CN105002206B - 一种基于Ms7基因构建的多控不育表达载体及其用于保持和繁殖玉米隐性核不育系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用Ms7基因构建的恢复、保持和繁殖玉米隐性核雄性不育系的多控不育表达载体及其应用方法，属于生物技术中的植物基因工程领域。所述的多控不育载体主要包括四大功能元件：1）玉米雄性不育的育性恢复基因功能元件；2）抑制玉米雄配子体形成的功能元件；3）玉米种皮颜色筛选标记功能元件；4）除草剂抗性基因功能元件。将所述构建体导入玉米受体（如细胞、愈伤组织或器官）中，可用于恢复、保持、繁殖玉米的雄性不育系，并有望应用于玉米不育化杂交育种和杂交制种，在玉米生产中产生巨大的经济价值。

Description

一种基于Ms7基因构建的多控不育表达载体及其用于保持和 繁殖玉米隐性核不育系的方法

技术领域

一般地，本发明属于分子生物学和植物基因工程领域。具体地，本发明涉及用于恢复雄性不育玉米育性的育性恢复基因Ms7的构建体、包含所述构建体的重组载体、以及用所述构建体或重组载体转化的宿主细胞、转基因植物细胞和转基因玉米制备方法，且由此产生的玉米雄性不育系种子和保持系种子。

背景技术

杂种优势是杂合体在一种或多种性状上优于它的两个亲本的现象。例如不同品系、不同品种、甚至不同种属间进行杂交所得到的杂种一代往往比它的双亲表现更强大的生长速率和代谢功能，从而导致器官发达、体型增大、产量提高，或者表现在抗病、抗虫、抗逆力、成活力、生殖力、生存力等的提高。这是生物界普遍存在的现象。通过利用杂种优势进行作物杂交育种，可以显著地提高作物的产量和品质。

玉米是杂种优势利用的最成功的作物之一，目前玉米生产上的杂交种利用率已经达到100%。在玉米杂交制种过程中，母本的去雄技术是影响玉米杂交种制种成本和制种纯度的关键因素。人工去雄相对容易，还可以通过机械去雄、化学杀雄等途径，但是这些策略也存在一些问题：一方面，这些技术大大增加了制种的成本，另一方面，因人工去雄的不彻底或不及时，会降低杂交种的纯度，造成生产上大面积减产，最终导致很大的经济损失。因此，提高杂交种种子纯度是当前玉米生产上急待解决的问题，而利用雄性不育系制种是提高杂交种质量最为有效的途径之一。

玉米隐性核雄性不育材料不存在去雄的问题，但由于缺乏有效的保持和繁殖技术，很难应用于实际生产当中。现代生物技术的发展为玉米隐性核雄性不育材料的利用创造了条件。本发明旨在将玉米隐性核雄性不育材料的育性恢复基因表达元件、抑制雄配子体形成的基因表达元件、荧光蛋白标记基因表达元件和除草剂抗性基因表达元件串联起来，构建高效的玉米多控不育遗传转化表达载体，导入相应的隐性核雄性不育材料中，获得玉米不育系的保持系，从而有效地解决玉米隐性核雄性不育系的保持和繁殖问题，以实现高效的不育化杂交育种和杂交制种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于Ms7基因的能恢复雄性不育玉米生育力的多控不育载体（构建体）及其应用的方法。

本发明所述的多控不育载体是指用于恢复雄性不育玉米生育力的遗传转化载体，其含有多个功能元件（4种不同类型表达盒的元件），这些功能元件的组装和表达，使转化植株得以可控地（通过雄性育性、种皮颜色和除草剂抗性）用于玉米雄性不育系的繁殖和保持。

本发明所述的多控不育载体的4种不同类型表达盒元件，包含玉米雄性育性相关基因的表达盒、抑制植物雄配子体形成或功能的表达盒、除草剂抗性基因表达盒和颜色标记基因表达盒。

（1）具体地，玉米雄性育性相关基因的表达盒中，从上游至下游依次包括雄性器官特异表达启动子或组成型表达启动子、育性相关基因和终止子。

进一步，上述育性相关基因即玉米Ms7基因。

上述启动子可以是雄性器官特异表达启动子5126、Ms7基因的启动子或组成型表达的Ubiquitin启动子。

5126启动子是玉米花药特异性启动子。

Ubiquitin启动子来自于玉米多聚泛素蛋白基因(maize poly ubi gene)，由Ubi基因的启动子区，5’非翻译区和第一内含子组成。

（2）抑制植物雄配子体的形成或功能的表达盒中，从上游至下游依次包括花药或雄蕊器官特异启动子、抑制植物雄配子体形成或功能的基因以及终止子。

具体地，上述花药或雄蕊器官特异启动子可以为Pg47启动子或Zm13启动子；抑制植物雄配子体形成或功能的基因为玉米α淀粉酶基因或Dam甲基化酶基因；终止子为In2-1终止子或PinⅡ终止子。

Pg47和Zm13都是花粉特异性启动子，Pg47启动子来自玉米花粉特异性聚半乳糖醛酸酶(Pg47)基因的5’调节区(Allen和Lonsdale，Plant J(1993) 3:261-271)。玉米α淀粉酶基因，可以是玉米α淀粉酶-1 基因，该基因在雄性组织表达时会导致花粉粒能量来源崩溃从而遏制花粉发育。

Dam甲基化酶基因(Brooks et al., Nucleic Acids Res(1983)11: 837-851)的表达产物能催化植物DNA中腺嘌呤残基的甲基化，经甲基化的腺嘌呤会影响到细胞存活。

终止子为In2-1终止子（玉米In2-1基因的终止子）或PinⅡ终止子（马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的终止子，An et al., Plant Cell (1989)1: 115-122）。

（3）除草剂抗性基因表达盒为35S启动子驱动Bar基因的表达盒，终止子是35S终止子。

35S启动子来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区（Franck et al., Cell(1980)21:285-294）。

（4）颜色标记基因表达盒为由Ltp2启动子、红色荧光蛋白DsRed2基因或mCherry基因以及pinⅡ终止子依次串联构成的表达盒。

Ltp2启动子是大麦脂质转移蛋白基因的启动子，在种子的糊粉层特异表达（Kallaet al., Plant J(1994) 6: 849-860）。

上述含多基因表达盒的构建体是以来自pCambia系列载体的pCambia3301（信息见网址：http://www.cambia.org/daisy/cambia）为骨架进行依次构建的。

利用本发明所述的构建体，本发明还提供了一种用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态，并能繁殖玉米雄性不育系的保持系植株的方法，其中还包括鉴定玉米保持系种子和植株的方法。

本发明提供的获得上述雄性不育系和保持系的培育方法是将恢复雄性不育玉米育性的多控不育构建体导入目的植物—玉米隐性核不育系中获得的。

上述导入目的植物的方法是通过花粉管或农杆菌导入植物细胞、愈伤组织、组织或器官中获得植株。

本发明所述的用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，包含：(a) 提供第一植株，所述第一植株包含雄性不育基因ms7的纯合隐性等位基因（ms7ms7），且所述第一植株是雄性不育的；(b) 向上述第一植株中引入权利要求1所述的构建体以获得第二植株，所述第二植株只在同源染色体的其中一条染色体上含有所述构建体，即所述构建体为半合子状态。半合子（hemizygote）指的是具有二组相同的染色体组，但有一个或多个基因是单价的，只存在于一个染色体组，另一个染色体组没有与之相对应的等位基因，这种合子称为半合子。所述第二植株包含与所述第一植株相同的雄性不育基因ms7的纯合隐性等位基因，当其构建体中的玉米雄性育性控制基因Ms7表达时将恢复第二植株雄性生育力；当抑制植物雄配子体形成或功能的基因（如淀粉酶基因或细胞毒素基因）表达时，所述第二植株抑制产生携带构建体的可育雄性配子的形成或功能，从而使得在所述第二植株中只能产生不包含所述构建体的雄性配子，其基因型为ms7；(c) 用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以保持并产生所述第一植株纯合隐性状态的后代种子。

