WO2014154141A1 - 一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法 - Google Patents
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Definitions
- the obtained seeds are sorted and sieved Selecting seeds that do not have red fluorescence, that is, homozygous female sterile rice seeds, the homozygous female sterile rice seeds are used for mechanized seed production of hybrid rice; the seeds with red fluorescence are selected as transgenic seeds.
- the transgenic seed is further used for the propagation of the female sterile rice, that is, the hybrid sterile line is self-crossed, and then photoelectrically sorted according to the foregoing steps, and the homozygous female sterile rice seed is selected and circulated.
- the present invention essentially provides a breeding technique for female sterile rice and a method for mechanally producing non-transgenic hybrid rice seeds using this technique.
- Three tightly linked gene expression cassettes of rice female fertile gene, pollen lethal gene and fluorescent selection marker gene were transferred into female sterile rice.
- the hybrid plants carrying the transgenes carry the transgenic pollen grains and cannot participate in fertilization; while the pollen grains that do not carry the transgenes can be fertilized with the female gametes and are firm.
- photoelectric sorting homozygous female sterile rice is obtained for mechanized seed production of hybrid rice. Since the male parent (recovery line) is a female sterile line, it can be mixed and mixed during seed production.
- Parents are evenly mixed according to a certain ratio, once planted, able to carry out breeding and field cultivation management like conventional rice, and can be broadcasted, thrown, machine inserted, etc.
- the simplification of the planting process is greatly simplified.
- Figure 5 is a Southern blot analysis of a part of the transgenic plants in Example 3 (one: negative control; + : using a plasmid as a positive control);
