CN116034870A - 一种通过含有可视化标记的小麦基因编辑突变体诱导的单倍体植株的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过含有可视化标记的小麦基因编辑突变体诱导的单倍体植株的筛选方法。本发明提供了一种鉴别或辅助鉴别植物单倍体诱导系的诱导后代中单倍体的方法，包括如下步骤：1)创制表达可视化标记基因的单倍体诱导系；所述创制的方法为将可视化标记基因转移到植物单倍体诱导系中，得到表达可视化标记基因的单倍体诱导系；2)将所述表达可视化标记基因的单倍体诱导系与植物其他品种杂交，得到F1代，在F2代籽粒的发育阶段或成熟期通过胚部位颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别。所提供的方法对小麦单倍体育种、DH群体构建、基因定位和目标基因功能研究等具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种通过含有可视化标记的小麦基因编辑突变体诱导的单倍体植株的筛选方法。
背景技术
传统育种方法育成一个优良小麦品种至少需要8-10年，而单倍体育种采用孤雌生殖或雄核发育产生单倍体，经过加倍后直接产生纯合双单倍体，经过一次培养或诱导就能产生全部基因同质的纯合二倍体，繁殖种子后就可参加产量鉴定和适应性试验，大大缩短了育种周期，提高了育种效率。
小麦单倍体最早主要通过花药培养和小孢子培养诱导产生，但花药培养和小孢子培养存在强烈的基因型依赖性和严重的白化苗现象，大多数基因型或杂种组合不能通过花药培养和小孢子培养获得再生植株，育种群体难以形成规模。另外，花药培养和小孢子培养诱导单倍体的程序比较复杂，要求一定的实验设备和条件。上世纪80年代末期发现，小麦与玉米杂交后玉米染色体逐步从合子胚中消失，产生无胚乳发育的小麦单倍体胚籽粒，经过幼胚拯救培养可以获得小麦单倍体植株。小麦与玉米杂交诱导小麦单倍体技术受环境条件和实验设施的影响较大，单倍体胚和单倍体植株诱导效率较低，应用范围受到限制。
近年来利用基因编辑技术敲除MTL(PLA)基因、DMP基因，PLD3基因等可以有效的诱导母本单倍体，中国农业大学陈绍江教授团队利用CRISPR/Cas9技术编辑小麦中ZmMTL基因的同源基因TaPLA，获得了同时敲除TaPLA-A和TaPLA-D的突变体，单倍体诱导率为2-3％(Liu et al.,2020a)。目前有研究在优化利用CRISPR/Cas9编辑小麦基因技术体系的基础上，编辑小麦中ZmMTL基因的同源基因TaMTL，获得了mtl-A、mtl-AD、mtl-BD和mtl-ABD共4种类型纯合突变体，其中3个等位基因同时突变的mtl-ABD自交后代中单倍体诱导率为18.9％。
单倍体在植株水平可以利用细胞学、细胞遗传学、基因组学和形态学等方法进行鉴定，包括保卫细胞长度、染色体数目、DNA总量、基因拷贝数、花粉活性、植株高度和育性等。通过花药培养、小孢子培养和远缘杂交等技术诱导产生的植株几乎全部为单倍体。但通过CRISPR/Cas9技术编辑MTL基因或诱导系授粉产生的单倍体胚，其频率只有1-20％，需要在籽粒发育阶段辨别单倍体和二倍体，以便进行染色体加倍。
小麦单倍体在植株水平可以利用细胞学、细胞遗传学、基因组学和形态学等方法进行鉴定，包括保卫细胞长度、染色体数目、DNA总量、流式细胞倍性、基因拷贝数和植株高度等。通过花药培养、子房培养和远缘杂交等技术诱导产生的小麦植株几乎全部为单倍体，可以全部直接进行染色体加倍处理获得纯合二倍体植株。但是，通过CRISPR/Cas9技术敲除TaMTL基因创制的小麦单倍体诱导系与其它品种杂交后的籽粒中既有单倍体又有二倍体，他们在外观形态上没有差异。由于源于TaMTL基因敲除诱导系诱导小麦单倍体的频率还比较低，从育种角度出发，需要尽可能在早期大量、快速、准确鉴定出单倍体，以便对单倍体及时进行染色体加倍。然而，在目前鉴定小麦单倍体的几种方法中，有的方法操作复杂、费时、需要特殊仪器设备，有的方法需要较多样品或在植株生长到足够大时才能进行，不适用于幼苗萌发阶段对单倍体进行大规模鉴定，急需开发一种对利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦TaMTL基因创制的单倍体诱导系诱导的单倍体进行快速、准确的鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过含有可视化标记的小麦基因编辑突变体诱导的单倍体植株的筛选方法。
第一方面，本发明提供了一种鉴别或辅助鉴别植物单倍体诱导系的诱导后代中单倍体的方法，包括如下步骤：
1)创制表达可视化标记基因的单倍体诱导系；
所述创制的方法为将可视化标记基因及驱动其表达的启动子转移到植物单倍体纯合诱导系中，得到表达可视化标记基因的单倍体诱导系；
所述启动子为胚芽鞘特异启动子或胚特异启动子；
2)将所述表达可视化标记基因的单倍体诱导系与植物其他品种杂交，得到F1代籽粒；
3)在所述F1代籽粒的萌发阶段通过胚芽鞘颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别；
或在所述F1代籽粒的发育阶段或成熟期通过胚部位颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别。
上文所述方法中，所述在F1代籽粒的萌发阶段通过胚芽鞘颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别为选取胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒，培育，得到或候选得到单倍体小麦。
或，所述在F1代籽粒的发育阶段或成熟期通过胚部位颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别为选取胚不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒，培育，得到或候选得到单倍体小麦。
上文所述方法中，所述植物为小麦、玉米、水稻、大麦、谷子、番茄或拟南芥。
