CN109486853A

CN109486853A - 一种利用基因组编辑技术快速创制适合机械化制种的工程雌性不育系的方法

Info

Publication number: CN109486853A
Application number: CN201811388237.6A
Authority: CN
Inventors: 曹孟良; 夏玉梅; 唐宁; 李丁; 罗珊; 卜小兰; 余木兰
Original assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Current assignee: Hunan Hybrid Rice Research Center
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2019-03-19

Abstract

本发明提供了一种利用基因组编辑技术快速创制适合机械化制种的工程雌性不育系的方法。本发明包括如下3个步骤：1）通过诱变技术或者基因编辑技术获得雌性不育突变体；2）将携带雌性可育基因、花粉致死基因和筛选标记基因3个基因表达盒的表达载体通过转基因技术转入受体材料，获得转基因材料；3）将雌性不育突变体与转基因材料通过杂交聚合选育出适合杂交种机械化制种的工程雌性不育恢复系。本发明能使与不育系播始期相同的优良恢复系快速转变为适合机械化制种的工程雌性不育恢复系。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

Description

一种利用基因组编辑技术快速创制适合机械化制种的工程雌性不育系的方法

技术领域

本发明属于植物分子生物学和农业生物技术领域，尤其涉及一种利用基因组编辑技术快速创制适合机械化制种的工程雌性不育系的方法。

背景技术

水稻是我国最重要的粮食作物，其中杂交稻种植面积占水稻总面积的 57%以上，平均产量 7.2t/hm²，比常规稻单产高出1.4t，每年种植杂交稻所增产的粮食可多养活7000 万人口。杂交稻的研究成功使得中国以占世界7%的土地养活了占世界22%的人口。杂交稻生产中播种（插秧）、收割等环节均可以实现机械化操作，然而杂交稻产业中另一重要的环节—制种，大多还是延续传统的生产技术，完全依靠人工操作，工序繁杂，制约了杂交水稻种子的生产。我国常年制（繁）种面积在18万hm²左右，不仅为我国大约1600万hm²杂交水稻提供种源，还出口到世界其他多个国家种植。随着农业就业人员的减少、劳动力成本的上升以及杂交稻种植面积在全球的扩大，如何实现制种机械化、轻简化，以降低种子生产成本、提高种子产量，适应杂交稻快速发展的步伐，是当前亟需解决的重要课题。

制种机械化的主要问题在于不育系和恢复系需分期插播、赶粉技术落后、杂交种子和恢复系自交种子难以有效分选等。不育系和恢复系的生育期相近就可以采取混播，人工赶粉技术只要做些改进也可适合制种机械化的要求，最大的难点在于如何把不育系上结的杂种与一同用收割机收获的恢复系种子准确地分开，以实现机械化收割。目前可用于机械化制种的方法包括用转基因技术的方法育成抗除草剂的显性基因标记的纯合不育系、除草剂敏感致死的隐性基因标记的纯合恢复系、呈特殊谷壳色的颜色基因标记的纯合不育系和利用雌性不育的恢复系等。

水稻雌性不育表型类型多样, 是不同基因突变和环境条件相互作用的结果。雌性不育特性用在杂交水稻制种上, 其意义不仅在于提高制种产量、降低种子生产成本和确保所产杂交种子的纯度, 而且完全可实现杂交水稻种子的机械化生产和轻型化栽培,如混直播或混抛秧等。CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，此系统的工作原理是 crRNA（CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA（trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计将这两种改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。当植物的基因组被切割后，在有同源序列的情况下会发生同源重组修复，此种情况下可以产生基因组定点修改（Knock in）；在没有同源序列的情况下细胞会进行随机修复，此时在基因组上会随机引入插入、缺失、替换事件，从而造成基因敲除（Knock out）。利用CRISPR/Cas9技术可以快速、精准的将任意水稻材料转化为雌性不育材料，从而应用于杂交稻的机械化制种。

