CN109392694A - 除草剂敏感型恢复系在基于雌性不育的机械化制种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明针对基于雌性不育的作物杂交种机械化制种技术，提出了一种雌性不育恢复系不育度不彻底的解决方法。利用除草剂敏感致死型雌性不育系作为恢复系亲本，应用于基于雌性不育的杂交种机械化制种中，生产的杂交种在苗期可以通过喷施相应除草剂保证作物杂交种的纯度。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

Description

除草剂敏感型恢复系在基于雌性不育的机械化制种中的应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，尤其涉及一种利用除草剂敏感致死的雌性不育恢复系亲本，应用于基于雌性不育的作物杂交种机械化制种技术的方法。

背景技术

作物杂种优势利用是广泛应用于农作物育种的现代农业技术，对提高农作物产量，解决粮食短缺这一问题有着重大的意义。在我国杂交水稻的年种植面积约1600万hm2，种子生产面积约需15万hm2，每年需商品杂交种2.4亿kg左右。我国现行杂交水稻制种整个制种过程工序繁杂，难以实现机械化，需要足够的劳动力作保证因此, 简化制种技术, 并实现机械化制种特别是混播混收制种引入杂交稻种子生产已成为目前高产制种技术研究的重要方向。目前，有不少研究者在杂交稻机械化制种方面开展各种研究与探索。其中利用转基因技术实现作物不育系的保持和繁殖很有可能在未来实现水稻混播混收机械化制种。目前这一智能不育系技术已有一定的成果，如玉米多控不育技术，水稻智能不育技术等。

无论是常规杂交制种或是智能不育技术都离不开特定的不育亲本，而这些不育亲本的不育度则直接影响到制种的质量，因此保持不育亲本材料稳定且高度不育在机械化制种中尤为重要。除草剂是现代农业生产中大规模使用的一种化学品，常用于消灭农作物田间杂草。而一些农作物品种对特定的除草剂是有抗性的，这些抗性来自于它们自身的除草剂抗性基因，如水稻对苯达松的抗性。在科学家们的不断努力下，许多除草剂抗性基因及其作用机理被揭示出来。而随着现代分子生物学技术的进步，CRISPR/Cas9基因组编辑等技术使我们能更加便捷地利用起来这些基因。CRISPR/Cas9系统中的crRNA（CRISPR-derivedRNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计将这两种改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），引导 Cas9蛋白对 DNA 的定点切割。当植物的基因组上某个基因被切割后，在有同源序列的情况下会发生同源重组修复，此种情况下可以产生基因组定点修改（Knock in）；在没有同源序列的情况下细胞会进行随机修复，此时在基因组上会随机引入插入、缺失、替换事件，从而造成基因敲除（Knock out）。这一技术使我们能快速创制除草剂敏感致死型不育亲本来解决机械化制种中制种纯度的问题。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的问题，提供除草剂敏感型恢复系在基于雌性不育的机械化制种中的应用。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：所述除草剂敏感型恢复系在基于雌性不育的机械化制种中的应用是利用除草剂敏感致死型雌性不育系作为恢复系亲本，应用于基于雌性不育的杂交种机械化制种中，得到除草剂敏感致死型雌性不育系作物。

优选地，所述除草剂敏感致死型雌性不育系中的除草剂抗性基因包括但不限于BEL基因等。获得除草剂敏感致死型雌性不育系的方法包括但不限于自然突变、人工诱变、基因组编辑等。所述作物为单子叶作物或双子叶作物。所述单子叶作物或双子叶作物为水稻、玉米、油菜、谷子、小麦、辣椒等。

基于上述应用而使野生型除草剂抗性基因发生任何缺失、插入、替换等修饰后产生的核酸。含有上述核酸的细胞系。上述核酸或细胞系课应用于机械化制种。

所述获得除草剂敏感致死型雌性不育恢复系的方法包括如下步骤：

（1）构建水稻BEL基因CRISPR/Cas9敲除载体，所述BEL基因序列如SEQ ID NO.1所示。

（2）将上述载体导入雌性不育ptb1突变体的BEL基因，获得雌性不育纯合bel突变体A 。

（3）对突变体A自交后代进行分子检测，筛选没有转基因插入片段的突变体B。

（4）将水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因表达盒的水稻表达载体转入突变体B中，获得除草剂敏感致死型杂合工程雌性不育系。

