CN108064297B

CN108064297B - 小麦育性相关基因TaMS7及其应用方法

Info

Publication number: CN108064297B
Application number: CN201780001491.3A
Authority: CN
Inventors: 李健; 王峥; 马力耕; 邓兴旺
Original assignee: Institute Of Modern Agriculture Peking University; Weimingwang System Crop Design Frontier Laboratory Beijing Co ltd; Peking University
Current assignee: Beijing Zhiyu wheat Biotechnology Co.,Ltd.; Institute of Modern Agriculture, Peking University; Peking University
Priority date: 2017-05-09
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: CN108064297A

Abstract

本发明公开了一种小麦育性相关基因TaMS7及其应用方法，属于生物技术领域。本发明通过对不同发育时期小麦花药的全基因组表达谱分析，获得了小麦育性相关基因TaMS7，并且通过调节该基因的表达以调控植物育性，用以生产并保持小麦雄性不育系以及制备杂交种子，对于建立高效的小麦杂交种制种技术、研究小麦雄性不育机理和杂种优势具有重要的理论和实践意义。

Description

小麦育性相关基因TaMS7及其应用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及小麦的杂交育种方法，包括小麦核不育系繁殖和杂交种子制备，更具体地涉及一个小麦雄性核不育基因及其突变体及其在杂交育种中的应用。

技术背景

小麦是自花授粉作物，其杂种优势利用的核心是建立高效生产小麦杂交种的技术体系。目前小麦生产上杂种优势利用的途径主要有三种：一是三系法，即利用核质互作雄性不育系，通过不育系、保持系和恢复系三系互作配套生产杂交种；二是化杀法，即应用化学杀雄剂诱导小麦雄性不育以进行杂交制种；三是二系法，即利用光温敏不育系随光温的变化进行杂交制种。三系法自上世纪50年代开始研究，迄今已经育成的小麦核质互作不育系有70多种，研究最多的有T型、K型、Q型等不育系，其胞质主要来自各种山羊草、提莫菲维小麦、野生燕麦、簇毛麦等。虽然这些不育系大都实现了三系配套，但是由于其自身在遗传上存在一些难以克服的缺陷，比如恢复源较少、异源细胞质的不良影响、强优势组合选出率低、不育系种子纯度低等，都未能在生产上大面积推广应用。上世纪80年代，化杀法的研究进入高潮，由于克服了三系法的种种问题，化杀法曾被认为是一种很有希望的杂交制种新技术。但是化学杀雄剂存在稳定性差、易残留、容易产生毒副作用、环境污染重等问题，因此想要大面积应用于生产，关键还需要研制出一种理想的化学杀雄剂。在三系法和化杀法困难重重的情况下，二系法杂交小麦发展迅速并逐渐成为今后小麦杂种优势研究和利用的主要发展趋势。二系法的核心是光温敏不育系，这是一种基因型与环境互作导致的雄性不育类型。由于实现了一系两用(兼具不育系和保持系的功能)，简化了不育系的繁殖程序，制种简单且恢复源广，容易获得优势组合，因此具有很高的推广价值。目前我国独创的二系法杂交小麦应用技术体系，整体领先于国际水平，选育的杂交小麦品种抗逆性强，水肥利用率高，增产幅度可达15％-20％，对粮食生产节本增效作用显著。但是，光温敏不育系的雄性不育高度依赖环境因素，环境的变化严重影响杂种种子的产量、质量和纯度，因此，两系法杂交小麦突破生产尚需时日，关键是要解决环境的影响。

在上述传统的常规育种模式遇到瓶颈的情况下，以现代分子生物学为主导的生物育种技术很可能是突破瓶颈的关键。小麦杂种优势利用的核心是建立高效的生产小麦杂交种的技术体系，而建立高效的小麦杂交种制种技术的关键是要有合适的雄性不育系母本。雄性不育指的是植物在有性繁殖过程中不能产生具有正常功能的花药、花粉或雄配子，对雄性不育机理的揭示，是利用杂种优势提高小麦产量和品质的基础。小麦基因组庞大且复杂，所以对小麦雄性不育的机理研究迄今为止积累的资料非常有限。因此，将现代分子生物学和细胞生物学手段应用于小麦雄性不育机理研究，对于加强小麦杂种优势研究和利用具有重要的理论和实践意义。

发明内容

本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。

本发明提供了一个育性相关基因TaMS7，所述育性相关基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

(a)如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示的核苷酸序列；

(b)其编码氨基酸序列如SEQ ID NO：7、8或9所示的核苷酸序列；

(c)在严谨条件下能够与(a)或(b)中所述序列的DNA杂交的DNA序列；或

(d)与(a)-(c)所述序列有至少80％(优选为至少85％)序列相似性，且具有育性相关功能的DNA序列；或

(e)与(a)-(d)之任一所述序列互补的DNA序列。

本领域技术人员应该知晓，本发明所述的育性相关基因还包括与TaMS7基因的核苷酸序列或蛋白序列高度同源，并且具有同样的育性调控或恢复功能的同源基因序列。所述高度同源且具有育性调控功能的的同源基因包括在严谨条件下能够与具有SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示序列的DNA杂交的DNA序列。或是其编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：7、8或9所示的蛋白氨基酸序列具有85％以上相似性的核苷酸序列。本文中使用的“严谨条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于杂交，优选杂交温度是53℃-60℃，杂交时间为12-16小时，然后在62℃-68℃下用含0.5×SSC、和0.1％SDS的洗涤液洗涤15-60分钟。

上述同源基因还包括与SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示序列的全长有至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％序列相似性，且具有育性调控功能的DNA序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法、Needleman-Wunsch全局比对法、Smith-Waterman局部比对法、Pearson和Lipman相似性搜索法、Karlin和Altschul的算法。这对于本领域技术人员来说是公知的。

本发明还提供了一种表达盒，所述表达盒含有本发明所公开的育性相关基因的DNA序列，所述育性相关基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

(a)如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示的核苷酸序列；

(b)其编码氨基酸序列如SEQ ID NO：7、8或9所示的核苷酸序列；

(d)与(a)-(c)所述序列有至少80％(优选为至少85％)序列相似性，且具有育性恢复功能的DNA序列；或

(e)与(a)-(d)之任一所述序列互补的DNA序列。

具体地，上述表达盒中的育性相关基因还可操作性的连有一个可驱动其表达的启动子，所述启动子包括但不限于组成型表达启动子、诱导型启动子、组织特异表达启动子、或时空特异表达启动子。更具体地，所述启动子是一个花药特异表达启动子。优选地，所述花药特异表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：16、17或18所示。

本发明上述表达盒，还进一步的包含一个花粉失活基因，所述花粉失活基因可以干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成。所述花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、DAM甲基化酶等。更具体的，所述花粉失活基因是玉米α淀粉酶基因，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。

本发明上述表达盒，还进一步的包含一个筛选基因，所述筛选基因可以用于将含有该表达盒的植株、植物组织细胞或载体筛选出来。所述筛选基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草剂基因、或是荧光蛋白基因等。具体地，所述筛选基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因DsRED、mCherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。

本发明还公开了一种植物育性调控的方法，所述方法通过将育性相关基因转入到ms7雄性不育突变体，使ms7雄性不育突变体的雄性育性恢复，其中所述的育性相关基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

(a)如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示的核苷酸序列；

(b)其编码氨基酸序列如SEQ ID NO：7、8或9所示的核苷酸序列；

(e)与(a)-(d)之任一所述序列互补的DNA序列。

本发明还提供了一种调控植物育性的方法，通过影响育性基因TaMS7的表达来调控植物的育性。包括但不限于通过突变TaMS7基因的方法，获得ms7雄性不育突变体材料；或是通过基因互补的方法，将TaMS7基因用于恢复由相应的TaMS7基因突变所导致的雄性不育，使ms7雄性不育突变体恢复成可育。在本发明中，所述的突变包括在育性调控基因的核苷酸序列上进行取代、缺失或添加一个或多个核苷酸。获得突变的方法包括但不限于物理诱变、化学诱变或RNAi、TALEN、CRISPR-Cas9等基因编辑方法。

本发明还包括一种获得ms7雄性不育突变体的方法，所述方法通过突变植物内源的育性调控基因TaMS7，或突变与其高度同源的基因的核苷酸序列，使该植物体丧失雄性育性的过程。所述育性调控基因TaMS7的氨基酸序列如SEQ ID NO：7、8或9所示。所述育性调控基因TaMS7的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示。所述“突变”包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法所导致的基因突变，化学方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变，所述突变还可以是点突变，也可以是DNA缺失或插入突变，也可以是通过RNAi等基因沉默手段或者通过基因定点突变的方法，所述基因定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法、和/或CRISPR/Cas9等基因编辑方法。

本发明还提供了一种ms7突变体材料的应用方法，其特征在于所述突变材料是由核苷酸序列的突变所造成，含有该突变后的核苷酸序列的植株具有雄性不育的表型，其中所述核苷酸序列为TaMS7基因的核苷酸序列，优选如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示。所述突变体材料的应用，包括但不限于在杂交育种中的应用，更具体的是指将ms7突变体植株作为不育系母本，与恢复系杂交，生产杂交种子。

本发明还公开了一种雄性不育系的保持方法，所述方法以ms7雄性不育突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育突变体受体植株中。所述3个目标基因分别是育性相关基因TaMS7、花粉失活基因和筛选标记基因。其中，育性相关基因TaMS7可使不育的转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有转化的外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子或组织和非转基因种子或组织的分拣，分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产不育系。

本发明中，在小麦植株中所述ms7雄性不育突变体是指由TaMS7突变所导致的雄性不育突变体。本发明中ms7雄性不育突变体也可以称为ms7不育系或ms7雄性不育系。

上述雄性不育系的保持方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、DAM甲基化酶等。更具体的，所述花粉失活基因是玉米α淀粉酶基因Zm-AA，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。所述花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。更具体地，所述偏好于雄性配子表达的启动子包括但不限于PG47启动子、Zm13启动子等。所述筛选基因可以用于将含有该表达盒的植株或载体筛选出来。所述筛选基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草剂基因、或是荧光蛋白基因等。具体地，所述筛选基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因DsRED、mCherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。

更具体地，本发明还公开了一种雄性不育系的繁殖方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向ms7雄性不育系中转入下述载体，以获得含有下述载体的保持系，所述载体包含：育性相关基因TaMS7，所述育性相关基因TaMS7可以恢复ms7雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表达时，会干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，从而使得所述植株中产生的具有活性的雄性配子都是不含所述载体的；和筛选基因，所述筛选基因可以用于转基因种子或组织和非转基因种子或组织的分拣。