上文所述方法中，所述植物单倍体纯合诱导系为对植物基因组中单倍体诱导基因进行基因编辑，使其终止表达或突变，得到纯合单倍体诱导系。
上文所述方法中，所述植物为小麦，
所述单倍体诱导基因为MTL同源基因或其他单倍体诱导基因；
所述其他单倍体诱导基因为PLD3或DMP基因。
上文所述方法中，所述小麦的单倍体诱导基因TaMTL-4A、TaMTL-4B、TaMTL-4D和/或诱导产生单倍体的其他TaMTL基因。
上文所述方法中，所述可视化标记基因为ZmC1和/或ZmR基因；
所述胚芽鞘特异启动子为Ubiquitin启动子；
所胚特异启动子为PBD；
或，所述可视化标记基因为ZmC1基因，其对应的特异启动子为Ubiquitin启动子，对应选取胚芽鞘为非紫色的F1代籽粒；
或，所述可视化标记基因为ZmC1和ZmR基因，其对应的特异启动子PBD，对应选取胚为非紫色的F1代籽粒。
上文所述方法中，所述创制表达可视化标记基因的单倍体诱导系的方法为将表达可视化标记基因及驱动其表达的启动子的转基因株系与小麦单倍体纯合诱导系mtl-ABD杂交，得到F1代植株，再将所述F1代植株自交后得到F2代籽粒或植株，选取具有可视化标记基因对应颜色的F2代籽粒或植株，对其进行可视化标记基因、TaMTL-4A、TaMTL-4B和TaMTL-4D基因的鉴定，选取满足如下1)和2)，或，1)和3)条件的株系，记作表达可视化标记基因的单倍体诱导系；
1)、可视化标记基因纯合(如ZmC1或ZmC1和ZmR基因)；
2)、TaMTL-4A基因纯合、TaMTL-4B基因纯合和TaMTL-4D基因纯合；
3)、TaMTL-4B基因纯合和TaMTL-4D基因纯合。
具体如下：
所述创制表达可视化标记基因的单倍体诱导系的方法包括如下A或B：
A所示的方法，包括如下步骤：
A-1)将表达可视化标记基因ZmC1及其启动子的转基因株系与小麦单倍体纯合诱导系mtl-ABD杂交，到F1代植株，从所述F1代植株收获F2代籽粒，选取具有紫色胚芽鞘F2代籽粒培育得到F2代植株；
A-2)对所述F2代植株进行ZmC1基因、TaMTL-4A基因、TaMTL-4B基因和TaMTL-4D基因鉴定，选取含有ZmC1基因、TaMTL-4B基因纯合和TaMTL-4D基因纯合的F2代植株，记作含有ZmC1基因的mtl-BD纯合突变体；
A-3)将所述含有ZmC1基因的mtl-BD纯合突变体收获籽粒，按照株系种植，得到F2-3代植株，从所述F2-3代植株中选取ZmC1基因不分离的植株，该ZmC1基因不分离的F2-3代植株或其对应的含有ZmC1基因的mtl-BD纯合突变体植株F2代株系记作ZmC1基因纯合的mtl-BD纯合突变体，即为表达可视化标记基因的单倍体诱导系；
上述具有可视化标记基因ZmC1对应胚芽鞘颜色为紫色，不具有可视化标记基因ZmC1对应颜色为绿色；
B所示的方法，包括如下步骤：
B-1)将表达可视化标记基因ZmR和ZmC1及其启动子的转基因株系与所述小麦单倍体诱导系mtl-ABD杂交，到F1代植株，从所述F1代植株收获F2代籽粒，选取紫色F2代籽粒培育得到F2代植株；
B-2)对所述F2代植株进行ZmR基因、TaMTL-4A基因、TaMTL-4B基因和TaMTL-4D基因鉴定，选取含有ZmR基因、TaMTL-4A基因基因纯合、TaMTL-4B基因纯合和TaMTL-4D基因纯合的F2代植株，记作含有ZmR基因的mtl-ABD纯合突变体；
B-3)将所述含有ZmR基因的mtl-ABD纯合突变体收获籽粒，按照株系种植，得到F2-3代植株，从所述F2-3代植株中选取ZmC1和ZmR基因不分离的植株，该ZmC1和ZmR基因不分离的F2-3代植株或其对应的含有ZmC1和ZmR基因的mtl-ABD纯合突变体植株F2代株系记作ZmC1和ZmR基因纯合的mtl-ABD纯合突变体，即为表达可视化标记基因的单倍体诱导系。
上述具有可视化标记基因ZmR和ZmC1对应颜色为紫色，不具有可视化标记基因ZmC1对应颜色为白色。
上述选取含有ZmC1基因的方法为如下ZmC1基因鉴定；
上述选取含有ZmR基因的方法为如下ZmR基因鉴定；
上述选取TaMTL-4A基因纯合的方法为如下TaMTL-4A基因鉴定，再用TaMTL-4A基因鉴定后的产物测序确定是否纯合；
上述选取TaMTL-4B基因纯合的方法为如下TaMTL-4B基因鉴定，再用TaMTL-4B基因鉴定后的产物测序确定是否纯合；
上述选取TaMTL-4D基因纯合的方法为如下TaMTL-4D基因鉴定，再用TaMTL-4D基因鉴定后的产物测序确定是否纯合；
所述ZmC1基因鉴定采用PCR的方法，所用引物对由SEQ ID NO：1所示引物和SEQ IDNO：2所示引物组成；
所述ZmR基因鉴定采用PCR的方法，所用引物对由SEQ ID NO：9所示引物和SEQ IDNO：10所示引物组成；
所述TaMTL-4A基因鉴定采用PCR的方法，所用引物对由SEQ ID NO：3所示引物和SEQ ID NO：4所示引物组成；
所述TaMTL-4B基因鉴定采用PCR的方法，所用引物对由SEQ ID NO：5所示引物和SEQ ID NO：6所示引物组成；
所述TaMTL-4D基因鉴定鉴定采用PCR/RE的方法，所用引物对由SEQ ID NO：7所示引物和SEQ ID NO：8所示引物组成，所述限制性内切酶为PstI。
上述从F2-3代植株中选取ZmC1基因不分离的植株为选取胚芽鞘均为紫色植株；
上述从F2-3代植株中选取ZmR和ZmC1基因不分离的植株为选取胚均为紫色植株。
上文第一方面的方法具体如下：
(1)利用含有ZmC1基因的株系AL-30与小麦纯合突变体mtl-ABD杂交，从F2-3代分离群体中筛选含有ZmC1基因的mtl-BD纯合突变体植株，并以此为父本获得杂交F1代籽粒，萌发后，通过幼苗胚芽鞘的颜色鉴别单倍体：具有紫色胚芽鞘的幼苗为二倍体杂交种，具有绿色胚芽鞘的幼苗为诱导出的单倍体。
其原理是：杂交F1代中的二倍体由编辑突变体雄配子与其他材料雌配子的合子发育而来，其幼苗基因组的一半来自父本(含有ZmC1基因)，另外一半来自母本小麦材料，因此幼苗胚芽鞘部位呈紫色；杂交种中的单倍体由母本小麦材料的雌配子发育而来(作为诱导系的编辑突变体的染色体在合子细胞中被完全排除)，其幼苗基因组完全来源于母本小麦材料(不含有ZmC1基因)，所以幼苗胚芽鞘部位呈绿色，因此可以通过幼苗胚芽鞘部位颜色直接快速的鉴定出单倍体。通过根尖染色体计数法证实该方法可行，适用于大批量单倍体幼苗的快速鉴定。