下面对本发明作进一步说明：

本发明要解决的技术问题在于提供了一种利用除草剂敏感致死的雌性不育恢复系亲本，应用于基于雌性不育的作物杂交种机械化制种技术的方法。另外，一种利用除草剂抗性基因的功能敲除解决不育亲本败育不彻底的方法及其在机械化制种中的应用，还提供了苯达松抗性基因的核酸序列以及判断植物是否采用本发明方法获得的鉴定方法。

具体而言，本发明提供了获得除草剂敏感致死型雌性不育恢复系的方法包括如下步骤：

（1）构建水稻BEL基因CRISPR/Cas9敲除载体，所述BEL基因序列如SEQ ID NO.1所示。

（2）将上述载体导入雌性不育ptb1突变体的BEL基因，获得雌性不育纯合bel突变体A 。

（3）对突变体A自交后代进行分子检测，筛选没有转基因插入片段的突变体B。

（4）将水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因表达盒的水稻表达载体转入突变体B中，获得苯达松除草剂敏感致死型杂合工程雌性不育系

在第二方面，本发明所述获得除草剂敏感致死型雌性不育植株的方法中所提到植物基因功能敲除的技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术，包括但不限于CRISPR/Cas9基因编辑系统。

在第三方面，本发明所述获得除草剂敏感致死型雌性不育植株的方法中所提到基因功能敲除包括目的基因发生任何缺失、插入、替换等修饰后产生的功能缺失。

在第四方面，本发明提供了植物可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物。在本发明的具体实施方式中，本发明优选植物是水稻，更优选是水稻恢复系，具有雌性不育特性的水稻恢复系。

在第五方面，本发明提供了前述各方面在机械化制种中的应用，将携带雌性可育基因、花粉致死基因和筛选标记基因3个紧密连锁的基因表达盒的载体转入第四方面所述的植物，其转入方法包括但不限于转基因技术（该方法已被ZL 2014 1 0116096.8的发明专利公开）、杂交等，从而应用到机械化制种中。

本发明针对基于雌性不育的作物杂交种机械化制种技术，提出了利用除草剂敏感致死型雌性不育系作为恢复系亲本，应用于基于雌性不育的杂交种机械化制种中，生产的杂交种在苗期可以通过喷施相应除草剂保证作物杂交种的纯度。

本发明取得的有益效果在于雌性不育恢复系不育度不彻底的解决方法。利用基因组编辑技术敲除雌性不育亲本中的BEL基因可以快速的获得对除草剂敏感致死的雌性不育材料，通过导入水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因连锁表达盒，可以获得杂合的除草剂敏感致死型雌性不育水稻。解决机械化制种中雌性不育水稻败育不彻底和繁殖技术难题，实现杂交稻种子生产的混播混收。繁殖时，雌性不育水稻虽为转基因水稻，但面积不大，易于隔离。制种时，可以箱式播插，也可以混播，父母本都不含有转基因成分，不会造成转基因的扩散漂移，有利于生物安全；收获时，可以混收，杂交种子也不含有转基因成分。生产的杂交种在苗期可以通过喷施相应除草剂保证作物杂交种的纯度。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1是Cas9敲除载体结构示意图；

图2是bel突变体与野生型受体品种靶位点测序序列比对结果；

图3是bel突变体除草剂敏感性实验；

图4是转基因植株育性检测；

图5是除草剂敏感型亲本的测试（左）和混播混收机械化制种现场图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步描述，但不因此限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、利用基因组编辑技术获得对除草剂敏感致死的雌性不育材料