(b)将转入上述载体后形成的保持系植株自交，同时产生不含载体的ms7雄性不育系和含载体的保持系种子；或是将保持系植株的花粉赶到ms7雄性不育系植株上，使ms7雄性不育系授粉繁殖出ms7雄性不育系的种子。

上述雄性不育系的繁殖方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、DAM甲基化酶等。更具体的，所述花粉失活基因是玉米α淀粉酶基因Zm-AA，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。所述花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。更具体地，所述偏好于雄性配子表达的启动子包括但不限于PG47启动子、Zm13启动子等。所述筛选基因可以用于将含有该表达盒的植株或载体筛选出来。所述筛选基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草剂基因、或是荧光蛋白基因等。具体地，所述筛选基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因DsRED、mCherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。

本发明还公开了一种保持系的生产方法，所述方法包括以下步骤:

(a)向ms7雄性不育系中转入下述载体，即获得了ms7雄性不育系的保持系，所述载体包含：育性相关基因TaMS7，所述育性相关基因TaMS7可以恢复ms7雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表达时，会干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，从而使得所述植株中产生的可育雄性配子都是不含所述载体的；和筛选基因，所述筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣。

上述保持系的生产方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、DAM甲基化酶等。更具体的，所述花粉失活基因是玉米α淀粉酶基因Zm-AA，优选其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。所述花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。更具体地，所述偏好于雄性配子表达的启动子包括但不限于PG47启动子、Zm13启动子等。所述筛选基因可以用于将含有该表达盒的植株或载体筛选出来。所述筛选基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草剂基因、或是荧光蛋白基因等。具体地，所述筛选基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因DsRED、mCherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。

本发明还公开了一种保持系的繁殖方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向ms7雄性不育系中转入下述载体，即获得了ms7雄性不育系的保持系，所述载体包含：育性相关基因TaMS7，所述育性相关基因TaMS7可以恢复ms7雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表达时，会干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，从而使得所述植株中产生的可育雄性配子都是不含所述载体的；和筛选基因，所述筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣；和

(b)将转入上述载体后形成的保持系植株自交，即按1:1的比例繁殖获得了不含载体的ms7雄性不育系种子和含载体的保持系种子。

本发明还公开了一种种子的生产方法，所述方法包括：

(a)向ms7雄性不育系中引入下述载体，获得ms7雄性不育系的保持系，所述载体包含：育性相关基因TaMS7，所述育性相关基因TaMS7可以恢复ms7雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表达时，会干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，从而使得所述植株中产生的可育雄性配子都是不含所述载体的。

(b)将转入上述载体后的保持系植株自交；和

(c)自交后即获得含有所述载体的保持系种子和不含载体的ms7雄性不育系。

本发明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生产方法或繁殖方法、种子的生产方法等中，其中步骤(a)也可以是向普通的植株中引入含有育性相关基因TaMS7、花粉失活基因和筛选基因的载体，获得含有所述载体的转基因植株后，再与ms7雄性不育系杂交，经过定向选育，获得背景为ms7雄性不育系、并且含有所述载体的保持系植株。

本发明上述的雄性不育系的繁殖方法或保持方法、保持系的生产方法或繁殖方法、种子的生产方法等中，其中所述的育性相关基因的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

(a)如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示的核苷酸序列；

(b)其编码氨基酸序列如SEQ ID NO：7、8或9所示的核苷酸序列；

(e)与(a)-(d)之任一所述序列互补的DNA序列。

上述育性相关基因TaMS7还可操作性的连有一个花药特异表达的启动子，可以驱动TaMS7基因在植物花粉中的表达。所述花药特异表达的启动子选自由MS26、NP1、MSP1、PAIR1、PAIR2、ZEP1、MELL、PSS1、TDR、UDT1、GAMYB4、PTC1、API5、WDA1、CYP704B2、MS26、MS22、DPW、MADS3、OSC6、RIP1、CSA、AID1、5126或Ms45等育性调控基因的启动子构成的组之一。更具体的，所述花药特异表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：16、17或18所示。上述育性相关基因TaMS7还可操作性的连有一个终止子，所述终止子可以是已经公开的任一个基因的终止子，具体地，所述终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO：22、23或24所示。

本发明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生产方法或繁殖方法、种子的生产方法等中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、DAM甲基化酶等。更具体的，所述花粉失活基因是玉米α淀粉酶基因Zm-AA，优选其核苷酸序列如SEQID NO：25所示。所述花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。更具体地，所述偏好于雄性配子表达的启动子包括但不限于PG47启动子、Zm13启动子等。

本发明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生产方法或繁殖方法、种子的生产方法等中，其中所述的筛选基因包括但不限于抗生素抗性基因、除草剂抗性基因或荧光基因。具体地，所述筛选基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因DsRED、mCherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因等。

本发明还提供了一种花药特异表达启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16、17或18所示。将SEQ ID NO：16、17或18与报告基因GUS相连，构建载体转化水稻和小麦，检测分析转基因植株中的GUS表达活性和表达模式，通过对转基因植株的根、茎、叶和花进行GUS染色分析，结果发现本发明所提供的启动子驱动GUS基因在植物花粉中表达。说明本发明所提供的SEQ ID NO：16、17或18是一个花药特异性表达的启动子。

本发明所提供的植物花药特异表达启动子，含有序列表中如SEQ ID NO：16、17或18所示的核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO：16、17或18中所列核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列，或包含来源于SEQ ID NO：16、17或18序列上的500个及500以上连续的核苷酸片段，并且可以驱动与该启动子操作性连接的核苷酸序列在植物花粉中的表达。含有上述序列的表达载体、转基因细胞系以及宿主菌等均属于本发明的保护范围。扩增本发明所公开的SEQ ID NO：16、17或18启动子的任一核苷酸片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明所述的“启动子”是指一种DNA调控区域，其通常包含能指导RNA聚合酶II在特定编码序列的合适转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子还可包含其它识别序列，这些识别序列通常位于TATA盒的上游或5’端，通常被称为上游启动子元件，起调控转录效率的作用。本领域技术人员应该知晓，虽然已经鉴定了针对本发明公开的启动子区域的核苷酸序列，但是分离和鉴定处于本发明鉴定的特定启动子区域的TATA盒上游区域的其它调控元件也在本发明的范围内。因此，本文公开的启动子区域通常被进一步界定为包含上游调控元件，例如用于调控编码序列的组织表达性和时间表达功能的那些元件、增强子等。以相同的方式，可以鉴定、分离出使得能在目标组织(例如雄性组织)中进行表达的启动子元件，将其与其它核心启动子一起使用，以验证雄性组织优先的表达。核心启动子指起始转录所需的最小限度的序列，例如被称为TATA盒的序列，这是编码蛋白质的基因的启动子通常都具有的。因此，可选地，TaMS7基因的上游启动子可与其自身的或来自其它来源的核心启动子关联使用。

核心启动子可以是任何一种已知的核心启动子，例如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子(美国专利No.5,352,605)、泛素启动子(美国专利No.5,510,474)、IN2核心启动子(美国专利No.5,364,780)或玄参花叶病毒启动子。

所述基因启动子的功能可以通过以下方法进行分析：将启动子序列与报告基因可操作性连接，形成可转化的载体，再将该载体转入植株中，在获得转基因后代中，通过观察报告基因在植物各个组织器官中的表达情况来确认其表达特性；或者将上述载体亚克隆进用于瞬时表达实验的表达载体，通过瞬时表达实验来检测启动子或其调控区的功能。

用来测试启动子或调控区域功能的适当表达载体的选择将取决于宿主和将该表达载体引入宿主的方法，这类方法是本领域普通技术人员所熟知的。对于真核生物，在载体中的区域包括控制转录起始和控制加工的区域。这些区域被可操作地连接到报告基因，所述报告基因包括YFP、UidA、GUS基因或荧光素酶。包含位于基因组片段中的推定调控区的表达载体可以被引入完整的组织，例如阶段性花粉，或引入愈伤组织，以进行功能验证。

此外，本发明的启动子还可与并非TaMS7基因的核苷酸序列相连，以表达其它异源核苷酸序列。本发明的启动子核苷酸序列及其片段和变体可与异源核苷酸序列一起组装在一个表达盒中，用于在目的植株中表达，更具体地，在该植株的雄性器官中表达。所述表达盒有合适的限制性酶切位点，用于插入所述启动子和异源核苷酸序列。这些表达盒可用于对任何植株进行遗传操作，以获得想要的相应表型。

本发明所公开的花药特异表达启动子，可用于驱动下列异源核苷酸序列的表达，以使转化的植株获得雄性不育的表型，所述异源核苷酸序列可编码促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，更具体的如barnase基因、玉米α淀粉酶基因、生长素基因、rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶，或是显性的雄性不育基因。

在某些实施方式中，本发明中所提到的可操作性地连接在本发明启动子下游的核苷酸序列，其中所述的“核苷酸序列”可以是操作性连接于本文所公开的启动子之后的结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA。

本发明还提供了一个转录终止子序列，所述转录终止子的核苷酸序列如SEQ IDNO：22、23或24所示，具有终止基因转录表达的功能。

本发明还提供了一种表达盒、载体或工程菌株，所述表达盒、载体或工程菌株中包含了本发明所提供的花药特异表达启动子SEQ ID NO：16、17或18。具体地，可以将本发明所提供的育性相关基因TaMS7的核苷酸序列构建到本发明所提供的启动子SEQ ID NO：16、17或18的下游，从而驱动该育性基因在转化受体植株中的表达。

本发明的所提供的花药特异表达启动子可用于外源基因在花粉中的特异性表达，从而避免该外源基因在植物其他组织中持续表达所带来的不利影响，还可以用于植物花粉生长发育相关基因的功能分析和鉴定；可用于雄性不育系和保持系的创建；并可应用于花粉败育实验中，从而避免由植物转基因漂移或花粉逃逸所带来的生物安全问题，对植物雄性不育系和保持系的创造具有重要意义。

本发明所提供的TaMS7基因的核苷酸序列和启动子序列或表达盒可被插入载体、质粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。当宿主细胞是植物细胞时，表达盒或载体可插入至被转化的植物细胞的基因组中。插入可以是定位的或随机的插入。

