CN111850035B - 通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法 - Google Patents

通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法，包括如下步骤：将抑制植物除草剂抗性基因表达的元件，与育性恢复基因、花粉致死基因和荧光标记基因构建四元连锁表达载体，转化入对对应类型除草剂具有抗性的不育系中，获得对对应类型除草剂敏感的繁殖系；繁殖系自交结实，采用对应类型除草剂对色选机筛选得到的不育系种子进行除杂，去除色选漏检的含有四元转基因元件的繁殖系种子。该方法可以杀死色选漏检的含有转基因成分的繁殖系，可以百分之百规避第三代杂交水稻制种或机械化混播混收制种使用不育系因色选漏检带来的杂交制种及获得的杂交种子转基因污染风险，操作简单、高效。

Description

通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子 的方法
技术领域
本发明属于杂交水稻育种技术领域，尤其涉及一种通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法。
背景技术
我国水稻杂种优势利用技术的发展经历了三个时代。第一代杂交水稻是以细胞质(核质互作)雄性不育系为遗传工具的三系法杂交水稻，三系不育系育性稳定，但杂交配组受恢保关系局限。第二代杂交水稻是以光温敏核不育系为遗传工具的两系法杂交水稻，克服了父母本组配不自由的问题；但因不育系育性受外界光温条件影响存在制种失败的风险。第三代杂交水稻以普通核不育系(即遗传工程核不育系)作为遗传工具利用杂种优势，克服了第一代、第二代技术存在的技术瓶颈，兼具有不育系育性稳定、配组自由双重优点，是杂交水稻技术发展方向。
第三代杂交水稻技术彻底克服了当前两系杂交水稻存在制种风险的问题，并且提高了杂交水稻不育系育种效率，能够更充分利用亚种间杂种优势；而利用雌性不育恢复系的杂交稻机械化制种方法(CN201410116096.8)，可实现制种的全程机械化，降低了杂交水稻种子生产成本。这两项技术都是杂交水稻新一代的技术，其技术关键是利用转基因技术解决雄/雌不育亲本自身的繁殖问题，并经过色选机筛出不含转基因成分的雄/雌性不育亲本种子用于制种，确保制种过程中亲本不含任何转基因成分，是这两项技术在生产上应用的前提。然而在实际色选过程中，由于色选机器存在一定的色选误差，不育系中不可避免地掺杂进含有转基因的繁殖系，这对不育系进一步杂交制种带来了转基因污染的风险。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法，以提高第三代杂交水稻不育系及其杂交种子的纯度。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法，包括如下步骤：
(1)将抑制植物除草剂抗性基因表达的元件，与育性恢复基因、花粉致死基因和荧光标记基因构建含有四元转基因元件的四元连锁表达载体；
(2)将所述步骤(1)得到的四元连锁表达载体转化入对对应类型除草剂具有抗性的不育系中，获得对对应类型除草剂敏感的繁殖系；
(3)使所述步骤(2)得到的繁殖系自交结实，其自交后代中包括含有所述四元转基因元件的繁殖系和不含所述四元转基因元件的不育系，经过色选机筛选，将发荧光的繁殖系种子与不发荧光的不育系种子分开；
(4)采用对应类型除草剂对所述步骤(3)色选机筛选后的不育系种子进行除杂，去除色选漏检的含有所述四元转基因元件的繁殖系种子。
上述的方法，优选的，所述植物除草剂抗性基因为水稻OsHIS1基因，其对应类型除草剂为β三酮类除草剂，所述β三酮类除草剂包括磺草酮(Sulcotrione)、硝磺草酮(Mesotrione)、双环磺草酮(benzobicylon)、环磺酮(tembotrione)和呋喃磺草酮(tefuryltrione)中的任意一种或几种。OsHis1基因是水稻内源基因，它赋予水稻对β-三酮类除草剂抗性，该基因功能缺失后，并不会对水稻正常生长造成影响，但会使水稻对β-三酮类除草剂敏感。
优选的，所述步骤(1)中，所述抑制植物除草剂抗性基因表达的元件包括基于CRISPR/dCas9系统的CRISPRi沉默元件或基于RNAi沉默技术RNAi沉默元件。CRISPRi(聚类的规则间隔的短回文重复序列干扰)是利用无活性的dCas9蛋白和可定制的单个向导RNA(sgRNA)共表达，dCas9与转录阻遏物结构域的偶联可以强有力地沉默多个目标内源基因的表达。
更优选的，所述CRISPRi沉默元件由所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链通过酶切连接反应连入载体pHdzCas9-KRAB后得到，所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
更优选的，所述RNAi沉默元件由植物除草剂抗性基因的CDS序列和其反向互补序列以及Linker序列通过酶切连接反应一起连入RNAi沉默载体pEGRNAi后得到，所述CDS序列和其反向互补序列之间由Linker序列隔开；所述CDS序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向互补序列如SEQ ID NO.4所示，所述Linker序列如SEQ ID NO.5所示。
优选的，所述步骤(1)中，所述四元连锁表达载体通过重组反应得到，其反应过程如下：包含育性恢复基因、花粉致死基因和荧光标记基因的三元连锁表达载体400ng，插入抑制植物除草剂抗性基因表达的元件120ng，5×CE II Buffer 4μl，Exnase II2μl，加ddH2O至20μl，然后37℃下反应30min。
优选的，所述步骤(1)中，若所述不育系为雄性不育系，所述育性恢复基因包括EAT1(Os04g0599300，基因序列如SEQ ID NO.6所示)、PTC1(Os09g0449000，基因序列如SEQID NO.13所示)、TDR(Os02g0120500，基因序列如SEQ ID NO.14所示)或CYP704B2(Os03g0168600，基因序列如SEQ ID NO.15所示)；若所述不育系为雌性不育系，所述育性恢复基因为PTB1(Os05g0145000，基因序列如SEQ ID NO.16所示)。
更优选的，所述花粉致死基因元件包括如SEQ ID NO.7所示的Pg47启动子序列、如SEQ ID NO.1所示的ZMAA1基因cDNA序列和如SEQ ID NO.8所示的IN2-1终止子序列。
更优选的，所述荧光标记基因元件包括如SEQ ID NO.9所示的1tp启动子序列、如SEQ ID NO.2所示的DsRed基因cDNA序列和如SEQ ID NO.10所示的PINII终止子序列。
优选的，所述步骤(2)中，所述四元连锁表达载体通过农杆菌介导转化入对对应类型除草剂具有抗性的不育系中；所述步骤(3)中，所述自交后代中含有的所述四元转基因元件的繁殖系和不含所述四元转基因元件的不育系数量各占一半。
优选的，所述步骤(4)中，采用对应类型除草剂对色选机筛选得到的不育系种子进行去除的方式具体包括：采用对应类型除草剂对所述不育系种子进行包衣、在不育系种子浸种催芽过程中添加对应类型除草剂或在不育系种子播种、种植后进行田间喷施对应类型除草剂。
本发明的技术方案是基于以下原理：将抑制植物除草剂抗性基因表达的元件、育性恢复基因元件、花粉致死基因元件和荧光标记基因元件4个紧密连锁的基因元件转入不育系得到携带转基因的繁殖系杂合单株，携带转基因的杂合单株在自交结实过程中，携带转基因的花粉粒因花粉致死基因的作用使其败育而不能参与受精，而没有携带转基因的花粉粒与雌配子(携带转基因和未携带转基因的雌配子各一半)正常受精而结实，得到携带转基因的繁殖系和未携带转基因的不育系后代。由于携带转基因的繁殖系中还含有荧光标记基因，能够通过色选技术进行识别分选，将发荧光的繁殖系种子与不发荧光的不育系种子初步分开。然而，由于色选技术存在一定误差，色选后仍然会在不育系中掺杂进含有转基因的繁殖系，此时由于携带转基因的繁殖系中含有抑制植物除草剂抗性基因表达的元件，使得繁殖系对对应类型除草剂敏感，通过采用对应类型除草剂喷施、浸种或进行包衣处理，可以高效去除掺杂进不育系中的转基因繁殖系，进而提高了不育系(雌、雄性不育父母本)及其杂交种子的纯度。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明在原有三元载体的基础上，增加一个抑制植物除草剂抗性基因表达的元件，形成四元连锁表达载体转化不育系，通过加入对应类型的除草剂，杀死色选漏检的含有转基因成分的繁殖系，提高不育系(雌、雄性不育父母本)及其杂交种子的纯度，除杂过程效率高，用于第三代杂交水稻制种或机械化混播混收制种，可以有效规避因色选漏检带来的杂交制种转基因污染风险。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的操作流程示意图；
图2是OsHIS1-RNAi沉默元件pEGRNAiPubi-H-OsHIS1的结构示意图；
图3是OsHIS1-CRISPRi沉默元件pHdzCas9-KRAB-OsHIS1的结构示意图；
图4是植物三元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA的结构示意图；
图5是四元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA-OsHisRNAi的结构示意图；
图6是四元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA-OsHisCRISPRi的结构示意图；
图7是植物三元连锁表达载体pDsRed-PTB-ZMAA的结构示意图；
图8是四元连锁表达载体pDsRed-PTB-ZMAA-OsHisRNAi的结构示意图；
图9是四元连锁表达载体pDsRed-PTB-ZMAA-OsHisCRISPRi的结构示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)设计引物扩增水稻OsHIS1(Os02g0280700)中CDS片段(如SEQ ID NO.3所示)、反向互补序列(如SEQ ID NO.4所示)与人工合成的Linker序列(如SEQ ID NO.5所示，北京擎科公司)，分别扩增以上三个片段；