一、利用CRISPR/Cas9 技术编辑水稻野生型BEL基因。

1、目标基因靶位点选择和双链接头设计

在BEL目标基因的突变区域找到任意NGG（PAM）的位置，上游第20碱基是A（用U3启动子）或G (用U6a~c启动子）的序列 (A，G分别为U3和U6启动子的转录起始碱基），优先选为靶序列。在MBKbase和RIGWR上分别与R498和9311基因组进行靶标特异性检查，BEL设计2个靶标：靶标1：gagagaatggcaataatgt（SEQ ID NO.2）靶标2：gtggaggtgtcccaggatc（SEQ ID NO.3）；

根据靶位点序列分别合成两条携带接头的引物Bel-Y1和Bel-B2（接头序列与经Bsa I酶切后的载体粘性末端互补），本研究设计的接头引物序列如下：

bel-Y1引物

bel-Y1(+):cagtGGTCTCaggcagagagaatggcaataatgt（SEQ ID NO.4） bel-Y1(-):cagtGGTCTCaaaacacattattgccattctctc（SEQ ID NO.5）

bel-B2引物

bel-B2(+):cagtGGTCTCagttggtggaggtgtcccaggatc（SEQ ID NO.6） bel-B2(-):cagtGGTCTCaaaacgatcctgggacacctccac（SEQ ID NO.7）

2.构建中间载体

（1）引物变性、退火，得到gRNA片段。PCR体系：H₂0: 40μl， 正向引物5μl，反向引物5μl。PCR 程序：95℃ 10min，55℃ 10min，14℃ 5min。

（2）酶切连接

酶切连接体系：gRNA片段 2μl，PBWD(LB)-DNAi空载 1.5μl，ECO31I 0.5μl，T4-ligase0.5μl，T4-buffer 1μl，加ddH₂O至 10μl。把配置好的体系置于37℃ 培养箱约2h左右。

（3）重组质粒转化

(1) 取一管200 μL大肠杆菌感受态细胞DH5a与5 μL连接产物混合，冰浴30 min；

(2) 迅速置于42 ℃恒温水浴锅中，热激90 s，冰浴2 min；

(3) 加入500 μL LB液体培养基，混匀；

(4) 37 ℃、200 rpm,培养45 min，使细胞恢复正常生长状态；

(5) 将菌液均匀涂布于LB固体培养基平板上；

(6) 30 min后，置37 ℃恒温培养箱，过夜培养。

（4）菌检及质粒抽提验证

根据本实验室经验，构建的中间载体不需要经过菌检，可以直接挑斑摇菌，准确率达99%，然后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，把抽提的质粒各送2个单克隆，测序

（5）按照bel-Y1和bel-B2的连接顺序进行靶标酶切连接

酶切体系： PBWA(V)HU-cas9pl空载 1μl，Bel-Y1(质粒) 1.5μl， LguI 0.5μl，T4-ligase 0.5μl，T4-buffer 1μl，加ddH₂O至10μl。把配置好的体系置于37℃培养箱2h后转化。

双靶标酶切连接体系： bel-Y1-1(质粒) 1μl ，Bel-B2(质粒) 1.5μl，LguI：0.5ul，T4-ligase 0.5μl，T4-buffer 1μl,加ddH₂O至10μl。把配置好的体系置于37℃培养箱2h,转化,菌检。挑取正确的单克隆接菌，抽提质粒，送测序。

3.重组菌的获得

将构建正确的Cas9敲除植物表达载体（图1）使用电激法转化农杆菌EHA105。导入方法采用电激转化方法，主要参考bio-rad公司的电击仪使用说明书进行，具体步骤如下：