本发明所述的将核苷酸序列、载体或表达盒转入植株或引入植株或对植株进行转化，均指通过常规的转基因方法，将核苷酸序列、载体或表达盒转入到受体细胞或受体植株中。植物生物技术领域技术人员已知的任何转基因方法均可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射。所述转化方法也包括农杆菌介导的植物转化方法等。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供了一种育性相关基因TaMS7及其启动子，及将该基因用于ms7雄性不育系的繁殖和保持的方法。本发明所提供的育性相关基因、核雄性不育系的育性保持和不育系的繁殖方法，对作物的杂交育种生产来说，具有重大的生产推广价值和应用价值。本发明提供的育性基因以及该基因突变产生的不育系为小麦杂交育种提供了资源，也为构建第三代杂交育种体系提供了必要的元件，该基因突变产生的雄性不育系，用来生产杂交种子，对于突破并改良现有的“三系”和“两系”杂交技术有重要意义。

附图说明

图1是comp155942_c0_seq4在花粉处于减数分裂期(WT-0)、单核期(WT-1)、双核期(WT-2)和三核期(WT-3)的花药中的表达水平分析，横坐标是花粉不同发育时期，纵坐标是FPKM，反映基因的表达水平。

图2是TaMS7的3个同源基因在小麦不同组织器官和不同发育时期的花药中的RT-PCR分析；1表示根，2表示茎，3表示叶片，4表示花粉处于减数分裂期的穗子，5表示花粉处于单核期的花药，6表示花粉处于双核期的花药，7表示花粉处于三核期的花药，8表示花粉处于单核期的花中除花药以外其它的花器官，9表示花粉处于双核期的花中除花药以外其它的花器官，10表示花粉处于三核期的花中除花药以外其它的花器官。

图3是采用CRISPR-Cas9技术得到的7个小麦核隐性雄性不育突变体株系的基因型和表型：a1、a2分别表示TaMS7-A突变的两种类型，b1表示TaMS7-B突变的一种类型，d1、d2分别表示TaMS7-D突变的两种类型。

图4是TaMS7-A、TaMS7-B、TaMS7-D三个基因均发生突变后的小麦植株具有完全雄性不育的性状：A图为野生型与突变体植株的穗，B图为野生型与突变体植株的花药和雌蕊，C图为野生型与突变体植株花粉的I₂-KI染色照片。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1.不同发育时期小麦花药的全基因组表达谱分析和花粉发育早期花药表达contig的获得

取花粉处于减数分裂期、单核期、双核期和三核期的小麦花药，用Trizol(Invitrogen)提取总RNA，并进行DNaseI(Promega)处理，进而纯化mRNA(Ambion)。将纯化的mRNA进行反转录(Invitrogen)、超声打断(Fisher)、制备文库(illumina)并扩增(illumina)，最后在illumina机器上进行测序反应。

小麦转录组高通量测序的结果首先通过Trinity软件进行序列拼接，得到的拼接序列进一步去除冗余以及相似性聚类。对于拼接得到的转录本contig的表达变化分析，各样品中高通量测序的序列首先通过TopHat(http://tophat.cbcb.umd.edu/)软件与转录本拼接的结果进行比对。而后Cufflink软件能够计算比对上的转录本contigs的均一化表达量，用“外显子每百万比对片段的千碱基数(fragments per kilobase of exon model permillion mapped fragments，FPKM)”表示。

通过对不同发育时期小麦花药的全基因组表达谱分析，找到花粉处于减数分裂期和单核期的花药中高表达而在花粉处于双核和三核期的花药中不表达的转录本contig7231个。如图1所示，comp155942_c0_seq4在花粉处于减数分裂期和单核期的花药中高表达而在花粉处于双核和三核期的花药中不表达。将comp155942_c0_seq4所对应的基因命名为TaMS7。

实施例2.RT-PCR验证TaMS7基因的组织表达特异性

由于小麦是由A、B、D三套基因组组成的异源六倍体，基因的平均拷贝数为2.8个，其中接近一半的基因(46％)有3-4个拷贝，12％的基因有1-2个拷贝，42％的基因拷贝数≥5个。从comp155942_c0_seq4的序列出发，利用CerealsDB和IWGSC(International WheatGenome Sequencing Consortium)公布的普通小麦的测序信息，以及2013年Nature上发表的小麦祖先乌拉尔图小麦(Triticum urartu，A基因组供体)和粗山羊草(Aegilopstauschii，D基因组供体)的测序信息进行电子克隆，获得了3个TaMS7基因，分别命名为TaMS7-A，TaMS7-B和TaMS7-D。3个TaMS7基因的基因组DNA序列分别为SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示，三者之间的同源性为95％-97％；CDS序列分别如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示，三者之间的同源性为97％-98％；蛋白序列分别如SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示，三者之间的同源性为98％-99％。分别设计针对TaMS7-A，TaMS7-B和TaMS7-D CDS的特异性引物，利用RT-PCR方法，对这三个基因在在小麦根、茎、叶、不同发育时期的花药及除花药以外的其他花器官等多种组织材料中进行表达特异性分析，结果如图2所示，TaMS7基因只在花粉处于减数分裂期的穗和花粉处于单核期的花药中特异表达，在花粉处于双核期和三核期的花药中不表达，在花粉处于各发育时期的除花药以外的其他花器官和根、茎、叶中都不表达，说明TaMS7基因是花药特异表达、且只在花粉发育早期的花药中特异表达的基因，驱动其表达的启动子也是一个花药特异表达的启动子。

TaMS7-A基因的RT-PCR引物为：

引物1：5'-ATACTGACACAAGTTTATGGGGCTG-3'(SEQ ID NO:10)

引物2：5'-AATTACATTCAAATATGGCTCCTTG-3'(SEQ ID NO:11)

TaMS7-B基因的RT-PCR引物为：

引物3：5'-GGCCTCGTGAACTCGTCGTATC-3'(SEQ ID NO:12)

引物4：5'-TGAATTACATGCAAATTTGGCTCCG-3'(SEQ ID NO:13)

TaMS7-D基因的RT-PCR引物为：

引物5：5'-ATGTCCAACCAGGAGCACTTCAC-3'(SEQ ID NO:14)

引物6：5'-GCACAGTTTTTTGAAGCAATGTTG-3'(SEQ ID NO:15)

实施例3.TaMS7基因启动子序列的获得

从TaMS7-A、TaMS7-B和TaMS7-D基因的基因组DNA序列出发，利用CerealsDB和IWGSC(International Wheat Genome Sequencing Consortium)公布的普通小麦的测序信息，以及2013年Nature上发表的小麦祖先乌拉尔图小麦(Triticum urartu，A基因组供体)和粗山羊草(Aegilops tauschii，D基因组供体)的测序信息进行电子克隆，获得了TaMS7-A、TaMS7-B和TaMS7-D基因的启动子，分别命名为TaMS7-A启动子、TaMS7-B启动子和TaMS7-D启动子，在本发明中所述启动子也可分别称为pTaMS7-A、pTaMS7-B和pTaMS7-D，其长度分别为2601bp、2635bp和2821bp，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ IDNO：18所示。

实施例4.TaMS7-D启动子的克隆和植物表达载体的构建

为了进一步核实上述启动子的功能，本发明进行了TaMS7-D启动子的功能验证实验。将植物表达载体pBI121用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切，得到的35S:GUS片段用T4DNA ligase连入同样用HindIII和EcoRI双酶切的CAMBIA公司的pCAMBIA2300载体，新的载体被命名为p2300 35S:GUS。

从TaMS7-D启动子的5’端和ATG上游设计引物：

引物7：5’-aagcttCTGACATAGTACATGTAATCTTTAAATCCATAAC-3’(SEQ ID NO:19)

引物8：5’-ggatccTTGCGCCGGCGAGCTCGGC-3’(SEQ ID NO:20)

引物7中序列aagctt是HindIII的酶切位点，引物8中序列ggatcc是BamHI的酶切位点。

以小麦的基因组DNA为模板，用引物7和引物8进行扩增，反应条件是：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒；60℃退火30秒；72℃延伸2分30秒；35个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pMD20-T载体中，筛选阳性克隆并进行测序验证，序列如SEQ ID NO:18所示，该质粒称为T-pTaMS7-D。

用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切T-pTaMS7-D，得到的TaMS7-D启动子用T4DNA ligase连入用HindIII和BamHI双酶切的p2300 35S:GUS载体，得到植物表达载体p2300pTaMS7-D:GUS。

实施例5.水稻的遗传转化和转基因水稻植株不同组织器官GUS基因表达的组织化学检测

利用热激法将植物表达载体p2300TaMS7-Dp:GUS转入农杆菌AGL0菌株。

用农杆菌侵染水稻胚性愈伤，暗中共培养2-3天，然后经过两步抗性筛选、预分化、分化和生根培养等步骤，最终获得具有卡那霉素抗性的、转p2300TaMS7-Dp:GUS水稻T₀代植株。

选择合适大小的转基因幼苗或特定组织浸入GUS染液中，37℃染色过夜，吸去反应液，乙醇梯度脱色，显微镜观察。结果表明，在转基因水稻的根、茎和叶等营养器官中都检测不到GUS基因的表达，在花粉处于双核期和三核期的花药和其他花器官、花粉处于减数分裂期和单核期的除花药以外的其它花器官中也检测不到GUS基因的表达，TaMS7-D启动子只能启动GUS基因在花粉处于减数分裂期和单核期的花药中表达，说明TaMS7-D启动子是一个花粉发育早期花药特异表达的启动子。按照TaMS7-D启动子的功能验证过程，对TaMS7-A启动子和TaMS7-B启动子也进行了功能验证，发现TaMS7-A启动子和TaMS7-B启动子也是一个花药特异表达的启动子，和实施例2中的实验结果一致。

实施例6.TaMS7育性基因的定点敲除及突变体的表型分析

本发明采用CRISPR-Cas9技术对小麦基因组进行定点突变实验。具体的，在本发明中，TaMS7育性基因的靶序列选为CTGGTGGACCAGCCCATGGT(SEQ ID NO：21)，该序列为TaMS7-A、TaMS7-B、TaMS7-D的共有序列，分别位于TaMS7-A正链中的第1017-1036位核苷酸、TaMS7-B正链中的第1035-1054位核苷酸、TaMS7-D正链中的第1038-1057位核苷酸。将带有靶序列的sgRNA表达框与Cas9表达框构建到同一载体pAHC20上，与表达bar基因的质粒一起，利用基因枪法共转化小麦幼胚，获得了转基因小麦植株。

对转基因小麦植株进行分子鉴定，发现在TaMS7-A、TaMS7-B、TaMS7-D三个基因靶序列的位置都发生了突变：其中TaMS7-A基因发生的突变有两种类型，分别为缺失5个碱基和插入55个碱基；TaMS7-B基因发生的突变有一种，为缺失13个碱基的同时又插入了54个碱基；TaMS7-D基因的突变有两种类型，一种为缺失9个碱基，另一种为缺失7个碱基的同时插入103个碱基(见图3)。