本发明所述的用于繁殖玉米不育系的保持系植株的方法，包含：通过权利要求21所述的第二植株自花受精，产生50%的含有所述构建体的种子（即保持系种子）；产生50%的正常不育系种子。

鉴定保持系种子和植株的方法，具体为：将所述第二植株的种子播种后，其产生的花粉作为供体（父本），与其它正常育性植株（作为母本）杂交，所获得F1种子全部是正常颜色种子（非荧光种子）。

将所述第二植株自交后产生的种子在荧光显微镜下观察，具有红色荧光的种子即为保持系种子。

种植所述第二植株自交后产生的种子，使所述种子长成待鉴定植株，用除草剂喷洒所述待鉴定植株，保持系植株与非保持系植株相比，没有植物损伤症状或具有的损伤症状程度更轻。

附图说明

图1所示为玉米多控不育载体pMCS0701构建流程图。

图2所示为玉米多控不育载体pMCS0701的T-DNA区域图谱。T-DNA的大小为13,777bp，其中包含5个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，雄性育性恢复基因Ms7的表达盒，抑制花粉形成的Dam甲基化酶基因表达盒和α淀粉酶基因表达盒，以及颜色标记基因mCherry的表达盒。

图3所示为玉米多控不育载体pMCS0701的质粒图谱。

图4所示为玉米多控不育载体pMCS0701的酶切鉴定图。M为1 kb plus DNAmarker，1，2，3分别为pMCS0701质粒用BglII、BamHI和KpnI进行酶切。

图5所示为玉米多控不育载体pMCS0702和pMCS0703构建流程图。

图6所示为pMCS0702的T-DNA区域图谱。T-DNA的大小为12,692 bp，其中包含4个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒，雄性育性恢复基因Ms7的表达盒，以及颜色标记基因DsRed的表达盒。

图7所示为玉米多控不育载体pMCS0702的质粒图谱。

图8所示为玉米多控不育载体pMCS0702的酶切鉴定图。M为1 kb plus DNAmarker，1，2，3分别为pMCS0702质粒用BglII/HindIII、BamHI和EcoRI进行酶切。

图9所示为玉米多控不育载体pMCS0703的T-DNA区域图谱。T-DNA的大小为14,260bp，其中包含5个表达盒，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，2个抑制花粉形成的表达盒（α淀粉酶基因表达盒和Dam甲基化酶基因表达盒），雄性育性恢复基因Ms7的表达盒，以及颜色标记基因DsRed的表达盒。

图10所示为玉米多控不育载体pMCS0703的质粒图谱。

图11所示为玉米多控不育载体pMCS0703的酶切鉴定图。M为1 kb plus DNAmarker，1，2，3分别为pMCS0703质粒用BglII/HindIII、BamHI和EcoRI进行酶切。

图12所示为多控不育载体（pMCS0701, 0702, 0703）的玉米转化流程和植株的再生。

图13所示为多控不育转基因玉米植株的PCR阳性鉴定。M为DL2000 DNA marker，1至21为不同的转基因植株，CK为非转基因对照植株，P为质粒阳性对照。H₂O为水对照。

图14所示为多控不育转基因玉米植株的RT-PCR检测结果。M为DL2000 DNAmarker，1至8样品为随机取样的转基因植株。图A为植株DNA的PCR阳性检测，其中1、3、5、7为转基因阳性植株，2、4、6、8为转基因阴性植株。图B、C为1至8样品的RT-PCR检测，检测基因分别为Bar和玉米actin基因。

图15所示为收获的转基因玉米植株穗子表型。A为转基因株系在正常白光下的穗子表型，B为A在蓝色激发光下的穗子表型。其中，在蓝色激发光下发红色荧光的种子，在正常白光下表皮呈红色；而在蓝色激发光下不发荧光的种子，在正常白光下表皮为黄色（正常的玉米种子颜色）。

图16所示为除草剂涂抹检测玉米多控不育保持系和不育系的表型。Ms7-1（+）为转入了多控不育载体pMCS0701的T-DNA的转基因玉米植株（保持系植株）。Ms7-1（-）为ms7 纯合隐性的不含转基因成分的植株（不育系植株）。除草剂涂抹后第5天，Ms7-1（+）植株基本上没有叶子损伤， Ms7-1（-）植株则有明显损伤。

具体实施方式

下述实施例用来说明本发明，但不限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

如无特殊说明，实施例中所用的内切酶等酶试剂购自宝生物（大连）有限公司，引物及基因的合成和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。其他生化试剂非特别注明外均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：多控不育载体pMCS0701、pMCS0702和pMCS0703的构建

1.构建含有5个表达盒的多控不育载体pMCS0701

1）构建含有荧光蛋白标记基因mCherry表达盒（Ltp2:mCherry, SEQ ID NO.1）

和除草剂抗性基因Bar的表达盒（CaMV35SPro:Bar, SEQ ID NO.2）的中间载

体pCLC。

以pMD18-Ltp2为模板扩增Ltp2片段，所用引物为：

oligo01：5’- caaagcttctctagaactagtggatctcgatgtgtag

(AAGCTT为HindIII酶切位点)；

oligo02：5’- ctggtcaccagatcttactcggctacactcacac

(GGTCACC为BstEII酶切位点，AGATCT为BglII 酶切位点)。

pCambia3301是pCambia系列载体之一，含有除草剂抗性基因Bar的表达盒。将以上扩增产物Ltp2片段和pCAMBIA3301质粒用HindIII和BstEII酶切、胶回收后连接得到pCLtp2。

质粒pMD18-mCherry含有mCherry基因（由上海英骏生物技术有限公司合成），以此质粒为模板扩增mCherry片段，所用引物为：

oligo03： 5’- cggagatctatggtgagcaagggcgaggag (AGATCT为BglII 酶切位点)

oligo04： 5’- cggagatcttacttgtacagctcgtccatg (AGATCT为BglII 酶切位点)

将扩增产物mCherry片段用BglII酶切，质粒pCLtp2经BglII酶切后去磷酸化处理，以上产物胶回收后进行连接，得到pCLC载体。

2）中间载体pCLCAA的构建(含有α淀粉酶基因表达盒)

质粒pMA-Pg47-ZmAA含有α淀粉酶基因ZmAA的表达盒（Pg47Pro:ZmAA-In2-1，SEQID NO.3），委托上海英骏生物技术有限公司合成。将质粒pMA-Pg47-ZmAA和pCLC用HindIII和EcoRI酶切，将4.6 kb的ZmAA表达盒和pCLC载体片段胶回收后连接，得到pCLCAA。

3）pT5126Ms7Ocs载体的构建(含有育性恢复基因Ms7表达盒5126:Ms7, SEQ IDNO.4）

玉米自交系B73是目前广泛应用于玉米遗传研究及育种实践的开放性玉米种质，可从种子公司直接购买获得。从B73 雄穗中提取RNA，反转录PCR扩增Ms7基因，得到2 Kb的Ms7基因片段。所用引物如下：

Oligo05： 5’- CAAAGTTGCTTTGCGGGGCCCGGATCCATGGCTGCC

AATAATAAGACG

Oligo06： 5’- TGGCATGCCGGATCCCTAA CAGCTCAAGGGAGGGAAT

以pCAMBIA2300-Ubi-Ocs为模板扩增Ocs片段，所用引物如下：

Oligo07： 5’- GCTGTTAGGGATCCGGCATGCCAGGGCTCTCAATGGAG

Oligo08： 5’- CCTAGGATATCTAGA TCAATCAGTAAATTGAACGGA

(CCTAGG为AvrII 酶切位点,TCTAGA为XbaI 酶切位点)