(2)利用胚和糊粉层特异性表达的双向启动子，驱动玉米花青素基因ZmR基因和ZmC1基因表达，获得的紫胚植株与获得的小麦mtl-ABD纯合突变体进行杂交，并对杂交F2和F2-3代进行鉴定，获得含有ZmR基因和ZmC1基因的mtl-ABD纯合突变体，以此为父本获得杂交F1代籽粒，通过籽粒胚部位颜色快速鉴定出单倍体籽粒。
其原理是：杂交种的二倍体由编辑突变体雄配子与其他材料雌配子的合子发育而来，其幼苗基因组的一半来自父本(含有ZmR基因和ZmC1基因)，另外一半来自母本小麦材料，因此籽粒胚部位呈紫色；杂交种中的单倍体由母本小麦材料的雌配子发育而来(作为诱导系的编辑突变体的染色体在合子细胞中被完全排除)，其幼苗基因组完全来源于母本小麦材料(不含有ZmR基因和ZmC1基因)，所以籽粒胚部位呈白色，因此可以通过籽粒胚部位颜色直接快速的鉴定出单倍体。通过根尖染色体计数法证实该方法可行，适用于大批量单倍体籽粒的快速鉴定。
第二个方面，本发明提供了第一个方面获得的胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒或植株在单倍体加倍育种中的应用；
或本发明提供了第一个方面获得的胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒或植株在单倍体加倍育种中的应用。
第三个方面，本发明提供了小麦的育种方法，为方法甲或乙：
所述方法甲包括如下步骤：选取第一个方面胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒或植株进行育种；
所述方法乙包括如下步骤：选取第一个方面胚不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒或植株进行育种。
上述育种为用胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒或胚不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒作为单倍体，经加倍产生纯合的后代，用作育种。
上述玉米ZmC1和ZmR基因分别属于MYB和bHLH转录因子家族，参与调控玉米花青素的生物合成。
本发明可用于小麦TaMTL纯合编辑突变体作为父本与其他小麦材料作为母本杂交诱导的单倍体籽粒的快速鉴定，对小麦单倍体育种、DH群体构建、基因定位和目标基因功能研究等具有重要意义。
附图说明
图1为株系AL-30与突变体mtl-ABD杂交F2代植株中ZmC1基因PCR检测结果。
图2为株系AL-30与突变体mtl-ABD杂交F2代植株中编辑类型检测结果。
图3为含有ZmC1基因mtl-BD纯合突变体×Fielder杂交F1代籽粒萌发情况。
图4为利用含有ZmC1基因的mtl纯合突变体作为父本与其他小麦材料杂交后的杂种一代中单倍体植株染色体检测结果。
图5为利用胚和糊粉层特异性启动子驱动ZmR基因和ZmC1基因表达的载体图。
图6为利用胚和糊粉层特异性启动子驱动ZmR基因和ZmC1基因表达载体T0代转基因植株检测。
图7为含有ZmR和ZmC1基因的表达载体T0代转基因植株表型观察。
图8为含有ZmR和ZmC1基因的表达载体T0代转基因植株籽粒表型。
图9为具有紫色胚的植株与突变体mtl-ABD杂交F2代植株中ZmR基因检测。
图10为具有紫色胚的植株与突变体mtl-ABD杂交F2代植株中编辑类型检测。
图11为利用含有可视化标记ZmR基因和ZmC1基因的mtl纯合突变体作为父本与其他小麦材料杂交后的杂种一代中单倍体植株染色体检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的小麦品种为Fieder，可从中国农业科学院作物科学研究所国家农作物种质资源库获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的小麦TaMTL编辑突变体具体为小麦mtl-ABD纯合突变体，为本实验室利用CRISPR/SpCas9系统对小麦内源基因TaMTL-4A(TraesCS4A02G018100)、TaMTL-4B(TraesCS4B02G286000)、TaMTL-4D(TraesCS4D02G284700)进行编辑后获得的纯合突变体。TaMTL-4A在靶点gM179和gM471之间缺失了291bp；TaMTL-4B在靶位点gM179和gM471之间缺失了292bp；TaMTL-4D在sgRNA1位置缺失了1bp(Liu et al.,2020)。
小麦mtl-ABD纯合突变体QD33为将野生型小麦(小麦品种Fielder)小麦基因组上的TaMTL-4A基因组DNA(TraesCS4A02G018100)的第777-1067位缺失291个碱基(即靶点gM179和gM471之间)，在TaMTL-4B基因组DNA(TraesCS4B02G286000)的第779-1070位上缺失了292个碱基(即靶点gM179和gM471之间)，在TaMTL-4D基因组DNA(TraesCS4D02G284700)的第775位上缺失了1个碱基(即靶点gM179上)，其他基因序列不变，得到的小麦突变体。
下述实施例中的AL-30为利用农杆菌介导法获得的Fielder转玉米花青素ZmC1(由Ubiquitin启动子驱动)基因株系(Riaz et al.,2019)。
具体如下：构建重组载体pWMB006-ZmC1，将重组载体pWMB006-ZmC1利用农杆菌介导法转入小麦Fielder中获得表达ZmC1基因的转基因小麦株系，转基因小麦株系中玉米花青素ZmC1由胚芽鞘特异Ubiquitin启动子驱动。