- Figure 8 is a plan view of a small-scale seed production in Example 5.
- Transgenic rice was extracted by DNA using the CTAB method (Murry and Thompson, 1980). Weigh 2-4 grams of fresh leaves, cut them into a 20 ° C pre-cooled mortar, grind them into powder with liquid nitrogen, transfer them to a pre-cooled sample bottle and store at 20 ° C for use. At the time of extraction, 10 ml of 1. 5X CTAB preheated to 100 ° C was added, and the mixture was quickly stirred, shaken in a water bath at 56 ° C for 20 minutes, and then extracted with an equal volume of chloroform: isoamyl alcohol (24 : 1 ).
- Electrophoretic detection Electrophoresis results were recorded by electrophoresis on a 1.4% agarose gel.
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Abstract
本发明公开了一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法。本方法中，3个紧密连锁的基因表达盒转入雌性不育水稻。这3个表达盒是：1）水稻雌性可育基因表达盒；2）花粉致死基因表达盒；3）荧光筛选标记基因表达盒。杂合转基因水稻在自交结实过程中，携带转基因的花粉粒败育而不能参与受精；而没有携带转基因的花粉粒能与雌配子正常受精而结实。通过光电分选，获得纯合的雌性不育水稻用于杂交稻机械化制种；而携带转基因的杂合种子，继续用于雌性不育水稻的繁殖。这一技术解决了雌性不育水稻繁殖难题，实现了杂交稻机械化制种，特别是混播混收方式的机械化制种。
Description
一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域， 公开了一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方 法。
背景技术
我国杂交水稻的年种植面积约 1600万 hm2， 种子生产面积约需 15万 hm2， 每年需商 品杂交种 2. 4 亿 kg左右。 我国现行杂交水稻制种技术， 自播种至收获主要依靠人工操 作。 父母本分期播种， 多为先播父本， 后播母本； 父母本箱式分开栽插， 母本多行， 父 本双行； 收获时父母本分开收割， 或者授粉后成熟前割掉父本。 整个制种过程工序繁 杂， 难以实现机械化， 需要足够的劳动力做保证， 只适宜在劳动密集型的农村推广应 用， 大型农场因缺少足够的劳动力而不能制种。 而且， 由于父本的因素， 减少了制种产 量。 随着城镇化、 工业化、 农业产业化和农村土地流转政策的逐步实施， 农村人口将进 一步减少， 现行劳动密集型、 精耕细作型的制种技术已阻碍了杂交水稻种子生产的发 展。 因此， 杂交水稻机械化制种技术研究迫在眉睫。
已有不少研究者作了各种尝试开展杂交稻机械化制种。 有研究者提出用谷壳颜色区 别水稻不育系和恢复系种子， 具体做法是将正常谷壳色的水稻不育系种子与非正常谷壳 色的水稻恢复系种子机械混播， 成熟后经机械混收， 再用色选机分选， 获得杂交种； 有 研究者提出用飞机将花粉喷施在母本田块里进行制种； 也有研究者提出利用父、 母本粒型 的较大悬殊， 用粒选机分选;还有研究者提出用半机械化操作的方法， 即直播母本， 人工 栽插和收割父本， 最后机械收割母本等方法； 还有研究者利用水稻对除草剂苯达松的敏 感特性进行杂交水稻机械化制种。 然而上述多种方法均存在诸多缺陷而不能从根本上实 现杂交水稻机械化制种， 目前在生产上也未见大规模商业化应用。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足， 提供一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法。 为了达到上述目的， 本发明提供的技术方案为：
