CN112251459B

CN112251459B - 一种制备和鉴定雄性配子体不育的方法

Info

Publication number: CN112251459B
Application number: CN202010879337.XA
Authority: CN
Inventors: 张毅; 陈云; 杜双林
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2023-01-20
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN112251459A

Abstract

本发明公开了一种制备和鉴定雄性配子体不育的方法，将可能的雄性配子体功能相关基因的下调表达元件，同直观的花青素性状相关基因或基因片段连入同一个植物表达载体，在转基因后代中，根据花青素相关性状是否随雄配子传递而判断相关基因是否为雄配子体不育相关基因，和雄配子体不育是否制备成功。本发明的方法具有通用、直观、高效和准确的优点，在分离、鉴定雄性配子体不育相关基因，制备雄性配子体不育，繁殖孢子体不育等方面具有重要作用。

Description

一种制备和鉴定雄性配子体不育的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种制备和鉴定雄性配子体不育的方法与应用，还涉及水稻芽鞘紫线基因的改造基因OsMYB76R，上述方法、基因和应用相关的植物表达载体。

背景技术

植物雄性不育在花粉发育研究和杂种优势研究中具有重要的作用。雄性不育包括孢子体不育和配子体不育。孢子体不育受植株本身的基因型控制，花药中的所有花粉都不育，在田间通常表现花药形态、颜色、大小异常，不结实，很容易发现和鉴定；孢子体不育基因既可通过雌配子在世代间传递，也可通过雄配子在世代间传递。而配子体不育受花粉基因型控制，花药中一半花粉可育，另一半花粉不育，其花药在田间同野生型相比无明显差异，结实也正常，难以直接发现和鉴定；雄配子体不育基因只能通过雌配子传递。由于上述差异，使得雄配子体不育的制备、发现和鉴定非常困难，需要结合室内的显微观察、PCR和电泳等手段进行，客观上造成配子体不育材料稀少，相关基础和应用研究滞后于孢子体不育。花青素性状在植物中肉眼可见，在各器官均可表现。转录因子基因OsMYB76是花青素合成调控必需基因，而花粉特异或高表达基因同雄配子体的正常功能密切相关，将花青素合成调控必需基因同抑制雄配子体功能相关基因的元件连锁，开发一种简单易行的制备和鉴定雄性配子体不育的方法具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供制备和鉴定雄性配子体不育的方法，为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

将可能的雄性配子体功能相关基因的下调表达元件，同直观的花青素性状相关基因或基因片段连锁转入植物中，在转基因后代中，根据花青素相关性状是否随雄配子传递而判断相关基因是否为雄配子体不育相关基因，和雄配子体不育是否制备成功。

具体包括以下步骤：

(1)根据基因表达数据(在线表达数据库，文献中的基因表达数据，或自行进行花药或花粉转录组测序、基因芯片或RT-qPCR等)分析，初步确定在花粉中表达的基因为雄性配子体不育相关基因的候选基因，如有冗余基因同时起作用，需同时对冗余基因进行下调或敲除。本发明实施例选用的是水稻基因Loc_Os05g40740，也可选用其他雄配子体发育相关基因，选用其他雄配子体发育相关基因不限制本发明专利所申明的权利要求的保护；下调冗余基因也不限制本发明的权利要求。

(2)根据候选基因序列与基因结构分析，构建候选基因Loc_Os05g40740下调表达载体 pXi。本发明实施例采用的是干涉，干涉片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；干涉用的启动子为花粉表达启动子，优选为花粉特异表达启动子，更优选为候选基因本身启动子，本发明使用Loc_Os05g40740本身启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；终止子是Tnos。

(3)改造水稻花青素合成必须基因OsMYB76序列：通过碱基替换和人工合成，去掉序列中的常用酶切位点，得到OsMYB76R。将人工合成的OsMYB76R置于35S等组成性启动子，或OsMYB76基因本身的启动子，或胚乳等特异性启动子下游，Tnos等终止子上游，将获得的启动子+OsMYB76R基因+终止子区段同上述Loc_Os05g40740基因的干涉片段连接，获得载体pXi-OsMYB76R。本发明在OsMYB76R基因两边用的是35S启动子和Tnos终止子。