a)扩增水稻OsHIS1中CDS片段的引物为(下划线引物为扩增SEQ ID NO.3的正反引物，下划线之前的序列为内切酶Bsa1(NEB公司)识别位点与接头)：
OsHIS1-RNAi-1F：Actag ggtctcGcaccGAGAGTTTTTCAACCAACCAATC(如SEQ IDNO.17所示)，
OsHIS1-RNAi-1R：Actag ggtctcTGCAGCTGAAAGATTCAGGATGGTCAGG(如SEQ IDNO.18所示)；
b)扩增反向互补序列的引物为(下划线引物为扩增SEQ ID NO.4的正反引物，下划 线之前的序列为内切酶Bsa1(NEB公司)识别位点与接头)：
OsHIS1-RNAi-2F：Actag ggtctcGGCTT CTGAAAGATTCAGGATGGTCAGG(如SEQ IDNO.19所示)，
OsHIS1-RNAi-2R：Actag ggtctcTACCG GAGAGTTTTTCAACCAACCAATC(如SEQ IDNO.20所示)；
c)扩增Linker序列的引物为(下划线引物为扩增SEQ ID NO.5的正反引物，下划线之前的序列为内切酶Bsa1(NEB公司)识别位点与接头)：
Linker-F：Actag ggtctcGCTGC AGGTAAATTTCTAGTTTTTCTC(如SEQ ID NO.21所示)，
Linker-R：Actag ggtctcTAAGC TTCTGTAACTATCATCATCA(如SEQ ID NO.22所示)；
PCR反应体系为：2x PCR buffer 25μl，2mM dNTPs 10μl，F-Primer：1.5μl，R-Primer：1.5μl，KOD FX：1μl，Template：1μl，加ddH2O至50μl；
PCR反应程序：
(2)将扩增后得到的三个片段通过酶切-连接反应一起连入RNAi沉默载体pEGRNAi(武汉艾迪晶生物科技有限公司)，水稻OsHIS1的CDS片段和反向互补序列的之间由Linker序列隔开，构建成pEGRNAiPubi-H-OsHIS1(如图2)，即得到OsHIS1-RNAi沉默元件；
酶切-连接反应体系：10×CutSmart Buffer1.5μl，10mM ATP1.5μl，空载质粒30ng，干扰片段30ng/每个片段，BsaI-HF10U，T4 DNA ligase35U，H2O最终15μl；
(3)设计引物包含插入载体位置同源臂，以pEGRNAiPubi-H-OsHIS1载体质粒为模板，扩增OsHIS1-RNAi沉默元件，同时设计引物扩增植物三元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA(图4，由湖南杂交水稻研究中心袁定阳课题提供，CN110250000A，含有育性恢复基因PTC1元件、花粉致死基因ZMAA1元件、荧光标记基因DsRed元件)，其中，育性恢复基因PTC1的序列(如SEQ ID NO.13所示)元件包括PTC1自身启动子序列、编码区基因组序列和终止子序列；花粉致死基因ZMAA1元件包括Pg47启动子(如SEQ ID NO.7所示)、ZMAA1基因cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)和IN2-1终止子序列(如SEQ ID NO.8所示)；荧光标记基因DsRed元件包括1tp启动子序列(如SEQ ID NO.9所示)、DsRed基因cDNA序列(如SEQ ID NO.2所示)和PINII终止子序列(如SEQ ID NO.10所示)；
a)扩增OsHIS1-RNAi沉默元件引物(下划线部分为插入载体位置同源臂)：
正向引物：5'-ACCGAGCTCGAATTCGACCGGTGCAGCGTGACCCGGTC-3'(如SEQ ID NO.23所示)，
反向引物：5'-AGCTTGTCGATCGACAGATCATCTAGTAACATAGATGACACCGCG-3'(如SEQ IDNO.24所示)；
b)扩增线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体引物(下划线部分与插入序列两端同源)：
正向引物：5'-GATCTGTCGATCGACAAGCTCG-3'(如SEQ ID NO.25所示)，
反向引物：5'-CGGTCGAATTCGAGCTCGG-3'(如SEQ ID NO.26所示)；
分别扩增OsHIS1-RNAi沉默元件与线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体，PCR反应体系为：2x PCR buffer 25μl，2mM dNTPs 10μl，F-Primer：1.5μl，R-Primer：1.5μl，KOD FX：1μl，Template：1μl，加ddH2O至50μl；
PCR反应程序：
(4)利用同源重组方法(ClonExpress II One Step Cloning Kit，VazymeBiotech)将OsHis-RNAi沉默元件通过重组反应连入线性化的pDsRed-PTC-ZMAA中，构建成四元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA-OsHisRNAi(如图5)；
重组反应：线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体400ng，插入片段OsHis-RNAi沉默元件120ng，5×CE II Buffer 4μl，Exnase II2μl，加ddH2O至20μl，37℃30min；
(5)将步骤(4)得到的四元连锁表达载体通过农杆菌介导转化入抗β三酮类除草剂的细胞核雄性不育系水稻，获得对β三酮类除草剂敏感的遗传工程繁殖系；
(6)繁殖系自交结实，其自交后代中包括含有四元转基因元件的繁殖系和不含四元转基因元件的细胞核雄性不育系，数量各占一半，经过色选机筛选，将所述繁殖系与所述细胞核雄性不育系的种子分开；
(7)在水稻种衣剂里加入体积比1％的硝磺草酮(山东先达农化股份有限公司)，用搅拌机对色选后得到的细胞核雄性不育系种子进行包衣，让每一粒种子均匀被种衣剂包裹，然后浸种48h，37℃催芽12h，在此过程中，色选中漏检的繁殖系全部被硝磺草酮除草剂杀死除杂，随机抽取正常长出的植株1000株叶片样本，送华智生物科技有限公司检测转基因成分，所有样本100％为不含转基因成分的雄性不育系；将该雄性不育系种子进行第三代杂交制种，可规避因色选漏检带来的杂交制种转基因污染风险。
实施例2：
一种通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)设计水稻OsHIS1(Os02g0280700)基因CIRSPRi的靶点(由北京擎科生物科技公司合成)：
ggcaATGGCTGACGAGTCATGGA(如SEQ ID NO.11所示)，
aaacTCCATGACTCGTCAGCCAT(如SEQ ID NO.12所示)；
(2)将步骤(1)中合成的互补配对的两条核苷酸单链等量混合后，经过90℃变性3min和20℃退火5min后形成具有粘性末端的靶点双链，用Bsa1酶切CRISPRi沉默载体pHdzCas9-KRAB(购于addgene公司后经水稻启动子改造，http：//www.addgene.org/)，然后将靶点双链通过酶切连接反应连入pHdzCas9-KRAB载体，构建成pHdzCas9-KRAB-OsHIS1(如图3)，即得到OsHIS1-CRISPRi沉默元件；
酶切连接反应：10×CutSmart Buffer1.5μl，10mM ATP1.5μl，pHdzCas9-KRAB30ng，靶点双链30ng/每个片段，BsaI-HF 10U，T4 DNA ligase 35U，H2O最终15μl；
(3)设计引物包含插入载体位置同源臂，以pHdzCas9-KRAB-OsHIS1载体质粒为模板，扩增OsHIS1-CRISPRi沉默元件，同时设计引物扩增植物三元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA(图4，由湖南杂交水稻研究中心袁定阳课题提供，CN110250000A，含有育性恢复基因PTC1元件、花粉致死基因ZMAA1元件、荧光标记基因DsRed元件)，其中，育性恢复基因PTC1的序列(如SEQ ID NO.13所示)元件包括PTC1自身启动子序列、编码区基因组序列和终止子序列；花粉致死基因ZMAA1元件包括Pg47启动子(如SEQ ID NO.7所示)、ZMAA1基因cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)和IN2-1终止子序列(如SEQ ID NO.8所示)；荧光标记基因DsRed元件包括1tp启动子序列(如SEQ ID NO.9所示)、DsRed基因cDNA序列(如SEQ ID NO.2所示)和PINII终止子序列(如SEQ ID NO.10所示)；
a)扩增OsHIS1-CRISPRi沉默元件引物(下划线部分为插入载体位置同源臂)：
正向引物：5'-ACCGAGCTCGAATTCGACCGCCTGCAGGTCAACATGGTGG-3'(如SEQ IDNO.27所示)，
反向引物：5'-AGCTTGTCGATCGACAGATCAGCACCGACTCGGTGCCA-3'(如SEQ ID NO.28所示)；
b)扩增线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体引物(下划线部分与插入序列两端同源)：
正向引物：5'-GATCTGTCGATCGACAAGCTCG-3'(如SEQ ID NO.29所示)，
反向引物：5'-CGGTCGAATTCGAGCTCGG-3'(如SEQ ID NO.30所示)；
分别扩增OsHIS1-CIRPSRi沉默元件与线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体，PCR反应体系为：2x PCR buffer25μl，2mM dNTPs 10μl，F-Primer：1.5μl，R-Primer：1.5μl，KOD FX：1μl，Template：1μl，加ddH2O至50μl；
PCR反应程序：