所述利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法， 包括如下步骤：
( 1 ) 将水稻雌性可育基因、 水稻花粉致死基因和荧光筛选标记基因插入水稻表达载体；
( 2 ) 将步骤 （1 ) 所制备的水稻表达载体导入雌性不育水稻， 得到杂合的转基因水稻；
( 3 ) 将步骤 （2 ) 所获得的杂合的转基因水稻或者利用步骤 （2 ) 所获得的转基因水稻进 行转育而成的杂合转基因， 进行自交， 通过光电分选法对自交后得到的种子进行分选， 筛
选出不具有红色荧光的种子， 即为纯合的雌性不育水稻种子， 将该纯合的雌性不育水稻种 子用于杂交稻机械化制种； 筛选出的具红色荧光的种子即为转基因种子， 将该转基因种子 继续用于雌性不育水稻的繁殖， 即， 继续进行杂合不育系自交， 然后按前述步骤进行光电 分选， 选出纯合的雌性不育水稻种子， 如此循环。
其中， 步骤（1 )所述水稻雌性可育基因为野生型 PTB1基因或雌性不育水稻 sfsl的 野生型雌性可育基因；所述雌性不育水稻 sfsl的野生型雌性可育基因序列如 SEQ ID NO. 1； 所示野生型 PTB1基因序列如 SEQ ID NO. 2所示。
步骤 （2 ) 所述雌性不育水稻包括雌性不育水稻 sfsl (该不育系已被申请号为 201210096970. 7的发明专利公开）， 携带雌性不育基因 PTB1 (野生型 PTB1基因已被申请 号为 201010194553. 7的发明专利公开， 所述雌性不育基因 PTB1即为野生型 PTB1基因发 生任何缺失、 插入、 替换等修饰后产生的不育基因） 的雌性不育水稻； 所述雌性不育水稻 sfsl的野生型雌性可育基因序列如 SEQ ID NO. 1所示，所述野生型 PTB1基因序列如 SEQ ID NO. 2所示。
所述花粉致死基因为 ZM-AA1 , 其序列如 SEQ ID NO. 5所示； 所述花粉致死基因由花 粉发育后期特异性启动子 PG47驱动， 其序列如 SEQ ID NO. 3所示； 所述荧光筛选标记基 因为 RP， 其序列如 SEQ ID NO. 8所示； 所述荧光筛选标记基由愈伤组织 /种皮特异性启动 子 END2驱动， 其序列如 SEQ ID NO. 7所示。 所述水稻表达载体为 pCAMBIA1300。
雌性不育水稻的繁殖和杂交稻机械化制种中利用了包含 3 个表达盒的转基因水稻进 行转育所获得的水稻材料。
下面结合原理， 对本发明作进一步说明：
本发明首先构建了携带水稻雌性可育基因、 花粉致死基因和荧光筛选标记基因 3个紧 密连锁的基因表达盒的水稻表达载体。 利用水稻转基因技术， 将上述表达载体转入雌性 不育水稻。
本发明实质上提供了一种雌性不育水稻繁殖技术， 以及利用这一技术机械化生产非转 基因杂交稻种子的方法。 将水稻雌性可育基因、 花粉致死基因和荧光筛选标记基因 3个紧 密连锁的基因表达盒转入雌性不育水稻。 携带转基因的杂合单株在自交结实过程中， 携 带转基因的花粉粒败育而不能参与受精； 而没有携带转基因的花粉粒能与雌配子正常受 精而结实。 通过光电分选， 获得纯合的雌性不育水稻用于杂交稻机械化制种， 因为父本 (恢复系） 为雌性不育系， 因此制种时可以混播混收。 父母本按照一定的比例均匀混合， 一次播种， 能够像常规水稻那样进行育秧和大田栽培管理， 可以直播、 抛秧、 机插等，
大大简化栽插工序。 成熟后进行机械化收割； 而携带转基因的杂合种子， 继续用于雌性 不育水稻的繁殖。
与现有技术相比， 本发明的有益效果为：
本发明方法解决了雌性不育水稻繁殖技术难题， 实现了杂交稻种子生产的混播混 收； 这一方法利用了转基因技术， 但生产的是非转基因杂交稻种子。 繁殖时， 雌性不育 水稻虽为转基因水稻， 但面积不大， 易于隔离。 制种时， 可以箱式播插， 也可以混播， 父 母本都不含有转基因成分， 不会造成转基因的扩散漂移， 有利于生物安全； 收获时， 可 以混收， 杂交种子也不含有转基因成分。 这一混播混收的杂交水稻种子生产技术， 可以 减少制种操作程序， 便于进行机械化操作， 减轻劳动强度， 降低种子生产成本， 整体提 高水稻种业的效益。
附图说明
图 1是实施例 1中携带水稻雌性可育基因、 花粉致死基因和荧光筛选标记基因 3个基因表 达盒的水稻表达载体图谱；
图 2是实施例 2中经农杆菌转化后表达红色荧光蛋白的水稻愈伤图；
图 3是实施例 2中经农杆菌转化后获得水稻转基因植株图；
图 4是实施例 3中部分转基因植株的 PCR检测图 （M: DNA分子量标准； +: 正 /阳性对 照； 一： 负 /阴性对照）；