对TaMS7-A、TaMS7-B、TaMS7-D三个基因的靶序列都发生纯合突变或双等位基因突变的植株进行表型观察，发现具有这种基因型的植株的花药瘦小、不开裂、内部没有花粉，表现为完全的雄性不育(见图4)，用野生型对其授粉保种；而TaMS7-A、TaMS7-B、TaMS7-D三个基因中只有一个或两个基因发生纯合突变或双等位基因突变的植株，没有雄性不育表型。说明本发明的TaMS7基因就是一个隐性的核雄性不育基因。

实施例7.转基因功能互补

将TaMS7-A，TaMS7-B和TaMS7-D编码区的基因组DNA序列(SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3)分别构建到pAHC20载体上，前面分别加各自的上游启动子序列2.5kb(SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18)用于驱动基因的表达，后面分别加1.4kb的下游序列(SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24)，载体分别命名为pAHC20pTaMS7-A:gTaMS7-A,pAHC20pTaMS7-B:gTaMS7-B和pAHC20pTaMS7-D:gTaMS7-D。

利用基因枪法，将上述三个功能互补载体分别转化或是共转化小麦Tams7-abd突变体，对获得的转基因阳性植株的花粉进行I₂-KI染色观察，结果显示转基因阳性植株花粉均发育正常、表现为可育。这些分析进一步证明TaMS7基因参与花粉发育调控，该基因突变导致雄性不育表型。

实施例8.TaMS7基因在新一代杂交育种技术中的应用

TaMS7基因可以用于新一代杂交育种技术，该技术的核心思想是：以小麦核隐性雄性不育突变体为转化受体材料，通过将紧密连锁的3个目标基因转化至不育突变体中，其中，隐性核雄性不育基因可使转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子即为不育系，而转基因种子用作保持系。通过保持系给不育系授粉杂交，可以在不育系上结实，由此繁殖不育系。而保持系通过自交可以源源不断地得以繁殖。由于该技术利用生物技术生产非转基因产品，解决了小麦杂交制种过程中面临人工或机械去雄问题，省去人工去雄或机械去雄步骤，可以提供更高质量及纯度的种子给种植者，节约劳动成本。

根据以上原理，更具体地，采用小麦TaMS7基因构建植物表达载体。在构建小麦的植物表达载体之前，发明人首先分别对表达载体内的ZmBT1-ZmAA、TaMS7和mCherryW三个表达盒单独进行了小麦转化，并进一步对各个表达盒的功能进行了验证。结果表明各个表达盒单独转化小麦时，都能够工作良好，达到预期的设计效果。

进一步，发明人通过装配下述DNA元件，构建了转化载体：

1)以pAHC20载体为基础，可操作性连入以下各个表达盒；

2)TaMS7基因育性恢复表达盒，含有育性相关基因TaMS7及其启动子和终止子均来自小麦品种CB037，小麦中来自A、B、D基因组上的三个TaMS7基因，即TaMS7-A，TaMS7-B和TaMS7-D均可同时用于恢复小麦ms7不育系的育性，或是单独用于恢复小麦ms7不育系的育性。其中TaMS7-A基因的基因组DNA序列、启动子序列和终止子序列分别如SEQ ID NO：1，SEQID NO：16和SEQ ID NO：22所示；TaMS7-B基因的基因组DNA序列、启动子序列和终止子序列分别如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：23所示；TaMS7-D基因的基因组DNA序列、启动子序列和终止子序列分别如SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：24所示。

3)花粉失活基因表达盒PG47：ZmBT1-ZmAA-IN2-1，花粉失活基因为ZmAA，转运肽为ZmBT1，ZmBT1-ZmAA(其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示)的开放读码框连接于启动子PG47(其核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示)的下游、终止子IN2-1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示)的上游。

4)筛选标记基因表达盒CaMV35S增强子-LTP2：mCherryW-PINII，mCherryW基因(SEQ ID NO：28)的开放读码框连接于CaMV35S增强子-LTP2启动子(SEQ ID NO：29)和PINII终止子(SEQ ID NO：30)之间，重组成mCherryW的基因表达盒(CaMV35S增强子-LTP2：mCherryW-PINII)。

本发明同时构建了TaMS7基因育性恢复表达盒中只含单个TaMS7基因，及另外两个花粉失活基因表达盒和筛选标记基因表达盒的载体。此外，也构建了TaMS7基因育性恢复表达盒中含有两个TaMS7基因，及另外两个花粉失活基因表达盒和筛选标记基因表达盒的载体。

利用基因枪法，将上述两种载体分别转化小麦Tams7-abd突变体，分别得到8株、12株和9株转基因为单拷贝的转基因阳性植株。对转基因植株及对照进行花粉活性检测，结果显示，非转基因的野生型小麦植株花粉不育比例小于2％，非转基因的小麦Tams7-abd突变体植株的花药中没有花粉，而转基因植株的花药中有花粉，但不育花粉的比例为50％左右，表明本发明所提供的载体中TaMS7基因恢复了Tams7-abd突变体雄性不育的表型，同时ZmBT1-ZmAA基因能够到达预期的花粉失活功能。

对上述转基因植株所结T₁代种子进行荧光分离比例调查，结果表明这些种子均显示1:1分离比，即携带外源基因的荧光种子和不携带外源基因的非荧光种子表现为1:1分离，表明本发明所提供的载体各元件作为整体表达良好，可以实现创制和繁殖不育系的目的；其中，TaMS7基因可以恢复雄性不育突变体受体的育性，ZmBT1-ZmAA基因和mCherryW基因的表达可以分别实现预期的花粉失活功能和种子荧光标记功能。由此，建立新一代杂交育种技术体系，即在小麦ms7雄性核不育系的基础上，转入上述载体以形成保持系，含有该外源载体的保持系可以用于源源不断的生产保持系和ms7不育系，以解决小麦ms7雄性核不育系无法繁殖的问题，获得的ms7雄性不育系可以用于生产制种，及生产杂交种。

上述技术体系也可以通过以下方式获得，即在普通野生型小麦的基础上，转入上述载体，再将转入了上述载体的植株与ms7雄性不育系杂交，杂交获得的植株再自交后进行筛选，即获得背景为纯合ms7突变的含有外源转入载体的保持系，含有该外源载体的保持系可以用于源源不断的生产保持系和ms7不育系。