上述重组载体pWMB006-ZmC1为将玉米花青素ZmC1(SEQ ID NO：12)插入pWMB006载体骨架(pWMB006载体记载在如下文献：Riaz et al.Overexpression of maize ZmC1 andZmR transcription factors in wheat regulates anthocyanin biosynthesis in atissue-specific manner.International Journal of Molecular Science，2019，20：5806；)的SmaI(Thermo Fisher Scientific，FD0664)和BcuI(SpeI，Thermo FisherScientific，FD1254)酶切位点间得到的载体，玉米花青素ZmC1利用载体上的Ubiquitin启动子(SEQ ID NO：13)表达，该启动子为组成型启动子。
下述实施例中的小麦品种为Fielder(Wang et al.Generation of marker-freetransgenic hexaploid wheat via an Agrobacterium-mediated co-transformationstrategy in commercial Chinese wheat varieties.Plant Biotechnology Journal，2017，15：614-623)，公众可以从中国农科学作物研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的胚和胚乳特异性双向启动子pBD由中国农业科学院生物技术研究所柳小庆老师提供。
实施例1、含有可视化标记ZmC1基因的单倍体诱导系的创制
一、株系AL-30(含有ZmC1基因)与编辑突变体mtl-ABD杂交F2-3代的获得与检测
1、F2籽粒的获得
以含有ZmC1基因的转基因株系AL-30为母本，小麦mtl-ABD纯合突变体QD33为父本进行杂交得到F1代植株。
从F1代植株收获F2代籽粒，待F2代籽粒萌发后，选取具有紫色胚芽鞘的植株进行移栽，得到F2代植株。
2、F2代mtl-ABD纯合突变体鉴定
对F2代植株的突变类型进行鉴定，鉴定出含有ZmC1基因的mtl-ABD纯合突变体。
利用ZmC1基因、TaMTL-4A基因、TaMTL-4B基因和TaMTL-4D基因对上述F2代植株幼苗进行检测；
ZmC1基因采用PCR鉴定；
TaMTL-4A基因(扩增引物由TaMTL-4A-F和TaMTL-4A-R组成，扩增基因编辑靶点)、TaMTL-4B基因(扩增引物由TaMTL-4B-F和TaMTL-4B-R组成，扩增基因编辑靶点)和TaMTL-4D基因(扩增引物由TaMTL-4D-F和TaMTL-4D-R组成，扩增基因编辑靶点)特异性引物对筛选出的含有ZmC1基因的F2代植株进行PCR/RE检测。考虑到杂交时父本mtl-ABD的4A和4B染色体上的TaMTL基因突变类型为2个靶点间DNA片段删除，因此在对F2代植株进行PCR扩增时，可以根据TaMTL-4A和TaMTL-4B的PCR产物直接判断是否为编辑植株，无需进行酶切，只需要利用限制性内切酶PstI对TaMTL-4D的PCR产物进行酶切，筛选出ZmC1基因纯合的mtl突变体。
引物由上海Sangong公司合成；PCR所用2×Es Taq MasterMix(Dye)(CW0690L)购自CWBIO试剂公司；PstI限制性内切酶(Thermo Fisher Scientific，FD0614)购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)；基因组DNA提取的具体操作步骤按照江苏康为世纪生物科技股份有限公司生产的植物DNA提取试剂盒说明书(CW0531M NuClean PlantGenomic DNA Kit)中的描述进行操作。引物序列如下：
ZmC1-F：ATGGGGAGGAGGGCGTGTT(SEQ ID NO：1)
ZmC1-R：CTACGCAAGCTGCCCGGCC(SEQ ID NO：2)
TaMTL-4A-F：CTAGCAAACCCACCAATTAC(SEQ ID NO：3)
TaMTL-4A-R：GATCCAAGTATAAAATTAGCATAT(SEQ ID NO：4)
TaMTL-4B-F：GTCAACCGAGGTGCCGTCAGTTTG(SEQ ID NO：5)
TaMTL-4B-R：CGTCATCGCCACCATCGTCTGC(SEQ ID NO：6)
TaMTL-4D-F：TTCAATCGATGGCAAGCTACTGGG(SEQ ID NO：7)
TaMTL-4D-R：CGTCATCGCCACCATCGTCTGC(SEQ ID NO：8)
PCR具体扩增条件为：
ZmC1基因(鉴定所需引物为ZmC1-F和ZmC1-R)：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：(1)变性：95℃/30s，(2)退火：63℃/20s，(3)延伸：72℃/1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
TaMTL-4A基因(鉴定所需引物为TaMTL-4A-F和TaMTL-4A-R)：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：(1)变性：95℃/30s，(2)退火：54℃/20s，(3)延伸：72℃/1min，共36个循环；最后72℃延伸10min。
TaMTL-4B基因(鉴定所需引物为TaMTL-4B-F和TaMTL-4B-R)：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：(1)变性：95℃/30s，(2)退火：64℃/20s，(3)延伸：72℃/1min，共36个循环；最后72℃延伸10min。
TaMTL-4D基因(鉴定所需引物为TaMTL-4D-F和TaMTL-4D-R)：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：(1)变性：95℃/30s，(2)退火：64℃/20s，(3)延伸：72℃/1min，共36个循环；最后72℃延伸10min。