(4)利用同源重组方法(ClonExpress II One Step Cloning Kit，VazymeBiotech)将OsHis-CRISPRi沉默元件通过重组反应连入线性化的pDsRed-PTC-ZMAA中，构建成四元连锁表达载体pDsRed-PTC-ZMAA-OsHisCRISPRi(如图6)；
重组反应：线性化pDsRed-PTC-ZMAA载体400ng，插入片段OsHis-CRISPRi沉默元件240ng，5×CE II Buffer 4μl，Exnase II 2μl，加ddH2O至20μl，37℃30min；
(5)将步骤(4)得到的四元连锁表达载体通过农杆菌介导转化入抗β三酮类除草剂的细胞核雄性不育系水稻，获得对β三酮类除草剂敏感的遗传工程繁殖系；
(6)繁殖系自交结实，其自交后代中包括含有四元转基因元件的繁殖系和不含四元转基因元件的细胞核雄性不育系，数量各占一半，经过色选机筛选，将所述繁殖系与所述细胞核雄性不育系的种子分开；
(7)在水稻种衣剂里加入体积比1％的硝磺草酮(山东先达农化股份有限公司)，用搅拌机对色选后得到的细胞核雄性不育系进行包衣，让每一粒种子均匀被种衣剂包裹，然后浸种48h，37℃催芽12h，在此过程中，色选中漏检的繁殖系全部被硝磺草酮除草剂杀死除杂，随机抽取正常长出的植株1000株叶片样本，送华智生物科技有限公司检测转基因成分，所有样本100％为不含转基因成分的雄性不育系，进行第三代杂交制种，可规避因色选漏检带来的杂交制种转基因污染风险。
实施例3：
一种通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)设计引物扩增水稻OsHIS1(Os02g0280700)中CDS片段(如SEQ ID NO.3所示)、反向互补序列(如SEQ ID NO.4所示)与人工合成的Linker序列(如SEQ ID NO.5所示，北京擎科公司)，分别扩增以上三个片段；
a)扩增水稻OsHIS1中CDS片段的引物为(下划线引物为扩增SEQ ID NO.3的正反引物，下划线之前的序列为内切酶Bsa1(NEB公司)识别位点与接头)：
OsHIS1-RNAi-1F：Actag ggtctcGcacc GAGAGTTTTTCAACCAACCAATC(如SEQ IDNO.17所示)，
OsHIS1-RNAi-1R：Actag ggtctcTGCAG CTGAAAGATTCAGGATGGTCAGG(如SEQ IDNO.18所示)；
b)扩增反向互补序列的引物为(下划线引物为扩增SEQ ID NO.4的正反引物，下划 线之前的序列为内切酶Bsa1(NEB公司)识别位点与接头)：
OsHIS1-RNAi-2F：Actag ggtctcGGCTT CTGAAAGATTCAGGATGGTCAGG(如SEQ IDNO.19所示)，
OsHIS1-RNAi-2R：Actag ggtctcTACCG GAGAGTTTTTCAACCAACCAATC(如SEQ IDNO.20所示)；
c)扩增Linker序列的引物为(下划线引物为扩增SEQ ID NO.5的正反引物，下划线之前的序列为内切酶Bsa1(NEB公司)识别位点与接头)：
Linker-F：Actag ggtctcGCTGC AGGTAAATTTCTAGTTTTTCTC(如SEQ ID NO.21所示)，
Linker-R：Actag ggtctcTAAGC TTCTGTAACTATCATCATCA(如SEQ ID NO.22所示)；
PCR反应体系为：2x PCR buffer 25μl，2mM dNTPs 10μl，F-Primer：1.5μl，R-Primer：1.5μl，KOD FX：1μl，Template：1μl，加ddH2O至50μl；
PCR反应程序：
(2)将扩增后得到的三个片段通过酶切-连接反应一起连入RNAi沉默载体pEGRNAi(武汉艾迪晶生物科技有限公司)，水稻OsHIS1的CDS片段和反向互补序列的之间由Linker序列隔开，构建成pEGRNAiPubi-H-OsHIS1(如图2)，即得到OsHIS1-RNAi沉默元件；
酶切-连接反应体系：10×CutSmart Buffer1.5μl，10mM ATP1.5μl，空载质粒30ng，干扰片段30ng/每个片段，Bsa I-HF10U，T4 DNA ligase35 U，H2O最终15μl；
(3)设计引物包含插入载体位置同源臂，以pEGRNAiPubi-H-OsHIS1载体质粒为模板，扩增OsHIS1-RNAi沉默元件，同时设计引物扩增植物三元连锁表达载体pDsRed-PTB-ZMAA(如图7，含有育性恢复基因PTB1元件、花粉致死基因ZMAA1元件、荧光标记基因DsRed元件)，其中，育性恢复基因PTB1的序列(如SEQ ID NO.16所示)元件包括PTB1自身启动子序列、编码区基因组序列和终止子序列；花粉致死基因ZMAA1元件包括Pg47启动子(如SEQ IDNO.7所示)、ZMAA1基因cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)和IN2-1终止子序列(如SEQ ID NO.8所示)；荧光标记基因DsRed元件包括1tp启动子序列(如SEQ ID NO.9所示)、DsRed基因cDNA序列(如SEQ ID NO.2所示)和PINII终止子序列(如SEQ ID NO.10所示)；
a)扩增OsHIS1-RNAi沉默元件引物(下划线部分为插入载体位置同源臂)：
正向引物：5'-ACCGAGCTCGAATTCGACCGGTGCAGCGTGACCCGGTC-3'(如SEQ ID NO.23所示)，
反向引物：5'-AGCTTGTCGATCGACAGATCATCTAGTAACATAGATGACACCGCG-3'(如SEQ IDNO.24所示)；
b)扩增线性化pDsRed-PTB-ZMAA载体引物(下划线部分与插入序列两端同源)：
正向引物：5'-GATCTGTCGATCGACAAGCTCG-3'(如SEQ ID NO.25所示)，
反向引物：5'-CGGTCGAATTCGAGCTCGG-3'(如SEQ ID NO.26所示)；
分别扩增OsHIS1-RNAi沉默元件与线性化pDsRed-PTB-ZMAA载体，PCR反应体系为：2x PCR buffer 25μl，2mM dNTPs 10μl，F-Primer：1.5μl，R-Primer：1.5μl，KOD FX：1μl，Template：1μl，加ddH2O至50μl；
PCR反应程序：
(4)利用同源重组方法(ClonExpress II One Step Cloning Kit，VazymeBiotech)将OsHis-RNAi沉默元件通过重组反应连入线性化的pDsRed-PTB-ZMAA中，构建成四元连锁表达载体pDsRed-PTB-ZMAA-OsHisRNAi(如图8)；
重组反应：线性化pDsRed-PTB-ZMAA载体400ng，插入片段OsHis-RNAi沉默元件120ng，5×CE II Buffer 4μl，Exnase II 2μl，加ddH2O至20μl，37℃30min；
(5)将步骤(4)得到的四元连锁表达载体通过农杆菌介导转化入抗β三酮类除草剂的细胞核雌性不育系水稻，获得对β三酮类除草剂敏感的遗传工程繁殖系；
(6)繁殖系自交结实，其自交后代中包括含有四元转基因元件的繁殖系和不含四元转基因元件的细胞核雌性不育系，数量各占一半，经过色选机筛选，将所述繁殖系与所述细胞核雌性不育系的种子分开；
(7)在水稻种衣剂里加入体积比1％的硝磺草酮(山东先达农化股份有限公司)，用搅拌机对色选后得到的细胞核雌性不育系进行包衣，让每一粒种子均匀被种衣剂包裹，然后浸种48h，37℃催芽12h，在此过程中，色选中漏检的繁殖系全部被硝磺草酮除草剂杀死除杂，随机抽取正常长出的植株1000株叶片样本，送华智生物科技有限公司检测转基因成分，所有样本100％为不含转基因成分的雌性不育系；将该雌性不育系(父本)种子进行机械化混播混收，可规避因色选漏检带来的杂交制种转基因污染风险。
实施例4：
一种通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)设计水稻OsHIS1(Os02g0280700)基因CIRSPRi的靶点(由北京擎科生物科技公司合成)：
ggcaATGGCTGACGAGTCATGGA(如SEQ ID NO.11所示)，
aaacTCCATGACTCGTCAGCCAT(如SEQ ID NO.12所示)；
(2)将步骤(1)中合成的互补配对的两条核苷酸单链等量混合后，经过90℃变性3min和20℃退火5min后形成具有粘性末端的靶点双链，用Bsa1酶切CRISPRi沉默载体pHdzCas9-KRAB(购于addgene公司后经水稻启动子改造，http://www.addgene.org/)，然后将靶点双链通过酶切连接反应连入pHdzCas9-KRAB载体，构建成pHdzCas9-KRAB-OsHIS1(如图3)，即得到OsHIS1-CRISPRi沉默元件；
酶切连接反应：10×CutSmart Buffer 1.5μl，10mM ATP1.5μl，pHdzCas9-KRAB30ng，靶点双链30ng/每个片段，BsaI-HF 10U，T4 DNA ligase 35U，H2O最终15μl；
(3)设计引物包含插入载体位置同源臂，以pHdzCas9-KRAB-OsHIS1载体质粒为模板，扩增OsHIS1-CRISPRi沉默元件，同时设计引物扩增植物三元连锁表达载体pDsRed-PTB-ZMAA(如图7，含有育性恢复基因PTB1元件、花粉致死基因ZMAA1元件、荧光标记基因DsRed元件)，其中，育性恢复基因PTB1的序列(如SEQ ID NO.16所示)元件包括PTB1自身启动子序列、编码区基因组序列和终止子序列；花粉致死基因ZMAA1元件包括Pg47启动子(如SEQ IDNO.7所示)、ZMAA1基因cDNA序列(如SEQ ID NO.1所示)和IN2-1终止子序列(如SEQ ID NO.8所示)；荧光标记基因DsRed元件包括1tp启动子序列(如SEQ ID NO.9所示)、DsRed基因cDNA序列(如SEQ ID NO.2所示)和PINII终止子序列(如SEQ ID NO.10所示)；
a)扩增OsHIS1-CRISPRi沉默元件引物(下划线部分为插入载体位置同源臂)：
正向引物：5'-ACCGAGCTCGAATTCGACCGCCTGCAGGTCAACATGGTGG-3'(如SEQ IDNO.27所示)，
反向引物：5'-AGCTTGTCGATCGACAGATCAGCACCGACTCGGTGCCA-3'(如SEQ ID NO.28所示)；