序列表

<110> 未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司

北京大学

<120> 小麦育性相关基因TaMS7及其应用方法

<150> 201710321452.3

<151> 2017-05-09

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1923

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 1

atggcacttg gccgcgcgag atcgccggcg ctggtgctcg ccgccgccgt ccttggcgcg 60

ctctgcgtcg tcgcgctctc ggaggatggt gcgtgtgttc ggggttttgc atgtcagcta 120

gtacggagta cgtgcctgtg tctgttatca tgatcaatga ccgatggtgg cgtgcgtgtg 180

cagagcaact ggagaacctg cggttcgtgc agcacgcgca ggacgcgccg ctggtgtcgc 240

actacaacta catcgtggtg ggcggcggca cgtccgggtg cccgctggcg gcgacgctgt 300

cggagcactc gcgggtgctg ctgctggagc gcgggggcct cccctaccgc aacatgtcca 360

accaggagca cttcacggac gcgctggccg acacgtcgct ggcgtccccg gcgcagcggt 420

tcgtgtccac ggacggcgtg gtgaacgcgc gggcgcgggt gctgggcggc gggagctgcc 480

tcaacgccgg gttctacacg cgggccagca acgagtacgt gcgcacggcc gggtgggacg 540

ccggcctcgt caactcgtcg taccggtggg tggagcgcgc gctggtgttc cgcccggacg 600

tgccgccgtg gcaggccgcg ctccgggacg cgctgctgga ggccggcgtc acccccgaca 660

acggcttcac cttcgaccac gtcacgggga ccaagatcgg cggcaccatc ttcgacaaca 720

acgggcagcg ccacacggcc gccgacttcc tccggcacgc ccggccgcgg gggctcaccg 780

tggtgctcta cgccacggtg tcgcgggtcc tgttcaggag ccaggagggg gtgccgtacc 840

cggtggcgta cggggtggtg ttcgcggacc cgctgggggt gcagcaccgg gtgtacctcc 900

gggacggggg caagaacgag gtgatcctgt cggcggggac gctggggagc ccgcagctgc 960

tgatgctgag cggcgtgggc ccgcaggtgc acctggaggc gcacagcatc caggtgctgg 1020

tggaccagcc catggtcggg cagggcgtgg ccgacaaccc catgaactcg gtcttcatcc 1080

cgtcgccggt gccggtgggg ctgtccctgg tgcaggtcgt cgggatcacc aagtccggca 1140

gcttcatcga gggcgtgagc ggctccgagt tcggcatccc ggtgtccaac ggcgcccgcc 1200

ggctggccag cttcgggctc ttctccccgc agaccgggca gctcggcacg ctgccgccgg 1260

ggcagaggac gccggaggcg ctgcagcgcg cggcggaggc gatgcggcgg ctggacaggc 1320

gggcgttccg gggcggcttc atcctggaga agatcctggg gccggtgtcg acggggcaca 1380

tcgagctgcg cagcaccgac ccgcgcgcca acccggccgt gaccttcaac tacttccagg 1440

aggcggagga cctggagcgg tgcgtccggg ggatccagac gatcgagcgg gtgatccagt 1500

cgcgcgcctt ctccaacttc acctacgcca acaccaccgt ggagtccatc ttcaccgact 1560

cggccaactt ccccgtcaac ctgctgccgc gccacgtcaa cgactcccgc tcgccggagc 1620

agtactgcag ggagaccgtc atgaccatct ggcactacca cggcgggtgc cacgtcggcg 1680

ccgtcgtcga cgacaactac cgggtgttcg gggtcagggg gctcagggtc atcgacagct 1740

ccaccttcag gtactccccc ggcaccaacc cgcaggccac cgtcatgatg ctcggcaggt 1800

aaacgcaact ctcaaatcac ccccgcaatt atactgatct gaatgaactc aactaacaca 1860

actgttgtaa atctgtacag gtatatgggc ataaagattc aggccgagag atggaggaaa 1920

tga 1923

<210> 2

<211> 1954

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 2

atggcacttg gccgcgcgag atcaccggcg ctggtgctcg ccgccgccgt tcttggcgcg 60

ctctgcatcg tcgcactctc ggaggatggt gcgtgtgttc acctgcatgg tttttctggg 120

ggttttgcgt cagctacgtg cgtgtgtctt ttatcatgat caatggacgc tgtgatgatc 180

aatggtgccg tgcgtgtgca gagcaactgg agaacctgcg gttcgtgcag cacgcgcagg 240

acgcgccgct ggtgtcgcac tacaactaca tcgtggtcgg cggcggcacg tccgggtgcc 300

cgctggcggc gacgctgtcg gagcactcgc gggtgctcct gctggagcgc gggggcctcc 360

cctaccgcaa catgtcgaac caggagcact tcacggacgc gctggccgac acgtcgctgg 420

cgtccccggc ccagcggttc atctccacgg acggcgtggt gaacgcgcgg gcgcgggtgc 480

tgggcggcgg gagctgcctc aacgccggat tctacacgcg ggccagcaac gagtacgtgc 540

gcacggccgg gtgggacgcc ggcctcgtga actcgtcgta tcggtgggtg gagcgcgcgc 600

tggtgttccg ccccgacgtg ccgccgtggc aggccgcgct ccgggacgcg ctgctcgagg 660

ccggcgtcac ccccgacaac ggcttcacct tcgatcacgt cacggggacc aagatcggcg 720

gcaccatctt cgacaacaac gggcagcgcc acacggccgc cgacttcctc cggcacgccc 780

ggccccgggg gctcaccgtc gtgctctacg ccacggtgtc ccggatcctg ttcagaagcc 840

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tcgagcgggt gatccagtcg cgcgccttct ccaacttcac ctacgccaac accaccgtcg 1560

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gcggatgcca cgtcggcgcc gtcgtcgacg acaactaccg ggtgttcggg gtgagggggc 1740

tcagggtgat cgacagctcc accttcaggt actcccccgg caccaacccg caggccaccg 1800

tcatgatgct cggcaggtaa acgcaagtct gaaatgaccc tcgcaattat actgatctga 1860

atgaatgaat caactcaact caactaacac aactatgata aatctgtaca ggtatatggg 1920

cataaagatt caggccgaga gatggaggaa atga 1954

<210> 3

<211> 1952

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 3

atggcacttg gccgcgcgag atcgccgacg ctggtgctcg ccgccgcggt ccttggcgcg 60

ctctgcgtcg tcgcactctc ggaggacggt gcgtgtgttc acctgcatgg tttttctggg 120

ggttttgcac gtcagctacg tgcgttgtct cttttatcat gatcactgga cgctgtgatg 180

accaatggtg ccatacgtgt gcagagcaac tggagaacct gcggttcgtg cagcacgcgc 240

aggacgcgcc gctggtgtcg cactacaact acatcgtggt cggcggcggc acgtccgggt 300

gcccgctggc ggcgacgctg tcggagcact cgcgggtgct gctgctggag cgcgggggcc 360

tcccctaccg caacatgtcc aaccaggagc acttcacgga tgcgctggcc gacacgtcgc 420

tggcgtcccc ggcccagcgg ttcgtctcca cggacggcgt ggtgaacgcg cgggcgcggg 480

tgctgggcgg cgggagctgc ctcaacgccg ggttctacac gcgggccagc aacgagtacg 540

tgcgcacggc cgggtgggac gccggcctcg tcaactcgtc gtaccggtgg gtggagcgcg 600

cgctggtgtt ccgccccgac gtgccgccgt ggcaggccgc gctccgggac gcgctgctcg 660

aggccggcgt cacccccgac aacggcttca ccttcgacca cgtcacgggg accaagatcg 720

gcggcaccat cttcgacaac agcgggcagc gccacaccgc ggccgacttc ctccggcacg 780

cccggccccg gcggctcacc gtcgtgctct acgccacggt gtcgcggatc ctgttcagaa 840

gccaggaggg ggtgccgtac ccggtggcgt acggggtggt gttcgcggac ccgctggggg 900

tgcagcaccg ggtgtacctc cgggacggcg ggaagaacga ggtgatactg tcggcgggga 960

cgctggggag cccgcagctg ctgatgctga gcggcgtggg cccgcaggcg cacctggagg 1020

cgcacggcat ccaggtgctg gtggaccagc ccatggtcgg gcagggcgtg gccgacaacc 1080

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<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

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gatctttacc tcatgccgat ggagataaag ccctttcatc ctcctagcaa gacttatata 360

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gatttgagaa gtgagatgac ttcacgcata tatttctagg tattatatat caagcagaaa 480

tatgttattg gaagtacttg agtttgcatg gatgatgcaa ctatgtcggt cagcttgtct 540

cgctacatgg atgtttgatt cagctgaacc atgttatctc tcgcttggtt tttgtgcacc 600

atggatgtcc ccagttgatg aatcttatgg ttccatgtaa agcactttgc ttctatttat 660

tttgagaagg aaaacggctc ttcccttgtc caccgtccat ttattttgat cccatggtcc 720

aggttttaga actcctagtc ccggaaataa acaactatct tgcaagtgct tcatgtacaa 780

ttgcaacgat gagcaggtga ctaacctaat actccctccg tttctaaata tttgtctttc 840

tagatatttt aacaagtgac tacatacgga gcaaaatgag tggatctaca ctctaaaata 900

tgtctacgta catccgtata tagtagccat ttgaaatgtc tagaaagaca aatatttagg 960

aacagaggga gtatttatta tacttttata aagaatgttg gagtacccat ctctggggag 1020

cctctgcgtg tgaaaatgtc ctccgcgctg tttgttgcac gttggccacc cgcggctggc 1080

tccctggggc gctccgggcc atcgatctag gcggccgcct cgcacccgga ctgcttgcct 1140

ctgggtccat gacgaggggg tgcgggcgcg gttggatcca tcgtgatgtg gtgtttttgg 1200

tcacaccagt ttgtgccctc ttgttggttg tcctgcgcgt gatgggccga ccgaatctgc 1260

ctgtctgtcg tgttgaccac ccgcggctag ctccctgggg cgctccgggc cattgatcta 1320

ggcagccgcc tcgcacctgg actgcttgcc tctgggtcca tgacgagggg tgcgggtgca 1380

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ccctgcgcgt gatgggctga ccggatctgc ctgttagtgt tgtgttggcc acccgcggct 1500

