CN109504701B - 利用p5126-ZmMs1M构建体创制玉米显性核雄性不育系及其育种制种应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用p5126‑ZmMs1和mCherry基因构建体创制玉米显性核雄性不育系的技术体系，及其在玉米杂交育种和制种上应用的方法。该构建体包含三种基因表达盒：导致玉米显性核雄性不育的表达盒、标记玉米种皮颜色的表达盒、除草剂抗性表达盒。将所述构建体导入玉米愈伤组织，可创制玉米显性核雄性不育系种子：在正常光下该转基因不育系种子与非转基因可育种子没有明显差异，不影响商品品质，但在绿色激发光下，转基因不育系种子表现为红色荧光；非转基因可育种子表现为正常玉米颜色，无荧光。本发明与本团队之前申请授权的玉米隐性雄性不育技术（即玉米多控不育技术体系）发明专利有本质的差异，可高效地应用于玉米不育化杂交育种和杂交制种。

Description

利用p5126-ZmMs1M构建体创制玉米显性核雄性不育系及其育 种制种应用方法

技术领域

一般地，本发明涉及分子生物学和植物基因工程及作物育种领域。具体地，本发明涉及用于创制玉米显性核雄性不育系且包含玉米花粉特异启动子p5126、雄花发育关键基因ZmMs1和种皮特异表达的荧光基因mCherry的构建体、包含所述构建体的重组载体、以及利用所述构建体或重组载体转化的宿主细胞、转基因玉米植物细胞和转基因玉米植株的制备方法，且由此产生的玉米雄性不育系种子及其杂交育种和制种应用方法。

背景技术

杂种优势是杂合体在一种或多种性状上优于它的两个亲本的现象。例如不同品系、不同品种、甚至不同种属间进行杂交所得到的杂种一代往往比它的双亲表现出更强大的生长速率和代谢功能，从而导致器官发达、体型增大、产量提高，或者表现在抗病、抗虫、抗逆力、成活力、生殖力、生存力等的提高。这是生物界普遍存在的现象。利用植物杂种优势可以显著地提高作物的产量和品质。

在作物中，存在着自花授粉作物和异花授粉作物。自花授粉是指一株植物的花粉，对同一个体的雌蕊进行授粉的现象。与此相反，一株植物的花粉给另一植株的雌蕊授粉就称作异花授粉。水稻的雄蕊和雌蕊在同一器官中，通常以自花授粉方式进行繁殖。对水稻进行杂交育种和杂种优势利用，获得雄性不育系是关键。上世纪70年代“杂交水稻之父”袁隆平等人在野外发现了雄花败育的普通野生稻，这一雄性不育系的发现，为应用“三系”（雄性不育系、保持系、恢复系）配套选育杂交水稻的成功，打开了一个突破口，从而为我国甚至世界的粮食生产做出了重大贡献。

对于异花授粉的作物如玉米，因为缺乏良好的雄性不育系，目前对其进行杂交育种和制种主要采用人工去雄或机械去雄的方法。这些方法存在诸多弊端，比如成本高、纯度不稳和易受环境影响等问题，制约了杂种优势在玉米实际生产中的应用效率。

玉米显性核雄性不育材料不存在去雄的问题，但由于缺乏有效的保持和繁殖技术，很难应用于实际生产当中。现代生物技术的发展为玉米显性核雄性不育材料的利用创造了条件。本发明旨在将导致显性核雄性不育基因表达盒、荧光蛋白标记基因表达盒和除草剂抗性基因表达盒串联起来，构建高效的玉米显性核不育遗传转化载体，导入玉米正常可育自交系材料中，获得玉米显性核雄性不育系及其保持系，通过荧光色选法可以高效分离红色荧光转基因显性核不育系和正常颜色可育系种子，从而有效解决玉米显性核雄性不育系的保持和繁殖问题，以实现高效的玉米不育化杂交育种和杂交制种。

ZmMs1是玉米花粉发育过程中参与小孢子细胞壁发育过程的转录因子，对小孢子细胞壁起负调控作用，该基因的突变能够导致小孢子凋亡和雄花败育。本团队在之前的研究工作中，利用ZmMs1的突变基因及其不育突变体材料发展了玉米隐性雄性不育技术，即玉米多控不育技术体系，并申请、授权了相关发明专利。本发明发现在5126启动子下的野生型ZmMs1能够导致玉米表现出显性不育的表型性状，与之前的发明有着本质的差异，在玉米杂交育种和制种中具有新的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于p5126-ZmMs1和mCherry基因的创制显性核雄性不育玉米的载体（构建体）及其杂交育种和制种应用的技术方法。

本发明所述的显性核不育载体是指用于创制显性核雄性不育玉米的遗传转化载体，其含有多个功能元件（3种不同类型表达盒的元件），这些功能元件的组装和表达，使转化植株得以可控地（通过雄性不育、种皮颜色和除草剂抗性）用于玉米显性核雄性不育系的繁殖和保持。

