CN113621641A - 一种介导调控植物隐性核雄性不育系雄性育性的gat载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种介导调控植物隐性核雄性不育系雄性育性的GAT载体及其应用。本发明的GAT载体包括五种功能元件表达盒：植物雄性育性恢复基因元件表达盒，用于恢复隐性核不育突变体的雄性育性；植物花粉败育基因元件表达盒，用于清除含GAT的花粉及保持GAT保持系的杂合状态；化学除草剂正向选择表达盒，用于基因转化及GAT保持系除杂提纯；化学除草剂负向选择表达盒，用于清除除草剂敏感的GAT保持系花粉及种子外逸及GAT不育系除杂提纯；种子筛选元件表达盒，用于种子机械分选。本发明的GAT载体可用于植物隐性核不育材料的杂交育种和杂交制种，从而获得优质高产广适高抗的植物新品种及其种子，具有巨大的经济价值。

Description

一种介导调控植物隐性核雄性不育系雄性育性的GAT载体及 其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种介导调控植物隐性核雄性不育突变体雄性育性的GAT载体及其应用。

背景技术

杂种优势是杂交后代在一种或多种性状上超越双亲的现象，普遍存在于生物界中。农作物杂种优势利用是农业增产重要手段，杂种优势利用产业化的核心在于母本的雄性不育性。

以水稻为例，中国是世界上杂交水稻产业化最成功的国家，在杂交水稻育制种研究领域处于世界领先地位。目前我国杂交水稻育制种方法主要分为“三系法”和“两系法”，各有其优缺点。“三系法”自70年代开始应用于水稻，其主要原理是，利用不育系、保持系和恢复系来配制杂交种。其基本流程是利用保持系自交繁殖保持系，不育系与保持系杂交繁殖不育系，恢复系与不育系杂交产生杂交种子。由于“三系法”不育系的雄性不育是由细胞核与细胞质的基因互作造成的，导致该方法存在缺陷：只有细胞核含有特定恢复基因的恢复系与不育系杂交后才能恢复杂交种育性，从而生产杂交水稻种子。因而“三系法”种质资源利用率较低，且细胞质的同质化也具有潜在病虫害风险。“两系法”的原理是，利用光温敏核不育系与恢复系配制杂交种。该不育系在水稻发育特定时期，环境温度高于23.5度时不育系的雄性保持不育，可与恢复系成功配制杂交种；若环境温度低于23.5度，不育系雄性育性恢复正常，将自交繁殖。因此，“两系法”只需要不育系与恢复系，节省制种成本。但是，由于“两系法”的光温敏核不育系育性转换受到光温环境影响，导致该技术在不育系繁殖以及杂交种制种过程中都存在极大的环境风险，同时由于对温度的特殊要求，生产季节和区域也大大受到限制。

隐性核雄性不育不同于“三系”、“两系”，其雄性育性仅受一对隐性核基因控制，不受光温环境影响；且由于其基因为非常稀有的隐性突变，由于绝大多数品种的基因组上述位点为野生型的显性基因，故理论上几乎任何品种都可以作为隐性核雄性不育的恢复系与其杂交产生可育后代。隐性核不育的发现已经有非常长久的历史，当其与野生型材料杂交时，其F1代为杂合状态表现为可育，F2代出现育性分离(单基因控制情况下，分离比为3:1)，但在F1代自交结实收获种子(即F2)时，因种子外观完全一样，无法区分哪一部分种子将来发育成株后是可育，哪一部分是不育的。因此，长期以来受限于无法规模化保持其后代雄性不育性而不能产业化利用。因此，研发一种能够保持和繁殖隐性核雄性不育材料并配套商业化生产的技术，就显得尤为必要，这也是广大育种人员的迫切需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种介导调控植物隐性核雄性不育突变体雄性育性的GAT载体及其应用。

本发明还提供一种农作物杂交育制种技术体系(GAT技术体系)和应用。GAT(Genetic Automation Technology，GAT)技术是一种新型的杂交种子育制种技术，该技术可成功利用隐性核雄性不育系，其核心思路是利用现代生物技术，将农作物花粉育性恢复基因、花粉败育基因、除草剂敏感基因、筛选标记基因等按特定顺序和方向紧密连锁地构建在GAT载体上，通过高通量基因转化技术导入到隐性核雄性不育系中，获得大量转化事件。由于多基因转化过程中经常出现部分基因转入、各转基因元件无法同时发挥功能及转基因沉默等问题，故多基因转化经常出现无法筛选获得均达目的性状的转化事件。本发明经过对各功能元件的筛选，从563个转化事件中筛选获得14个各元件均发挥正常功能的初始保持系，创造隐性核雄性不育系的保持系，用于GAT不育系和杂交种的生产，从而成功实现隐性核雄性不育系的保持和繁殖，进而实现隐性核雄性不育系的商业化利用。

本发明所述的隐性核雄性不育突变体，其基因呈隐性纯合状态时，植株呈现雄性不育状态；该基因为杂合或显性纯合状态时，植株呈现雄性可育状态。该隐性核雄性不育突变体的控制基因可为MS1、MS2、MS3、MS5、MS7、MS8、MS9、MS10、MS11、MS12、MS13、MS14、MS17、MS20、MS22、MS23、MS24、MS25、OsCYP704B2、MS27、MS28、MS29、MS30、MS31、MS32、MS33、MS34、MS36、MS37、MS38、MS43、MS45、MS48、MS50核苷酸序列等的突变基因。优选的，为OsCYP704B2的突变体(oscyp704b2)，对应的，其恢复基因为OsCYP704B2。

本发明首先提供一种用于农作物杂交育种制种的遗传智能化育制种系统，称为GAT系统，含有植物隐性核雄性不育系，即GAT不育系，隐性核雄性不育保持系，即GAT保持系，和普通恢复系三个系别；