发明内容

本发明旨在客服现有技术的不足，提供一种利用基因组编辑技术快速创制雌性不育材料的方法及其在机械化制种中的应用。另外，本发明还提供了编码雌性不育的核酸以及基因工程中间体（如，表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌），判断植物是否采用本发明方法获得的鉴定方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述利用基因组编辑技术快速创制适合机械化制种的工程雌性不育系的方法包括如下步骤：

（1）通过诱变技术或者基因编辑技术获得雌性不育突变体；

（2）将携带雌性可育基因、花粉致死基因和筛选标记基因3个基因表达盒的表达载体通过转基因技术转入受体材料，获得转基因材料；

（3）将雌性不育突变体与转基因材料通过杂交聚合选育出适合杂交种机械化制种的工程雌性不育恢复系作物。

其中，所述获得雌性不育突变体的方法包括但不限于诱变、基因组编辑。

所述雌性不育基因包括但不限于PTB1、FST基因；所述花粉致死基因包括但不限于ZM-AA1基因；所述筛选标记基因包括但不限于荧光标记基因和颖壳颜色基因。

所述雌性可育基因为雌性不育基因的野生型。

所述将携带雌性可育基因、花粉致死基因和筛选标记基因3个基因表达盒的表达载体转入雌性不育突变体的方法包括但不限于转基因技术、杂交。

所述作物为单子叶作物或双子叶作物。

所述单子叶作物或双子叶作物为水稻、玉米、油菜、谷子、小麦、辣椒。

基于上述方法使得野生型雌性不育基因发生任何缺失、插入、替换等修饰后产生了核酸。可以制备成含有所述核酸的细胞系。

下面对本发明作进一步说明：

在第一方面，本发明提供了获得雌性不育植物的方法，其包括如下步骤：

（1）利用CRISPR/Cas9技术构建敲除载体编辑野生型雌性不育基因，所示野生型雌性不育基因包括但不限于PTB1基因，所述雌性不育基因序列如SEQ ID NO.1所示。

（2）Cas9载体导入作物，获得靶位点突变的雌性不育材料。

该方法使野生型雌性不育基因发生任何缺失、插入、替换等修饰后产生了核酸。

在第二方面，本发明提供了核酸，是本发明人通过第一方面的方法获得的。在本文中，核酸可以是DNA，也可以是RNA，优选是DNA。目前已经发现PTB1发生470bp的DNA缺失后表现出花粉管生长受阻,不能完成正常的受精过程,导致雌性不育。然而，没有报道表明，其它位点的突变，会使得相应植物（尤其是水稻）雌性不育。

在第三方面，本发明第二方面的核酸可被构建成表达盒插入转化进细胞中的任何载体中。扩增上述核酸片段的全长或任意片段的引物对也是本发明保护的范围。含有第二方面核酸片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明的保护范围。优选的细胞是植物细胞，优选是水稻细胞，更优选是水稻恢复系细胞，所述植物细胞中包含的本发明第二方面的核酸可以是通过转基因技术导入植物细胞的，包括导入到植物细胞的核、叶绿体、线粒体和/或质体中，也可以是通过基因组编辑技术（如本发明具体实施方式所述的技术）使得本发明第二方面的核酸存在于植物细胞中的。

在第四方面，本发明提供了植物，其包含本发明第二方面的核酸。由于引入了本发明第二方面的核酸，本发明第五方面的植物雌性不育。

在本发明中，植物指的是借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物就能合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的单个植株、植株群或其繁殖材料，包括植物、植物品种、植株、植物事件、植物后代、植物种子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物后代本身就是植物，包括通过转基因技术产生的植物后代、与其他植物品种杂交产生的植物后代、以及回交或自交产生的植物后代。

本发明第四方面的植物可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物。在本发明的具体实施方式中，优选本发明第五方面的植物是水稻，更优选是水稻恢复系，具有雌性不育特性的水稻恢复系。

在第五方面，本发明提供了前述各方面在机械化制种中的应用，将携带雌性可育基因、花粉致死基因和筛选标记基因3个紧密连锁的基因表达盒的载体转入第四方面所述的植物，其转入方法包括但不限于转基因技术（该方法已被ZL 2014 1 0116096.8的发明专利公开）、杂交等，从而应用到机械化制种中。在本发明的具体实施方式中，优选方法是杂交。