图 5是实施例 3中部分转基因植株的 Southern blot检测图 （一： 阴性对照； +: 以质粒作 为阳性对照）；
图 6是实施例 4中 I2-KI转基因植株花粉粒图；
图 7是实施例 4中转基因植株穗部性状图；
图 8是实施例 5中小规模制种现场图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步描述， 但不因此限制本发明的范围。
实施例 1 : 携带水稻雌性可育基因、 花粉致死基因和荧光筛选标记基因 3个基因表达盒的 水稻表达载体构建
在表达载体 PCAMBIA1300上， 插入 3个表达盒： 野生型 PTB1表达盒、花粉致死的淀粉 酶基因 ZM-AA1表达盒、 荧光筛选标记基因 RP表达盒。 野生型 PTB1携带有自身的启动子 和终止子 （其核苷酸序列见 SEQ ID NO. 2)； 淀粉酶基因 ZM-AA1表达盒元件包括： 玉米的 花粉发育后期特异性启动子 PG47 (其核苷酸序列见 SEQ ID NO. 3)、 玉米的转运肽 ZM-BT1
(其核苷酸序列见 SEQ ID NO. 4)、 玉米的淀粉酶基因编码序列 ZM-AA1 (其核苷酸序列见 SEQ ID NO. 5)、 玉米的终止子 IN2-1 (其核苷酸序列见 SEQ ID NO. 6)； 红色荧光蛋白基因 RP表达盒元件包括： 玉米的种子特异性启动子 END2 (其核苷酸序列见 SEQ ID NO. 7)、 载 体 pLJ02上的 RP编码序列 （其核苷酸序列见 SEQ ID NO. 8)、 马铃薯的终止子 ΡΙΝ Π (其 核苷酸序列见 SEQ ID NO. 9)。 完整的构建载体图谱见附图 1。
所构建载体质导入农杆菌菌株 EHA105用于水稻遗传转化。 导入方法采用电击转化方 法， 主要参考 bio-rad公司的电击仪使用说明书进行， 具体步骤如下：
( 1 ) 将储存于 -80 t^ DH 10B感受态细胞取出放在冰上冻融， 1 mm电激杯放在冰上预 冷， 把冻存的 SOC放置在 37 °C解冻。
(2) 将干净的 EP离心管插在冰上预冷， 一般 EP离心管的数目比要转化的样品多两个， 一个用来做阴性对照 （没有加入 DNA) 、 另一个做阳性对照 （加入 Ι μ ΐ 的 10 ng/ μ ΐ pUC19) 。
(3 )分别吸取 1-2 μ 1要转化的 DNA样品放入预冷的 ΕΡ离心管中， 然后将融化的 DH 10B 感受态细胞 20 μ ΐ轻轻取出放入预冷的 ΕΡ离心管底部， 轻轻的将两者混匀， 尽量不要产 生气泡， 离心管底部不要用手接触， 避免温度变化对感受态转化效率造成影响， 操作过 程尽量的快。
(4) 设置转化参数， 1800ν， 25 F, 200 Ω , lmm, BioRad 电激仪一般有推荐的使用参 数。
( 5 )轻轻吸取感受态和 DNA混合物， 放入电激杯中， 轻敲使混合物均匀的分布于杯底， 改上盖子放入电激槽中， 关上安全盖， 按下电激红色按钮， 待电激完成后 （一般会仪器会 发出完成提示音） ， 将在 37 °C预热好的 SOC放入电激杯中， 将混合物旋起， 用吸头将混 合物转入摇菌管中， 于 37 °C恒温摇床， 225 rpm ， 1 hr。
实施例 2: 转基因水稻获得
2. 1 植物材料选择
用于遗传转化的水稻 （Oryza sativa L. ) 品种选择为对应的携带 PTB1基因 （SEQ ID
NO. 1 ) 的水稻雌性不育系。
2. 2水稻胚性愈伤组织的诱导
取授粉后 10-15d的未成熟水稻种子剥去种皮， 于 70%酒精浸泡 3min， 再于 0. 1%升汞 中浸泡 15min (或再转入 20 %的次氯酸钠溶液中于摇床振荡灭菌 25min) ， 超净工作台中 无菌水清洗 3-5次， 将消毒后种子的幼胚用镊子挤出， 接种于诱导培养基上， 每个皿约放
35粒， 28°C暗培养 4一 5d， 切除胚根， 继续培养 12-15d， 待愈伤长大后进行继代培养， 每 两周继代一次， 共继代 2-3次。
成熟胚去壳， 经上述方法消毒后， 置于诱导培养基上。 28°C暗培养至长出愈伤组 织。 选用培养或预培养 4天的愈伤组织作为转化材料。 （第三代开始可以选择适当的胚性 愈伤用于农杆菌转化。
2. 3 愈伤组织的预培养
取生长旺盛的胚性愈伤组织 （从继代培养上挑选分散状， 颜色鲜黄的 2— 3mm的胚性 愈伤颗粒） 转接到预培养培养基， 27°C暗培养 3〜4天。 生长旺盛的愈伤用于转化。
2. 4农杆菌介导的水稻转化
农杆菌的培养。 挑农杆菌单菌落接种于含 50mg/L YM培养基上， 260C暗培养 2〜3天 后， 用一金属匙收集农杆菌菌体， 将其悬浮于 AAM 液体悬浮培养基中。 调整菌落浓度至 0. D. 600为 0. 8〜1. 0， 即可用于转化。