本发明所述的显性核不育载体的3种不同类型表达盒元件，包含控制玉米雄性育性基因的表达盒、除草剂抗性基因表达盒和颜色标记基因表达盒。（1）具体地，玉米雄性育性基因的表达盒中，从上游至下游依次包括雄性器官特异表达启动子、育性相关基因和终止子。进一步，上述雄性育性基因即玉米ZmMs1基因，上述启动子是雄性器官特异表达启动子p5126，该启动子是玉米花药特异性表达启动子；将两者结合p5126-ZmMs1转基因玉米可导致显性核不育。（2）颜色标记基因表达盒为由Ltp2启动子、红色荧光蛋白mCherry基因以及pinⅡ终止子依次串联构成的表达盒。其中，Ltp2启动子是大麦脂质转移蛋白基因的启动子，在种子的糊粉层特异表达（Kalla et al., Plant J(1994) 6: 849-860）。（3）除草剂抗性基因表达盒为35S启动子驱动Bar基因的表达盒，终止子是35S终止子。其中，35S启动子来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区（Franck et al., Cell (1980)21:285-294）。

上述含多基因表达盒的构建体是以来自pCambia系列载体的pCambia3301（信息见网址：http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pCAMBIA3301/）为骨架进行依次构建的。

利用本发明所述的构建体，本发明还提供了一种用于创制玉米显性核雄性不育植株，并能保持和繁殖玉米显性核雄性不育系的方法，其中还包括鉴定玉米不育系和保持系种子和植株的方法。

本发明提供的获得上述雄性不育系和保持系的培育方法是将导致显性核雄性不育的构建体导入目的植物—可转化的玉米自交系中获得的。

上述导入目的植物的方法是通过农杆菌导入植物细胞、愈伤组织、组织或器官中获得植株。

本发明所述的用于创制玉米显性核雄性不育植株的方法，包含：（1）提供第一植株，该植株是一种可用于遗传转化的玉米自交系材料，包括但不限于B104、综31、HiII；（2）创制第二植株，所述第二植株是向上述第一植株中引入权利要求1所述构建体，且所述构建体只存在于玉米同源染色体的其中一条染色体上，即所述构建体为半合子状态，该植株表现为不依赖于其背景基因型的显性核雄性不育；其中，半合子（hemizygote）指的是具有二组相同的染色体组，但有一个或多个基因是单价的，只存在于一个染色体组，另一个染色体组没有与之相对应的等位基因，这种合子称为半合子；（3）用所述第一植株的雄性配子给所述第二植株受精，以保持并产生50%所述第二植株基因型（即所述构建体为半合子状态）的后代。

本发明所述的用于繁殖玉米不育系和保持系植株的方法，包含：通过权利要求4所述的第二植株通过与第一植株的异花受精，产生50%的含有所述构建体的不育系种子；产生50%的正常可育系种子（保持系）。

本发明提供鉴定不育系和保持系种子或植株的方法，具体为：将所述第二植株异交后产生的种子在绿色激发光下观察，具有红色荧光的种子即为不育系，非荧光种子为可育的保持系。种植所述第二植株异交后产生的种子，使所述种子长成待鉴定植株，用除草剂喷洒所述待鉴定植株，保持系植株有损伤症状或枯死，不育系没有损伤症状或损伤症状程度更轻。

本发明还提供了利用所述玉米显性核不育系进行高效杂交育种和杂交制种的技术方法。

利用含有所述构建体的玉米显性核不育系进行杂交育种的方法，所述的方法具体为：（a）种植权利要求5所述的含有所述构建体的玉米转基因显性核不育系种子，以及其它不同遗传背景的玉米常规自交系种子；（b）在玉米开花、散粉期，利用上述的显性核不育系植株作为母本，以其它玉米常规自交系作为父本进行人工杂交，获得的F₁杂交种；（c）该F₁杂交种在正常光下观察种子颜色没有明显差异（即为正常玉米籽粒颜色，不影响玉米商品外观品质）；但在绿色激发光源下通过荧光滤镜观察，可分离为50%的红色荧光种子，为转基因雄性不育杂交种，50%的非荧光种子，为非转基因可育杂交种；（d）该F₁杂交种一方面可以作为转基因品种直接混合测试和杂交组合品比，可育杂交种和不育杂交种自由授粉，不影响产量和商品外观品质；另外，也可通过荧光色选机，选择50%无荧光的非转基因的可育杂交种测试和品比。