将以上得到的Ms7和Ocs的PCR产物各取1 ul混合做模板，以引物oligo05和oligo08进行overlap PCR扩增，得到Ms7和Ocs融合的片段Ms7-Ocs。

以B73为材料，用PlantGen DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪公司）提取基因组DNA。以得到的基因组DNA为模板扩增5126启动子片段，所用引物如下：

Oligo09： 5’-gaattcCTAGGATCTTTCTGATTTCAACCATTAC

(GGATCC为EcoRI 酶切位点)

oligo10： 5’- CCATGGATCCGGGCCCCGCAAAGCAACTTTGATTTGTGG

扩增得到1.5 kb的 5126片段。

将以上得到的Ms7-Ocs片段和5126片段的PCR产物各取1 ul混合做模板，以引物oligo08和oligo09进行overlap PCR扩增，得到融合的片段5126-Ms7-Ocs。将该片段进行进行胶回收后连接到pEASY-T5载体，得到pT5126Ms7Ocs。

4）pT5126Ms7OcsDam载体的构建

pMD18 -Dam质粒含有Dam基因表达盒（Zm13:Dam, SEQ ID NO.5），由上海英骏生物技术有限公司合成。以该质粒为模板扩增Dam表达盒片段，所用引物如下：

oligo11： 5’- ccgtctagagctgccatttaatgattctatat (下划线为XbaI酶切位点)

oligo12： 5’- ATTCCTAGGCCGCATTCGCAAAACACAC (下划线为AvrII酶切位点)

将以上扩增产物Dam基因表达盒片段用XbaI和AvrII酶切，质粒pT5126Ms7Ocs同样XbaI和AvrII酶切，以上酶切产物胶回收后连接得到pT5126Ms7OcsDam。

5）构建pMCS0701载体

用AvrII酶切步骤2得到的质粒pCLCAA，酶切产物再经去磷酸化处理；将步骤4得到的pT5126MsOcs用AvrII酶切。以上两种产物分别胶回收，连接获得重组载体pMCS0701，经酶切和测序验证正确。pMCS0701载体的专利保藏号为CGMCC No.10445，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101；生物保藏的分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；保藏日期：2015年1月27日。

pMCS0701载体包含5个表达盒，如图2所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，雄性育性恢复基因Ms7的表达盒，2个抑制花粉形成的表达盒（a淀粉酶基因表达盒和Dam甲基化酶基因表达盒），以及颜色标记基因mCherry的表达盒。pMCS0701载体图谱见图3。

2.构建含有4个表达盒的多控不育载体pMCS0702

1）构建含有花粉致死基因ZmAA表达盒的重组载体pCZmAA

以质粒pMA-Pg47-ZmAA为模板扩增 ZmAA的表达盒，得到片段Pg47-ZmAA。PCR引物为：

Oligo13： 5’- cccaagctttgcaccggacactgtctggtg (AAGCTT为HindIII酶切位点)；

Oligo14： 5’- ccgaattccgtggagatataggggaaagagaacg (gaattc为EcoRI酶切位点)。

将上述花粉致死基因ZmAA表达盒与pCambia3301载体的骨架相连：用HindIII和EcoRI双酶切Pg47-ZmAA片段和pCAMBIA3301载体后，将ZmAA表达盒连入pCAMBIA3301大片段中，获得载体命名为pCZmAA。

2）构建含有育性恢复基因Ms7表达盒（Ubiquitin:Ms7-Ocs, SEQ ID NO.6）和荧光标记基因表达盒（Ltp2:DsRed2-Nos, SEQ ID NO.7）的重组载体pTUbiMs7Ocs-LD。

从玉米B73 雄穗cDNA中PCR扩增Ms7基因，得到2 Kb的Ms7的ORF片段。所用引物如下：

Oligo15： 5’-ggtaccATGGCTGCCAATAATAAGACG (GGTACC为KpnI酶切位点)

Oligo16： 5’-gccggatccCTAAATAAGAGTGGTCTCCGG (GGATCC为BamHI酶切位点)

pCAMBIA2300-Ubi-Ocs载体含有Ubiquitin启动子和Ocs终止子，在Ubiquitin启动子后含多克隆位点，载体的骨架是pCAMBIA系列的pCAMBIA2300（信息见网址：http://www.cambia.org/daisy/cambia）。pCAMBIA2300-Ubi-Ocs载体由发明人所在公司实验室保存。本实验室构建的pTUbiOcs载体，是将pCAMBIA2300-Ubi-Ocs载体的Ubi-Ocs片段扩增后连接到pEASYT3载体得到。含有荧光标记基因表达盒（Ltp2:DsRed2-Nos, SEQ ID NO.7）载体pT-LD也是由本公司构建。

将以上pTUbiOcs载体和pT-LD用BclI和BstEII双酶切，酶切产物胶回收后进行连接，得到重组质粒pTUbiOcs-LD。

用KpnI酶切 pTUbiOcs-LD质粒，然后用T4 DNA聚合酶进行补平，接着用BamHI酶切。将Ms7片段也用BamHI进行酶切处理。以上产物进行胶回收后连接。得到的重组质粒命名pTUbiMs7Ocs-LD。

3）构建pMCS0702载体

用HindIII和HpaI双酶切上述获得的中间载体pCZmAA和pTUbiMs7Ocs-LD，胶回收后连接得到多控不育载体pMCS0702，经酶切和测序验证正确。载体pMCS0702的专利保藏号为CGMCC No.10446，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101；生物保藏的分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；保藏日期：2015年1月27日。

多控不育载体pMCS0702包含4个表达盒，如图6所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒，雄性育性恢复基因Ms7的表达盒以及颜色标记基因DsRed的表达盒。pMCS0702载体图谱如图7所示。

3.构建含有5个表达盒的多控不育载体pMCS0703

用HindIII酶切pMCS0702载体，并进行去磷酸化处理。载体pMD18-Dam含有Dam表达盒，将该载体用HindIII酶切后得到Dam表达盒片段。将以上pMCS0702载体酶切片段和Dam表达盒片段分别胶回收后进行连接，获得的重组载体命名为pMCS0703，分别经酶切和测序验证正确。载体pMCS0703的专利保藏号为CGMCC No.10447，保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，100101；生物保藏的分类命名：大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；保藏日期：2015年1月27日。

多控不育载体pMCS0703包含5个表达盒，如图9所示，从T-DNA的左边界到右边界分别是除草剂抗性基因Bar的表达盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表达盒和Dam表达盒，雄性育性恢复基因Ms7的表达盒以及颜色标记基因DsRed的表达盒。pMCS0703载体图谱如图10所示。

实施例2：玉米多控不育载体pMCS0701、pMCS0702和pMCS0703的应用

1.玉米多控不育载体转化农杆菌

参照AN（Methods in Enzymology(1987)153:292-305）方法，将本发明所构建的多控不育载体pMCS0701、pMCS0702和pMCS0703转化到农杆菌EHA105（Hood et al.,Transgenic Res(1993)2:208-218）中。

取1~2 ug 质粒，加到100 ul于冰上溶化的农杆菌EHA105感受态细胞中，冰浴30min。置于液氮中迅速冷冻1 分钟，移入37℃水浴中5 min；迅速冰浴 2 min后将加入1000ul YEB 液体培养基，于28℃，转速为200 rpm 条件下培养2~4 hr，涂于含50 mg/L 的利福平（Rifampicin）和100 mg/L 的卡那霉素（Kanamycin）的固体YEB 平板上培养2~3天。长出单菌落后，挑取单菌落接种于含相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒。将以上质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到单菌落后接种LB培养基培养，然后提取质粒。用限制性内切酶酶切质粒验证，如图4、7和图11所示，酶切结果表明玉米多控不育载体pMCS0701 、pMCS0702 和pMCS0703都正常转化进入农杆菌中。