愈伤组织与农杆菌的共培养。 用于转化的愈伤组织在被农杆菌污染前均应先在新鲜的 继代培养基頂上预培养 3〜4天。 转化时将经过预培养的愈伤组织转移到一无菌的三角瓶 中， 然后倒入适量的农杆菌悬浮液 （至少保证有足够的菌液与材料接触） ， 室温下放置 10^20 分钟， 并不时晃动。 取出愈伤组织， 在无菌纸上吸去多余的菌液， 随即将愈伤组织 转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基 CM上于 260C暗培养 2〜3天。
2. 5抗性愈伤的筛选
将愈伤转移到选择培养基上筛选抗性愈伤， 每两周转接 1次。 培养 4一 8周， 多数愈 伤褐化死亡， 有少数瘤状抗性愈伤从干瘪褐化的愈伤表面长出。 挑选这些抗性愈伤继续 在选择培养基上暗培养 2次， 挑选长大后愈伤的一部分转移到分化培养基上。
2. 6抗性愈伤的分化培养
经抗生素筛选长出的抗性愈伤， 转入分化培养基中继续培养， 26°C〜28°C， 12h光 照， 12h黑暗条件下培养。
2. 7转基因植株的再生及幼苗移栽
转移到分化培养基上的愈伤组织， 培养 2周后愈伤开始转绿， 3周后即可长出幼芽， 随之根也长出。 将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内， 每瓶一株， 继续光照培养， 待苗高广 10cm时， 打开瓶盖于温室中炼苗 5〜7天， 待小苗生长健壮后， 移出培养瓶， 洗 净跟上的培养基， 移至温室盆栽 （铁盘中） 。 注意保湿， 以提高移栽成活率。
实施例 3: 转基因植株的分子检测
3. 1 DNA大规模抽提
T。代转基因水稻 DNA抽提采用 CTAB法 （Murry and Thompson, 1980 ) 。 称取新鲜叶片 2— 4克， 剪碎后放入一 20°C预冷的研钵中， 用液氮磨成粉末， 转入预冷的磨样瓶中于一 20°C保存备用。 提取时加入预热至 100°C的 10 ml 1. 5X CTAB, 迅速搅匀， 于 56 °C水浴保 温摇床振荡 20分钟， 然后用等体积氯仿:异戊醇（24 : 1 )抽提。 离心后， 上清液再用 1/10 体积预热至 56°C的 10 %CTAB缓冲液及等体积的氯仿:异戊醇（24 : 1 )抽提一次， 然后上清 加入 1 %CTAB沉淀 DNA， 离心后加入添加有 RNase A的 lmol/L NaCl溶解 DNA， 于 56°C过 夜完全溶解酒精沉淀后， 溶于适量 TE中， 用 DNA微量测定仪（DNA Fluorometer)测定 DNA 浓度， 平衡 DNA浓度至 250ng/ul， 存于 4°C备用。
3. 2 PCR分析
对 T0代转基因水稻 DNA进行 PCR检测。 以 ZM-AA1基因作为模板设计引物。 正向引 物为： 5， -AAAAACGGAGACTTTGTGAGCCATT-3 ' ( SEQ ID NO. 11 ) ， 反向引物为： 5， -TCAACAAGTTTGGAATGAAGGATGC-3 ' ( SEQ ID NO. 12 ) 。 扩增产物片段为 1043bp。 PCR反应 体系： DNA 30— 90 ng， 10x Buffer 2. 0 ul, 1 mM dNTP 1. 8 ul, 25 mM MgCl2 1. 5 ul, 10 uM primer 两种各 0. 5 ul, Tag酶 1. 5 U， 然后加 dd h20至 20 ul反应体积。 PCR 循环条件： 94°C， 变性 3分钟； 94°C， 1分钟， 55°C， 1. 5分钟， 72°C， 1. 5分钟， 40个 循环； 72°C， 延伸 5分钟。 电泳检测： 用 1. 4%琼脂糖凝胶电泳， 照相记录电泳结果。
附图 4为部分转基因植株 PCR扩增结果， 表明目的基因已整合进入水稻基因组中。
3. 3 Southern印迹分析
取水稻总 DNA 2. 5 ug， 用限制性内切酶 Xbal 37°C酶解 20 hr左右， 经电泳检测酶切 完全后， 用 0. 6〜0. 8%琼脂糖 （Sigma公司生产） 凝胶电泳， 经 12— 16 hr电泳后， 凝胶用 0. 2N HC1变性 10分钟， 用 0. 4 N NaOH溶液将凝胶上的 DNA片段转移至尼龙膜 Hybond_N+ 上。 转移 20小时， 将尼龙膜用 2X SSC漂洗 2次， 各 5分钟， 膜晾干后于 80— 100°C真空 烘烤 3 hr， 取出冷却后置于 4°C冰箱中保存备用。