在第六方面，本发明提供了可用于机械化制种的植物，其包含本发明第二方面的核酸，同时包含本发明第五方面所述连锁表达盒。可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物。在本发明的具体实施方式中，优选本发明第五方面的植物是水稻，更优选是水稻恢复系，具有雌性不育特性的水稻恢复系。

在第七方面，本发明提供了鉴定本发明第六方面的植物的方法，其包括如下步骤：

（1）测定所述植物是否包含本发明第一方面产生的核酸；

（2）测定所述植物是否含有连锁表达盒元件。

通过该方法，可以判断植物是否属于本发明的植物，即是否属于本发明第六方面的植物。测定的步骤可以通过常规的核酸检测，示例性的方法包括核酸测序、聚合酶链式反应（PCR）检测、探针杂交检测等。

本发明取得的有益效果在于利用基因组编辑技术编辑野生型雌性不育基因可以快速的获得雌性不育材料，通过导入雌性可育基因、花粉致死基因和筛选标记基因连锁表达盒，可以获得杂合的转基因雌性不育水稻。解决雌性不育水稻繁殖技术难题，实现杂交稻种子生产的混播混收。繁殖时，雌性不育水稻虽为转基因水稻，但面积不大，易于隔离。制种时，可以箱式播插，也可以混播，父母本都不含有转基因成分，不会造成转基因的扩散漂移，有利于生物安全；收获时，可以混收，杂交种子也不含有转基因成分。这一混播混收的杂交水稻种子生产技术，可以减少制种操作程序，便于进行机械化操作，减轻劳动强度，降低种子生产成本，整体提高水稻种业的效益。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1 Cas9敲除载体结构示意图；

图2 PTB1突变体与野生型受体品种靶位点测序序列比对结果；

图3 PTB1突变体植株图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步描述，但不因此限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、利用基因组编辑技术快速获得雌性不育材料

一、利用CRISPR/Cas9 技术编辑水稻野生型PTB1基因。

1、目标基因靶位点选择和双链接头设计

在目标基因的突变区域找到任意NGG（PAM）的位置，上游第20碱基是A（用U3启动子）或G(用U6a~c启动子）的序列 (A，G分别为U3和U6启动子的转录起始碱基），优先选为靶序列。在MBKbase和RIGWR上分别与R498和9311基因组进行靶标特异性检查，设计2个靶标：

靶标1：acccgaggaaggacaaaaatggg（SEQ ID NO.2）

靶标2：ggactgtgataggaacattgtgg（SEQ ID NO.3）

根据靶位点序列合成两条携带接头的引物PTB-B2引物和PTB-AU2（接头序列与经Bsa I酶切后的载体粘性末端互补），设计的接头引物序列如下：

PTB-B2引物

PTB-B2(+):cagtGGTCTCaggcacccgaggaaggacaaaaat（SEQ ID NO.4） PTB-B2(-):cagtGGTCTCaaaacatttttgtccttcctcggg（SEQ ID NO.5）

PTB-AU2引物

PTB-AU2(+):cagtGGTCTCagttggactgtgataggaacattg （SEQ ID NO.6） PTB-AU2(-):cagtGGTCTCaaaaccaatgttcctatcacagtc（SEQ ID NO.7）

2.构建中间载体

（1）引物变性、退火，得到gRNA片段。PCR体系：H₂0: 40μl，正向引物 5μl，反向引物 5μl。PCR 程序：95℃ 10min，55℃ 10min，14℃ 5min。

（2）酶切连接

酶切连接体系：gRNA片段 2μl，PBWD(LB)-DNAi空载 1.5μl，ECO31I 0.5μl，T4-ligase0.5μl，T4-buffer 1μl，加ddH₂O至 10μl。把配置好的体系置于37℃ 培养箱约2h左右。

