)

1.一种用于保持雄性不育玉米纯合隐性状态的方法，所述方法包括：

(a)提供第一玉米植株，其包含使玉米雄性不育的纯合隐性等位基因ms45；

(b)提供第二玉米植株，其包含同第一玉米植株相同的纯合隐性等位基因ms45，并且含有下述构建体，所述构建体在植株中以杂合状态存在，所述构建体包含：

i.第一核苷酸序列，该核苷酸序列为玉米雄性不育基因的显性等位基因Ms45，其序列为SEQ ID No：1所示，当该核苷酸序列在第一植株中表达时将恢复其雄性生育力；

ii.第二核苷酸序列，其中包含Mc16-KDγ-醇溶蛋白基因的完整表达元件，其序列为SEQ ID No：2所示，当第二核苷酸序列以杂合状态存在时即可影响胚乳中淀粉的合成，从而影响玉米籽粒的主要营养物质淀粉、油份含量及是否粉质胚乳的性状，通过肉眼或仪器分辨含有该构建体的籽粒和不含有该构建体的籽粒；

iii.第一核苷酸序列与第二核苷酸序列紧密相连，这两个核苷酸序列在植株中同时存在；

(c)用所述第二玉米植株的雄性配子与第一玉米植株的雌性配子受精，以产生保持了所述第一玉米植株纯合隐性状态的后代。

2.一种DNA构建体，所述构建体包含：

(a)第一核苷酸序列，该核苷酸序列为玉米雄性不育基因的显性等位基因Ms45，其序列为SEQ ID No：1所示，当该核苷酸序列在含有纯合隐性等位基因ms45的玉米雄性不育植株中表达时将恢复其雄性生育力；

(b)第二核苷酸序列，其中包含Mc16-KDγ-醇溶蛋白基因的完整表达元件，其序列为SEQ ID No：2所示，当第二核苷酸序列以杂合状态存在时即可影响胚乳中淀粉的合成，从而影响玉米籽粒的主要营养物质淀粉、油份含量及是否粉质胚乳的性状，通过肉眼或仪器分辨含有该构建体的籽粒和不含有该构建体的籽粒；

(c)第一核苷酸序列与第二核苷酸序列紧密相连，这两个核苷酸序列在植株中同时存在。

3.利用权利要求1所述的方法在生产玉米杂交种中的用途。