预杂交： 先将尼龙膜用 2X SSC漂洗， 凉干后装入杂交袋中， 加入 10— 18 ml (依膜的 张数 1一 6张） 预热至 65°C的杂交缓冲液。 赶气泡后， 于 65°C空气摇床中预杂交 6 hr左 右。
探针标记： 用随机引物法按下列步骤进行标记。 探针 DNA 100 ng， 加入 dd ¾0至 10 ul , 100°C变性 10分钟， 冰浴 5分钟冷却后， 加入 dNTP (A+G+T) 3 ul， 随机引物缓冲液 5. 0 ul, Klenow Fragment酶 2 U， 最后加入 a—32P— dCTP10_40 uCi (按杂交膜数量) ， 混匀
后于 25°C保温 3小时以上。
杂交: 加 600 ul杂交液到标记好的探针溶液中， 打开管盖， 100°C变性 10分钟后， 倒入杂交袋中， 65°C杂交 6 hr。
洗膜、 压片： 杂交完毕后， 将膜从杂交袋中取出， 用洗膜液 IX SSC、 0. 2 % SDS室温 漂洗 1次， 然后再用预热至 65°C的洗膜液于 65°C保温摇床中热洗 1一 2次， 每次 15分钟。 凉干后用保鲜膜包膜， 压片后于一 20°C放射自显影约 4一 7天。
探针 DNA制备。 探针 DNA选自 3. 2中的 PCR扩增产物，扩增产物的序列见 SEQ ID NO. 10。 附图 5为部分转基因植株的 Southern印迹分析。结果表明， 目的基因已整合进入水稻 基因组中。
实施例 4: 转基因水稻植株的育性考察
对经过分子鉴定的转基因植株考察了花粉育性和结实情况。 取开花时的花药， 经常规 的 L-KI染色后， 观察到部分花粉粒为黑染的可育花粉粒 （见附图 6 ); 与雌性不育对照比 较， 转基因植株能正常结实 （见附图 7 ) 。
实施例 5: 水稻雌性不育系用于繁殖制种试验
水稻雌性不育系的繁殖。 将携带杂合转基因的水稻雌性不育系自交。 自交种子通过对 红色荧光的光电分选， 可以筛选出具有红色荧光的种子， 获得纯合的雌性不育水稻用于 混播混收的杂交稻机械化制种； 而携带转基因的杂合种子， 继续用于雌性不育水稻的繁 殖。
水稻雌性不育系应用于杂交稻制种。 因为父本 （恢复系） 为雌性不育系， 因此制种时 可以箱式栽插， 也可以混播混收。 父母本按照一定的比例均匀混合， 一次播种， 能够像常 规水稻那样进行育秧和大田栽培管理， 可以直播、 抛秧、 机插等。 待成熟后进行机械化 收割， 收获的均为杂交水稻种子。 附图 7展示了小规模的制种现场。
Claims
1 、 一种利用雌性不育的杂交稻机械化制种方法， 其特征在于， 所述方法包括如下步骤： ( 1 ) 将水稻雌性可育基因、 水稻花粉致死基因和荧光筛选标记基因插入水稻表达载体； ( 2) 将步骤 （1 ) 所制备的水稻表达载体导入雌性不育水稻， 得到杂合的转基因水稻；
( 3 ) 将杂合的转基因水稻自交， 通过光电分选法对自交后得到的种子进行分选， 筛选出 不具有红色荧光的种子， 即为纯合的雌性不育水稻种子， 将该纯合的雌性不育水稻种子用 于箱式播插或者混播混收的杂交稻机械化制种； 筛选出的具红色荧光的种子即为转基因种 子， 将该转基因种子继续用于雌性不育水稻的繁殖。
2、 如权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述水稻雌性可育基因为野生型 PTB1基因或 雌性不育水稻 sfsl的野生型雌性可育基因； 所述雌性不育水稻 sfsl的野生型雌性可育基 因序列如 SEQ ID NO. 1； 所示野生型 PTB1基因序列如 SEQ ID NO. 2所示。
3、如权利要求 1所述的方法， 其特征在于，所述花粉致死基因为 ZM-AA1 ,其序列如 SEQ ID NO. 5所示。
4、 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述花粉致死基因由花粉发育后期特异性启 动子 PG47驱动， PG47序列如 SEQ ID NO. 3所示。
5、 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述荧光筛选标记基因包括红色荧光蛋白基 因 RP， 其序列如 SEQ ID NO. 8所示。
6、 如权利要求 5所述的方法， 其特征在于， 所述荧光筛选标记基由愈伤组织 /种皮特异性 启动子 END2驱动， END2序列如 SEQ ID NO. 7所示。
7、 如权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述水稻表达载体为 pCAMBIA1300。
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