以F2代植株幼苗基因组DNA为模板，分别用上述引物进行扩增，得到ZmC1基因PCR扩增产物、TaMTL-4A基因PCR扩增产物、TaMTL-4B基因PCR扩增产物、TaMTL-4D基因PCR扩增产物；再将TaMTL-4D基因PCR扩增产物用PstI酶切，得到TaMTL-4D基因酶切产物。
将上述ZmC1基因PCR扩增产物、TaMTL-4A基因PCR扩增产物、TaMTL-4B基因PCR扩增产物和TaMTL-4D基因酶切产物利用1％的琼脂糖凝胶进行分析。
若含有822bp的ZmC1基因PCR扩增产物，则待测植株含有ZmC1基因；
若含有806bp的TaMTL-4A基因PCR扩增产物，且送去测序，靶点发生纯合突变，则待测植株TaMTL-4A进行基因编辑，含有TaMTL-4A纯合突变体(与父本小麦mtl-ABD纯合突变体QD33相同)；
若含有1095bp的TaMTL-4B基因PCR扩增产物，且送去测序，靶点发生纯合突变，则待测植株TaMTL-4B进行基因编辑，含有TaMTL-4B纯合突变体(与父本小麦mtl-ABD纯合突变体QD33相同)；
若含有1026bp的TaMTL-4D基因酶切产物，且送去测序，靶点发生纯合突变，则待测植株TaMTL-4D进行基因编辑，含有TaMTL-4D纯合突变体(与父本小麦mtl-ABD纯合突变体QD33相同)；
电泳结果如图1和图2所示，图1中，M：DL5000 DNA marker；1-8：ZmC1基因PCR扩增产物；图2中，a1-11：杂交F2代植株中TaMTL-4A基因PCR扩增产物；b1-11：杂交F2代植株中TaMTL-4B基因PCR扩增产物；c1：对照植株没有进行酶切的PCR扩增产物；c2：对照植株经限制性内切酶PstI酶切的PCR扩增产物；c3-c11：经限制性内切酶PstI酶切的杂交F2代植株中TaMTL-4D基因PCR扩增产物；M：DL2000 DNA marker；可以看出，共筛选出2个含有ZmC1基因、TaMTL-4B纯合突变体和TaMTL-4D纯合突变体，命名为含有ZmC1基因的mtl-BD纯合突变体。
鉴定mtl-BD纯合突变体(仅突变TaMTL-B和TaMTL-D)可以作为单倍体诱导系诱导。
3、ZmC1基因纯合的mtl-ABD纯合突变体鉴定
对上述2鉴定出的F2代中含有ZmC1基因的mtl-ABD纯合突变体植株进行单株收获，收获的籽粒按株系进行种植，得到F2-3代植株，以F2-3代植株ZmC1基因是否分离鉴定其F2代ZmC1基因的纯合性，以此来鉴定出ZmC1基因纯合的mtl-ABD纯合突变体植株：若F2-3代植株胚芽鞘为紫色，则ZmC1基因不分离，则该F2-3代植株或其对应的含有ZmC1基因的mtl-BD纯合突变体植株F2代株系均为ZmC1基因纯合的mtl-BD纯合突变体，即为ZmC1基因纯合的mtl单倍体诱导系。
二、ZmC1基因纯合的mtl单倍体诱导系的功能验证
(一)、小麦品种Fielder×ZmC1基因纯合的mtl-ABD纯合突变体的F1代中单倍体植株鉴定
以上述一制备的ZmC1基因纯合的mtl-ABD纯合突变体为父本,与小麦品种Fielder进行杂交，得到杂交F1代籽粒。
F1代籽粒萌发阶段，通过胚芽鞘颜色鉴别单倍体：具有紫色胚芽鞘的籽粒为二倍体杂交种，具有绿色胚芽鞘的籽粒为诱导出的单倍体(图3，其中，黑色箭头指示杂交种，胚芽鞘为紫色；白色箭头指示单倍体，胚芽鞘为绿色，bar＝1cm。)。
选取具有绿色胚芽鞘的F1代籽粒培育得到的植株，即为小麦单倍体植株。
(二)、小麦品种Fielder×ZmC1基因纯合的mtl-BD纯合突变体的F1代中单倍体植株的细胞遗传学验证
利用滴片法对上述F1代籽粒进行染色体数目鉴定，以验证上述鉴定方法的准确性。检测结果如图4(a：二倍体植株，具有42条染色体；b：单倍体植株，具有21条染色体)所示。具体操作步骤如下：
(1)上述(一)制备的F1代籽粒用清水浸泡过夜，萌动后转移到放有滤纸的培养皿中发芽，并将滤纸用水进行湿润。随后将培养皿放入25℃培养箱中生长，待主根长度3-4cm时取样；
(2)将提前在顶部钻有小孔的0.5mL的离心管置于冰上，用喷壶湿润。剪取1cm左右的主根放入离心管中，与籽粒对应进行编号，取完根尖后的萌发籽粒种植于花盆中；然后将装有根尖样品的离心管放入笑气罐中，进气3min左右，关闭进气阀门，处理2h后将离心管从笑气罐中取出置于冰上；
(3)用90％醋酸固定根尖5min，然后用清水清洗3次；放入70％乙醇中，置于-20℃冰箱中保存备用。
(4)用镊子将根尖取出，放在滤纸上吸干水分，在载玻片上切下根尖乳白色部分，将其放入提前准备好的酶解液中，37℃水浴50min；
(5)根尖酶解后用少量70％酒精清洗2次，加入60μL的酒精，用解剖针将根尖捣碎后溶于管内酒精。6000rpm离心2min，弃去上清液，室温倒置几分钟；
(6)向上述离心管中加入30μL的100％乙酸，置于涡旋仪上轻轻涡旋，使其充分混匀。
(7)预先准备好纸盒，用清水湿润，并在盒内放入载玻片，用移液器吸取7μL步骤6中的悬浮液，滴在载玻片上；
(8)待载玻片晾干后，于显微镜下进行染色体观察。
经过验证，在图4中a为具有紫色胚芽鞘的F1代籽粒萌发幼苗的根尖染色体，数目为42条，b为具有绿色胚芽鞘的F1代籽粒萌发幼苗的根尖染色体，数目为21条。
经过验证，通过籽粒萌发阶段胚芽鞘的颜色，鉴定小麦材料与含有ZmC1基因的mtl-BD纯合突变体的杂交F1代中单倍体籽粒的方法准确可靠。
实施例2、含有可视化标记ZmR基因和ZmC1基因的单倍体诱导系的创制
一、pBD-ZmR+ZmC1载体转基因阳性植株的鉴定
(一)、农杆菌介导的小麦遗传转化
取小麦品种Fielder开花后15d左右的幼嫩籽粒，经75％酒精灭菌1min，15％次氯酸钠灭菌5min，无菌水清洗3次。在超净工作台中剥取幼胚，将图5所示载体质粒pBD-mtp-RC通过农杆菌侵染、转化小麦幼胚，得到T0代转基因小麦。
上述质粒pBD-mtp-RC按照如下方法构建：
将玉米花青素ZmR基因(SEQ ID NO：11)插入pBD载体骨架的HindⅢ(ThermoFisher Scientific，FD0504)酶切位点，且将玉米花青素ZmC1(SEQ ID NO：12)插入pBD载体骨架的BamHⅠ(Thermo Fisher Scientific，FD0054)酶切位点，得到的载体，玉米花青素ZmC1和ZmR利用载体上的pBD启动子(SEQ ID NO：14)共表达，该启动子为胚特异表达启动子。