利用含有所述构建体的玉米显性核不育系进行杂交制种的方法。所述的方法具体为：（a）显性核不育系为母本，通过回交转育，定向改良和创制不同遗传背景的含有所述构建体的玉米转基因显性核不育母本系；（b）在制种田中，上述的显性核不育母本系种子及其常规父本自交系种子按照行数比5:1种植，进行自由授粉，后期拔除或提前收获父本系，获得显性核不育母本系上的F₁杂交种；（c）该F₁杂交种在正常光下观察种子颜色没有明显差异（不影响玉米商品外观品质）；但在绿色激发光源下通过荧光滤镜观察，可分离为50%的红色荧光种子，为转基因不育杂交种，50%的非荧光种子，为非转基因可育杂交种；（d）该F₁杂交种一方面可以作为转基因品种直接混合种植，可育杂交种和不育杂交种自由授粉，不影响玉米产量和商品外观品质；另一方面，可通过荧光色选机，选择50%无荧光的非转基因的可育杂交种进行推广应用。

附图说明

图1所示为玉米显性核不育载体p5126-ZmMs1M的T-DNA区域图谱。T-DNA的大小为6.1kb，其中包含3个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，雄性不育元件p5126-ZmMs1的表达盒以及颜色标记基因mCherry的表达盒。

图2 所示为玉米显性核不育载体p5126-ZmMs1M的质粒图谱。

图3 所示为p5126-ZmMs1M玉米显性核不育系的雄穗、小花和花粉。

图4 所示为p5126-ZmMs1M玉米显性核不育系独立转化事件拷贝数分析结果。

图5所示为p5126-ZmMs1M转基因事件58#的玉米显性核不育系的果穗颜色分离情况。

图6所示为不同p5126-ZmMs1M显性核不育系的创制。其中，第1-2行为转基因不育系在正常白光下的穗子表型，第3-4行为转基因不育系在绿色激发光下的穗子表型，其中第3行为国产滤光片下的穗子表型，第4行为进口滤光片下的穗子表型。

图7所示为利用p5126-ZmMs1M进行玉米显性核不育系创制和荧光种子色选分筛的技术流程图。

图8所示为p5126-ZmMs1M玉米显性核不育系繁殖及其杂交育种和制种应用的技术流程图。

具体实施方式

下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

如无特殊说明，实施例中所用的内切酶等酶试剂购自宝生物（大连）有限公司，引物及基因的合成和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：显性核不育载体p5126-ZmMs1M的构建

1. pT5126-ZmMs1Ocs载体的构建（含有p5126-ZmMs1显性核不育元件，表达盒SEQID NO.1）

以玉米自交系B73为材料，用PlantGen DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪公司）提取基因组DNA。以得到的基因组DNA为模板扩增5126启动子片段，所用引物如下：

Oligo05：5’-gaattcctaggatctttctgat ttcaaccat (GAATTC为EcoRI酶切位点)；

Oligo06：5’- gccgcggccgccgccggtcatggatccgggccccgcaaagcaactttgatttg(GCGGCCGC为NotI酶切位点)。

将扩增产物为1.5 kb的片段即5126启动子连入pEASY-T5载体中，获得的载体命名为pT5126。

从玉米自交系B73 提取RNA，反转录PCR扩增ZmMs1基因，得到650 bp的ZmMs1基因片段。所用引物如下：

Oligo07：5’- atgaccggcggcggccgcgg

Oligo08：5’- ctggcatgccggatcctcacctgcaggcgctgctcttg

以发明人所在公司实验室保存的载体pCAMBIA2300-Ubi-Ocs为模板扩增终止子Ocs片段，所用引物如下：

Oligo09：5’- ctgcaggtgaggatccggcatgccagggctctcaatg

Oligo10：5’- ccggcggccgctagcgtctagatcaatcagtaaattgaac ggagaata

将得到的ZmMs1和OCS的PCR产物各取1：l混合做模板，以引物oligo07和oligo10进行overlap PCR扩增，得到ZmMs1和Ocs融合的片段ZmMs1-Ocs ，将该片段用NotI酶切和胶回收。

将质粒pT5126用NotI酶切和去磷酸化处理，然后进行胶回收。将以上两个片段进行连接，得到pT5126-ZmMs1Ocs。

以构建的pT5126-ZmMs1Ocs为模板，扩增pT5126-ZmMs1Ocs表达元件片段，所用引物如下：

Oligo11：5’-ACATGATTACGAATTCATCTTTCTGATTTCAACCATTACC

Oligo12：5’-AGTTCTAGAGAAGCTTTCAATCAGTAAATTGAACGGAGAA

扩增得到的pT5126-ZmMs1Ocs片段（2.3 Kb, SEQ ID NO.1）进行胶回收。

构建含有荧光蛋白标记基因mCherry表达盒（Ltp2:mCherry, SEQ ID NO.2）的中间载体pCLC

以pMD18-Ltp2为模板扩增Ltp2片段，所用引物为：

Oligo01：5’- caaagcttctctagaactagtggatctcgatgtgtag (AAGCTT为HindIII酶切位点)；

Oligo02：5’-ctggtcaccagatcttactcggctacactcacac (GGTC ACC为BstEII酶切位点)。

将以上扩增产物Ltp2片段和pCAMBIA3301用HindIII和BstEII酶切、胶回收后连接得到pCLtp。

质粒pMD18-mCherry含有mCherry基因（由上海英骏生物技术有限公司合成），以此质粒为模板扩增mCherry片段，所用引物为：

Oligo03：5’- cggagatctatggtgagcaagggcgaggag (AGATCT为BglII 酶切位点)