(4)将载体pXi-OsMYB76R转入一OsMYB76基因(水稻)或其同源基因(其他物种) 异常，花青素缺失的植物中。本发明用的植物是水稻中九B，其中的OsMYB76基因发生了功能缺失性突变，所有器官均无紫色。在水稻中，中九B、9311和明恢63等品系中的 OsMYB76基因均发生功能缺失突变，所有器官没有紫色表现，均可作为待转入的寄主植物。使用中九B之外的其他OsMYB76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的植物品系，不限制本发明专利所申明的权利要求的保护。

(5)在T₀代中选出任一器官有紫色的转基因阳性株。

(6)以选出的阳性株为父本，同OsMYB76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的母本杂交，并让阳性株自交。在水稻中，9311、明恢63和中九B等品系中的OsMYB76基因均发生功能缺失突变，所有器官没有紫色表现，均可作为杂交母本。本发明用的植物是水稻中九B-osabcg15(为免除杂交时去雄环节，以OsMYB76基因异常的中九B 为轮回父本，以OsABCG15基因异常的核不育突变体osabcg15(Wu et al.,2014)为非轮回母本，回交选育获得)，使用中九B-osabcg15之外的其他OsMYB76基因(水稻)或其同源基因(其他物种)异常，花青素缺失的植物品系，不限制本发明专利所申明的权利要求的保护。

(7)调查杂交F₁代具有紫色个体同没有紫色个体的比例。如果全部个体无紫色，或有紫色的个体所占比率远小于50％，说明转基因成分无法或难以随花粉在代间传递，候选基因为配子体不育相关基因，转基因阳性株为雄性配子体不育材料。原理：在一般情况下，雄性配子体不育相关基因的抑制，会导致带色素基因和抑制元件的转基因花粉全部或部分(随抑制效果而定)致死，不能或极少产生后代，因此F₁代具有紫色个体的几率理论上为0或远小于50％，如果候选基因不是雄性配子体不育相关基因，F₁代具有紫色个体的几率理论上为50％。

(8)对自交获得的T₁代中紫色的分离比例进行调查，如果紫色∶无色比例符合1∶1；且用T₁代中有紫色的单株为父本同无色的母本杂交，如果杂交后代的全部个体无紫色，或有紫色的个体所占比率远小于50％。说明转基因成分无法或难以随花粉在代间传递，只能通过雌配子在代间进行传递，进一步确证候选基因为雄性配子体不育相关基因，转基因阳性株为雄性配子体不育材料。

(9)在获知某一基因为雄配子体功能必须的情况下，为了获得上述雄配子体发育基因相关的，花粉败育更为彻底的雄性配子体不育材料，杜绝内源性雄配子体发育相关元件或转基因成分随花粉在代间传递，可采用基因编辑、基因删除、射线辐照、EMS诱导、组培诱导和自然突变等基因变异方式，使上述鉴定出来的雄配子体发育相关基因发生功能缺失性突变，从而实现内源性雄配子体发育相关元件或转基因成分随花粉传递几率为0，获得彻底的雄性配子体不育材料。

本发明的目的之二在于提供上述方法在制备、鉴定雄性配子体不育相关基因，制备雄性配子体不育和繁殖孢子体不育等方面的应用。本发明实施例制备并鉴定了Loc_Os05g40740 基因相关的雄性配子体不育材料。用本发明所述方法制备并鉴定其他基因相关的雄性配子体不育材料，不限制本发明专利所申明的权利要求的保护。

作为一个总的技术构思，本发明所述启动子，待鉴定基因，终止子和待转物种品种可灵活选用；基因抑制表达的方式可为干涉、反义和miRNA等；为了提高目的基因下调的效果，可改变靶点、拷贝数；为了增加配子体不育程度，可对冗余基因和同功基因同时进行下调或敲除；各种片段载入的先后顺序和相对位置可根据具体情况调整。另外，在方法陈述中所用的载体名称仅仅是为了陈述方便而使用，并不限制在实际应用中使用其他符号来表示相关载体。因而，上述可选内容的实际采用不表明同本发明有实质性差异，从而不影响本发明的保护。

另外，由于报告基因用的是花青素合成必需的OsMYB76基因，在该基因功能丧失的植物材料中会表现所有器官无紫色，在选取待转植物品系为该基因的突变材料时，可用OsMYB76 或其改造的OsMYB76R基因为报告基因。而选取待转植物品系为某一器官或多个器官有紫色的野生型材料时，可对该基因进行下调来报告转基因事件是否发生，转基因阳性株表现无紫色。上述可选方式不影响本发明的权利要求。