2.多控不育载体的玉米转化流程和植株的再生

将ms7 突变体（ms7ms7）纯合的雄性不育植株与来自玉米HiⅡ植株的花粉杂交、回交数代之后，该ms7 等位基因渐渐渗入易于转化的HiⅡ玉米种质。

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的上述具有玉米Ms7ms7杂合等位基因的玉米HiⅡ的幼胚与本实施例所述的农杆菌共培养，将实施例1构建的多控不育载体pMCS0701中的T-DNA（包含5个表达盒）、pMCS0702中的T-DNA（包含4个表达盒）或pMCS0703中的T-DNA（包含5个表达盒）转入到玉米基因组中，获得了转基因玉米植株。

农杆菌侵染玉米幼胚转化流程如下：

取授粉后9~11天的玉米幼穗，剥去苞叶，表面消毒后剥取幼胚，从玉米中分离幼胚（见图12-1），用农杆菌悬浮液侵染幼胚（见图12-2），其中农杆菌能够将所述介导植物雄性育性的构建体传递至幼胚细胞（步骤1 ：侵染步骤）。在此步骤中，幼胚浸入农杆菌悬浮液（OD₆₆₀=0.4~0.6，侵染培养基（N6盐2g/L、N6 维生素、L-脯氨酸0.115g/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L，pH5.2））中以启动接种。幼胚在侵染步骤后在固体培养基（N6盐2g/L、N6 维生素、L-脯氨酸0.115g/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS）100mg/L、2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂7g/L，pH5.8）上与农杆菌共培养（见图12-3）3天（步骤2 ：共培养步骤）。在此共培养阶段后，有一个选择性的“恢复”步骤（步骤3 ：恢复步骤）。在该步骤中，恢复培养基（N6盐2g/L、N6 维生素、L-脯氨酸0.115g/L 、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂7g/L，pH5.8）中含有抑制农杆菌生长的抗生素（羧苄青霉素500mg/L），以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，幼胚在有选择剂（2.5mg/L双丙氨膦）的筛选固体培养基（N6盐4g/L、N6 维生素、L-脯氨酸1.38g、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4- 二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂7g/L，pH5.8）上培养，导致转化的细胞选择性生长（步骤4：选择步骤）（见图12-4）。然后，抗性愈伤组织转到再生培养基I（N6盐4g/L、N6 维生素、L-脯氨酸1.38g/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、琼脂7g/L，双丙氨膦1.5mg/L，pH5.8），25℃暗培养2-3周。在此阶段出现胚芽鞘（见图12-5）。在固体培养基（MS 分化培养基和MS 生根培养基）上培养以再生植物（步骤5 ：再生步骤）（见图12-6）。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS 分化培养基（MS 盐4.3g/L、MS 维生素、麦芽糖20g/L、葡萄糖10g/L、天冬酰胺0.15g/L、肌醇100mg/L、琼脂7g/L，pH5.8）上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS 生根培养基（MS 盐2.15g/L、MS 维生素、蔗糖20g/L、萘乙酸 0.5mg/L、琼脂7g/L，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实（见图12-7和12-8）。在温室中，每天于28℃下光照培养16 小时，再于20℃下黑暗培养8小时。

3.转基因玉米植株的PCR阳性鉴定

取温室培养的转化阳性候选玉米植株的叶片，用PlantGen DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用质粒载体特异引物Bar基因引物进行PCR鉴定，同时以非转基因玉米DNA作为阴性对照，以多控不育载体质粒作为阳性对照。

Bar基因引物序列如下：

Oligo17 (Bar-F)： 5’- ctcgagtctaccatgagcccagaac

Oligo18 (Bar-R)： 5’- ctcgagtcaaatctcggtgacgggca

图13为部分转基因植株的PCR鉴定。从图13可以看出，在检测的转多控不育载体的21株转基因候选株中，有13株是转化阳性植株。

4.转基因植株在RNA水平的鉴定

随机挑取8株温室培养的转化多控不育载体的阳性候选植株分别提取DNA和RNA，并将RNA反转录成cDNA。用上述Bar基因引物对DNA和cDNA分别进行PCR扩增。玉米actin基因作为内标参照基因，引物序列如下：

Olig19 (Actin-F)： 5’- AAATGACGCAGATTATGTTTGA

Oligo20 (Actin-R)： 5’- GCTCGTAGTGAGGGAGTACC

图14-A和14-B表明随机检测的8株植株，其基因组DNA和RNA水平上的阳性结果一致，表明在DNA水平检测阳性的植株都有除草剂抗性基因的表达。

5.Real time PCR验证转基因玉米植株

取上述DNA水平和RNA水平检测为阳性的转基因玉米植株Ms7（T₀）的叶片约100mg作为样品，用PlantGen DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR 方法检测Bar 基因和IVR 基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3 次重复，取平均值。

检测BAR 基因和IVR 基因拷贝数的具体方法如下：

取转基因玉米植株Ms7 （T0）和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3 个重复；

使用PlantGen DNA Kit 植物基因组DNA提取试剂盒提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

用Quawell Q5000超微量紫外分光光度计测定上述样品的基因组DNA 浓度；

调整上述样品的基因组DNA 浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl ；

采用Taqman 探针荧光定量PCR 方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为负对照，每个样品3 个重复，取其平均值；荧光定量PCR 引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测BAR基因序列：

Oligo21：5’- TCACTCGGGATGACGATGG ；

Oligo22：5’- TGCCACCAGACAGTGTCCG ；

Probe1：5’- ccgagccgcaggaaccgcaggag （荧光基团5’6-FAM; 淬灭基团3’TAMRA）；

以下引物和探针用来检测IVR 基因序列：

Oligo23 ：5’- TGGCGGACGACGACTTGT ；

Oligo24 ：5’- AAAGTTTGGAGGCTGCCGT ；

Probe2 ：5’- CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC（荧光基团5’CY5; 淬灭基团3’BHQ-2）；

PCR 反应体系为：25 μl 2×GoldStar TaqMan Mixture（With ROX）；1 μlForward Primer，10 µM（终浓度0.2 μM）；1 μl Reverse Primer，10 µM（终浓度0.2 μM）；1μl Probe，10 µM；2 μl Template DNA，最终利用不含任何RNase的水稀释到50 μl。

PCR 反应条件为：步骤1：预变性，温度95℃，时间10 min；步骤2：变性，温度95℃，时间15s；步骤3：退火/延伸，温度60℃，时间1 min；重复上述40个循环。

利用SDS2.3 软件（Applied Biosystems）分析数据。

实验结果表明，所述介导植物生育力的构建体（包含完整的T-DNA区）己经整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且获得了具有单拷贝的所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株Ms7-1（转化pMCS0701）、Ms7-2（转化pMCS0702）和转基因玉米植株Ms7-3（转化pMCS0703）。

6.玉米多控不育保持系和不育系的鉴定和繁殖

使所述转基因玉米植株Ms7-1（T₀）自交，收获自交T₁ 种子Ms7-1（T₁）。如图12-8所示，50% 的所述自交T₁ 种子Ms7-1（T₁）表皮为红色，在荧光下观察呈现红色荧光（见图15），所述红色荧光种子标记为Ms7-1（+）；另50% 的所述自交T₁ 种子Ms7-1（T₁）表皮为黄色或乳白色，荧光下观察无红色荧光，所述无红色荧光种子标记为Ms7-1（-）。