ggctccttgg ggcgctccag gtcatcgatc taggcggtcg cctcgcaccc ggactgcttg 1560

cctctgggtc catgacgaga ggatgcgggc gcggtcggat ccatcatgat gtggtgtttt 1620

cggtcacacc agtttgtgct ctcttgttgg ttgtcctgcg cgtgatgggc cgaccggatc 1680

tgcctgtcag tgttgtgttg gccacccgcg gctggctcct tggggcgctc cgggctatcg 1740

atctaggcgt ccgcctcgca cccggactgc ttgcctctgg gtccatgacg aggaggtgcg 1800

gacgcggtcg gatccatcat gatgtggtgt tttcggtcac accagtttat gccctcttgt 1860

tggttgatct gcgcgtgatg ggccgactag atctgcctgt cagtgttgtg ttggccaccc 1920

gcggctggct ccatggggcg ctccgcgcca tcgatctagg gggccgcctc gcatccagac 1980

tgcttcagga actgacatcc gttcatttat tttgtcagtt catttatttg aggcaaattt 2040

cttcaggaac tgacatccgt tccatggggc atacgttggg gattggtttc tggcgaacgt 2100

tcgccagatt atctttaccg ctttttttta gtttctaggt ttttcttggt attttattat 2160

tttcttatag tttggaccga tctccttaca tcatagtttt gccttggtac ctgtaatatg 2220

tatttgtgct tgtatataaa aatggaggga gtatagtttt ttcgggaaaa atatagtgca 2280

cgcgcaaaac cgtctcaaga tcggccagta aaccctcccc cttgctgctt catcgcattt 2340

gatatgatat actcaacagc tcctcccgtc taaaaagaaa gttcatcact tctgcatttc 2400

acaaccgatg cattccattt gatataacca ttccctttct atactgacac aagtttatgg 2460

ggctgttctt tgcactgcaa ccgcctccgc attatttaac acatctaccc tcgatctacc 2520

cgcgcgctaa ctcgaggttt ataaaccaag cgaacttttc gcgtccctga agcgcaaagg 2580

atgccgagct cgccggcgca a 2601

<210> 17

<211> 2635

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 17

tgctgccaaa gaagaatgga gctttggagg tcaaccatta tcgaccaatc agcttgatcc 60

actctgttgc taagctaatc tccaaagtgc tcgttgcaag gctggcaggg gccctggata 120

aaatcatctc accggcgtag actgcatttc agaaaggcaa atgcagccac gagagctatc 180

agtacgtgca aagctgcgtt cggatgttac ataggacgaa gaaaaaggca cttttcttca 240

aactcgacat agcaaaggct tttgattcgg tgacatggga ggacttgctc gagctcaagc 300

aaaaaaatgg gtttccctcc tagatgggga aactggatag cgctgctact ctcttctacc 360

acctcctcct gcttgctcaa cgaaacgcag agccaatcaa tatctcatgg ttgtggcttt 420

aggcagggtg attcgctatc cctgctgctt ttcatcctgg cgatcgaccc tcttcaccac 480

ctccttcaag ctgctgcaga ggaagagatg atcgctcagc tgacaggccg tgggatcagc 540

atgtggatta gcttatacgc tgatgacgcc gtcattttcg ccaacccggt gaaggaagaa 600

gtggacacgc tgttgttttt gctcagcaga ttcggggagg ccacgggact gaagttaaac 660

caggcaaaat ctgaagtcat cccaattaac tgtgctgatg ttcagttaac tgaggttctg 720

caaaactttg gggggctgca gtccacgttc ccaaccacat acctgggact gccaatctct 780

ccaaggaagc taaggctggt gcatttccaa tttatcattg accggatacg ctcaaggttg 840

gctggttgga aaggcaagct gatgaacatg gcaggtagaa gggtactggt gcgtgctgtg 900

ttgatggcac tgccggtgtt tgcaatgaca gtactcaaag tgccgaagaa gattttaaaa 960

gaggtggaaa aagcaaggag gcagtttcta tgggcacatg atgagaatgt cactggcgcc 1020

aaatgcaagg tggcctgggg caaagtctgt cttccggtgg ccaagggggg gctaggtttg 1080

ttggacctcc atcgtttcag cacagctctc cggctgcgct ggttgtggct ctcctggcaa 1140

cagccacacc ggccctggat gaacttcccg gcccaaggag gacctggagc tgtttgcatc 1200

ggccaccttt gtgcacttgg gcaacggaaa aacagcgcgt ttctggactt gcaaatggat 1260

ctgggcggtg gcgctgcaac acgagttccc atcattgttt cagcatgcca gaagaaaaaa 1320

caggatggtt catgatgcgc tgacaaatga cacatgggta cgtgatctcc ggcatggcaa 1380

catagtagag attgctcacc ggtttttgca aatgtggaga aagattcagg gtgcaggcat 1440

tgttctctcc tccaacgagg accggatcag ctgggtggca accagaggag gaggaagcta 1500

ctcggctaag gctgcttacg atctacaaat cagtgacatt cctccttcag gaggcaaagc 1560

tgcgatttgg agggcttggg cgccaggcac ggtgaagatc ttcgcctggc tgctccacca 1620

ggacaagctt tggtgcaacg atcgcctgca acggcgaggg tggcccaatg ggtatttttg 1680

cgtatgctgc aacagaaatc tggaaagctc aatacacctt ttctgggact gcccttttgc 1740

ccgatctgtc tggccggcag tgtcgcgtag atatggttgc gctgtgctca aagaagcgcg 1800

ggacgcaggt cacagttccc tcagacattg ggaaagactg accgcactaa cgcctcaaag 1860

ttgcagaaaa gggctaaggt cgatgctgtt gctgatcact tgggagtttt ggaaagagag 1920

gaacgcgtgt gtatttagag gaaaaacgcc ccagacggag gatgttcagc gagccatcaa 1980

gaacacgatg gagctctggc gggcagcagg agctcgatgc attgaggccc tgttctgtag 2040

cgagataaaa cgtacggctc atgtagctgg cctagttttg gccattctta gctcttctca 2100

aaccatgatc acttgatcgc ccatgtattt cccactgctt tcttctaaat caatgaagca 2160

ggtgaacccg gatctttcaa aaaaaaacct cctgatgtac tcagtgtcgt ggccggtgat 2220

ttaaccgtgt ccactgatta attggaatgt atggtgttcc aggtcaaaaa agaatgtcaa 2280

atgtaattct ttcggaaaaa atatagtgca cgcgcaaaac cgtctcaaga ttggccagta 2340

aaccctctcg cttgctgctc cgtcgcattt gatatactca acagctcctc ctgtctaaaa 2400

agaaagttca tcacttctgc atttcacgac caatgcattg catttgatat aaccattccc 2460

tttctatagt aacacatgtt tatgggctcc tcgcggctct tctttgcact gcaaccgcct 2520

ccgcattatt taacacatct accctcgatc tacccgcgcg ctaactccag gtttataagc 2580

gaagcgaact tttcgcgtcc ctgaagcgta aaggatgccg agctcgccgg cgcaa 2635

<210> 18

<211> 2821

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 18

ctgacatagt acatgtaatc tttaaatcca taaccttctg tttctatcag tgctactagg 60

ttgtaaaatg ttatgtctga caccatcata gatctctcaa tgttgtctct gtcatggaaa 120

tgcatcctca attcccaaac ctcatcatcc agactgcaaa taatataaag cactaatgaa 180

acactaataa aactaataac caaatgtaaa ccctagggca caggacaaac aaagcacaac 240

atcagaacta atctaaaaat gtcaacccta ggcacaggac aaacaaagca cataatctga 300

actaatctaa ataatgtcct agggcacatg acaacaaaat cacaacattt gacacttgta 360

ctgcatttga taggatagaa caatatgaac actaacccta ggggtaccct cgcaacacaa 420

ttgaatggag taccctggca acgcaattga atggagaacg ggaagggaag agcaaagaaa 480

agtggatctc actatacgcc gccgaaggat gacgcgatgt gctggcttcc cgtcgaattg 540

gccttcaccg ccgcggcgaa tgctctggcc gccctgtatt ccatcgaata ttgcgggtcc 600

tcctcctcct cttcctctga cggcttgcta gggttcgaac tcgcgcacag ctcgcctaga 660

tccactgcgg gtcctcctcc actacgtacg atgcgtgcgg cgctgccggg cggagagccg 720

ccaccagcat ctccaccttt cgccggactg cgcatctctg tgtttctatg gaatggcgac 780

ggcaccaatg ggggagggcg acggcagcgg gagcgaggag gagggggaag aagaatgggg 840

gagggcgacg gcggcgggag cgaggaggag ggggaagaag aatgggggag ggcgacggcg 900

gcgggagcga ggaggagggg gaagaagaat gggggagggc gacggcggcg ggagcgagga 960

gggggaaaag agacggatgc gggagtggat gactaaagac gagccctaac ggcgccgtct 1020

aacgccgact gccggctgtc gggacggcct ggagtgccat gtaggcgaaa aacgggccca 1080

acctgtcata aactcactta acacggcccg atccgccgat cagtggtttt tgcaaaacaa 1140

ttacgataga cgtggtgctt tctgcaacaa ttctgtaacc taatgttttc cgcaaaccta 1200

gccctcaaag tggtggtttt atgcaattta ctctgattac agttgatctt acttttgtgg 1260

tgatcacagg tctcttcgta tgtgatggcg gatggggttg gcctaacttt cttggactca 1320

agaaactcaa gaaaggctat gttgtagggt cgagctgcat tgtgaaggca gatctcacta 1380

tcgttggttt atacaatgat ggctagatct ttacctcatg cctatggaga gataaagccc 1440

tttcatcctc ctagcaagac ttatatatga gatgatgttg tggtagcagc actaaaaact 1500

ttttttttag aaaaggagca gcactaaaaa cttggggtga ttagtagtaa tgagctggat 1560

ttgagaagtg agatgacttc acgcatatat ttctaggtat tatatatcaa gcagaaatat 1620

gatattggaa gtacttgtgt ttgcatggat gatgcaacta tgtcggtcag cttgtctcgc 1680

tacatggatg tttgattcag ctaaaccatg ttatctctcg cttggttttt gtgcaccatg 1740

gatgttccag ttgatgaatg gttccatgta aagcgctttg cttctattta ttttgggaag 1800

gaaaacggct ctttccattg tccaccgtcc atttattttg atcccatggg ccagatttta 1860

gaactcccgg tcccggaact aaactaatat ttattacttc tataaagaat gttggagtat 1920

caggtcttcg gggagccttt gcgtgtgaaa atgtcctccg cgttgttcgt tgcatgttgg 1980

ccacccgcgg ttggctccct ggggcgctct gggccgtccg atctaggcag gcgcctcaca 2040

cccggacgac ttgcctatgg gtccatgccg ggggggctgc gggcacggtt gggtccatcg 2100

tgatgtggtg ttttcgatca caccagtttg tgccctcttg ttggttgcct tgcgcgtgac 2160

gggccgaccc tgttggtgta gttcgcttgt gccaggcaag ccgcgcacac ccccggatcg 2220

gggtggcgcg tgttaggaaa ccggagaggg ccatccggcc agccgtcgcg atggcgggcc 2280

agccggccaa ggttcattta tttgaggcaa atttctttag tgacatccgt gctatggggc 2340

gtttgctggg gattggtttc tagcgaacgt tcgccagatt atctttaccg ctttctttta 2400

gtatctaggt ttttcttagt attttattat ttttctcata gtttggaccg atctcctcac 2460

gtcagaatgt caaatgtaat cctttcgaaa aaaatatagt gcacgcgcga aaaccgtctc 2520

aagattggcc agtaaaccct cctgcttact gctccatcgc atttgatata ctccttctgt 2580

gtaaaaagaa tgttcatcac ttttgcattt cacaaccaat gcattgcatt tgatataacc 2640

attccctttc tatagtaaca caagtttatg ggctcctcgc agctgttctt tgcactgcaa 2700

ccgcctccgc attatttaac agatctaccc tcgatctacc cgcgcgctaa ctcgaggttt 2760

ataaaccaag cgaacttttc gcgtccctga agcgcaaagg atgccgagct cgccggcgca 2820

a 2821

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 19

aagcttctga catagtacat gtaatcttta aatccataac 40

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 20

ggatccttgc gccggcgagc tcggc 25

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 21

ctggtggacc agcccatggt 20

<210> 22

<211> 1453

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 22

tatttcaagg agccatattt gaatgtaatt catggcataa tattgtattt ggggaacctg 60

gtttagacag attaatttgt ttttttccac ttattctcta ggcatagtct tttagtgcct 120

gtttgttgat tattatgaaa cccagtcatc cctttaacat gcatttctct gcattgcaaa 180

ataagaagga aaaacttatg ttgcaaaggc atgacggtgg ttcaagcaac aatacttcga 240

tcaaaaaaat tggaaaccgg ttgccacatc cacctaccaa tttccattga taacaagagt 300

agcaaaccag aatactgtgc aggatgcatt tacagttttg tactagaaac ttaatttcat 360

gaaattacat accactattt tacttggtgg ttgttacatg ctacaaacgc caggttccct 420

tcagagggat ccagcaagcc atcatcttat ctatacaggg accgagtaca tgtcaaagga 480

acatgatgag ttaagaatgg aacagccaaa ggcagaaatg acttgaacat tttttttcct 540

tgtttccaac ttgccctact tgcctgctac ctatatattg gcttgcgaaa ttctctccct 600

acctatgtta tcaggaacca gaaaatgcta cttcggcatc tctgttgtcc agaataccca 660

agaagtcacc aacaattgca tgcttgcata agaataattc atatagtgag gttttcttgg 720

atggccgtga aggagccaca aatgtttccg cccatgtctg ggaatgtcgc acatcctggc 780

aagggtttca ccttgccttt acggtcaaca cttacagggt acttgaggag gtggcctctc 840

atctcagtca cctcatttgc aaagaactga tcccagttat gttgcccgag ttgacgaacc 900

cgcctcatgc actctaggct ctctggatgg ttaaagtctt cctcgataat tccaatatgc 960

tcagcccaga gggacattct gtagccataa atctacataa aaaatcacca aacttgattt 1020

aagagtataa tccagaaata ccagctgcgt cataactaga ttattaccct aagagatgag 1080

atgatatacc ccgacaacct ttttcacttg ctgttttaga atgcacatat tagtatttat 1140

attcacataa ctgtacttgt agaattgcca ccaacagtat ttatgtgtca ttacatgtct 1200

atagtttagt gtatatataa ttgaaaaaaa ggtaaatgtt aaatgggtgt agttggaggc 1260

agtctctcta aataaggtga aacaattgta atgaagcagc agttctaagc aacgcataac 1320

atcaggaaga caagtacaaa atctgcaggc acaatctcaa aatgcaagct catgaaaaca 1380

cctgtcttct gcaggtacca aaagatgtga ttcagcagct tgaacttgaa acatgaggca 1440

ttacctgtcc acg 1453

<210> 23

<211> 1446

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 23

tatttcacgg agccaaattt gcatgtaatt catggcataa tattgtattt gggggacctg 60

gtttagaaca gattaatttg gtttttccac ttattctcta ggcatagtct tttagtgcct 120

gtttgttgat tattatgaaa cccatacatc cctttaacat gcatttctct gcactgtaaa 180

ataagaagga aaacttatgt cccaaaggca tgatggtggt tcaagcaaca atacttcggt 240

aaaaaaatgg aaccggttgc cacatccacc caccaatttc cattgatgac aagaggagca 300

aaccaaggcc caacattgct tcagaatagt gtgaaggatg catttacagt tttgcactag 360

aaactttgtt tcatcaaatt acatataaca tactactatt tctcttggtg gttgtcactt 420

gctacaaacg ccaggttccc ttcagaggga tccagcatgt aatcatctta catatacagg 480

gaccgaatac atgtaaaagg aacatgatta gttaagatgg gaacaaccaa aaggcagaaa 540

tgacttgatt tttttttcct tgtttccaac ttgccctact tgcctgctac ctacatattg 600

gcttgcgaaa ttctctccct acctatgtta tcaggaacca gaaagtgcta cttcggcatc 660

tctgttgtcc ataataccca agaagtcacc aacaattgca tgcttgcata agcagaattc 720

atattgtgag gttttcctgg atggccgtga aggagccaca aatgtttccg cccatgtctg 780

ggaatgtcgc acatcctggc aagggtttca ccttgccttt acggtcaaca cttacagggt 840

acttgaggag gtggcctctc atctcagtca cctcatttgc aaagaactga tcccagttat 900

gttgcccgag ttgacgaacc cgcctcatgc actctaggct ctctggatgg ttaaagtctt 960

cctcgataat tccaatatgc tcagcccaga gggacattct gtagccataa atctacataa 1020

aaaatcacca aacttgattt agagtataat ccagaaatac cagctgcgtc ataagtcata 1080

actagattat taccctaaga gatgagataa tatacccaga caaccttttt cactgctgtt 1140

ttagaatgca catattagta tttaattcac ataagaactg tacttgtaga attgccacca 1200

acagtatgta tgtgtcatta cgtgtctata gtttagtgta tatataatta aaaaaaggta 1260

aatgttaaat gggcgtagtt ggaggcagtc tctctgaaaa cgtaaaaaat aagtaaggtg 1320

aaacaattgt aatgaagcag tggttctaag caacgcataa catcaggaag acaagtacaa 1380

aatctgcagg cacaatctca aaatgcaagc tcatgaaaac acctgtcttc tgcaggtacc 1440

aaaaaa 1446

<210> 24

<211> 1472

<212> DNA

<213> 小麦(Triticum aestivum L.)