本发明的有益效果在于：本发明公开了水稻花青素合成调控必需基因OsMYB76的改造基因OsMYB76R，能够调控花青素的合成。OsMYB76R基因编码的蛋白为水稻内源性蛋白，将其用作报告基因可降低转基因风险和减少人们对转基因产品的担忧。

本发明的有益效果还在于：OsMYB76R基因控制的紫色性状明显，肉眼可见。在转基因阳性鉴定中，比起GUS、GFP和RFP等报告基因来说：不必借助仪器、药品，对检测对象无损伤等，可使转基因阳性后代的检测程序简化，根据紫色有无用肉眼就可直接判断；可使检测结果准确，降低假阳性；可节省检测时间，节省培养及种植空间，降低费用。在雄性配子体不育鉴定中，一般利用分子标记，通过PCR扩增，结合电泳或测序来分析可能的雄性配子体不育的连锁标记在后代中的传递情况，这种方法存在费用高，时间长，假阳性等问题。本发明在制备雄配子体不育时采用的是抑制雄配子体发育相关基因的表达，并将表现明显的紫色相关基因同可能的雄性配子体不育基因的抑制元件连锁，可根据转基因后代紫色性状的传递情况进行鉴定，具有简单，准确，时间短等优点：可在田间直接判断该基因是否同雄配子体功能相关，直接判断雄配子体不育是否制备成功，不需要借助药剂或进行PCR等复杂检测。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为紫色在芽鞘、茎基部的表现：A和B分别为本发明OsMYB76基因正常和异常的亲本芽鞘紫线的表现；C为利用组培苗茎基部紫色有无判断是否是阳性株；D、E和F为利用芽鞘紫线在杂交F₁中的传递情况，其中D为全部传递，E为部分传递，F为全不传递。

图2为载体pOsMYB76R的多克隆位点改造后的酶切位点示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第四版，冷泉港实验室出版)或精编分子生物学实验指南(第五版，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。

相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本实施例所公开的有关核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库，或基因组DNA作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

实施例1、OsMYB76基因的改造及功能验证

1、根据OsMYB76基因的CDS核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，在保持氨基酸序列不变的前提下，改变部分核苷酸以除去常用酶切位点，获得OsMYB76基因改造后的OsMYB76R基因的CDS序列(SEQ ID NO.2)并人工合成。

2、以合成的OsMYB76R基因为模板，用OsMYB76RF/R(分别带pCAMBIA1301的BglII和BstEII附近同源片段，序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)扩出目的片段，用同源重组方式将目的片段连入pCAMBIA1301，得载体pOsMYB76R。

3、用根癌农杆菌介导法将pOsMYB76R转化OsMYB76发生突变，所有器官无紫色的水稻中九B，观察其紫色表现情况，结果显示部分T₀植株基部表现紫色(图1)，其T₁代紫色有无表现3:1的分离。上述结果表明无色的中九B经过转入OsMYB76R后表现紫色，说明本发明所改造的OsMYB76R能够代替OsMYB76基因控制花青素的合成。

实施例2、通过对Loc_Os05g40740基因的RNA干涉制备雄性配子体不育，通过转基因产生的紫色性状的传递行为鉴定雄性配子体不育

雄配子体发育相关基因往往在中后期的花/花粉中表达。为了找到一些配子体发育相关基因，对BAR水稻基因表达数据库(http://bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efpWeb.cgi)进行分析，发现很多在中后期花中表达的基因，经qPCR验证，选出一批可能同雄配子体发育相关的基因。其中，水稻Loc_Os05g40740基因在后期花中特异高表达，其拟南芥的同源基因在花粉中特异表达，初步将Loc_Os05g40740基因列为雄配子体发育相关基因，将其启动子列为花粉特异启动子。为了制备和鉴定出配子体雄性不育材料，我们以Loc_Os05g40740为对象，实施了配子体雄性不育创造和鉴定：

1)对前述载体pOsMYB76R的多克隆位点的酶切位点种类和顺序进行改造。先人工合成新的多克隆位点序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。然后通过同源重组将合成序列替换原有多克隆位点的序列，新的多克隆酶切位点如图2所示。多克隆位点改造后的载体命名为 pOsMYB76R1。

2)人工合成Nos终止子序列(带酶切位点Sbf I+Asc I)，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；将其载入pOsMYB76R1得载体pOsMYB76R2。