Oligo04：5’- cggagatcttacttgtacagctcgtccatg (AGATCT为BglII 酶切位点)

将以上扩增产物mCherry片段用BglII酶切，质粒pCLtp经BglII酶切后去磷酸化处理，胶回收后连接得到pCLC。

载体的构建

对以上构建的含有荧光蛋白标记基因mCherry表达元件的中间载体pCLC用限制性内切酶HindIII 和EcoRI进行双酶切，得到的载体骨架片段（10.0 Kb）进行胶回收。

以上胶回收的载体骨架片段和pT5126-ZmMs1Ocs进行同源重组连接，转化得到的转化子经过PCR鉴定和测序验证正确。构建得到的载体命名为p5126-ZmMs1M。

p5126-ZmMs1M包含3个表达盒，如图1所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，显性核不育5126-ZmMs1表达盒，以及颜色标记基因mCherry的表达盒。p5126-ZmMs1M载体图谱见图2。

实施例2：显性核不育载体p5126-ZmMs1M的应用

1.通过农杆菌介导的玉米遗传转化获得显性核不育转基因株系

参照AN(Methods in Enzymology(1987)153:292-305)方法，将本发明所构 建的显性核不育载体p5126-ZmMs1M转化到农杆菌EHA105(Hood et al., Transgenic Res(1993)2:208-218)中，经鉴定，选取转化获得的阳性菌株进行农杆 菌介导的玉米遗传转化，并将所用菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏建议的分类命名为“大肠埃希氏菌(Eschrichia coli)”，发明人将其命名为“p5126Ms1M”；保藏地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号；保藏日期：2018年9月14日；保藏编号：CGMCC NO.16471。

通过农杆菌介导的玉米遗传转化（Frame et al., Plant Physiology(2002)129:13-22）获得不同转基因事件，最后通过田间表型和I₂-KI花粉染色，鉴定其雄花育性表型。

具体方法如下：取1~2μg 质粒，加到100μL于冰上溶化的农杆菌EHA105感受态细胞中，冰浴30 min。置于液氮中迅速冷冻1 分钟，移入37℃水浴中5 min；迅速冰浴 2 min后将加入1000μL YEB 液体培养基，于28℃，转速为200 rpm 条件下培养2~4 hr，涂于含50 mg/L的利福平（Rifampicin）和100 mg/L 的卡那霉素（Kanamycin）的固体YEB 平板上培养2~3天。长出单菌落后，挑取单菌落接种于含相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒。将以上质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到单菌落后接种LB培养基培养，然后提取质粒。进而通过酶切或PCR法验证获得的质粒真伪。

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米HiⅡ的幼胚与本实施例所述的农杆菌共培养，以将本实施例构建的显性核不育载体p5126-ZmMs1M中的T-DNA（包含3个表达盒）转入到玉米基因组中，获得了转基因玉米植株。

对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离幼胚，用农杆菌悬浮液侵染幼胚，其中农杆菌能够将所述介导植物雄性育性的构建体传递至幼胚的细胞（步骤1 ：侵染步骤）。在此步骤中，幼胚浸入农杆菌悬浮液（OD660=0.4~0.6，侵染培养基（MS 盐4.3g/L、MS维生素、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L，pH5.3））中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤2：共培养步骤）。幼胚在侵染步骤后在固体培养基（MS盐4.3g/L、MS 维生素、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）100mg/L、2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基（MS 盐4.3g/L、MS 维生素、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）中至少存在一种已知抑制农杆菌生长的抗生素（头孢霉素）（步骤3 ：恢复步骤）。幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基（MS 盐4.3g/L、MS维生素、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上培养，导致转化的细胞选择性生长（步骤4 ：选择步骤）。然后，愈伤组织在固体培养基（MS 分化培养基和MS 生根培养基）上培养以再生植物再生成植物（步骤5 ：再生步骤）。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基（MS 盐4.3g/L、MS 维生素、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基（MS 盐2.15g/L、MS 维生素、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3- 乙酸1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养16 小时，再于20℃下培养8 小时。

对于p5126-ZmMs1M转基因植株的雄花表型鉴定，具体地，首先通过表型观察转基因植株的雄花育性（图3）。相对于野生型可育植株B73（即ZmMs1野生型），转基因植株的雄花表现为不育，小花干瘪，花药小而不外露，这一点类似于ms1-alb突变体的表型。进一步通过花粉I₂-KI染色实验发现：野生型的花粉表现为圆而饱满，花粉粒充满淀粉染色后呈蓝黑色；p5126-ZmMs1M转基因植株的花粉粒不规则，因不含有淀粉，染色后称透明的黄色；而ms1-alb突变体表现为无花粉粒。因此，p5126-ZmMs1M转基因植株的显性核雄性不育属于染败型不育，不同于ms1-alb隐性不育突变体（属于无花粉型不育）。