<400> 24

tatttcacgg agccaaattt gcatgtaatt cgtggcataa tattgtattt gggggacctg 60

gtttagaaca gattaatttg gtttttccac ttattctcta ggcatagtct tttagtgcct 120

gtttgttgat tactatgaaa cccagacatc cctttaacat gcatttctct gcattgcaaa 180

ataagaaaga aaacttatgt tgcaaaggca tgatggtggt tcaagcaaca atacttcggt 240

aaaaaaatgg aaaccggttg caacatccac ccaccaattt ccattgatga caagagtagc 300

aaaccaaggc ccaacattgc ttcaaaaaac tgtgcaggat gcatttacag ttttgcacta 360

gaaacttagt ttcatcaaat tacatataac atactactat ttctcttggt ggttgtcact 420

tgctacaaac gccaggttcc cttcagaggg atccagcatg taatcatctt acctatacag 480

ggaccgaata catgtaaaag gaacatgatt agttaagacg ggaacaacca aaaggcagaa 540

atgacttgaa ttttttttcc ttgtttccaa cttgccctac ttgcctgcta cctacatatt 600

ggcttgcgaa attctctccc tacctatgtt atcaggaacc agaaagtgct acttcggcat 660

ctctgttgtc cagaataccc aagaagccaa caattgcatt cttgcataag cagaattcat 720

attgtgaggt tttcctggat ggccgtgaag gagccacaaa tgtttccgcc catgtctggg 780

aatgtcgcac atcctggcaa gggtttcacc ttgcctttac ggtcaacact tacagggtac 840

ttgaggaggt ggcctctcat ctcagtcacc tcattggcaa agaactgatc ccagttatgt 900

tgcccgagtt gacgaacccg cctcatgcac tctaggctct ctggatggtt aaagtcttcc 960

tcgataattc caatatgctc agcccagagg gacattctgt agccataaat ctacataaaa 1020

gatcaccaaa cttgatttag agtataatcc agaaatacca gctgcgtcat aactagatta 1080

ttaccctata agagatgaga tgatataccc cgacaacctt tttcacttgc tgttttagaa 1140

tgcacatatt agtatttata ttcacataag aactgtactt gtataattgc caccaacagt 1200

atttatgtgc cattacgtgt ctatagttta gtgtatatat aataaaaaag ggtaaatgtt 1260

aaataggtgt agttggaggc agtctctctg aaaacgtaaa aaataagtta aaacaattgt 1320

aatgaagcag cggttctaag caacgcataa catcaggaag acaagtacaa aatctgcagg 1380

cacaatctca aaatgcaagc tcatgagaac acctgtcttc tgcaggtacc aaaaaatgtg 1440

attcagcagc ttgaacttga aacatgaggc at 1472

<210> 25

<211> 1487

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 25

atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca 60

ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc 120

gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg 180

gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcggcctg cggcctggtc 240

caggcacaag tcctcttcca ggggtttaac tgggagtcgt gcaagcagca gggaggctgg 300

tacaacaggc tcaaggccca ggtcgacgac atcgccaagg ccggcgtcac gcacgtctgg 360

ctgcctccac cctcgcactc cgtctcgcca caaggctaca tgccaggccg cctatacgac 420

ctggacgcgt ccaagtacgg cacggcggcg gagctcaagt ccctgatagc ggcgttccac 480

ggcaggggcg tgcagtgcgt ggcggacatc gtcatcaacc accggtgcgc ggaaaagaag 540

gacgcgcgcg gcgtgtactg catcttcgag ggcgggactc ccgacgaccg cctggactgg 600

ggccccggga tgatctgcag cgacgacacg cagtactcgg acgggacggg gcaccgcgac 660

cgggcgaggg gttcgcggcg gcgcccgaca tcgaccacct caacccgcgc gtgcagcggg 720

agctctccgc ctggctcaac tggctcaggt ccgacgccgt ggggttcgac ggctggcgcc 780

tcgacttcgc caagggctac tcgccggccg tcgccagaat gtacgtggag agcacggggc 840

cgccgagctt cgtcgtcgcg gagatatgga actcgctgag ctacagcggg gacggcaagc 900

cggcgcccaa ccaggaccag tgccggcagg agctgctgga ctggacgcgg gccgtcggcg 960

ggcccgccat ggcgttcgac ttccccacca agggcctgct gcaggcgggc gtgcaggggg 1020

agctgtggcg gctgcgcgac agctccggca acgcggccgg cctgatcggg tgggcgcccg 1080

agaaggccgt caccttcgtc gacaaccatg acaccgggtc gacgcagaag ctctggccgt 1140

tcccatccga caaggtcatg cagggctacg cctacatcct cacccatcca ggagtcccct 1200

gcattttcta cgaccacatg ttcgactgga acctgaagca ggagatatcc acgctgtctg 1260

ccatcagggc gcggaacggc atccgcgccg ggagcaagct gcggatcctc gtggcggacg 1320

cggacgcgta cgtggccgtc gtcgacgaga aggtcatggt gaagatcggg acaaggtacg 1380

gcgtgagcag cgtggtcccg tcggatttcc acccggcggc gcacggcaag gactactgcg 1440

tctgggagaa agcgagcctc cgcgtcccgg cggggcgcca cctctag 1487

<210> 26

<211> 2736

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 26

tgcaccggac actgtctggt ggcataccag acagtccggt gtgccagatc agggcaccct 60

tcggttcctt tgctcctttg cttttgaacc ctaactttga tcgtttattg gtttgtgttg 120

aacctttatg cacctgtgga atatataatc tagaacaaac tagttagtcc aatcatttgt 180

gttgggcatt caaccaccaa aattatttat aggaaaaggt taaaccttat ttccctttca 240

atctccccct ttttggtgat tgatgccaac acaaaccaaa gaaaatatat aagtgcagaa 300

ttgaactagt ttgcataagg taagtgcata ggttacttag aattaaatca atttatactt 360

ttacttgata tgcatggttg ctttctttta ttttaacatt ttggaccaca tttgcaccac 420

ttgttttgtt ttttgcaaat ctttttggaa attctttttc aaagtctttt gcaaatagtc 480

aaaggtatat gaataagatt gtaagaagca ttttcaagat ttgaaatttc tccccctgtt 540

tcaaatgctt ttcctttgac taaacaaaac tccccctgaa taaaattctc ctcttagctt 600

tcaagagggt tttaaataga tatcaattgg aaatatattt agatgctaat tttgaaaata 660

taccaattga aaatcaacat accaatttga aattaaacat accaatttaa aaaatttcaa 720

aaagtggtgg tgcggtcctt ttgctttggg cttaatattt ctcccccttt ggcattaatc 780

gccaaaaacg gagactttgt gagccattta tactttctcc ccattggtaa atgaaatatg 840

agtgaaagat tataccaaat ttggacagtg atgcggagtg acggcgaagg ataaacgata 900

ccgttagagt ggagtggaag ccttgtcttc gccgaagact ccatttccct ttcaatctac 960

gacttagcat agaaatacac ttgaaaacac attagtcgta gccacgaaag agatatgatc 1020

aaaggtatac aaatgagcta tgtgtgtaat gtttcaatca aagtttcgag aatcaagaat 1080

atttagctca ttcctaagtt tgctaaaggt tttatcatct aatggtttgg taaagatatc 1140

gactaattgt tctttggtgc taacataagc aatctcgata tcaccccttt gttggtgatc 1200

cctcaaaaag tgataccgaa tgtctatgtg cttagtgcgg ctgtgttcaa cgggattatc 1260

cgccatgcag atagcactct cattgtcaca taggagaggg actttgctca atttgtagcc 1320

atagtcccta aggttttgcc tcatccaaag taattgcaca caacaatgtc ctgcggcaat 1380

atacttggct tcggcggtag aaagagctat tgagttttgt ttctttgaag tccaagacac 1440

cagggatctc cctagaaact gacaagtccc tgatgtgctc ttcctatcaa ttttacaccc 1500

tgcccaatcg gcatctgaat atcctattaa atcaaaggtg gatcccttgg ggtaccaaag 1560

accaaattta ggagtgtaaa ctaaatatct catgattctt ttcacggccc taaggtgaac 1620

ttccttagga tcggcttgga atcttgcaca catgcatata gaaagcatac tatctggtcg 1680

agatgcacat aaatagagta aagatcctat catcgaccgg tatacctttt ggtctacgga 1740

tttacctccc gtgtcgaggt cgagatgccc attagttccc atgggtgtcc tgatgggctt 1800

ggcatccttc attccaaact tgttgagtat gtcttgaatg tactttgttt ggctgatgaa 1860

ggtgccatct tggagttgct tgacttgaaa tcctagaaaa tatttcaact tccccatcat 1920

agacatctcg aatttcggaa tcatgatcct actaaactct tcacaagtag atttgttagt 1980

agacccaaat ataatatcat caacataaat ttggcataca aacaaaactt ttgaaatggt 2040

tttagtaaag agagtaggat cggctttact gactctgaag ccattagtga taagaaaatc 2100

tcttaggcat tcataccatg ctgttggggc ttgcttgagc ccataaagcg cctttgagag 2160

tttataaaca tggttagggt actcactatc ttcaaagccg agaggttgct caacatagac 2220

ctattcaccc catttgatca cttttttggt ccttcaggat ctaatagtta tgtataattt 2280

agagtctctt gtttaatggc cagatatttc taattaatct aagaatttat gatatttttt 2340

aattttttat catgtctgat gagaattaac ataaaggctc aattgggtcc tgaattaata 2400

atagagtgaa aattaatcca gaggctctat tagaaccttc aattagtaat accaagatat 2460

atataagata gtagagtata gtttaaatgt tggcattgtt cattctttct tttgttattt 2520

aatttatgct ttccacggtg gttagtggtt acttctgaag ggtccaaata atgcatgaag 2580

agtttgagga caagaagtct gccctaaaaa tagcgatgca aaggcatggt gtccaagcca 2640

tacatatagc gcactaattt tatcagcaga acaatggtat ttataggtcc tagtgcccag 2700

gcaacaagag acacgaataa agcatcgatc acgaca 2736

<210> 27

<211> 344

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 27