b)扩增线性化pDsRed-PTB-ZMAA载体引物(下划线部分与插入序列两端同源)：
正向引物：5'-GATCTGTCGATCGACAAGCTCG-3'(如SEQ ID NO.29所示)，
反向引物：5'-CGGTCGAATTCGAGCTCGG-3'(如SEQ ID NO.30所示)；
分别扩增OsHIS1-CIRPSRi沉默元件与线性化pDsRed-PTB-ZMAA载体，PCR反应体系为：2x PCR buffer 25μl，2mM dNTPs10μl，F-Primer：1.5μl，R-Primer：1.5μl，KOD FX：1μl，emplate：1μl，加ddH2O至50μl；
PCR反应程序：
(4)利用同源重组方法(ClonExpress II One Step Cloning Kit，VazymeBiotech)将OsHis-CRISPRi沉默元件通过重组反应连入线性化的pDsRed-PTB-ZMAA中，构建成四元连锁表达载体pDsRed-PTB-ZMAA-OsHisCRISPRi(如图9)；
重组反应：线性化pDsRed-PTB-ZMAA载体400ng，插入片段OsHis-CRISPRi沉默元件240ng，5×CE II Buffer 4μl，Exnase II 2μl，加ddH2O至20μl，37℃30min；
(5)将步骤(4)得到的四元连锁表达载体通过农杆菌介导转化入抗β三酮类除草剂的细胞核雌性不育系水稻，获得对β三酮类除草剂敏感的遗传工程繁殖系；
(6)繁殖系自交结实，其自交后代中包括含有四元转基因元件的繁殖系和不含四元转基因元件的细胞核雌性不育系，数量各占一半，经过色选机筛选，将所述繁殖系与所述细胞核雌性不育系的种子分开；
(7)在水稻种衣剂里加入体积比1％的硝磺草酮(山东先达农化股份有限公司)，用搅拌机对色选后得到的细胞核雌性不育系进行包衣，让每一粒种子均匀被种衣剂包裹，然后浸种48h，37℃催芽12h，在此过程中，色选中漏检的繁殖系全部被硝磺草酮除草剂杀死除杂，随机抽取正常长出的植株1000株叶片样本，送华智生物科技有限公司检测转基因成分，所有样本100％为不含转基因成分的雌性不育系，用这种雌性不育系(父本)进行机械化混播混收，可规避因色选漏检带来的杂交制种转基因污染风险。
本发明的实施例1-4，将抑制OsHIS1基因表达元件(OsHIS1-CRISPRi沉默元件或OsHIS1-RNAi沉默元件)，与育性恢复基因、花粉致死基因、荧光标记基因，构建四元连锁表达载体，并转化抗β三酮类除草剂的雄/雌不育系获得对β三酮类除草剂敏感的繁殖系，经过色选获得的亲本种子在萌发过程通过加入β三酮类除草剂杀死色选漏检的含有转基因成分的繁殖系，以规避因色选漏检带来的杂交制种转基因污染风险。
序列表
<110> 湖南杂交水稻研究中心
<120> 通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1488
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 1
atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60
ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120
gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180
gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcggcctg cggcctggtc 240
caggcacaag tcctcttcca ggggtttaac tgggagtcgt gcaagcagca gggaggctgg 300
tacaacaggc tcaaggccca ggtcgacgac atcgccaagg ccggcgtcac gcacgtctgg 360
ctgcctccac cctcgcactc cgtctcgcca caaggctaca tgccaggccg cctatacgac 420
ctggacgcgt ccaagtacgg cacggcggcg gagctcaagt ccctgatagc ggcgttccac 480
ggcaggggcg tgcagtgcgt ggcggacatc gtcatcaacc accggtgcgc ggaaaagaag 540
gacgcgcgcg gcgtgtactg catcttcgag ggcgggactc ccgacgaccg cttggactgg 600
ggccccggga tgatctgcag cgacgacacg cagtactcgg acgggacggg gcaccgcgac 660
acgggcgagg ggttcgcggc ggcgcccgac atcgaccacc tcaacccgcg cgtgcagcgg 720
gagctctccg cctggctcaa ctggctcagg tccgacgccg tggggttcga cggctggcgc 780
ctcgacttcg ccaagggcta ctcgccggcc gtcgccagaa tgtacgtgga gagcacgggg 840
ccgccgagct tcgtcgtcgc ggagatatgg aactcgctga gctacagcgg ggacggcaag 900
ccggcgccca accaggacca gtgccggcag gagctgctgg actggacgcg ggccgtcggc 960
gggcccgcca tggcgttcga cttccccacc aagggcctgc tgcaggcggg cgtgcagggg 1020
gagctgtggc ggctgcgcga cagctccggc aacgcggccg gcctgatcgg gtgggcgccc 1080
gagaaggccg tcaccttcgt cgacaaccat gacaccgggt cgacgcagaa gctctggccg 1140
ttcccatccg acaaggtcat gcagggctac gcctacatcc tcacccatcc aggagtcccc 1200
tgcattttct acgaccacat gttcgactgg aacctgaagc aggagatatc cacgctgtct 1260
gccatcaggg cgcggaacgg catccgcgcc gggagcaagc tgcggatcct cgtggcggac 1320
gcggacgcgt acgtggccgt cgtcgacgag aaggtcatgg tgaagatcgg gacaaggtac 1380
ggcgtgagca gcgtggtccc gtcggatttc cacccggcgg cgcacggcaa ggactactgc 1440
gtctgggaga aagcgagcct ccgcgtcccg gcggggcgcc acctctag 1488
<210> 2
<211> 678
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 2
atggcctcct ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60
accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120
cacaacaccg tgaagctgaa ggtgacgaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180
ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240
gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300
gacggcggcg tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360
aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420
atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480
acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540
tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600
atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660
caccacctgt tcctgtag 678
<210> 3
<211> 205
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 3
gagagttttt caaccaacca atcgaacgga agcaaaaatt cagcaacttg atcgatggca 60
agaacttcca gattcaaggg tatggaactg accgggtggt tacccaagat cagatcctgg 120
actggtctga tcggttgcat ctcagagttg aacccaagga ggagcaagat cttgccttct 180
ggcctgacca tcctgaatct ttcag 205
<210> 4
<211> 205
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 4
ctgaaagatt caggatggtc aggccagaag gcaagatctt gctcctcctt gggttcaact 60
ctgagatgca accgatcaga ccagtccagg atctgatctt gggtaaccac ccggtcagtt 120
ccataccctt gaatctggaa gttcttgcca tcgatcaagt tgctgaattt ttgcttccgt 180
tcgattggtt ggttgaaaaa ctctc 205
<210> 5
<211> 202