将储存于-80℃的EHA105感受态细胞取出放在冰上冻融，1mm电击杯放在冰上预冷，把冻存的SOC放置在37℃解冻。将干净的EP离心管插在冰上预冷，一般EP离心管的数目比要转化的样品多两个，一个用来做阴性对照（没有加入DNA）、另一个做阳性对照（加入1μl的10ng/μl pUC19）。分别吸取1μl要转化的DNA样品放入预冷的EP离心管中，然后将融化的EHA105感受态细胞20μl轻轻取出放入预冷的离心管底部，轻轻的将两者混匀，尽量不要产生气泡，离心管底部不要用手接触，避免温度变化对感受态转化效率造成影响，操作过程尽量的快。设置转化参数，电阻200Ω，电容25 μF，电压1800 V，电激杯规格1 mm，BioRad电激仪一般有推荐使用的参数。轻轻吸取感受态和DNA混合物，放入电激杯中，轻敲使混合物均匀的分布于杯底。盖上盖子放入电激槽中，关上安全盖，按下电激红色按钮，待电激完成后，将在37℃预热好的SOC放入电激杯中，将混合物旋起，用吸头将混合物转入摇菌管中，于28℃恒温摇床， 180rpm, 2 h。取50 μl菌液涂布在含卡那霉素（50 μg/mL）和利福平（25 μg/mL）的LB固体培养基上，28℃暗培养2 d，挑取农杆菌转化子单菌落，接种到添加了相同抗生素的LB液体培养基中，28℃条件下，振荡培养2 d。取适量菌液加入等体积的50%浓度的无菌甘油混合，于-80℃条件下保存、备用。

4、农杆菌介导的遗传转化

挑选Cas9敲除植物表达载体农杆菌单菌落接种于含50mg/L kanamycin的LB培养基上26℃暗培养2天后，用NB-AS液体培养基洗下农杆菌菌体，28℃ 180rpm 液体振荡培养90-120分钟。调整菌落浓度至OD600为0.8～1.0，即可用于转化。

转化水稻受体明恢86纯合ptb1突变体，水稻种子消毒，挑选子粒饱满的种子，用75%的酒精浸泡30S，倒掉酒精，无菌水冲洗一遍，用HgCl2消毒8min，无菌水清洗2遍，每次浸泡1Min，用无菌水浸泡1h。消毒后的种子接种到诱导培养基上，光照下生长7d。

将无菌愈伤集中在一起。放入农杆菌悬浮液中，浸泡5-10min，取出，用滤纸晾干。接种到共培养培养基，共培养2天，将共培养的愈伤，清洗6遍，并用滤纸晾干后接种到具潮霉素抗性的筛选培养基上45天。

将抗性愈伤转移到分化培养基上，培养2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随之根也长出。将幼苗转移到含生根培养基的小三角瓶内，每瓶一株，继续光照培养，待小植株长至7-10 cm 左右时进行室内炼苗，3～4 d 后将其移栽到土壤中生长。

5.bel突变体的检测

T0代转基因水稻采用CTAB法抽提DNA。在基因敲除靶位点两侧设计特异引物进行PCR检测，并送样测序（图2），图2仅为其中一种突变情况。根据测序结果挑选纯合bel突变体T0代。

6.转基因水稻除草剂敏感性性状考察

分别在转基因和非转基因对照组水稻叶片上涂抹合适浓度的苯达松，观察叶片情况的变化（图3）。

7.转基因片段的去除

纯合bel突变体T0代自交后代通过测序的方法筛选出无转基因片段的ptb1和bel双纯合突变体。

实施例2 将雌性不育材料应用于杂交稻的机械化制种

一、携带水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因表达盒的水稻表达载体构建

在表达载体pCAMBIA1300上，插入3个表达盒；野生型PTB1表达盒、花粉致死的淀粉酶基因ZM-AA1表达盒，荧光筛选标记基因RFP表达盒。野生型PTB1携带有自身的启动子和终止子；淀粉酶基因ZM-AA1表达盒元件包括：玉米的花粉发育后期特异性启动子PG47、玉米的转运肽ZM-BT1、玉米的淀粉酶基因编码序列ZM-AA1、玉米的终止子IN2-1；红色荧光蛋白基因RP表达盒元件包括：玉米的种子特异性启动子END2、载体pLj02上的RP编码序列、马铃薯的终止子PINⅡ。所构建载体利用电激法导入农杆菌菌株EHA105用于水稻遗传转化。