上述pBD载体由中国农业科学院生物技术研究所柳小庆老师提供，记载在如下文献中，在文献中的名称为pBD-mtp，Chen et al.,2022.Chen,C.,Liu,X.,Li,S.,Liu,C.,Zhang,Y.,Luo,L.,Miao,L.,Yang,W.,Xiao,Z.,Zhong,Y.,Li,J.,Chen,R.,Chen,S.,2022.Co-expression of transcription factors ZmC1 and ZmR2 establishes anefficient and accurate haploid embryo identification system in maize.PlantJ.111,1296-1307)。
上述转化方法参照Wang等的实验方法：Wang et al.2022.Wang,K.,Shi,L.,Liang,X.,Zhao,P.,Wang,W.,Liu,J.,Chang,Y.,Hiei,Y.,Yanagihara,C.,Du,L.,Ishida,Y.,Ye,X.,2022.The gene TaWOX5 overcomes genotype dependency in wheat genetictransformation.Nat.Plants 8,110–117。
(二)、T0代转基因小麦基因组DNA提取
T0代转基因小麦提取基因组DNA，提取步骤按江苏康为世纪生物科技股份有限公司生产的植物DNA提取试剂盒说明书(CW0531M NuClean Plant Genomic DNA Kit)中的描述进行操作。
(三)、T0代转基因植株检测及表型鉴定
利用ZmR基因特异性引物(由ZmR-F和ZmR-R组成)对获得的T0代转基因小麦的基因组DNA进行检测，筛选出转基因阳性植株。引物由上海Sangong公司合成；PCR所用2×Es TaqMasterMix(Dye)(CW0690L)购自CWBIO试剂公司。引物序列如下：
ZmR-F：ATGGCGCTTTCAGCTTCCC(SEQ ID NO：9)
ZmR-R：TCACCGCTTCCCTATAGCTTTGC(SEQ ID NO：10)
PCR具体扩增条件为：
ZmR基因：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：(1)变性：95℃/30s，(2)退火：60℃/20s，(3)延伸：72℃/2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
PCR产物利用1％的琼脂糖凝胶进行分析，电泳结果如图6所示，M：DNA2000marker；1-15：T0代转基因植株中ZmR基因PCR扩增产物；16：阴性对照(非转基因植株)；17：阳性对照(pBD-mtp-RC)，从图6可以看出，泳道5、6、7、11、12、14为阳性T0代转基因小麦。
(四)、T0代转基因植株表型鉴定
将阳性T0代转基因小麦在籽粒灌浆期观察表型。以Fielder植株为对照。
结果如图7所示，其中，a：对照植株Fielder(左)和pBD-mtp-RC表达载体转化T0代(右)植株表型，bar＝10cm；b：对照植株Fielder叶片、叶耳表型，bar＝1cm；c：pBD-mtp-RC表达载体T0代植株叶片表型bar＝1cm；阳性T0代转基因小麦与对照Fielder植株相比，植株表型和叶片性状都没有差异。
将阳性T0代转基因小麦在灌浆期对籽粒进行观察。以Fielder植株为对照。
结果如图8所示，a、b、c：对照植株Fielder幼嫩籽粒、幼胚和成熟籽粒；d、e、f：pBD-mtp-RC表达载体转化T0代幼嫩籽粒、幼胚和成熟籽粒，转化载体pBD-mtp-RC的阳性T0代转基因小麦幼胚部位颜色较深，离体幼胚呈深紫色，成熟胚同样呈深紫色。
将上述紫胚的阳性T0代转基因小麦记作紫胚T2代转基因小麦。
二、含有ZmR和ZmC1基因可视化标记的mtl单倍体诱导系的创制
(一)、ZmR基因和ZmC1基因纯合的mtl-ABD纯合突变体的获得
1、F2代籽粒的获得
将上述一获得的紫胚T2代转基因小麦为母本，小麦mtl-ABD纯合突变体QD33为父本进行杂交得到F1代植株。
从F1代植株收获F2代籽粒，待F2代籽粒萌发后，选取具有紫色胚的籽粒种植，得到F2代植株。
2、F2代mtl-ABD纯合突变体鉴定
对F2代植株的突变类型进行鉴定，鉴定出含有ZmC1和ZmR基因的mtl-ABD纯合突变体。
利用ZmR基因(由于ZmR和ZmC1连锁表达，只需鉴定ZmR即可)、TaMTL-4A基因、TaMTL-4B基因和TaMTL-4D基因对上述F2代植株幼苗纯合性进行检测；
ZmR基因(扩增引物由ZmR-F和ZmR-R组成)对幼苗进行检测，并进一步利用TaMTL-4A基因(扩增引物由TaMTL-4A-F和TaMTL-4A-R组成，扩增基因编辑靶点)、TaMTL-4B基因(扩增引物由TaMTL-4B-F和TaMTL-4B-R组成，扩增基因编辑靶点)和TaMTL-4D基因(扩增引物由TaMTL-4D-F和TaMTL-4D-R组成，扩增基因编辑靶点)特异性引物对筛选出的含有ZmR基因的F2代植株进行PCR/RE检测。考虑到杂交时父本mtl-ABD的4A和4B染色体上的TaMTL基因突变类型为2个靶点间DNA片段删除，因此在对F2代植株进行PCR扩增时，可以根据TaMTL-4A和TaMTL-4B的PCR产物直接判断是否为编辑植株，无需进行酶切，只需要利用限制性内切酶PstI对TaMTL-4D的PCR产物进行酶切，筛选出含有可视化标记ZmR基因和ZmC1基因的mtl-ABD纯合突变体。