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgcaggtaa atttctagtt tttctccttc attttcttgg ttaggaccct tttctctttt 60
tatttttttg agctttgatc tttctttaaa ctgatctatt ttttaattga ttggttatgg 120
tgtaaatatt acatagcttt aactgataat ctgattactt tatttcgtgt gtctatgatg 180
atgatgatag ttacagaagc tt 202
<210> 6
<211> 1395
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 6
atgattgttg gggctggtta ctttgaggat tcccacgatc aaagtctcat ggcaggatct 60
ttgatccatg actcaaatca agctcctgca agcagtgaaa acacaagcat tgatttgcag 120
aaattcaaag tgcacccgta ctcaacagaa gctctctcga atacggccaa tctagctgaa 180
gctgcaagag caattaacca ccttcaacat caactagaaa ttgatttgga gcaagaggtt 240
cccccagtag aaactgcaaa ctgggatcca gctatctgca ctataccaga tcatatcatc 300
aaccatcagt ttagcgaaga tccacaaaac atattggtgg agcaacagat ccagcagtat 360
gattctgcac tttatccaaa tggtgtttac acacctgcac cagatctcct taatcttatg 420
cagtgcacaa tggctccagc attcccggca acgacatccg tattcggtga cacaacactg 480
aatggtacta actatttgga tcttaacggt gaacttacag gagtagcagc ggttccagac 540
agtgggagtg ggttgatgtt tgctagtgat tcagctctcc agttagggta ccatggtact 600
caatctcatc taataaagga tatctgccac tcgttgcccc aaaattatgg gttgtttccc 660
agtgaggacg aacgagatgt gattattggt gttggaagtg gagatctttt tcaggagata 720
gatgacaggc agtttgatag tgtacttgaa tgcaggagag ggaagggtga gttcggaaag 780
ggcaagggaa aagctaattt tgcaactgag agagagaggc gggagcagct aaatgtgaag 840
ttcaggaccc taagaatgct cttcccaaat cctaccaaga atgacagggc ctcaatagta 900
ggtgatgcca ttgagtatat agatgagctc aatcgaacag tgaaggagct gaagatcctg 960
gtggaacaga agaggcatgg aaataacagg agaaaggtgt taaagttgga tcaagaggca 1020
gccgctgatg gcgagagctc atcgatgagg ccagtgaggg atgatcaaga caatcagctc 1080
catggagcca taaggagctc atgggttcag aggaggtcaa aggaatgcca cgttgatgtc 1140
cgcatagtgg acgatgaagt aaacatcaag ctcactgaaa agaagaaggc caactctctg 1200
cttcatgcag caaaggttct agatgagttc cagctcgagc ttatccatgt agtgggtggg 1260
attataggtg atcaccatat attcatgttc aacactaagg tatcagaagg ttcggcggtt 1320
tatgcatgtg cagtggcaaa gaagctcctt caagcagtgg acgtgcaaca ccaggccctc 1380
gacatattca actaa 1395
<210> 7
<211> 2717
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 7
ggcataccag acagtccggt gtgccagatc agggcaccct tcggttcctt tgctcctttg 60
cttttgaacc ctaactttga tcgtttattg gtttgtgttg aacctttatg cacctgtgga 120
atatataatc tagaacaaac tagttagtcc aatcatttgt gttgggcatt caaccaccaa 180
aattatttat aggaaaaggt taaaccttat ttccctttca atctccccct ttttggtgat 240
tgatgccaac acaaaccaaa gaaaatatat aagtgcagaa ttgaactagt ttgcataagg 300
taagtgcata ggttacttag aattaaatca atttatactt ttacttgata tgcatggttg 360
ctttctttta ttttaacatt ttggaccaca tttgcaccac ttgttttgtt ttttgcaaat 420
ctttttggaa attctttttc aaagtctttt gcaaatagtc aaaggtatat gaataagatt 480
gtaagaagca ttttcaagat ttgaaatttc tccccctgtt tcaaatgctt ttcctttgac 540
taaacaaaac tccccctgaa taaaattctc ctcttagctt tcaagagggt tttaaataga 600
tatcaattgg aaatatattt agatgctaat tttgaaaata taccaattga aaatcaacat 660
accaatttga aattaaacat accaatttaa aaaatttcaa aaagtggtgg tgcggtcctt 720
ttgctttggg cttaatattt ctcccccttt ggcattaacg gccaaaaaac ggagactttg 780
tgagccattt atactttctc cccattggta aatgaaatat gagtgaaaga ttataccaaa 840
tttggacagt gatgcggagt gacggcgaag gataaacgat accgttagag tggagtggaa 900
gccttgtctt cgccgaagac tccatttccc tttcaatcta cgacttagca tagaaataca 960
cttgaaaaca cattagtcgt agccacgaaa gagatatgat caaaggtata caaatgagct 1020
atgtgtgtaa tgtttcaatc aaagtttcga gaatcaagaa tatttagctc attcctaagt 1080
ttgctaaagg ttttatcatc taatggtttg gtaaagatat cgactaattg ttctttggtg 1140
ctaacataag caatctcgat atcacccctt tgttggtgat ccctcaaaaa gtgataccga 1200
atgtctatgt gcttagtgcg gctgtgttca acgggattat ccgccatgca gatagcactc 1260
tctcattgtc acataggaga gggactttgc tcaatttgta gccatagtcc ctaaggtttt 1320
gcctcatcca aagtaattgc acacaacaat gtcctgcggc aatatacttg gcttcggcgg 1380
tagaaagagc tattgagttt tgtttctttg aagtccaaga caccagggat ctccctagaa 1440
actgacaagt ccctgatgtg ctcttcctat caattttaca ccctgcccaa tcggcatctg 1500
aatatcctat taaatcaaag gtggatccct tggggtacca aatttaagga gtgtaaacta 1560
aatatctcat gattcttttc acggccctaa ggtgaacttc cttaggatcg gcttggaatc 1620
ttgcacacat gcatatagaa agcatactat ctggtcgaga tgcacataaa tagagtaaag 1680
atcctatcat cgaccggtat accttttggt ctacggattt acctcccgtg tcgaggtcga 1740
gatgcccatt agttcccatg ggtgtcctga tgggcttggc atccttcatt ccaaacttgt 1800
tgagtatgtc ttgaatgtac tttgtttggc tgatgaaggt gccatcttgg agttgcttga 1860
cttgaaatcc tagaaaatat ttcaacttcc ccatcataga catctcgaat ttcggaatca 1920
tgatcctact aaactcttca caagtagatt tgttagtaga cccaaatata atatcatcaa 1980
cataaatttg gcatacaaac aaaacttttg aaatggtttt agtaaagaga gtaggatcgg 2040
ctttactgac tctgaagcca ttagtgataa gaaaatctct taggcattca taccatgctg 2100