二、转基因水稻的获得

用携带水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因表达盒的水稻表达载体转化ptb1和bel双纯合突变体。愈伤组织与农杆菌的共培养2天后，从中挑选颜色鲜黄的转入选择培养基上培养一周，用体式荧光显微镜筛选带有红色荧光的转化愈伤组织，观察转化效率，筛选第15天对发荧光的愈伤组织进行第一次分切，将发荧光的细胞团切成0.1-0.2mm大小，转移至新的筛选培养基，筛选第30天，第二次分切，尽量分成独立转化的细胞团。筛选第45天，第三次分切。分切三次后的愈伤在筛选培养基上长至>0.2mm时，转移到分化培养基，分化苗长到4 cm 左右时转到生根培养基诱导生根，待小植株长至7-10 cm左右时进行室内炼苗， 3～4 d 后将其移栽到土壤中生长。

三、转基因植株的分子检测

1.采用CTAB法对T0代转基因水稻进行DNA抽提。

2.对T0代转基因水稻DNA进行分子检测。

T0代转基因水稻采用CTAB法抽提DNA。在基因敲除靶位点两侧设计特异引物进行PCR检测，并送样测序。

四、转基因水稻植株的育性考察

1.对经过分子鉴定的转基因植株考察花粉育性和结实情况。取开花时的花药，经常规的I2-KI染色后，观察其花粉粒情况（图4）。

2.水稻苯达松敏感致死型雌性不育恢复系用于繁殖制种。

水稻苯达松敏感致雌性不育恢复系的繁殖。将携带杂合转基因的水稻雌性不育恢复系自交。自交种子通过对红色荧光的光电分选，可以筛选出具有红色荧光的杂合种子，用于进一步繁殖或制种。所获得雌性不育系亲本展示了对本达松敏感的极好效果（图5左）。

水稻苯达松敏感致死型雌性不育恢复系应用于杂交稻制种。因为父本（恢复系）为雌性不育系，因此制种时可以箱式栽插，也可以混播混收（图5右）。父母本按照一定的比例均匀混合，一次播种，能够像常规水稻那样进行育秧和大田栽培管理，可以直播、抛秧、机插等。待成熟后喷施除草剂进行机械化收割，收获的均为杂交水稻种子。在杂交水稻种子育秧时，可喷洒合适浓度的苯达松，使育种纯度达到百分之百。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 除草剂敏感型恢复系在基于雌性不育的机械化制种中的应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5372

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggcgttct tgggatgggc ggtcgacatc gcccgcgact ccggcgcgtc gagctccgtc 60

gtgctcacct gcgacggcta cggctcggcg ctctacttct cgccgtggga cagtgtcccg 120

cttccggcga cagcttcccc cgacgacggc ttcctgctgc cgcgtttccc ggacgtctgc 180

gtgcagcgct cgcaattcac caaccacctc gcgccggcca acggcactgg cggcggcggc 240

tcaagaacgg gcgtcaagga ggaagcgagc gaggtgagca ccgggttggg gtgcttgcgg 300

ccggtgcgcg ggcggccagc ggttcttggc ggcgggatac gtccccggct gcctcctcct 360

ctctcccacg ccgccgtgcc tcgcctccca cgccgcggcg gcacaccggg gacgccgccg 420

ccgtgcgcct cgcctcgccg gggacgccgc cgccgtgtgt cgatttgttg ccgggcacgg 480

gcggcgcgag ggcacgagct ccacagtgcg agaaaagcag ccgtttcctc acctcgcgag 540

agaaggatgc gcgcggctca gtttggcgac gaggtgctct ccactggcgc gcaccctccc 600

tccacgcaag gccgagtcct acgtggcacc ccatagcacc ggtccagctg tgtgcactgt 660

gagaggcctc aaatactcca aggtaccaca cggtatttct atttccgatc acgacctatg 720

taatcaacct gttgtgttgt gagcgtgtgt gcctgatttg gttgcctgca ggtgttgtcc 780

tggccaccga cttcgaagca atctgtgcgc cggttggagg tggcggagca ctggtaccga 840

ctctacaaga cggacaatca acgggtacca caatccggct ccacctcgac gcgattgcgg 900

caaccacgaa aacctcacgc tccaatctgt gccctccgcc cgtgctcgct gcatctcgtg 960

ccaccgtctc ggactctcga tcctcatggc ctgaattatc ctaattcttc gttaccagtt 1020

tttttgagac taatatgact cccatcaaac aatgcagttg agagtgagtt cttacctgta 1080

ttatatagta cattgtattt aaaccatagt acatggggac agtggtgcgt tcatcaattt 1140

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taggttacct tcactttagg ttcctaaatt tatcactaag tctgaaattt atccctaaac 1380