通过Real-time PCR鉴定显性核不育转基因玉米不同株系的拷贝数

取上述DNA水平和RNA水平都检测为阳性的转基因玉米植株（T₀）的叶片约100mg作为样品，用PlantGen DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测Bar基因和IVR基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3 次重复，取平均值。

检测BAR基因和IVR基因拷贝数的具体方法如下：取转基因玉米植株ZmMs1和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3 个重复；使用PlantGen DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；用Quawell Q5000超微量紫外分光光度计测定上述样品的基因组DNA 浓度；调整上述样品的基因组DNA 浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl ；采用Taqman 探针荧光定量PCR 方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为负对照，每个样品3 个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测BAR基因序列：

Oligo21：5’- TCACTCGGGATGACGATGG ；

Oligo22：5’- TGCCACCAGACAGTGTCCG ；

Probe1：5’- ccgagccgcaggaaccgcaggag （荧光基团5’6-FAM;淬灭基团3’TAMRA）；

以下引物和探针用来检测IVR 基因序列：

Oligo23：5’- TGGCGGACGACGACTTGT ；

Oligo24：5’- AAAGTTTGGAGGCTGCCGT ；

Probe2： 5’- CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC（荧光基团5’CY5; 淬灭基团3’BHQ-2）；

PCR 反应体系为：

PCR 反应条件为：

利用SDS2.3 软件（Applied Biosystems）分析数据。

实验结果表明，所述介导植物显性核不育的构建体（包含完整的T-DNA区）己经整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且获得了具有低拷贝的所述显性核不育构建体的转基因玉米植株（图4）。

玉米显性核不育系的果穗颜色分离实例

获得的低拷贝转基因玉米显性核不育转化事件可以通过与不同玉米骨干系（如郑58等）的杂交和回交得到保持和繁殖。具体地，使所述显性核不育转基因玉米植株（T₀）作为母本与常规可育系（如郑58等）杂交，收获杂交T₁代种子58#（T₁）。如图5所示，在正常光下，所有的种子颜色均为黄色或白色，差异不明显；在绿色激发光下，50% 的所述杂交T₁种子58#（T₁）呈现红色荧光，即为转基因的显性核不育系种子（以S表示）；另50% 的所述杂交T₁种子58#（T₁）表皮无红色荧光（表现为暗褐色），即为非转基因的可育保持系种子（以M表示）。

种植上述S和M种子直至长到3叶期，用3mg/L 除草剂喷洒所述S和M植株，根据在除草剂处理后第5天观察到的叶子损伤情况来确定植株是否损伤。实验表明，所述S植株基本上没有显示出叶子损伤，所述M植株则有明显的叶子损伤。

上述荧光观察结果和除草剂抗性结果表明所述介导植物显性核不育构建体以约50%的频率通过雌配子方式传递给了后代，即S为包含所述介导植物显性核不育构建体的转基因玉米植株（不育系植株），M为不含所述构建体的可育植株（保持系植株）。

不同p5126-ZmMs1M显性核不育系的创制、分筛和杂交育种及制种应用

通过传统的回交转育法，可以将低拷贝p5126-ZmMs1M玉米显性核不育转化事件导入到不同玉米骨干系（如郑58等）的遗传背景中。例如，通过不同的转基因事件（55#，56#，57#）（图6）分别与常规自交系（如郑58等）杂交和回交，可以创制新的遗传背景的p5126-ZmMs1M玉米显性核不育系，技术流程如图7所示。在正常白光下，所有的种子颜色均为黄色或白色，差异不明显；在绿色激发光下，50% 的所述杂交T₁种子呈现红色荧光，即为转基因的显性核不育系种子；另50% 的所述杂交T₁种子表皮无红色荧光（表现为暗褐色），即为非转基因的可育保持系种子。通过种子荧光色选机可高效分筛转基因不育系种子和非转基因保持系种子。

利用含有所述构建体的玉米显性核不育系可高效地进行杂交育种，技术流程如图8所示。种植含有所述构建体的玉米转基因显性核不育系种子，以及其它玉米常规自交系种子，在玉米开花、散粉期，利用上述的显性核不育系植株作为母本，以其它玉米常规自交系作为父本进行人工杂交，获得的F₁杂交种。该F₁杂交种在正常光下观察种子颜色没有明显差异（不影响玉米商品外观品质）；在绿色激发光源下通过荧光滤镜观察，分离为50%的红色荧光种子，为转基因不育杂交种，50%的非荧光种子，为非转基因可育杂交种。该F₁杂交种一方面可以作为转基因品种直接混合测试和杂交组合品比，可育杂交种和不育杂交种自由授粉，不影响产量和商品外观品质；另外，可通过荧光色选机，选择50%无荧光的非转基因的可育杂交种进行测试。