ttggggcttg cttgagccca taaagcgcct ttgagagttt ataaacatgg ttagggtact 2160
cactatcttc aaagccgaga ggttgctcaa catagaccta ttcaccccat ttgatcactt 2220
ttttggtcct tcaggatcta atagttatgt ataatttaga gtctcttgtt taatggccag 2280
atatttctaa ttaatctaag aatttatgat attttttaat tttttatcat gtctgatgag 2340
aattaacata aaggctcaat tgggtcctga attaataata gagtgaaaat taatccagag 2400
gctctattag aaccttcaat tagtaatacc aagatatata taagatagta gagtatagtt 2460
taaatgttgg cattgttcat tctttctttt gttatttaat ttatgctttc cacggtggtt 2520
agtggttact tctgaagggt ccaaataatg catgaagagt ttgaggacaa gaagtctgcc 2580
ctaaaaatag cgatgcaaag gcatggtgtc caagccatac atatagcgca ctaattttat 2640
cagcagaaca atggtattta taggtcctag tgcccaggca acaagagaca cgaataaagc 2700
atcgatcacg acaagat 2717
<210> 8
<211> 294
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 8
gagttgaatg tttgatcaat aaaatacggc aatgctgtaa gggttgtttt ttatgccatt 60
gataatacac tgtactgttc agttgttgaa ctctatttct tagccatgcc aagtgctttt 120
cttattttga ataacattac agcaaaaagt tgaaagacaa aaaaaaaaac ccccgaacag 180
agtgctttgg gtcccaagct tctttagact gtgttcggcg ttccccctaa atttctcccc 240
ctatatctca ctcacttgtc acatcagcgt tctctttccc cctatatctc cacg 294
<210> 9
<211> 816
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 9
aaccgtctct tcgtgagaat aaccgtggcc taaaaataag ccgatgagga taaataaaat 60
gtggtggtac agtacttcaa gaggtttact catcaagagg atgcttttcc gatgagctct 120
agtagtacat cggacctcac atacctccat tgtggtgaaa tattttgtgc tcatttagtg 180
atgggtaaat tttgtttatg tcactctagg ttttgacatt tcagttttgc cactcttagg 240
ttttgacaaa taatttccat tccgcggcaa aagcaaaaca attttatttt acttttacca 300
ctcttagctt tcacaatgta tcacaaatgc cactctagaa attctgttta tgccacagaa 360
tgtgaaaaaa aacactcact tatttgaagc caaggtgttc atggcatgga aatgtgacat 420
aaagtaacgt tcgtgtataa gaaaaaattg tactcctcgt aacaagagac ggaaacatca 480
tgagacaatc gcgtttggaa ggctttgcat cacctttgga tgatgcgcat gaatggagtc 540
gtctgcttgc tagccttcgc ctaccgccca ctgagtccgg gcggcaacta ccatcggcga 600
acgacccagc tgacctctac cgaccggact tgaatgcgct accttcgtca gcgacgatgg 660
ccgcgtacgc tggcgacgtg cccccgcatg catggcggca catggcgagc tcagaccgtg 720
cgtggctggc tacaaatacg taccccgtga gtgccctagc tagaaactta cacctgcaac 780
tgcgagagcg agcgtgtgag tgtagccgag tagatc 816
<210> 10
<211> 297
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 10
tggccaactt aattaatgta tgaaataaaa ggatgcacac atagtgacat gctaatcact 60
ataatgtggg catcaaagtt gtgtgttatg tgtaattact agttatctga ataaaagaga 120
aagagatcat ccatatttct tatcctaaat gaatgtcacg tgtctttata attctttgat 180
gaaccagatg catttcatta accaaatcca tatacatata aatattaatc atatataatt 240
aatatcaatt gggttagcaa aacaaatcta gtctaggtgt gttttgcgaa tgcggcc 297
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggctgacg agtcatgga 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tccatgactc gtcagccat 19
<210> 13
<211> 2040
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 13
atggcgccta agatggtgat cagcctgggg agctcgcggc ggcggaagcg cggcgagatg 60
ctgttccggt tcgaggcctt ctgccagccc ggctacccgg cgaacttcgc cggcgccggc 120
ggcttcaggg acaacgtgag gacgctgctc ggcttcgcgc acctggaggc cggcgtccac 180
ggcgagacca agtgctggtc gttccagctc gagctgcacc gccacccccc caccgtcgtg 240
aggctcttcg tcgtcgagga ggaggtcgcc gcctcgccgc accgccagtg ccacctctgc 300
cgccatattg ggtgggggag gcatctgata tgcagcaaga ggtatcactt cttgctgccg 360
aggagggaat cggcggcgga agccgacggc ctgtgcttcg cgatcaacca cggcggcggc 420
ggtggcgcgg agaaagcgtc gtcgaaaggg acgacgacga cggcctccag cagaggccac 480
ctgctacacg gcgtcgtgca cctcaacggc tacggccacc tcgtcgccct ccacggcctc 540
gagggcggct ccgacttcgt ctccggccac cagatcatgg acctctggga ccgcatttgc 600
tcagccttgc acgtaaggac ggtgagcctg gtggacacgg cgaggaaggg ccacatggag 660
ctgaggctgc tgcacggcgt cgcgtacggc gagacgtggt tcgggcggtg ggggtacagg 720
tacggccggc cgagctacgg cgtcgcgctg ccgtcgtacc ggcagtcgct gcacgtgctc 780
ggctccatgc cgctctgcgt gctggtgccg cacctgtcgt gcttcagcca ggagctcccc 840
atggtggtca ccaagtacca ggccatcagc ggccacaagc tgctcagcct cggcgacctc 900
ctccgcttca tgctcgagct gcgcgcccgc ctgccggcca cctccgtcac ggccatggac 960
taccggggca tcatgtcgga ggcctcgtgc cggtggtcgg cgaagcgcgt cgacatggcg 1020
gcgcgcgccg tcgtggacgc gctccgccgc gccgagccgg cggcgcggtg ggtcacgcgg 1080
caggaggtgc gcgacgcggc gcgcgcctac atcggcgaca cgggcctcct cgacttcgtg 1140
ctcaagtccc tcggcaacca catcgtcggc aactacgtcg tgcgccgcac catgaacccg 1200
gtgaccaagg tgctcgagta ctgcctcgag gacgtctcca gcgtgctccc ggcggtcgcc 1260
gccggcggcg gcgtgccggc gcagggcaag atgagggtga ggttccagct cacgcgtgcg 1320
cagctcatga gggacctggt gcacctgtac cggcacgtgc tcaaggagcc cagccaggcg 1380
ctcaccggcg gcgcgttcgg cgcgatcccg gtggcggtgc ggatggtcct ggacatcaag 1440