种植上述Ms7-1（+）和Ms7-1（-）种子直至长到3叶期，用0.1mg/mL 的除草剂Basta涂抹所述Ms7-1（+）和Ms7-1（-）植株叶片，根据在除草剂处理后第5天观察到的叶子损伤情况来确定植株是否损伤。实验表明，所述Ms7-1（+）植株基本上没有显示出叶子损伤，所述Ms7-1（-）植株则有明显的叶子损伤（见图16）。

上述荧光观察结果和除草剂抗性结果表明所述介导植物生育力构建体以预计频率传递给了后代，即Ms7-1（+）为包含所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株（保持系植株）。Ms7-1（-）为ms7 纯合隐性的不含所述构建体的植株（不育系植株）。

7.转基因植株花粉育性的分析

为确定转基因植株中抑制植物雄配子体的形成或功能的表达盒的表达效果，我们对具有单拷贝的所述介导植物生育力构建体的转基因玉米植株加以评估（图15），以该转基因植株做父本，非转基因玉米对照植株HiⅡ-A做母本进行测交分析。12.86万粒杂交的种子在荧光显微镜下观察，没有发现具有红色荧光的种子。表明所授的花粉是不含转基因成分的，这也说明所述表达盒已起到抑制雄配子细胞正常发育的作用。

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SEQUENCE LISTING

<110> 北京首佳利华科技有限公司

<120> 一种基于Ms7基因构建的多控不育表达载体及其用于保持和繁殖玉米隐性核不育系的方法

<130> 2015

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1856

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctctagaact agtggatctc gatgtgtagt ctacgagaag ggttaaccgt ctcttcgtga 60

gaataaccgt ggcctaaaaa taagccgatg aggataaata aaatgtggtg gtacagtact 120

tcaagaggtt tactcatcaa gaggatgctt ttccgatgag ctctagtagt acatcggacc 180

tcacatacct ccattgtggt gaaatatttt gtgctcattt agtgatgggt aaattttgtt 240

tatgtcactc taggttttga catttcagtt ttgccactct taggttttga caaataattt 300

ccattccgcg gcaaaagcaa aacaatttta ttttactttt accactctta gctttcacaa 360

tgtatcacaa atgccactct agaaattctg tttatgccac agaatgtgaa aaaaaacact 420

cacttatttg aagccaaggt gttcatggca tggaaatgtg acataaagta acgttcgtgt 480

ataagaaaaa attgtactcc tcgtaacaag agacggaaac atcatgagac aatcgcgttt 540

ggaaggcttt gcatcacctt tggatgatgc gcatgaatgg agtcgtctgc ttgctagcct 600

tcgcctaccg cccactgagt ccgggcggca actaccatcg gcgaacgacc cagctgacct 660

ctaccgaccg gacttgaatg cgctaccttc gtcagcgacg atggccgcgt acgctggcga 720

cgtgcccccg catgcatggc ggcacatggc gagctcagac cgtgcgtggc tggctacaaa 780

tacgtacccc gtgagtgccc tagctagaaa cttacacctg caactgcgag agcgagcgtg 840

tgagtgtagc cgagtaagat ctatggtgag caagggcgag gaggataaca tggccatcat 900

caaggagttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga 960

gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt 1020

gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg 1080

ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc tgtccttccc 1140

cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac 1200

ccaggactcc tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc gcggcaccaa 1260

cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctcctccga 1320

gcggatgtac cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa 1380

ggacggcggc cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca 1440

gctgcccggc gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca acgaggacta 1500

caccatcgtg gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg gcatggacga 1560

gctgtacaag taagatctgg tgaccagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca 1620

ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct 1680

gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg 1740

ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata 1800

gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcggg 1856

<210> 2

<211> 1541

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgacactctc gtctactcca agaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggctat 60

tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 120

ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc acctacaaat gccatcattg 180

cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 240

cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 300

ggattgatgt gaacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata 360

cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc 420

tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag 480

gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg 540

ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 600

ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 660

acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 720

tggagaggac acgctgaaat caccagtctc tctctacaaa tctatctctc tcgagtctac 780

catgagccca gaacgacgcc cggccgacat ccgccgtgcc accgaggcgg acatgccggc 840

ggtctgcacc atcgtcaacc actacatcga gacaagcacg gtcaacttcc gtaccgagcc 900

gcaggaaccg caggagtgga cggacgacct cgtccgtctg cgggagcgct atccctggct 960

cgtcgccgag gtggacggcg aggtcgccgg catcgcctac gcgggcccct ggaaggcacg 1020

caacgcctac gactggacgg ccgagtcgac cgtgtacgtc tccccccgcc accagcggac 1080

gggactgggc tccacgctct acacccacct gctgaagtcc ctggaggcac agggcttcaa 1140

gagcgtggtc gctgtcatcg ggctgcccaa cgacccgagc gtgcgcatgc acgaggcgct 1200

cggatatgcc ccccgcggca tgctgcgggc ggccggcttc aagcacggga actggcatga 1260

cgtgggtttc tggcagctgg acttcagcct gccggtaccg ccccgtccgg tcctgcccgt 1320

caccgagatt tgactcgagt ttctccataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa 1380

ttagggttcc tatagggttt cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat 1440

ttgtatttgt aaaatacttc tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagta 1500

ctaaaatcca gatcccccga attaattcgg cgttaattca g 1541

<210> 3

<211> 4644

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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gttcctttgc tcctttgctt ttgaacccta actttgatcg tttattggtt tgtgttgaac 120

ctttatgcac ctgtggaata tataatctag aacaaactag ttagtccaat catttgtgtt 180

gggcattcaa ccaccaaaat tatttatagg aaaaggttaa accttatttc cctttcaatc 240

tccccctttt tggtgattga tgccaacaca aaccaaagaa aatatataag tgcagaattg 300

aactagtttg cataaggtaa gtgcataggt tacttagaat taaatcaatt tatactttta 360

cttgatatgc atggttgctt tcttttattt taacattttg gaccacattt gcaccacttg 420

ttttgttttt tgcaaatctt tttggaaatt ctttttcaaa gtcttttgca aatagtcaaa 480

ggtatatgaa taagattgta agaagcattt tcaagatttg aaatttctcc ccctgtttca 540

aatgcttttc ctttgactaa acaaaactcc ccctgaataa aattctcctc ttagctttca 600

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caattgaaaa tcaacatacc aatttgaaat taaacatacc aatttaaaaa atttcaaaaa 720

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aaaaacggag actttgtgag ccatttatac tttctcccca ttggtaaatg aaatatgagt 840

gaaagattat accaaatttg gacagtgatg cggagtgacg gcgaaggata aacgataccg 900

ttagagtgga gtggaagcct tgtcttcgcc gaagactcca tttccctttc aatctacgac 960

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tcccggcggg gcgccacctc tagcagctca gattgctcag tcttgtgctg cattgcaaac 4260

acagcagcac gacactgcat aacgtctttt ccttgagatc tgacaaagca gcattagtcc 4320

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ttgaaagaca aaaaaaaaaa cccccgaaca gagtgctttg ggtcccaagc tactttagac 4560

tgtgttcggc gttcccccta aatttctccc cctatatctc actcacttgt cacatcagcg 4620

ttctctttcc cctatatctc cacg 4644

<210> 4

<211> 3749

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gatctttctg atttcaacca ttaccgatga atttctattt ggattagttc attttcgtct 60