caaaatacca ggtacaacgg atccctcaat ctacaaaact caatcaccca agattgtaga 1440

tagtattatg tccggtttta actgacgtgt caagttgagt taacgtggaa tctatgcggg 1500

ccccacatgt aagtggctag tacttttttc cacgttggac gaaaccgtct cccaaaccac 1560

taaaggaggc gatatgcacc gattttgata gatgggggag acgttatacc ctgttttatt 1620

atcaagagat gtgattcaac caggagcaag agttgagaga gcaagaatag acttattcgt 1680

gagcccacag gctaaacccg ccacggccca cagactaagc ccgccaactc gggccgttcg 1740

gcccagtttg cacgcatggt gggccggaaa ctggaatctc cgaaccgcaa cggaatcgac 1800

gacatctgta gccacagcgc gcactcgacg gcgggcagct tcgtcactgg ttcgagctgt 1860

ctgctgactc aacgacgaac acacgtactc ctgctcggtt tcttcctccg tgtcgcacaa 1920

aagtcaaatt gctctctatt agtattcatt attagcactt caaacctttc tttacgtttt 1980

aaacgaacca actaatcagg ttatgaggac tataataatc gaatccaggg atcttgctgg 2040

aagcaattga ataatcgccc aacgattgag ttcatttctt gtctccaaag ctgtctcctg 2100

atagtcaaca ggtctcggtc ctcgcagagt cgcactgcga tttggcctct ggaaactgga 2160

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cttccaggta cgtagcaatt gaatacggaa tactctctcc gtttaaaacg tttgattatt 2280

ttcctaatca aactttatca tgtttgacca aatttataga aaaaaataac aacatcttaa 2340

atataaaatt agtataacta aatctagcat tggatatact ttcataatat ttgtttgttt 2400

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tcatctcctt ctagaagcac aagcgccgct cggtataaag gcagacgcat tgtcacaaat 2700

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gtcgccgggg tgcgccaggg agtgcttcac cgagcacgac gtgaccttcg cgaaccggcc 3060

caggttcgag tcgcagctgc tggtctcgtt caacggcgcc gcgctcgcca cggcgagcta 3120

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cgtcggcctc atgtcggggc tcatcgccgg cgaggtccgc gccatggtgc ggaggatgta 3240

ccgcgccgcg gccgcgtccc ccgccggcgc cgcgcgcatc cagctgaagc ggaggctgtt 3300

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gatcatcccg cacatcggcg cggccaacct gtgggactac ttgccggcgc tccggtggtt 3480

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tcgccgcctg atcgacgcgg agcggcggag gctggacgac ggcgacgagg gcgagaagaa 3600

gagcatgatc gccgtgctgc tcactctgca gaagacagag ccggaggtgt acaccgataa 3660

catgatcaca gctctaacgg cggtgagttc atcttctgct gttttacctt tctgatatct 3720

gaattctctc attggtgcgt aatttttttt ttttggctgt catcggtata gctttcttaa 3780

gcactcagta gccttgcaat tataaaaaga aaaacaatca gtagcttttt acatgctttg 3840

agtcagtcag tagcagtgtg gcactatcag cattcagcag tattcatgtt gtttgctaat 3900

cactatcatg gtttgagtca gcacaatcag tagcttttga catggtttga gtcagcagta 3960

tcttttctag gaactgaatt agttattcat ttagtacaac ttgtttgtct gtctattgat 4020

tgctttaaat tatttcttct atgcaaccct ctaatcctag tatagtacta gccttttata 4080

tgaagaatca tcaataattt tcttctcact ttcagtgtag ctttacttaa tgaatatttt 4140

gaaagatcgc ctagttgcct tattataatt gtataaaagg aaaacaatca gtagcctttt 4200

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gactattcaa cccgggcgat taaaatcctt ctcccaaatt tgtattcttt gttttttcct 4320