利用含有所述构建体的玉米显性核不育系可高效地进行杂交制种，技术流程如图8所示。通过回交转育，定向改良和创制不同遗传背景的含有所述构建体的玉米转基因显性核不育母本系。在制种田中，上述的显性核不育母本系种子及其常规父本自交系种子按照行数比5:1种植，进行自由授粉，后期拔除或提前收获父本系，获得显性核不育母本系上的F₁杂交种。该F₁杂交种在白光下观察种子颜色没有明显差异（不影响玉米商品外观品质）；在绿色激发光源下通过荧光滤镜观察，分离为50%的红色荧光种子，为转基因不育杂交种，50%的非荧光种子，为非转基因可育杂交种。该F₁杂交种一方面可以作为转基因品种直接混合种植，可育杂交种和不育杂交种自由授粉，不影响玉米产量和商品外观品质；另一方面，可通过荧光色选机，选择50%无荧光的非转基因的可育杂交种进行推广应用。

相关参考文献：

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2.万向元，吴锁伟，谢科，安学丽，李金萍，张丹凤，肖中华，刘慎思，授权专利：基于Ms1基因构建的介导玉米雄性生育力的多控不育载体及其应用，申请号：201510298173.0

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序列表

<110> 北京首佳利华科技有限公司

<120> 利用p5126-ZmMs1M构建体创制玉米显性核雄性不育系及其育种制种应用方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2352

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatctttctg atttcaacca ttaccgatga atttctattt ggattagttc attttcgtct 60