tgacaaagca gcattagtcc gttgatcggt ggaagaccac tcgtcagtgt tgagttgaat 60

gtttgatcaa taaaatacgg caatgctgta agggttgttt tttatgccat tgataataca 120

ctgtactgtt cagttgttga actctatttc ttagccatgc caagtgcttt tcttattttg 180

aataacatta cagcaaaaag ttgaaagaca aaaaaaaaaa cccccgaaca gagtgctttg 240

ggtcccaagc tactttagac tgtgttcggc gttcccccta aatttctccc cctatatctc 300

actcacttgt cacatcagcg ttctctttcc cctatatctc cacg 344

<210> 28

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 28

atggtgtcca agggcgagga ggacaacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca aaccgccaag ctcaaggtga ccaagggtgg ccccctcccc 180

ttcgcctggg acatcctctc cccacaattc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cctcaagctc tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aagactcctc cctccaagac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctccgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcaaaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctcaagg gcgagatcaa gcaaaggctc aagctcaagg acggcggcca ctacgacgcc 540

gaggtgaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcaac tccccggcgc ctacaacgtg 600

aacatcaagc tcgacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga gcaatacgag 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtg a 711

<210> 29

<211> 1149

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 29

cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc 60

agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg 120

attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc 180

ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag 240

tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 300

cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tgaattcaac cgtctcttcg tgagaataac 360

cgtggcctaa aaataagccg atgaggataa ataaaatgtg gtggtacagt acttcaagag 420

gtttactcat caagaggatg cttttccgat gagctctagt agtacatcgg acctcacata 480

cctccattgt ggtgaaatat tttgtgctca tttagtgatg ggtaaatttt gtttatgtca 540

ctctaggttt tgacatttca gttttgccac tcttaggttt tgacaaataa tttccattcc 600

gcggcaaaag caaaacaatt ttattttact tttaccactc ttagctttca caatgtatca 660

caaatgccac tctagaaatt ctgtttatgc cacagaatgt gaaaaaaaac actcacttat 720

ttgaagccaa ggtgttcatg gcatggaaat gtgacataaa gtaacgttcg tgtataagaa 780

aaaattgtac tcctcgtaac aagagacgga aacatcatga gacaatcgcg tttggaaggc 840

tttgcatcac ctttggatga tgcgcatgaa tggagtcgtc tgcttgctag ccttcgccta 900

ccgcccactg agtccgggcg gcaactacca tcggcgaacg acccagctga cctctaccga 960

ccggacttga atgcgctacc ttcgtcagcg acgatggccg cgtacgctgg cgacgtgccc 1020

ccgcatgcat ggcggcacat ggcgagctca gaccgtgcgt ggctggctac aaatacgtac 1080

cccgtgagtg ccctagctag aaacttacac ctgcaactgc gagagcgagc gtgtgagtgt 1140

agccgagta 1149

<210> 30

<211> 310

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 30

ctagacttgt ccatcttctg gattggccaa cttaattaat gtatgaaata aaaggatgca 60

cacatagtga catgctaatc actataatgt gggcatcaaa gttgtgtgtt atgtgtaatt 120

actagttatc tgaataaaag agaaagagat catccatatt tcttatccta aatgaatgtc 180

acgtgtcttt ataattcttt gatgaaccag atgcatttca ttaaccaaat ccatatacat 240

ataaatatta atcatatata attaatatca attgggttag caaaacaaat ctagtctagg 300

tgtgttttgc 310

Claims

1.一种育性相关基因，其特征在于所述育性相关基因TaMS7的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

（a）如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示的核苷酸序列；

（b）其编码氨基酸序列如SEQ ID NO：7、8或9所示的核苷酸序列。

2.一种表达盒、表达载体或工程菌，其特征在于所述表达盒、表达载体或工程菌包含权利要求1所述的育性相关基因。

3.一种育性恢复基因、表达盒、表达载体或工程菌在调控小麦育性中的应用，其特征在于所述育性恢复基因、表达盒、表达载体、工程菌含有如下所示的核苷酸序列之一：

（a）如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示的核苷酸序列；

4.一种调控小麦育性的方法，所述方法通过过表达、抑制或突变植株中的育性恢复基因，影响其表达水平，进而调控植物育性，其特征在于：所述育性恢复基因TaMS7的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

（a）如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示的核苷酸序列；

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的突变包括在育性恢复基因的核苷酸序列上进行取代、缺失或添加一个或多个核苷酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的突变是用物理方法、化学方法、基因沉默方法或基因编辑方法所导致的基因突变。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述化学方法是用EMS等诱变剂处理所导致的诱变，所述基因沉默方法是RNAi，所述基因编辑方法是ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法包括用TaMS7基因的核苷酸序列互补由TaMS7基因突变所导致的雄性不育表型，使ms7雄性不育系恢复成可育。

9.权利要求4-8之任一所述的方法在调控小麦育性中的应用。

10.一种小麦雄性不育系的生产或繁殖方法，所述方法包括以下步骤：

（a）向由TaMS7基因突变所导致的ms7雄性不育系中转入下述载体，以获得含有下述载体的保持系，所述载体包含：育性恢复基因TaMS7，所述育性恢复基因TaMS7可以恢复ms7雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表达时，会干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，从而使得所述植株中产生的可育雄性配子都是不含所述载体的；和筛选基因，所述筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣；和

（b）将转入上述载体后形成的保持系植株自交，同时产生不含载体的ms7雄性不育系种子和含载体的保持系种子；或是用保持系植株的花粉给ms7不育系植株授粉上，使ms7不育系授粉繁殖出ms7不育系种子，

其中所述的育性恢复基因TAMS7的核苷酸序列选自下列组的序列之一：

（a）如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示的核苷酸序列；

11.根据权利要求10所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述育性恢复基因TAMS7由一个花粉特异性表达的启动子驱动表达。

12.根据权利要求10-11所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述花粉特异性表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:16、17或18所示。

13.根据权利要求10所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述花粉失活基因是barnase基因、淀粉酶基因、DAM甲基化酶。

14.根据权利要求10所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述花粉失活基因是玉米α淀粉酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。

15.根据权利要求10所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述的花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。

16.根据权利要求15所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述启动子是PG47启动子或Zm13启动子。

17.根据权利要求10所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述的筛选基因是抗生素抗性基因、抗除草剂基因、荧光蛋白基因。

18.根据权利要求10所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述筛选基因是氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因DsRED、mCherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因。

19.一种小麦保持系的生产或繁殖方法，所述方法包括以下步骤：

（a）向由TaMS7基因突变所导致的ms7雄性不育系中转入下述载体，即获得了ms7雄性不育系的保持系，所述载体包含：育性恢复基因TaMS7，所述育性恢复基因TaMS7可以恢复ms7雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表达时，会干扰植株中含有该花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，从而使得所述植株中产生的可育雄性配子都是不含所述载体的；和筛选基因，所述筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣；和

（b）将转入上述载体后形成的保持系植株自交，同时产生不含载体的ms7雄性不育系种子和含载体的保持系种子，

（a）如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示的核苷酸序列；

20.根据权利要求19所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述的育性恢复基因TaMS7由一个花粉特异性表达的启动子驱动表达。

21.根据权利要求19-20所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述花粉特异性表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:16、17或18所示。

22.根据权利要求19所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述的花粉失活基因是barnase基因、淀粉酶基因、DAM甲基化酶。

23.根据权利要求19所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述花粉失活基因是玉米α淀粉酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。

24.根据权利要求19所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述的花粉失活基因与偏好于雄性配子表达的启动子相连。

25.根据权利要求24所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述启动子是PG47启动子或Zm13启动子。

26.根据权利要求19所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述的筛选基因是抗生素抗性基因、抗除草剂基因、荧光蛋白基因。

27.根据权利要求19所述的生产或繁殖方法，其特征在于，所述筛选基因是氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、红色荧光基因DsRED、mCherry基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因。