（3）重组质粒转化

(1) 取一管200 μL大肠杆菌感受态细胞DH5a与5 μL连接产物混合，冰浴30 min；

(2) 迅速置于42 ℃恒温水浴锅中，热激90 s，冰浴2 min；

(3) 加入500 μL LB液体培养基，混匀；

(4) 37 ℃、200 rpm,培养45 min，使细胞恢复正常生长状态；

(5) 将菌液均匀涂布于LB固体培养基平板上；

(6) 30 min后，置37 ℃恒温培养箱，过夜培养。

（4）菌检及质粒抽提验证

根据本实验室经验，构建的中间载体不需要经过菌检，可以直接挑斑摇菌，准确率达99%，然后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，把抽提的质粒各送2个单克隆，测序

（5）靶标酶切连接

酶切体系： PBWA(V)HU-cas9pl空载 1μl，PTB-B2(质粒) 1.5μl， LguI 0.5μl，T4-ligase 0.5μl，T4-buffer 1μl，加ddH₂O至10μl。把配置好的体系置于37℃培养箱2h后转化。双靶标酶切连接体系：PTB-B2-Cas9 (质粒) 1μl，PTB-AU2(质粒) 1.5μl，ESP3I 0.5μl，T4-ligase 0.5μl，T4-buffer 1μl,加ddH₂O至10μl。把配置好的体系置于37℃培养箱2h,转化,菌检。菌检体系：2*Mix 10μl，PTB-B2+(正向检测引物) 1μl，GET-(反向检测引物) 1μl，加ddH₂O至10μl。

菌检条带大小：750bp左右，挑取正确的单克隆接菌，抽提质粒，送测序。

3.重组菌的获得

将构建正确的Cas9敲除植物表达载体(图1）使用电激法转化农杆菌EHA105。导入方法采用电激转化方法，主要参考bio-rad公司的电击仪使用说明书进行，具体步骤如下：

将储存于-80℃的EHA105感受态细胞取出放在冰上冻融，1mm电击杯放在冰上预冷，把冻存的SOC放置在37℃解冻。将干净的EP离心管插在冰上预冷，一般EP离心管的数目比要转化的样品多两个，一个用来做阴性对照（没有加入DNA）、另一个做阳性对照（加入1μl的10ng/μl pUC19）。分别吸取1μl要转化的DNA样品放入预冷的EP离心管中，然后将融化的EHA105感受态细胞20μl轻轻取出放入预冷的离心管底部，轻轻的将两者混匀，尽量不要产生气泡，离心管底部不要用手接触，避免温度变化对感受态转化效率造成影响，操作过程尽量的快。设置转化参数，电阻200Ω，电容25 μF，电压1800 V，电激杯规格1 mm，BioRad电激仪一般有推荐使用的参数。轻轻吸取感受态和DNA混合物，放入电激杯中，轻敲使混合物均匀的分布于杯底。盖上盖子放入电激槽中，关上安全盖，按下电激红色按钮，待电激完成后，将在37℃预热好的SOC放入电激杯中，将混合物旋起，用吸头将混合物转入摇菌管中，于28℃恒温摇床， 180rpm, 2 h。取50 μl菌液涂布在含卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（25 μg/mL）的LB固体培养基上，28℃暗培养2 d，挑取农杆菌转化子单菌落，接种到添加了相同抗生素的LB液体培养基中，28℃条件下，振荡培养2 d。取适量菌液加入等体积的50%浓度的无菌甘油混合，于-80℃条件下保存、备用。

4、农杆菌介导的遗传转化

挑选Cas9敲除植物表达载体农杆菌单菌落接种于含50mg/L kanamycin的LB培养基上26℃暗培养2天后，用NB-AS液体培养基洗下农杆菌菌体，28℃ 180rpm 液体振荡培养90-120分钟。调整菌落浓度至OD600为0.8～1.0，即可用于转化。

转化水稻受体明恢86，水稻种子消毒，挑选子粒饱满的种子，用75%的酒精浸泡30S，倒掉酒精，无菌水冲洗一遍，用Hgcl2消毒8min，无菌水清洗2遍，每次浸泡1Min，用无菌水浸泡1h。消毒后的种子接种到诱导培养基上，光照下生长7d。