tccctgtctg atcctgtttt cgacaattct gatcccgaat ccgtttttga attaaaatat 120

aaaaaataaa aacaagaaat ggtttatctc ggtcaatttc gtttttcacg aggaacatat 180

tcggtgtaca tgagcctttg gtgcacatga actaacaaag ttcacaaaaa attctgaaaa 240

aaaatcatac atattctttg catcgctact cctattatat ataaaatttc atgttcaaat 300

ttgttatatt ttagctgtaa taaaaagagt atttttagcc gattttctaa tttaaacttg 360

tcagaagttg tcttttttta ttacaactaa gtttaatgaa tttgaacttg aaacatgtat 420

ataattagag taagatgaaa agaatatgta tggatttttt caaaaaaatt gtaaaccttt 480

tttagttcat gtgcaccata tgtgaatcaa aggttcatat acaccggata tgtttccttt 540

ttcacgaacc taatctggcc tagccagtat gttgtggact tggctcctaa gtgtgaacct 600

ggcagtgatg ggcaacaaag caggcatgcc ttatgtgtga tgaataattg acacatgtac 660

cgagaggttt ggggtttttt tgtattgcat agcaaaacat ggtgaaattc ttagggtatt 720

tttgagatta catttagggc atgtttgttt cccttcattt tgaggaattg gaatctaact 780

aataaattag gctatttttt tagaatgtga cattcccaac tttctaaagt gtacatataa 840

gtctatctta aataatttat agggtggaag atgtaaattg attatataga tttataagct 900

tcttttctaa tgtaaaattt aaagctcact cttctacttg cttctctata acataatata 960

gtttataact acctctctca tatgatttag aataatatac aaatatatta cataaaaaat 1020

atattaattg aattagtgtt gtctaattta taattattag aatgtaattc aattccaacg 1080

aaacaacggg gccttaggtt taatatcttc cttacactgc gaaaatgttg ttacacttgc 1140

caaaaaaaat caatcgcata tttaccttac aaggacatat tttagcaaaa tgctatagac 1200

atgaatccaa cgtaatcaat agagtgagat ttactggtaa actaccaatt gctcatctgc 1260

tcggtaccaa ccagcctttc ctattaccat gcacatgttg cctctcaact gcagcatctt 1320

tcaagccgtg agcagacatg ttgcagatcg aagtaaggta tatatgtgca tagtctccta 1380

attcttcatc ttcaacctct agctgattga tctctggtat ttaccactct ttccttcctt 1440

ccttccttca attctaaata ccacaaatca aagttgcttt gcggggcccg gatccatggc 1500

tgccaataat aagacgatgg tggtcagcct ggggagctcg cggcggcgga agcgcggcga 1560

gatgctgttc cggttcgagt ccttctgcca gcccggctac cccgctccgc tcgccggcgg 1620

gggcgccttc agggacaacg tcagggcgct gctcggcctc gcgcacctgg aggccggcgc 1680

gcatggcgag accaagtgct ggtctttcca gctcgagctg caccgccacc cgcccaccgt 1740

cgtcaggctc ttcgtcgtcg aggaagtggt cgacacgtcg ccgcagcgcc agtgccacct 1800

ctgccgtcac gtcggttggg gtcggcatct gatctgcagc aagcggttcc acttcgtgct 1860

gcccaagagg gagttgtcag tggaagctga cggcctgcac tacgggatca accacagccc 1920

ggagaaaccg tccaaaggca cggcgacctc caggggccac ctgctgcacg gcgtggtgca 1980

cctcaacggc ttcggccacc tcgttgccct gcacggcttc gagggcggct ccgaattcgt 2040

cgccggcgag cagatcatgg acctctggga tcgcatatgc tcctctctga acgtcaggaa 2100

ggtgagcctc gtcgacacgg cgaggaaggg gcacatggag ctgcggctgc tgcacggcgt 2160

tgcgtacggc gacacgtggt tcgggcggtg gggctacagg ttcggccggc ccagctacgg 2220

cgtcgcgcta ccgtcctacc agcagtcgct gcacgcgctc cagtcggtac ctctctgcgt 2280

gctcgtgccg cacctgtcgt gcttcagcca ggacctcccc gtggtggtga ccaagtacca 2340

ggccatcagc ggccacaagc tgctcaacct cggcgacctc ctccgcttca tgctcgagct 2400

gcggacgcgc ctcccggcga cctccgtcac cgccatggac taccgcggca tcatgtcgga 2460

ggcctcgtgc cggtggtcgg ccaagcgcgt ggacatggcg gcccgcgccg tggtggacgc 2520

tctccgccgc accgagccgc ccgcgcggtg ggtcacgcgg caggaggtgc gcgacgcggc 2580

gcgcgcctac atcggcgaca cgggcctcct cgacttcgtg ctcaagtccc tgggcaacca 2640

catcgtcggc aactacgtcg tgcgacgcgc gatgaacccg gtgaccaagg tgctcgagta 2700

ctgcctggag gacgtgtcca gcgtgctccc ggcggtgggc ggcgtgccga gcaacggcgg 2760

cggcaagatg agggtccggt tccagctcac gcgggcgcag ctcatgaggg acctgatgca 2820

cctgtaccgc cacgtgctga aggagccgag ccaggcgctc accaccggcg ccttcggcgc 2880

gatccccgtg gcggcgcgga tggtcttgga caccaagcac ttcgtcaaag attaccacga 2940

aggtttcgct ccgatcaaca gtgttggagt tgggcacgtc cacatgaacc tgtgttgcac 3000

gctgcttctg aagaacgggg gtccggagct ggtggcgccg tacgagacgg tcaccctgcc 3060

ggcgcatgca acggtgggcg agctcaaatg ggaggtgcag aggctgttca gtgagatgta 3120

cctcggccta aggaccttca cggccgagtc cgtcgccggg gtcggcgtca gccaggacgc 3180

ttgcccggtg ctcgggctca tcgacgtggg aagcgtcgtg gtgatcgaag gatcagtcgt 3240

cgagcagcag cagctggcgg atgaaagcgt acatacaggg agcgaggccg cgtctgtgag 3300

cgagggaggc ggcgacagcg agagggtcgt ggactgcgcg tgcggagcgg atgacgacga 3360

cggggagcgc atggcgtgct gcgacatctg cgaggcgtgg cagcacaccc ggtgcgcggg 3420

gatcaaggac accgacgacg ccccgcacgt cttcgtctgc aaccgctgcg acaacgacgt 3480

tctgtcattc cctcccttga gctgttaggg atccggcatg ccagggctct caatggagtt 3540

tgaatcaaat cttccagctg ctttaatgag atatgcgaga cgcctatgat cgcatgatat 3600

ttgctttcaa ttctgttgtg cacgttgtaa aaaacctgag catgtgtagc tcagatcctt 3660

accgccggtt tcggttcatt ctaatgaata tatcacccgt tactatcgta tttttatgaa 3720

taatattctc cgttcaattt actgattga 3749

<210> 5

<211> 1562

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctgccattt aatgattcta tatatactat tcacttatgg atacatttaa ctgatggcgt 60