tccctgtctg atcctgtttt cgacaattct gatcccgaat ccgtttttga attaaaatat 120

aaaaaataaa aacaagaaat ggtttatctc ggtcaatttc gtttttcgcg aggaacatat 180

tcggtgtaca tgagcctttg gtgcacatga actaacaaag ttcacaaaaa attctgaaaa 240

aaaatcatac atattctttg catcgctact cctattatat ataaaatttc atgttcaaat 300

ttgttatatt ttagctgtaa taaaaagagt atttttagcc gattttctaa tttaaacttg 360

tcagaagttg tcttttttta ttacaactaa gtttaatgaa tttgaacttg aaacatgtat 420

ataattagag taagatgaaa agaatatgta tggatttttt caaaaaaatt gtaaaccttt 480

tttagttcat gtgcaccata tgtgaatcaa aggttcatat acaccggata tgtttccttt 540

ttcacgaacc taatctggcc tagccagtat gttgtggact tggctcctaa gtgtgaacct 600

ggcagtgatg ggcaacaaag caggcatgcc ttatgtgtga tgaataattg acacatgtac 660

cgagaggttt ggggtttttt tgtattgcat agcaaaacat ggtgaaattc ttagggtatt 720

tttgagatta catttagggc atgtttgttt cccttcattt tgaggaattg gaatctaact 780

aataaattag gctatttttt tagaatgtga cattcccaac tttctaaagt gtacatataa 840

gtctatctta aataatttat agggtggaag atgtaaattg attatataga tttataagct 900

tcttttctaa tgtaaaattt aaagctcact cttctacttg cttctctata acataatata 960

gtttataact acctctctca tatgatttag aataatatac aaatatatta cataaaaaat 1020

atattaattg aattagtgtt gtctaattta taattattag aatgtaattc aattccaacg 1080

aaacaacggg gccttaggtt taatatcttc cttacactgc gaaaatgttg ttacacttgc 1140

caaaaaaaat caatcgcata tttaccttac aaggacatat tttagcaaaa tgctatagac 1200

atgaatccaa cgtaatcaat agagtgagat ttactggtaa actaccaatt gctcatctgc 1260

tcggtaccaa ccagcctttc ctattaccat gcacatgttg cctctcaact gcagcatctt 1320

tcaagccgtg agcagacatg ttgcagatcg aagtaaggta tatatgtgca tagtctccta 1380

attcttcatc ttcaacctct agctgattga tctctggtat ttaccactct ttccttcctt 1440

ccttccttca attctaaata ccacaaatca aagttgcttt gcggggccca tgaccggcgg 1500

cggccgcggc gcgtgcgcgg tgtgcaagca ccagcggcgc aagtgcgagc ccaactgcga 1560

gctggccgcc tacttcccgg cgcacaggat gaacgacttc cgcgcgctgc acctcgtctt 1620

cggggtggcc aacctcacca agctcatcaa ggccaacgcc agcgaggccg gccggcgccg 1680

cgccgccgag acgctcacct gggaggcccg ctggagggag tgcgacccct cggacgggtg 1740

ctaccgcgag gtggcctgcc tgcgccgcga caacgccgtg ctgcgcgccg agaacgccgc 1800

gctgcggcgg cagctggccg agcagcagct gctctggtcc agcgcctgca gcactggcgg 1860

cagcgcgctt ctggccgagc agcagctgct gccgccgtgt gggggcaata ataatgggct 1920

tctgacggcg agtagcagag ctcatcatgc accggcagca gctctggcgg caacgcacac 1980

cgcgctggcc tgctaccgtg gcagcatgcc ggtgtgtact attactatga cagcggacga 2040

cggcagcggc aggaggccgg cgtcggatgc tgccgccatc gccgggagag ggagtggtgc 2100

tcaggtcgac gcttctaggg ataacaagag cagcgcctgc aggtgaggat ccggcatgcc 2160

ctgctttaat gagatatgcg agacgcctat gatcgcatga tatttgcttt caattctgtt 2220

gtgcacgttg taaaaaacct gagcatgtgt agctcagatc cttaccgccg gtttcggttc 2280

attctaatga atatatcacc cgttactatc gtatttttat gaataatatt ctccgttcaa 2340

tttactgatt ga 2352

<210> 2

<211> 1856

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctctagaact agtggatctc gatgtgtagt ctacgagaag ggttaaccgt ctcttcgtga 60

gaataaccgt ggcctaaaaa taagccgatg aggataaata aaatgtggtg gtacagtact 120

tcaagaggtt tactcatcaa gaggatgctt ttccgatgag ctctagtagt acatcggacc 180

tcacatacct ccattgtggt gaaatatttt gtgctcattt agtgatgggt aaattttgtt 240

tatgtcactc taggttttga catttcagtt ttgccactct taggttttga caaataattt 300

ccattccgcg gcaaaagcaa aacaatttta ttttactttt accactctta gctttcacaa 360

tgtatcacaa atgccactct agaaattctg tttatgccac agaatgtgaa aaaaaacact 420

cacttatttg aagccaaggt gttcatggca tggaaatgtg acataaagta acgttcgtgt 480

ataagaaaaa attgtactcc tcgtaacaag agacggaaac atcatgagac aatcgcgttt 540

ggaaggcttt gcatcacctt tggatgatgc gcatgaatgg agtcgtctgc ttgctagcct 600

tcgcctaccg cccactgagt ccgggcggca actaccatcg gcgaacgacc cagctgacct 660

ctaccgaccg gacttgaatg cgctaccttc gtcagcgacg atggccgcgt acgctggcga 720

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tacgtacccc gtgagtgccc tagctagaaa cttacacctg caactgcgag agcgagcgtg 840

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cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctcctccga 1320

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ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata 1800

gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcggg 1856

<210> 3

<211> 1454

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 60

ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc acctacaaat gccatcattg 120

cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 180

cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 240

ggattgatgt gaacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata 300

cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc 360

tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag 420

gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg 480

ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 540

ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 600

acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 660

tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctacaaa tctatctctc tcgagtctac 720

catgagccca gaacgacgcc cggccgacat ccgccgtgcc accgaggcgg acatgccggc 780

ggtctgcacc atcgtcaacc actacatcga gacaagcacg gtcaacttcc gtaccgagcc 840

gcaggaaccg caggagtgga cggacgacct cgtccgtctg cgggagcgct atccctggct 900

cgtcgccgag gtggacggcg aggtcgccgg catcgcctac gcgggcccct ggaaggcacg 960

caacgcctac gactggacgg ccgagtcgac cgtgtacgtc tccccccgcc accagcggac 1020

gggactgggc tccacgctct acacccacct gctgaagtcc ctggaggcac agggcttcaa 1080

gagcgtggtc gctgtcatcg ggctgcccaa cgacccgagc gtgcgcatgc acgaggcgct 1140

cggatatgcc ccccgcggca tgctgcgggc ggccggcttc aagcacggga actggcatga 1200

cgtgggtttc tggcagctgg acttcagcct gccggtaccg ccccgtccgg tcctgcccgt 1260

caccgagatt tgactcgagt ttctccataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa 1320

ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat 1380

ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagta 1440

ctaaaatcca gatc 1454

Claims (6)

1.一种构建体在使转基因玉米表现显性核雄性不育的应用，其特征在于，该构建体由三种类型基因表达盒组成：（a）第一种表达盒，为导致玉米显性核雄性不育的基因表达盒；（b）第二种表达盒，为标记玉米种皮颜色的表达盒；（c）第三种表达盒，为除草剂抗性基因表达盒；其中，导致玉米显性核雄性不育的基因表达盒由花粉特异表达的玉米5126 启动子、雄花发育基因ZmMs1基因和农杆菌章鱼碱合酶Ocs基因的终止子可操作地相连，其序列如SEQ ID NO .1所示；标记玉米种皮颜色的表达盒由玉米种皮特异表达的Ltp2启动子、玉米种皮颜色标记基因即红色荧光基因mCherry和胭脂碱合成酶基因Nos终止子可操作地相连，其序列如SEQ ID NO .2所示；除草剂抗性基因的表达盒由花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子、除草剂抗性基因BAR和花椰菜花叶病毒的35S polyA终止子可操作地相连，其序列如SEQID NO.3所示，利用该构建体转化玉米，导致转基因玉米具有显性核雄性不育的功能，所述转化玉米的受体材料为可遗传转化的玉米自交系。