将无菌愈伤集中在一起。放入农杆菌悬浮液中，浸泡5-10min，取出，用滤纸晾干。接种到共培养培养基，共培养2天，将共培养的愈伤，清洗6遍，并用滤纸晾干后接种到具潮霉素抗性的筛选培养基上45天。

将抗性愈伤转移到分化培养基上，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待小植株长至7-10 cm 左右时进行室内炼苗，3～4 d 后将其移栽到土壤中生长。

5.PTB1突变体的检测

T0代转基因水稻采用CTAB法抽提DNA。在基因敲除靶位点两侧设计特异引物进行PCR检测，并送样测序（附图2），图2仅为其中一种突变情况。待成熟时考察其结实情况（附图3）。

实施例2 将雌性不育材料应用于杂交稻的机械化制种

一、将雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因连锁表达盒的转入水稻

1.构建连锁表达载体

在表达载体pCAMBIA1300上，插入3个表达盒；野生型PTB1表达盒、花粉致死的淀粉酶基因ZM-AA1表达盒，荧光筛选标记基因RFP表达盒。野生型PTB1携带有自身的启动子和终止子；淀粉酶基因ZM-AA1表达盒元件包括：玉米的花粉发育后期特异性启动子PG47、玉米的转运肽ZM-BT1、玉米的淀粉酶基因编码序列ZM-AA1、玉米的终止子IN2-1；红色荧光蛋白基因RP表达盒元件包括：玉米的种子特异性启动子END2、载体pLj02上的RP编码序列、马铃薯的终止子PINⅡ。所构建载体利用电激法导入农杆菌菌株EHA105用于水稻遗传转化。

2.转基因水稻的获得

用携带水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因表达盒的水稻表达载体转化明恢86。愈伤组织与农杆菌的共培养3天后，从中挑选颜色鲜黄的转入选择培养基上培养一周，用体式荧光显微镜筛选带有红色荧光的转化愈伤组织，观察转化效率，筛选第15天对发荧光的愈伤组织进行第一次分切，将发荧光的细胞团切成0.1-0.2mm大小，转移至新的筛选培养基，筛选第30天，第二次分切，尽量分成独立转化的细胞团。筛选第45天，第三次分切。分切三次后的愈伤在筛选培养基上长至>0.2mm时，转移到分化培养基，分化苗长到4 cm 左右时转到生根培养基诱导生根，待小植株长至7-10 cm 左右时进行室内炼苗，3～4 d 后将其移栽到土壤中生长。

3.转基因植株的分子检测

（1）采用CTAB法对T0代转基因水稻进行DNA抽提。

（2）对T0代转基因水稻DNA进行PCR检测。

以ZM-AA1基因作为模板设计引物，扩增产物片段为1043bp。正向引物：5'AAAAACGGAGACTTTGTGAGCCATT 3’（SEQ ID NO.8），反向引物：5’TCAACAAGTTTGGAATGAAGGATGC 3’ （SEQ ID NO.9）。PCR反应体系：DNA 30-90ng,10×Buffer2.0μl,1mM dNTP 1.8μl,25mM MgCl2 1.5μl,10uM primer 两种各0.5μl,Tag酶1.5U，加ddH₂O至20μl反应体积。PCR循环条件94℃，3min；94℃,1min，55℃,1.5min，72℃ 1.5min，40个循环；72℃，延伸5min。用1.4%琼脂糖凝胶电泳检测，照相记录电泳结果。

（3）Southern印迹分析

取水稻总DNA 进行EcoRⅠ酶切、电泳、转移至硝酸纤维素膜Hybond-N。利用随机引物标记试剂盒（Promega 公司）和[α-32P]dATP（北京亚辉公司），随机引物法制备α-32P 标记的bar基因片段，作为分子探针，按照Sambrook 等分子克隆方法进行转化植株的Southern 杂交分析。

二、将雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因连锁表达盒的转入雌性不育突变体，获得适合机械化制种的雌性不育突变体