cacttcgtca aagattacca cgaaggacaa gccgcggcga gcagcaatgg cggtggcgga 1500
ttcgggcatc cccacatcaa cctgtgctgc acgctgctcg tgagcaacgg gagcccggag 1560
ctagctccac cgtacgagac ggtgaccctg ccggcgcacg cgacggtggg cgagctgaag 1620
tgggaggcgc agagggtgtt cagcgagatg tacctcggcc tgaggagctt cgcggcggac 1680
tccgtcgtcg gggtcggcgc cgaccaggag ggcctcccgg tgctcgggct ggtcgacgtc 1740
ggaagcgccg tcgtggtgca agggagcgtg ggcgagcaga taaacgggga ggaccacgag 1800
aggaaggagg aggcggcggc ggcggccgtg tgcgagggga gcggcggcgg cgagcgcgtc 1860
gtggactgcg cgtgcggcgc ggtggacgac gacggcgagc gcatggcgtg ctgcgacatc 1920
tgcgaggcgt ggcagcacac gcggtgcgcc gggatcgcgg acaccgagga cgcgccgcac 1980
gtcttcctct gcagccggtg cgacaacgac gtcgtgtcgt tcccgtcctt caactgttag 2040
<210> 14
<211> 1659
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 14
atgggaagag gagaccacct gctgatgaag aacagcaatg ctgctgcagc tgcagctgct 60
gtcaatggag gtggcaccag tttggatgct gcattgaggc ctctagttgg ttcagatggc 120
tgggattact gcatctactg gaggctctct cctgatcaga ggttcttgga gatgacagga 180
ttctgctgca gcagtgagct tgaagcacag gtctcagcac tgctggacct gccttcttca 240
atcccactgg actcctcctc catagggatg catgcgcagg cattgctgtc gaaccagccg 300
atctggcaga gcagcagtga ggaggaggag gctgatggcg gcggtggcgc caagacgcgg 360
ctgctggtcc ccgtcgccgg cggcctcgtc gagctcttcg cgtcgagata tatggcggag 420
gagcagcaga tggcggagct tgtcatggcg cagtgcggcg gcggcggcgc cggggacgac 480
ggtggggggc aggcgtggcc gccgccggag acgcccagct tccagtggga cggaggcgcc 540
gacgcgcaga ggctgatgta cggcggctcg tcgctgaacc tgttcgacgc cgccgccgcc 600
gacgacgacc cgttcttggg tggtggtggt ggtgacgccg tgggcgacga ggcggcggcg 660
gcgggcgcgt ggccgtacgc ggggatggcg gtgagcgagc cgtcggtggc ggtggcgcag 720
gagcagatgc agcacgcggc gggcggcggc gtggcggagt ccgggtcgga ggggaggaag 780
ctgcatggcg gtgacccgga ggacgacggc gacggcgagg ggcgctccgg cggcgccaag 840
aggcagcagt gcaagaacct cgaggcggag aggaagcgga ggaagaagct caatggccac 900
ctctacaagc tccgctcgct cgtcccaaac atcaccaaga tggatcgcgc gtcgattctt 960
ggagacgcga tcgactacat cgtggggttg cagaagcagg tgaaggagct gcaggacgag 1020
ctggaagaca accatgtcca ccataagccg cccgacgtgc tcatcgacca cccgccgccg 1080
gcgagcctcg tcgggctcga caacgacgac gcctcgccgc ccaacagcca ccaacagcag 1140
ccgccgctcg ccgtttccgg cagcagcagc aggaggagta acaaggaccc agcaatgacc 1200
gacgacaagg tcggcggcgg cggcggcggt gggcaccgga tggagccgca gctggaggtg 1260
cgtcaggtgc aggggaacga gctgttcgtc caggtgctct gggagcacaa gcccggcggg 1320
ttcgtccgcc tcatggacgc catgaacgcg ctcggcctcg aggtcatcaa cgtcaacgtc 1380
accacctaca agaccctcgt cctcaacgtc ttccgcgtca tggtgaggga cagcgaggtg 1440
gcggtgcagg cggacagggt gagggactcg ctgctggagg tgacgcggga gacgtacccc 1500
ggcgtgtggc cgtcgccgca ggaggaggac gacgccaagt tcgacggcgg cgacggcggg 1560
caggctgcgg cggcggcggc ggcggccggt ggagagcact accacgacga agtcggcggc 1620
ggataccatc agcacctgca ttacctcgcg tttgattga 1659
<210> 15
<211> 1635
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 15
atgaagagcc ccatggagga agctcatgca atgccagtga catcattctt cccagtagca 60
ggaatccaca agctcatagc tatcttcctt gttgtcctct catggatctt ggtccacaag 120
tggagcctga ggaaccagaa agggccaaga tcatggccaa tcatcggcgc gacagtggag 180
caactgaaga actaccacag gatgcatgac tggcttgtcg agtacttgtc gaaggacagg 240
acggtgaccg tcgacatgcc tttcacctcc tacacctaca ttgccgaccc ggtgaacgtc 300
gagcatgtcc tgaagaccaa cttcaccaat taccccaagg gtgaagtgta caggtcttac 360
atggatgtgc tgctcggtga tggcatattc aatgccgacg gcgagatgtg gaggaagcaa 420
aggaagacgg cgagcttcga gtttgcctcc aagaacttga gagacttcag cactgtggtg 480
ttcagggagt actccctgaa gctatcaagc attctgagcc aagcatgcaa ggccggcaga 540
gttgtagaca tgcaggaatt gttcatgagg atgacactgg actcgatctg caaggtcggg 600
tttggggttg agatcgggac gctgtcacct gatctcccgg agaacagctt tgcccaggca 660
ttcgacgctg ccaacatcat cgtcacgctg cggttcatcg atcctctgtg gcgtctgaag 720
aagttcttgc acgtcggatc agaggctctc ctcgagcaga gcatgaagct ggttgatgac 780
ttcacctaca gcgtgatccg ccgccgcaag gctgagatct tgcaggctcg agccagcggc 840
aagcaagaga agatcaagca cgacatactg tcgcggttca tcgagctcgg ggaggccggc 900
ggcgacgagg ggggcggcag cttcggggac gacaagagcc tccgcgacgt ggtgctcaac 960
ttcgtgatcg ccgggcgtga cacgacggcg acgacgctgt cgtggttcac gtacatggcg 1020
atgacgcacc cggccgtcgc cgacaagctc cggcgcgagc tggccgcgtt cgaggatgag 1080
cgcgcgcgcg aggagggcgt cgcgctcgcc gacgccgccg gcgaggcgtc gttcgcggcg 1140
cgcgtggcgc agttcgcgtc gctgctgagc tacgacgcgg tggggaagct ggtgtacctg 1200
cacgcgtgcg tgacggagac gctccgcctc tacccggcgg tgccgcagga ccccaagggg 1260
atcgtggagg acgacgtgct ccccgacggc accaaggtgc gcgccggcgg gatggtgacg 1320
tacgtgccct actccatggg gaggatggag tacaactggg gccccgacgc ggcgagcttc 1380
cggccggagc ggtggctcag cggcgacggc ggcgcgttcc ggaacgcgtc gccgttcaag 1440