caaaaattca ccaaactctt ggaactatta tagttcagtt ttagacaaaa aaaaaatgaa 4380

atcttagttc caccctcttg ccgtgcagaa cttgttcgga gcaggaacag agacaacctc 4440

gacgacatca gaatgggcga tgtcgctact gctgaaccac cccgacacac tcaagaaagc 4500

gcaagccgag atcgacgcat ccgtcggcaa ctctcgcctg atcaccgccg acgacgtgac 4560

tcgcctcggc tacctccagt gcatcgtcag ggagacgctc cgcctgtacc ccgccgcgcc 4620

gatgctcctc ccgcacgagt cctccgccga ctgcaaggtc ggcggctaca acatcccgcg 4680

cgggtcgatg ttgctcatca acgcgtacgc catccaccgt gacccggcgg tgtgggagga 4740

gccggagaag ttcatgccgg agaggttcga ggacggcggg tgcgacggca atctcttgat 4800

gccgttcggg atggggaggc ggaggtgccc cggcgagacg ctggcgctgc gcacagtggg 4860

gttggtgctg ggcacgctga tccagtgctt cgactgggag agggtcgacg gcgtggaggt 4920

cgacatgact gaaggtggcg ggctcaccat ccccaaggtc gtgccgttgg aggccatgtg 4980

caggccgcgc gacgccatgg gtggtgttct tcgcgagctc gtctgaatat tttttggcgg 5040

cgtttgcatc tccaggacga actcatgtat tgaaagcacc aaaagtaagt agcaaataag 5100

cttctcgtga gcatacacat aacacatgtg agcttgtaat gtggaataaa ttacacgtag 5160

aggatttgga agagagtgac tgcgctagca atcgctcttt gagagttgtg ttttacagtt 5220

ttagtgagga accaatttgt atgaatgtgc aataatcatg tataaagtat aattgtacac 5280

gccaggtatt tcaatttcat attgcttgtg tgatgtatgc gttcgaatac tatacagtca 5340

acaaaagaga acaaaattac tatgagctta ta 5372

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gagagaatgg caataatgt 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

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<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cagtggtctc aggcagagag aatggcaata atgt 34

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

cagtggtctc aaaacacatt attgccattc tctc 34

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

cagtggtctc agttggtgga ggtgtcccag gatc 34

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<211> 34

<212> DNA

<213> 人工合成

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Claims (9)

1.除草剂敏感型恢复系在基于雌性不育的机械化制种中的应用，其特征在于，所述应用是利用除草剂敏感致死型雌性不育系作为恢复系亲本，应用于基于雌性不育的杂交种机械化制种中，得到除草剂敏感致死型雌性不育系作物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述除草剂敏感致死型雌性不育系中的除草剂抗性基因包括但不限于BEL基因。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，获得除草剂敏感致死型雌性不育系的方法包括但不限于自然突变、人工诱变、基因组编辑。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述作物为单子叶作物或双子叶作物。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单子叶作物或双子叶作物为水稻、玉米、油菜、谷子、小麦、辣椒。

6.基于权利要求1所述应用而使野生型除草剂抗性基因发生任何缺失、插入、替换等修饰后产生的核酸。

7.含有权利要求6所述核酸的细胞系。

8.如权利要求6所述的核酸或权利要求7所述的细胞系在机械化制种中的应用。

9.获得除草剂敏感致死型雌性不育恢复系的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）构建水稻BEL基因CRISPR/Cas9敲除载体，所述BEL基因序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）将上述载体导入雌性不育ptb1突变体的BEL基因，获得雌性不育纯合bel突变体A ；

（3）对突变体A自交后代进行分子检测，筛选没有转基因插入片段的突变体B；

（4）将水稻雌性可育基因、花粉致死基因和荧光筛选标记基因3个基因表达盒的水稻表达载体转入突变体B中，获得除草剂敏感致死型杂合工程雌性不育系。