3)人工合成Loc_Os05g40740的干涉片段(带酶切位点EcoRI+Sbf I)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；将其载入pOsMYB76R2得载体pOsMYB76R3。

4)用引物P5F(5’-GCGTCGACGTCCCATGTCACCGACAGTACT-3’，SEQ ID NO.9，带酶切位点SalI)和P5R(5’-CGGAATTCCGTGGAAATGTGATCGCTAGGCT-3’，SEQ ID NO.10，带酶切位点EcoRI)从中花11中扩出Loc_Os05g40740的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，载入载体pOsMYB76R3得配子体雄性不育载体pOsMYB76R-GM。

5)将pOsMYB76R-GM转入农杆菌LBA4404，再将阳性农杆菌转染所有器官无色的中九B。

6)在T₀代根据茎基部紫色有无选出阳性株，让其自交，并用阳性株作父本，同无色核不育材料中九B-osabcg15(为免除杂交时去雄环节，以OsMYB76基因异常的中九B为轮回父本，以OsABCG15基因异常的核不育突变体osabcg15为非轮回母本，回交选育获得)杂交。对自交和杂交种子进行紫线调查，发现自交F₂种子紫线有无分离比例符合1:1，不符合3:1，97.1％的杂交F₁种子表现无紫线，这说明转基因成分难以随花粉在代间进行传递，但随雌配子在代间进行传递，这正是配子体雄性不育的特征。因此，Loc_Os05g40740与雄配子体花粉发育有关，通过对其进行干涉，借助连锁的紫线性状的遗传调查，获得了配子体雄性不育材料并成功进行了遗传鉴定。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一种制备和鉴定雄性配子体不育的方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 819

<212> DNA

<213> 水稻(oryza.sativa L.)

<400> 1

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<212> DNA

<213> 水稻(oryza.sativa L.)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 水稻( oryza.sativa L.)

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<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggactcttga ccatgatggg acgcagggct tgct 34

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

attcgagctg gtcactcacg cacacaggtt ccaag 35

<210> 7

<211> 227

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acagctatga ccatgattac aagcttcata cctctagaca cccatggagt gtatgagtaa 60

ggtacacgtg cacgagctct ttttagcggg gtcgacacaa ccgaattcca cagatctatg 120

gaatgagtat gtgaggtgac ccaccctgca ggtttttgaa gggggcgcgc cacaaccact 180

agtcaccacg gtaccagcgg gggatccggc actggccgtc gttttac 227

<210> 8

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccctgcagg gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga 60

atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 120

taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc 180

cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat 240

tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggggcg cgccac 286

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcgtcgacgt cccatgtcac cgacagtact 30

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggaattccg tggaaatgtg atcgctaggc t 31

Claims

1.制备和鉴定雄性配子体不育的方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）构建一个包括可能的雄配子体可育基因的下调元件和花青素调控相关序列的植物表达载体；

（2）将上述表达载体转入一个花青素缺失的无色材料中，选出具有花青素颜色的阳性株作父本同无色母本杂交，并让阳性株自交；

（3）调查杂交F₁代具有色个体同无色个体的比例，如果全部个体无色，说明候选基因为配子体不育相关基因，转基因阳性株为雄性配子体不育材料；调查自交T₁代中花青素色的分离比例，如果紫色:无色比例符合1:1，进一步确证候选基因为雄性配子体不育相关基因，转基因阳性株为雄性配子体不育材料。

2.根据权利要求1所述制备雄性配子体不育的方法，其特征在于：所述雄性配子体功能相关基因为水稻Loc_Os05g40740基因。

3.根据权利要求1所述制备雄性配子体不育的方法，其特征在于：所述花青素合成调控必需基因为水稻OsMYB76基因或水稻OsMYB76基因的改造后基因OsMYB76R，水稻OsMYB76的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，改造后基因OsMYB76R的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述制备雄性配子体不育的方法，其特征在于：所述雄性配子体功能相关基因的下调表达元件由花粉特异启动子调控表达，所述花粉特异启动子为水稻Loc_ Os05g40740基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求1所述制备雄性配子体不育的方法，其特征在于：所述下调表达元件为RNAi干涉元件，其干涉元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求1所述制备雄性配子体不育的方法，其特征在于：所述花青素性状为芽鞘紫线。

7.根据权利要求1-6任一项所述方法在分离、鉴定雄性配子体不育相关基因，制备雄性配子体不育中方面的应用。