ttcaccgcgt tccaggccgg gccgcggatc tgcctcggca aggactccgc ctacctccag 1500
atgaagatgg cgctcgccat cctcttccgc ttctacacct tcgacctcgt cgaggaccac 1560
cccgtcaagt accggatgat gaccatcctc tccatggctc acggcctcaa ggtccgcgtc 1620
tccacctccg tctga 1635
<210> 16
<211> 1161
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 16
atggcgatgc ggggggtcga tttcaagtgg tacgatggat tcttcctctc catgctcgcc 60
accagcctaa tcattgtctc catcaactgg aagaggtatc gtctctgcgc ccacccgttg 120
cacatatgga tcgtggttga ctacaccacc gtcttcatct tccgccttct catgttcgtc 180
gataatggcc ttgccgccgg catgggattg gatcttggat ggcaacagag atatgctcgt 240
ttttgtggga gaattgttgt cttgtcggtt cttgtgcttc ttctctatcc ctttctttgg 300
gtttggactg tgataggaac attgtggttt agcactgcaa gaggctgttt acccgaggaa 360
ggacaaaaat ggggcttcct tatatggctg cttttcagct actgtggtct cgcctgtatt 420
gcgtgtgtgg ctgttggaaa gtggctaagc cgaaggcatg ctctccagca gagggcacaa 480
cagggaatac cagtctctga atatggggtt ttggttgaca tgatccgtgt gcctgattgg 540
gcatttgagg ccgttggctt ggaaatgaga ggaatgggcc aagatactgc atatcatcct 600
ggtctttatt taacagctgc ccaaagagag gcagttgagg cactgattca agaactcccg 660
aagttcagac tgaaagctgt tcctacagac tgcagtgagt gtccaatctg cctggaggaa 720
ttccatgttg gcaacgaggt ccgtgggctc ccgtgcgcgc acaatttcca tgtggagtgc 780
atcgaccagt ggctccggct gaatgtcaag tgcccccgtt gccggtgctc cgtcttcccc 840
aacctcgacc tgagcgcgct caacaacctc cggccatcct ccgagccgga ccggccgtcg 900
gccagcgagg tgacagcggc gacgatggcg cggtacgtga ggtcgtcgca gccggctggg 960
cagagctacc tgctgcggct gcaggggctg ctgctgcggc aggtggtggt tcggcacggc 1020
ggcggcgacg acatggcgag cgccgagaac ggcgcttctc atgtggccgc cgcggtgacc 1080
gcgccggcga ccaccggcgg cgtggagagc gagctgccta gcatagtggt tgacggtggg 1140
catcagctgc cggatcgctg a 1161
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gagagttttt caaccaacca atc 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctgaaagatt caggatggtc agg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctgaaagatt caggatggtc agg 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gagagttttt caaccaacca atc 23
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aggtaaattt ctagtttttc tc 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttctgtaact atcatcatca 20
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
accgagctcg aattcgaccg gtgcagcgtg acccggtc 38
<210> 24
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agcttgtcga tcgacagatc atctagtaac atagatgaca ccgcg 45
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gatctgtcga tcgacaagct cg 22
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cggtcgaatt cgagctcgg 19
<210> 27
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
accgagctcg aattcgaccg cctgcaggtc aacatggtgg 40
<210> 28
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agcttgtcga tcgacagatc agcaccgact cggtgcca 38
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gatctgtcga tcgacaagct cg 22
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cggtcgaatt cgagctcgg 19

Claims (8)

1.一种通过抑制植物除草剂抗性基因表达去除色选漏检转基因种子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将抑制植物除草剂抗性基因表达的元件，与育性恢复基因、花粉致死基因和荧光标记基因构建含有四元转基因元件的四元连锁表达载体；
所述植物除草剂抗性基因为水稻OsHIS1基因，其对应类型除草剂为β三酮类除草剂，所述β-三酮类除草剂包括磺草酮、硝磺草酮、双环磺草酮、环磺酮和呋喃磺草酮中的任意一种或几种；
所述抑制植物除草剂抗性基因表达的元件包括CRISPRi沉默元件或RNAi沉默元件；
（2）将所述步骤（1）得到的四元连锁表达载体转化入对对应类型除草剂具有抗性的不育系中，获得对对应类型除草剂敏感的繁殖系；
（3）使所述步骤（2）得到的繁殖系自交结实，其自交后代中包括含有所述四元转基因元件的繁殖系和不含所述四元转基因元件的不育系，经过色选机筛选，将发荧光的繁殖系种子与不发荧光的不育系种子分开；
（4）采用对应类型除草剂对所述步骤（3）色选机筛选后的不育系种子进行除杂，去除色选漏检的含有所述四元转基因元件的繁殖系种子。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CRISPRi沉默元件由所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链通过酶切连接反应连入载体pHdzCas9-KRAB后得到，所述植物除草剂抗性基因的CIRSPRi靶点双链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNAi沉默元件由植物除草剂抗性基因的CDS序列和其反向互补序列以及Linker序列通过酶切连接反应一起连入RNAi沉默载体pEGRNAi后得到，所述CDS序列和其反向互补序列之间由Linker序列隔开；所述CDS序列如SEQ ID NO.3所示，所述反向互补序列如SEQ ID NO.4所示，所述Linker序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，若所述不育系为雄性不育系，所述育性恢复基因包括EAT1、PTC1、TDR或CYP704B2；若所述不育系为雌性不育系，所述育性恢复基因为PTB1。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述花粉致死基因元件包括如SEQ IDNO.7所示的Pg47启动子序列、如SEQ ID NO.1所示的ZMAA1基因cDNA序列和如SEQ ID NO.8所示的IN2-1终止子序列。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记基因元件包括如SEQ IDNO.9所示的1tp启动子序列、如SEQ ID NO.2所示的DsRed基因cDNA序列和如SEQ ID NO.10所示的PINII终止子序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述四元连锁表达载体通过农杆菌介导转化入对对应类型除草剂具有抗性的不育系中。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，采用对应类型除草剂对色选机筛选得到的不育系种子进行去除的方式具体包括：采用对应类型除草剂对所述不育系种子进行包衣、在所述不育系种子浸种催芽过程中添加对应类型除草剂或在所述不育系种子播种、种植后进行田间喷施对应类型除草剂。
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