引物由上海Sangong公司合成；PCR所用2×Es Taq MasterMix(Dye)(CW0690L)购自CWBIO试剂公司；PstI限制性内切酶(Thermo Fisher Scientific，FD0614)购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)；基因组DNA提取的具体操作步骤按照江苏康为世纪生物科技股份有限公司生产的植物DNA提取试剂盒说明书(CW0531M NuClean PlantGenomic DNA Kit)中的描述进行操作。引物序列如下：
ZmR-F：ATGGCGCTTTCAGCTTCCC(SEQ ID NO：9)
ZmR-R：TCACCGCTTCCCTATAGCTTTGC(SEQ ID NO：10)
TaMTL-4A-F：CTAGCAAACCCACCAATTAC(SEQ ID NO：3)
TaMTL-4A-R：GATCCAAGTATAAAATTAGCATAT(SEQ ID NO：4)
TaMTL-4B-F：GTCAACCGAGGTGCCGTCAGTTTG(SEQ ID NO：5)
TaMTL-4B-R：CGTCATCGCCACCATCGTCTGC(SEQ ID NO：6)
TaMTL-4D-F：TTCAATCGATGGCAAGCTACTGGG(SEQ ID NO：7)
TaMTL-4D-R：CGTCATCGCCACCATCGTCTGC(SEQ ID NO：8)
PCR具体扩增条件为：
ZmR基因：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：(1)变性：95℃/30s，(2)退火：60℃/20s，(3)延伸：72℃/2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
TaMTL-4A基因：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：(1)变性：95℃/30s，(2)退火：54℃/20s，(3)延伸：72℃/1min，共36个循环；最后72℃延伸10min。
TaMTL-4B基因：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：(1)变性：95℃/30s，(2)退火：64℃/20s，(3)延伸：72℃/1min，共36个循环；最后72℃延伸10min。
TaMTL-4D基因：95℃预变性5min；然后进行如下3个反应程序：(1)变性：95℃/30s，(2)退火：64℃/20s，(3)延伸：72℃/1min，共36个循环；最后72℃延伸10min。
以F2代植株幼苗基因组DNA为模板，分别用上述引物进行扩增，得到ZmR基因PCR扩增产物、TaMTL-4A基因PCR扩增产物、TaMTL-4B基因PCR扩增产物、TaMTL-4D基因PCR扩增产物；再将TaMTL-4D基因PCR扩增产物用PstI酶切，得到TaMTL-4D基因酶切产物。
将上述ZmR基因PCR扩增产物、TaMTL-4A基因PCR扩增产物、TaMTL-4B基因PCR扩增产物和TaMTL-4D基因酶切产物利用1％的琼脂糖凝胶进行分析。
若含有1833bp的ZmR基因PCR扩增产物，则待测植株含有ZmR基因；
若含有806bp的TaMTL-4A基因PCR扩增产物，且送去测序，靶点发生纯合突变，则待测植株TaMTL-4A进行基因编辑，含有TaMTL-4A纯合突变体(与父本小麦mtl-ABD纯合突变体QD33相同)；
若含有1095bp的TaMTL-4B基因PCR扩增产物，且送去测序，靶点发生纯合突变，则待测植株TaMTL-4B进行基因编辑，含有TaMTL-4B纯合突变体(与父本小麦mtl-ABD纯合突变体QD33相同)；
若含有1026bp的TaMTL-4D基因酶切产物，且送去测序，靶点发生纯合突变，则待测植株TaMTL-4D进行基因编辑，含有TaMTL-4D纯合突变体(与父本小麦mtl-ABD纯合突变体QD33相同)。
电泳结果如图9和图10所示,图9中M：DL5000 DNA marker；1-16：ZmR基因PCR扩增产物；图10中a1-a19：杂交F2代植株中TaMTL-4A基因PCR扩增产物；b1-b19：杂交F2代植株中TaMTL-4B基因PCR扩增产物；c1：对照植株没有进行酶切的PCR扩增产物；c2：对照植株经限制性内切酶PstI酶切的PCR扩增产物；c3-c19：经限制性内切酶PstI酶切的杂交F2代植株中TaMTL-4D基因PCR扩增产物；M：DL2000 DNA marker；共筛选出7棵含有ZmR和ZmC1基因的mtl-ABD纯合突变体。
3、ZmR和ZmC1基因纯合的mtl-ABD纯合突变体鉴定
对上述2鉴定出的F2代中含有ZmR和ZmC1基因的mtl-ABD纯合突变体植株进行单株收获，收获的籽粒按株系进行种植，得到F2-3代植株，以F2-3代植株ZmR和ZmC1基因是否分离鉴定其F2代ZmR和ZmC1基因的纯合性，以此来鉴定出ZmR和ZmC1基因纯合的mtl-ABD纯合突变体植株：若F2-3代植株籽粒的胚为紫色，则ZmR和ZmC1基因不分离，则该F2-3代植株或其对应的含有ZmR和ZmC1基因的mtl-ABD纯合突变体植株F2代株系均为ZmR和ZmC1基因纯合的mtl-ABD纯合突变体，即为ZmR和ZmC1基因纯合的mtl单倍体诱导系。
(二)、ZmR和ZmC1基因纯合的mtl单倍体诱导系的功能验证
以上述(一)创制的ZmR和ZmC1基因纯合的mtl-ABD纯合突变体为父本,与小麦品种Fielder进行杂交，得到杂交F1代籽粒。
通过F1代籽粒胚部位颜色鉴别单倍体：具有紫色胚的籽粒培育的植株为二倍体杂交种，具有白色胚的籽粒培育的植株为单倍体。
(三)、ZmR和ZmC1基因纯合的mtl-ABD纯合突变体作为父本诱导的小麦单倍体植株的细胞遗传学验证
利用滴片法对上述F1代籽粒培育的植株进行染色体数目鉴定，以验证上述鉴定方法的准确性。
具体操作步骤如下：
(1)小麦品种Fielder×ZmR和ZmC1基因纯合的mtl-ABD纯合突变体的F1代种子，用清水浸泡过夜，萌动后转移到放有滤纸的培养皿中发芽，并将滤纸用水进行湿润。随后将培养皿放入25℃培养箱中生长，待主根长度3-4cm时取样；
(2)将提前在顶部钻有小孔的0.5mL的离心管置于冰上，用喷壶湿润。剪取1cm左右的主根放入离心管中，与籽粒对应进行编号，取完根尖后的萌发籽粒种植于花盆中；然后将装有根尖样品的离心管放入笑气罐中，进气3min左右，关闭进气阀门，处理2h后将离心管从笑气罐中取出置于冰上；