1.杂交选育将利用基因编辑技术获得的明恢86雌性不育突变体进行Cas9的PCR检测，扩增产物片段为439bp,cas9pl-F : GAACGGTCGTAAGAGGATGCTG（SEQ ID NO.10）， cas9pl-R:GGTGATGGACTGGTGGATGAGA（SEQ ID NO.11）。已剔除敲除载体的雌性不育突变株与含连锁表达盒的转基因植株杂交，从杂交F1代中筛选出已剔除敲除载体并成功转入连锁表达盒的性状稳定植株。

2.转基因水稻植株的育性考察

（1）对经过分子坚定的转基因植株考察花粉育性和结实情况。取开花时的花药，经常规的I2-KI染色后，观察其花粉粒情况。

（2）水稻雌性不育系用于繁殖制种。

水稻雌性不育系的繁殖。将携带杂合转基因的水稻雌性不育系自交。自交种子通过对红色荧光的光电分选，可以筛选出具有红色荧光的种子，获得纯合的雌性不育水稻用于混播混收的杂交稻机械化制种；而携带转基因的杂合种子，继续用于雌性不育水稻的繁殖。

水稻雌性不育系应用于杂交稻制种。因为父本（恢复系）为雌性不育系，因此制种时可以箱式栽插，也可以混播混收。父母本按照一定的比例均匀混合，一次播种，能够像常规水稻那样进行育秧和大田栽培管理，可以直播、抛秧、机插等。待成熟后进行机械化收割，收获的均为杂交水稻种子。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 一种利用基因组编辑技术快速创制适合机械化制种的工程雌性不育系的方法

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gataggaaca ttgtggttta gcactgcaag aggctgtgta agttttctta ttgtgatggt 60

attatgctca tcaccaatta tatagaattt ctacttaaca tacactcact ctatctgtag 120

ttacccgagg aaggacaaaa atggggcttc cttatatggc tgcttttcag ctactgtggt 180

ctcgcctgta ttgcatgtgt ggctgttgga aaggtactgc tataagatat attggtacaa 240

actgcaatct tgcattggat ccgcatatta tcgtccaccg gcttttcatc agtcatacat 300

accatatcta gatgtcattt agattgaaga tgttaaggtt ttagttattt ggcattgatg 360

tattcataat ttcatatctt ctttgcatca tct 393

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

acccgaggaa ggacaaaaat ggg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggactgtgat aggaacattg tgg 23

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cagtggtctc aggcacccga ggaaggacaa aaat 34

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cagtggtctc aaaacatttt tgtccttcct cggg 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cagtggtctc agttggactg tgataggaac attg 34

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cagtggtctc aaaaccaatg ttcctatcac agtc 34

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aaaaacggag actttgtgag ccatt 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tcaacaagtt tggaatgaag gatgc 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gaacggtcgt aagaggatgc tg 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ggtgatggac tggtggatga ga 22

Claims

1.一种利用基因组编辑技术快速创制适合机械化制种的工程雌性不育系的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）通过诱变技术或者基因编辑技术获得雌性不育突变体；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述获得雌性不育突变体的方法包括但不限于诱变、基因组编辑。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述雌性不育基因包括但不限于PTB1、FST基因；所述花粉致死基因包括但不限于ZM-AA1基因；所述筛选标记基因包括但不限于荧光标记基因和颖壳颜色基因。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述雌性可育基因为雌性不育基因的野生型。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将携带雌性可育基因、花粉致死基因和筛选标记基因3个基因表达盒的表达载体转入雌性不育突变体的方法包括但不限于转基因技术、杂交。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述作物为单子叶作物或双子叶作物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述单子叶作物或双子叶作物为水稻、玉米、油菜、谷子、小麦、辣椒。

8.基于权利要求4所述方法而使野生型雌性不育基因发生任何缺失、插入、替换等修饰后产生的核酸。

9.含有权利要求8所述核酸的细胞系。

10.如权利要求8所述的核酸或权利要求9所述的细胞系在机械化制种中的应用。