tttgttgagc gcgtcttatt tatttttaca tagcagcata gaagattaga agtcgcatgt 120

ccaagttttg tggaccgctg agaaactcaa ccaaattcga catatttttc acctccccat 180

gccacagaac caggtcaaaa cggctttctg gccgtcgccc actatttgta cgggcagcca 240

gacaaatatt cgggtctcgc agattattta aggacaccac aggctgcgtt acgaaaccag 300

gccagatttg ccaccctcgt ctcaccctcc ctccctcaca caaataataa ggaaaggtcc 360

cgcccttttc ctccgacatc cacagagagg aggggaaaac acgtacaatg aagaaaaatc 420

gcgctttttt gaagtgggca gggggcaagt atcccctgct tgatgatatt aaacggcatt 480

tgcccaaggg cgaatgtctg gttgagcctt ttgtaggtgc cgggtcggtg tttctcaaca 540

ccgacttttc tcgttacatc cttgccgata tcaatagcga cctgatcagt ctctataaca 600

ttgtgaagat gcgtactgat gagtacgtac aggccgcacg cgagctgttt gttcccgaaa 660

caaattgcgc cgaggtttac tatcagttcc gcgaagagtt caacaaaagc caggatccgt 720

tccgtcgggc ggtactgttt ttatatttga accgctacgg ttacaacggc ctgtgtcgtt 780

acaatctgcg cggtgagttt aacgtgccgt tcggccgcta caaaaaaccc tatttcccgg 840

aagcagagtt gtatcacttc gctgaaaaag cgcagaatgc ctttttctat tgtgagtctt 900

acgccgatag catggcgcgc gcagatgatg catccgtcgt ctattgcgat ccgccttatg 960

caccgctgtc tgcgaccgcc aactttacgg cgtatcacac aaacagtttt acgcttgaac 1020

aacaagcgca tctggcggag atcgccgaag gtctggttga gcgccatatt ccagtgctga 1080

tctccaatca cgatacgatg ttaacgcgtg agtggtatca gcgcgcaaaa ttgcatgtcg 1140

tcaaagttcg acgcagtata agcagcaacg gcggcacacg taaaaaggtg gacgaactgc 1200

tggctttgta caaaccagga gtcgtttcac ccgcgaaaaa ataaagactt gtccatcttc 1260

tggattggcc aacttaatta atgtatgaaa taaaaggatg cacacatagt gacatgctaa 1320

tcactataat gtgggcatca aagttgtgtg ttatgtgtaa ttactagtta tctgaataaa 1380

agagaaagag atcatccata tttcttatcc taaatgaatg tcacgtgtct ttataattct 1440

ttgatgaacc agatgcattt cattaaccaa atccatatac atataaatat taatcatata 1500

taattaatat caattgggtt agcaaaacaa atctagtcta ggtgtgtttt gcgaatgcgg 1560

cc 1562

<210> 6

<211> 4277

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aattagcttg catgcctgca gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg 60

agcattgcat gtctaagtta taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga 120

agtgcagttt atctatcttt atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct 180

atagtactac aataatatca gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt 240

ctaaaggaca attgagtatt ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca 300

tgtgttctcc tttttttttg caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta 360

gtacatccat ttagggttta gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct 420

attttattct attttagcct ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat 480

ttaataattt agatataaaa tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct 540

ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct 600

gttaaacgcc gtcgacgagt ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg 660

gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct ctggacccct ctcgagagtt 720

ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga aattgcgtgg cggagcggca 780

gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca cggcaccggc agctacgggg 840

gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc 900

ccctccacac cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga 960

tctcccccaa atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc 1020

cccccctctc taccttctct agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc cggtagttct 1080

acttctgttc atgtttgtgt tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg ctagcgttcg 1140

tacacggatg cgacctgtac gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca gtgtttctct 1200

ttggggaatc ctgggatggc tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc atgatttttt 1260

ttgtttcgtt gcatagggtt tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac 1320

ttgtttgtcg ggtcatcttt tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg 1380

ttgggcggtc gttctagatc ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt ggatttatta 1440

attttggatc tgtatgtgtg tgccatacat attcatagtt acgaattgaa gatgatggat 1500

ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat gcatatacag 1560

agatgctttt tgttcgcttg gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc gttcattcgt 1620

tctagatcgg agtagaatac tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg 1680

tatgtgtgtg tcatacatct tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa tatcgatcta 1740

ggataggtat acatgttgat gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg catatgcagc 1800

atctattcat atgctctaac cttgagtacc tatctattat aataaacaag tatgttttat 1860

aattattttg atcttgatat acttggatga tggcatatgc agcagctata tgtggatttt 1920

tttagccctg ccttcatacg ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca 1980

ccctgttgtt tggtgttact tctgcaggtc gactctagag gatcaattcg agctcggtac 2040

catggctgcc aataataaga cgatggtggt cagcctgggg agctcgcggc ggcggaagcg 2100

cggcgagatg ctgttccggt tcgagtcctt ctgccagccc ggctaccccg ctccgctcgc 2160

cggcgggggc gccttcaggg acaacgtcag ggcgctgctc ggcctcgcgc acctggaggc 2220

cggcgcgcat ggcgagacca agtgctggtc tttccagctc gagctgcacc gccacccgcc 2280

caccgtcgtc aggctcttcg tcgtcgagga agtggtcgac acgtcgccgc agcgccagtg 2340

ccacctctgc cgtcacgtcg gttggggtcg gcatctgatc tgcagcaagc ggttccactt 2400

cgtgctgccc aagagggagt tgtcagtgga agctgacggc ctgcactacg ggatcaacca 2460

cagcccggag aaaccgtcca aaggcacggc gacctccagg ggccacctgc tgcacggcgt 2520

ggtgcacctc aacggcttcg gccacctcgt tgccctgcac ggcttcgagg gcggctccga 2580

attcgtcgcc ggcgagcaga tcatggacct ctgggatcgc atatgctcct ctctgaacgt 2640

caggaaggtg agcctcgtcg acacggcgag gaaggggcac atggagctgc ggctgctgca 2700

cggcgttgcg tacggcgaca cgtggttcgg gcggtggggc tacaggttcg gccggcccag 2760

ctacggcgtc gcgctaccgt cctaccagca gtcgctgcac gcgctccagt cggtacctct 2820

ctgcgtgctc gtgccgcacc tgtcgtgctt cagccaggac ctccccgtgg tggtgaccaa 2880

gtaccaggcc atcagcggcc acaagctgct caacctcggc gacctcctcc gcttcatgct 2940

cgagctgcgg acgcgcctcc cggcgacctc cgtcaccgcc atggactacc gcggcatcat 3000

gtcggaggcc tcgtgccggt ggtcggccaa gcgcgtggac atggcggccc gcgccgtggt 3060

ggacgctctc cgccgcaccg agccgcccgc gcggtgggtc acgcggcagg aggtgcgcga 3120

cgcggcgcgc gcctacatcg gcgacacggg cctcctcgac ttcgtgctca agtccctggg 3180

caaccacatc gtcggcaact acgtcgtgcg acgcgcgatg aacccggtga ccaaggtgct 3240

cgagtactgc ctggaggacg tgtccagcgt gctcccggcg gtgggcggcg tgccgagcaa 3300

cggcggcggc aagatgaggg tccggttcca gctcacgcgg gcgcagctca tgagggacct 3360

gatgcacctg taccgccacg tgctgaagga gccgagccag gcgctcacca ccggcgcctt 3420

cggcgcgatc cccgtggcgg cgcggatggt cttggacacc aagcacttcg tcaaagatta 3480

ccacgaaggt ttcgctccga tcaacagtgt tggagttggg cacgtccaca tgaacctgtg 3540

ttgcacgctg cttctgaaga acgggggtcc ggagctggtg gcgccgtacg agacggtcac 3600

cctgccggcg catgcaacgg tgggcgagct caaatgggag gtgcagaggc tgttcagtga 3660

gatgtacctc ggcctaagga ccttcacggc cgagtccgtc gccggggtcg gcgtcagcca 3720

ggacgcttgc ccggtgctcg ggctcatcga cgtgggaagc gtcgtggtga tcgaaggatc 3780

agtcgtcgag cagcagcagc tggcggatga aagcgtacat acagggagcg aggccgcgtc 3840

tgtgagcgag ggaggcggcg acagcgagag ggtcgtggac tgcgcgtgcg gagcggatga 3900

cgacgacggg gagcgcatgg cgtgctgcga catctgcgag gcgtggcagc acacccggtg 3960

cgcggggatc aaggacaccg acgacgcccc gcacgtcttc gtctgcaacc gctgcgacaa 4020

cgacgttctg tcattccctc ccttgagctg ttagggatcc tctagagtcg acctgcaggc 4080

atgccctgct ttaatgagat atgcgagacg cctatgatcg catgatattt gctttcaatt 4140

ctgttgtgca cgttgtaaaa aacctgagca tgtgtagctc agatccttac cgccggtttc 4200

ggttcattct aatgaatata tcacccgtta ctatcgtatt tttatgaata atattctccg 4260

ttcaatttac tgattga 4277

<210> 7

<211> 1818

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctctagaact agtggatctc gatgtgtagt ctacgagaag ggttaaccgt ctcttcgtga 60