(3)用90％醋酸固定根尖5min，然后用清水清洗3次；放入70％乙醇中，置于-20℃冰箱中保存备用。
(4)用镊子将根尖取出，放在滤纸上吸干水分，在载玻片上切下根尖乳白色部分，将其放入提前准备好的酶解液中，37℃水浴50min；
(5)根尖酶解后用少量70％酒精清洗2次，加入60μL的酒精，用解剖针将根尖捣碎后溶于管内酒精。6000rpm离心2min，弃去上清液，室温倒置几分钟；
(6)向上述离心管中加入30μL的100％乙酸，置于涡旋仪上轻轻涡旋，使其充分混匀。
(7)预先准备好纸盒，用清水湿润，并在盒内放入载玻片，用移液器吸取7μL步骤6中的悬浮液，滴在载玻片上；
(8)待载玻片晾干后，于显微镜下进行染色体观察。
结果如图11所示，a：二倍体植株，具有42条染色体；b：单倍体植株，具有21条染色体；在图11中a为具有紫色胚籽粒培育的植株的根尖染色体，数目为42条，b为具有白色胚的籽粒培育的植株的根尖染色体，数目为21条。
经过验证，通过籽粒胚部位颜色，鉴定小麦材料与ZmR和ZmC1基因纯合的mtl单倍体诱导系的杂交F1代中单倍体籽粒的方法准确可靠。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种鉴别或辅助鉴别植物单倍体诱导系的诱导后代中单倍体的方法，包括如下步骤：
1)创制表达可视化标记基因的单倍体诱导系；
所述创制的方法为将可视化标记基因及驱动其表达的启动子转移到植物单倍体纯合诱导系中，得到表达可视化标记基因的单倍体诱导系；
所述启动子为胚芽鞘特异启动子或胚特异启动子；
2)将所述表达可视化标记基因的单倍体诱导系与植物其他品种杂交，得到F1代籽粒；
3)在所述F1代籽粒的萌发阶段通过胚芽鞘颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别；
或在所述F1代籽粒的发育阶段或成熟期通过胚部位颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述在F1代籽粒的萌发阶段通过胚芽鞘颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别为选取胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒，培育，得到或候选得到单倍体小麦；
或，所述在F1代籽粒的发育阶段或成熟期通过胚部位颜色实现单倍体的鉴别或辅助鉴别为选取胚不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒，培育，得到或候选得到单倍体小麦。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述植物为小麦、玉米、水稻、大麦、谷子、番茄或拟南芥。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：
所述植物单倍体纯合诱导系为对植物基因组中单倍体诱导基因进行基因编辑，使其终止表达或突变，得到纯合单倍体诱导系。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：
所述植物为小麦，
或所述单倍体诱导基因为MTL同源基因或其他单倍体诱导基因；
或所述其他单倍体诱导基因为PLD3或DMP基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述小麦的单倍体诱导基因TaMTL-4A、TaMTL-4B、TaMTL-4D和/或诱导产生单倍体的其他TaMTL基因。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：
所述可视化标记基因为ZmC1和/或ZmR基因；
所述胚芽鞘特异启动子为Ubiquitin启动子；
所胚特异启动子为PBD；
或，所述可视化标记基因为ZmC1基因，其对应的特异启动子为Ubiquitin启动子，对应选取胚芽鞘为非紫色的F1代籽粒；
或，所述可视化标记基因为ZmC1和ZmR基因，其对应的特异启动子PBD，对应选取胚为非紫色的F1代籽粒。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：
所述创制表达可视化标记基因的单倍体诱导系的方法为将表达可视化标记基因及驱动其表达的启动子的转基因株系与小麦单倍体纯合诱导系mtl-ABD杂交，得到F1代植株，再将所述F1代植株自交后得到F2代籽粒或植株，选取具有可视化标记基因对应颜色的F2代籽粒或植株，对其进行可视化标记基因、TaMTL-4A、TaMTL-4B和TaMTL-4D基因的鉴定，选取满足如下1)和2)，或，1)和3)条件的株系，记作表达可视化标记基因的单倍体诱导系；
1)、可视化标记基因纯合；
2)、TaMTL-4A基因纯合、TaMTL-4B基因纯合和TaMTL-4D基因纯合；
3)、TaMTL-4B基因纯合和TaMTL-4D基因纯合。
9.权利要求1-8任一中胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒或植株在单倍体加倍育种中的应用；
或权利要求1-8任一中胚不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒或植株在单倍体加倍育种中的应用。
10.小麦的育种方法，为方法甲或乙：
所述方法甲包括如下步骤：选取权利要求1-8任一中胚芽鞘不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒或植株进行育种；
所述方法乙包括如下步骤：选取权利要求1-8任一中胚不具有可视化标记基因对应颜色的F1代籽粒或植株进行育种。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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