2.一种创制玉米显性核雄性不育植株和繁殖玉米显性核雄性不育种子的方法，包括：（a）提供第一植株，该植株是一种可用于遗传转化的玉米自交系材料；（b）创制第二植株，所述第二植株是向上述第一植株中引入显性核雄性不育构建体，且所述构建体只存在于玉米同源染色体的其中一条染色体上，即所述构建体为半合子状态，该植株表现为不依赖于其背景基因型的显性核雄性不育，（c）用所述第一植株的雄性配子给所述第二植株受精，产生的种子中有50%的基因型同第二植株，即所述构建体为半合子状态的显性核雄性不育种子，另外50%为非转基因的正常可育保持系种子；所述构建体由三种类型基因表达盒组成：（a）第一种表达盒，为导致玉米显性核雄性不育的基因表达盒；（b）第二种表达盒，为标记玉米种皮颜色的表达盒；（c）第三种表达盒，为除草剂抗性基因表达盒；其中，导致玉米显性核雄性不育的基因表达盒由花粉特异表达的玉米5126启动子、雄花发育基因ZmMs1基因和农杆菌章鱼碱合酶Ocs基因的终止子可操作地相连，其序列如SEQ ID NO .1所示；标记玉米种皮颜色的表达盒由玉米种皮特异表达的Ltp2启动子、玉米种皮颜色标记基因即红色荧光基因mCherry和胭脂碱合成酶基因Nos终止子可操作地相连，其序列如SEQ ID NO .2所示；除草剂抗性基因的表达盒由花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子、除草剂抗性基因BAR和花椰菜花叶病毒的35S polyA终止子可操作地相连，其序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其还包括鉴定具有所述构建体的植株的方法，具体为：（1）种植权利要求2中所述的显性核雄性不育种子；（2）使所述种子长成待鉴定植株；（3）用权利要求2中所述的除草剂抗性基因对应的除草剂喷洒所述待鉴定植株，具有所述构建体的植株与不含所述构建体的植株相比，没有植物损伤症状或具有的损伤症状程度更轻。

4.根据权利要求2所述的方法，其还包括鉴定具有所述构建体的种子的方法，具体为：权利要求2中所述步骤(c)产生的种子，在正常光下直接观察，全部是正常颜色种子；在绿色激发光下通过荧光滤镜观察，50%具有红色荧光的种子，即为含有所述构建体的显性核雄性不育系种子。

5.一种利用显性核雄性不育构建体建立玉米显性核雄性不育系进行杂交育种的方法，所述的方法具体为：（a）种植权利要求2中所述的含有所述构建体的玉米转基因显性核雄性不育系种子，以及其它不同遗传背景的玉米常规自交系种子；（b）在玉米开花、散粉期，利用上述的显性核雄性不育系植株作为母本，以其它玉米常规自交系作为父本进行人工杂交，获得F1杂交种；（c）该F1杂交种在正常光下观察种子颜色没有明显差异，即为正常玉米籽粒颜色，不影响玉米商品外观品质；但在绿色激发光源下通过荧光滤镜观察，可分离为50%的红色荧光种子，为转基因雄性不育杂交种；以及50%的非荧光种子，为非转基因可育杂交种；（d）该F1杂交种可以作为转基因品种直接混合测试和杂交组合品比，可育杂交种和不育杂交种自由授粉，不影响产量和商品外观品质；或者也可通过荧光色选机，选择50%无荧光的非转基因的可育杂交种，进行测试和品比，选育优良杂交组合。

6.一种利用含有显性核雄性不育构建体的玉米显性核雄性不育系进行杂交制种的方法，所述的方法具体为：（a）利用权利要求2中所述的第二植株为母本，通过回交转育，定向改良和创制不同遗传背景的含有所述构建体的玉米转基因显性核雄性不育母本系；（b）在制种田中，上述的显性核雄性不育母本系种子及其常规父本自交系种子按照行数比5:1种植，进行自由授粉，后期拔除或提前收获父本系，获得显性核雄性不育母本系上的F1杂交种；（c）该F1杂交种在正常光下观察种子颜色没有明显差异，不影响玉米商品外观品质；但在绿色激发光源下通过荧光滤镜观察，可分离为50%的红色荧光种子，为转基因不育杂交种，50%的非荧光种子，为非转基因可育杂交种；（d）该F1杂交种一方面可以作为转基因品种直接混合种植，可育杂交种和不育杂交种自由授粉，不影响玉米产量和商品外观品质；另一方面，可通过荧光色选机，选择50%无荧光的非转基因的可育杂交种进行推广应用。

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