gaataaccgt ggcctaaaaa taagccgatg aggataaata aaatgtggtg gtacagtact 120

tcaagaggtt tactcatcaa gaggatgctt ttccgatgag ctctagtagt acatcggacc 180

tcacatacct ccattgtggt gaaatatttt gtgctcattt agtgatgggt aaattttgtt 240

tatgtcactc taggttttga catttcagtt ttgccactct taggttttga caaataattt 300

ccattccgcg gcaaaagcaa aacaatttta ttttactttt accactctta gctttcacaa 360

tgtatcacaa atgccactct agaaattctg tttatgccac agaatgtgaa aaaaaacact 420

cacttatttg aagccaaggt gttcatggca tggaaatgtg acataaagta acgttcgtgt 480

ataagaaaaa attgtactcc tcgtaacaag agacggaaac atcatgagac aatcgcgttt 540

ggaaggcttt gcatcacctt tggatgatgc gcatgaatgg agtcgtctgc ttgctagcct 600

tcgcctaccg cccactgagt ccgggcggca actaccatcg gcgaacgacc cagctgacct 660

ctaccgaccg gacttgaatg cgctaccttc gtcagcgacg atggccgcgt acgctggcga 720

cgtgcccccg catgcatggc ggcacatggc gagctcagac cgtgcgtggc tggctacaaa 780

tacgtacccc gtgagtgccc tagctagaaa cttacacctg caactgcgag agcgagcgtg 840

tgagtgtagc cgagtactcg agatggcctc ctccgagaac gtcatcaccg agttcatgcg 900

cttcaaggtg cgcatggagg gcaccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg 960

cgagggccgc ccctacgagg gccacaacac cgtgaagctg aaggtgacga agggcggccc 1020

cctgcccttc gcctgggaca tcctgtcccc ccagttccag tacggctcca aggtgtacgt 1080

taagcacccc gccgacatcc ccgactacaa gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg 1140

ggagcgcgtg atgaacttcg aggacggcgg cgtggccacc gtgacccagg actcctccct 1200

gcaggacggc tgcttcatct acaaggtgaa gttcatcggc gtgaacttcc cctccgacgg 1260

ccccgtgatg cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc accgagcgcc tgtacccccg 1320

cgacggcgtg ctgaagggcg agacccacaa ggccctgaag ctgaaggacg gcggccacta 1380

cctggtggag ttcaagtcca tctacatggc caagaagccc gtgcagctgc ccggctacta 1440

ctacgtggac gccaagctgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggagca 1500

gtacgagcgc accgagggcc gccaccacct gttcctgtag ggtgaccagc tcgaatttcc 1560

ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg 1620

cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat 1680

gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat 1740

acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat 1800

ctatgttact agatcggg 1818

Claims (21)

1.一种可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，其特征在于，包含四种功能基因表达元件：雄性不育玉米育性恢复基因Ms7的表达元件；抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达元件；玉米种皮颜色筛选标记的表达元件；除草剂抗性基因表达元件，

其中，所述雄性不育玉米育性恢复基因Ms7的表达元件的核苷酸序列如序列表中SEQID No.4所示。

2.根据权利要求1所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，其特征在于，所述表达体包含1个或2个抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达元件。

3.根据权利要求1所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，其特征在于：所述抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达元件由启动子、抑制玉米雄配子体形成或功能的基因和终止子可操作地相连而构成。

4.根据权利要求3所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，其特征在于，所述抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达元件的启动子为聚半乳糖醛酸酶47基因的调控序列或Zm13基因的调控序列。

5.根据权利要求3所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，其特征在于，所述抑制玉米雄配子体形成或功能的基因是淀粉酶基因、DAM甲基化酶基因或细胞毒素基因。

6.根据权利要求3所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，其特征在于，所述抑制玉米雄配子体的形成或功能的表达元件的终止子是玉米In2-1基因的终止子或马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的终止子。

7.根据权利要求1所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，其特征在于：所述玉米种皮颜色筛选标记的表达元件由启动子、玉米种皮颜色筛选标记基因和终止子可操作地相连而构成。

8.根据权利要求7所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，所述玉米种皮颜色筛选标记的表达元件的启动子是玉米种皮特异表达的启动子。

9.根据权利要求7所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，所述玉米种皮颜色筛选标记基因是红色荧光基因或绿色荧光基因。

10.根据权利要求7所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，所述玉米种皮颜色筛选标记的表达元件的终止子是胭脂碱合成酶基因或章鱼碱合成酶基因的终止子。

11.根据权利要求1所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，其特征在于：所述除草剂抗性基因的表达元件由启动子、除草剂抗性基因和终止子可操作地相连而构成。

12.根据权利要求11所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，其特征在于，所述除草剂抗性基因的表达元件的启动子是花椰菜花叶病毒的35S启动子。

13.根据权利要求11所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，其特征在于，所述除草剂抗性基因是EPSPS基因、PAT基因或BAR基因。

14.根据权利要求11所述的可以恢复玉米雄性生育力、保持和繁殖玉米雄性不育系的多控不育植物表达体，其特征在于，所述除草剂抗性基因的表达元件的终止子是来自花椰菜花叶病毒的35S polyA终止子。

15.一种包含权利要求1所述表达体的重组载体。

16.一种包含权利要求1所述表达体的植物细胞，所述植物为玉米。

17.一种用于保持玉米雄性不育植株的纯合隐性状态的方法，所述方法包括：(a)提供第一植株，其包含Ms7基因的纯合隐性等位基因，并且其是雄性不育的；(b)创制第二植株，所述第二植株是向上述第一植株中引入权利要求1所述表达体，且所述表达体只存在于同源染色体的其中一条染色体上，即所述表达体为半合子状态；所述第二植株包含Ms7基因的纯合隐性等位基因；(c)用所述第二植株的雄性配子给所述第一植株受精，以保持并产生所述第一植株纯合隐性状态的后代。

18.一种用于繁殖含有权利要求1所述表达体的玉米多控不育保持系种子和不含任何转基因元件的不育系种子的方法，所述方法包括：通过权利要求17中所述的第二植株自花受精产生50％的含有所述表达体的种子和50％的正常不育系种子。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，其还包括鉴定具有所述表达体种子的步骤，具体为：将所述第二植株的种子播种后，其产生的花粉作为供体，与其它正常育性植株杂交，所获得子一代种子全部是正常颜色种子。

20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，其还包括鉴定具有所述表达体的种子的步骤，具体为：将所述第二植株的种子在荧光显微镜下观察，含有所述表达体的种子具有红色荧光。

21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，其还包括鉴定具有所述表达体的植株的步骤，具体为：种植所述第二植株自交后产生的种子；使所述种子长成待鉴定植株；用除草剂喷洒所述待鉴定植株，具有所述表达体的植株与不含所述表达体的植株相比，没有植物损伤症状或损伤症状程度更轻。