其中的GAT保持系中含有GAT载体，该载体包括五种功能元件表达盒：(1)植物雄性育性恢复基因元件表达盒，用于恢复隐性核不育突变体的雄性育性；(2)植物花粉败育基因元件表达盒，用于清除含GAT的花粉及保持GAT保持系的杂合状态或半合子状态；(3)基因转化及保持系筛选元件表达盒，用于基因转化及GAT保持系除杂提纯；(4)除草剂敏感元件表达盒，用于清除除草剂敏感的GAT保持系花粉及种子外逸及GAT不育系除杂提纯；(5)种子筛选元件表达盒，用于种子机械分选；所述五种功能元件表达盒构建于植物双元表达载体中，得到GAT系统载体。

上述GAT系统中，GAT载体以单拷贝形式存在于GAT保持系基因组中。

上述GAT系统中，所述GAT不育系为单隐性细胞核基因控制的不育系，当基因位点为隐性纯合状态时表现为雄性不育；杂合状态及显性纯合状态表现为雄性可育。

进一步地，在所述的GAT系统中，GAT保持系自交结实，所获种子呈1:1分离得到GAT保持系和GAT不育系；两种种子通过种子筛选元件实现分离，实现GAT保持系的自我繁殖；GAT保持系向GAT不育系授粉使得GAT不育系结实并保持其后代的雄性不育性，从而实现隐性雄性核不育系的繁殖。通过种子筛选可规模化将隐性核雄性不育种子(GAT不育系)与可育种子(GAT保持性)分离，辅以保持系筛选元件及除草剂敏感元件的功能进行后续的GAT保持系及不育系除杂保纯，创造性的解决了现有技术存在的隐性雄性核不育系的规模化繁殖与保持问题，从而使得隐性核雄性不育的产业化成为可能。

本发明提供了一种农作物遗传智能化育制种载体，称为GAT载体，该载体由五种功能元件表达盒通过接头序列连接构建于植物双元表达载体中得到，所述物种功能元件表达盒分别为：

(1)植物雄性育性恢复基因元件表达盒，用于恢复隐性核不育突变体的雄性育性；

(2)植物花粉败育基因元件表达盒，用于清除含GAT的花粉及保持GAT保持系的杂合状态或半合子状态；

(3)基因转化及保持系筛选元件表达盒，用于基因转化及GAT保持系除杂提纯；

(4)除草剂敏感元件表达盒，用于清除除草剂敏感的GAT保持系花粉及种子外逸及GAT不育系除杂提纯；

(5)种子筛选元件表达盒，用于种子机械分选；所述五种功能元件表达盒通过接头序列连接构建得到GAT系统载体。

本发明的GAT载体中，所述(1)植物雄性育性恢复基因元件表达盒由启动子、雄性育性恢复基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；

所述雄性育性恢复基因为MS1、MS2、MS3、MS5、MS7、MS8、MS9、MS10、MS11、MS12、MS13、MS14、MS17、MS20、MS22、MS23、MS24、MS25、OsCYP704B2、MS27、MS28、MS29、MS30、MS31、MS32、MS33、MS34、MS36、MS37、MS38、MS43、MS45、MS48、MS50、OsCYP704B2基因的野生型基因，优选OsCYP704B2基因的野生型基因。

优选地，本发明所述(1)植物雄性育性恢复基因元件表达盒中，启动子为水稻OsCYP704B2基因起始密码子ATG上游1112bp序列，编码区为OsCYP704B2基因的编码区，终止子为OsCYP704B2基因终止密码子TGA下游274bp序列。该表达盒的作用是恢复OsCYP704B2基因的隐性纯合突变体oscyp704b2的雄性育性。

所述(1)植物雄性育性恢复基因元件表达盒的序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的GAT载体中，所述(2)植物花粉败育基因元件表达盒由植物花粉特异启动子、败育基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；优选启动子为玉米PG47启动子、水稻PCHF15、OsPC32启动子，优选败育基因为水稻α-淀粉酶基因OsAA、玉米α-淀粉酶基因Zm-AA1、大麦α-淀粉酶基因HvAA1、小米α-淀粉酶基因SiAA、细胞分裂素氧化酶，半胱氨酸蛋白酶，赤霉素氧化酶，终止子为玉米IN2-1、细菌NosT终止子。

优选地，本发明所述植物花粉败育基因元件表达盒由启动子PG47、Zm-AA1编码区和终止子IN2-1组成的表达盒Killer序列如SEQ ID NO.7所示；或植物花粉败育基因元件表达盒Killer 5400，由启动子PG47、OsAA编码区和Nos终止子(NosT)组成，序列如SEQID NO.8所示；或植物花粉败育基因元件表达盒Killer Hv，由启动子OsPC32、大麦α-淀粉酶基因HvAA1编码区和NosT组成，序列如SEQ ID NO.9所示。

该元件的作用是使得含GAT元件的花粉败育，用于维持GAT转化株或者GAT保持系的杂合状态或半合子状态及防止GAT元件漂移。

本发明的GAT载体中，所述(3)基因转化及保持系筛选元件表达盒由启动子、筛选标记基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；优选启动子为OsUbi启动子或Actin启动子的任一个，优选筛选标记基因编码区为OsALSm1、OsALSm2、OsALSm3序列、草甘膦抗性基因EPSPSm序列、草甘膦N-乙酰转移酶序列或草丁膦抗性基因Bar序列中的任一个筛选标记基因；终止子为OsUbiT(SEQ ID NO.22)或NosT终止子。

优选地，由ActinP、OsALSm1和NosT组成的基因转化及保持系筛选元件表达盒Marker2序列如SEQ ID NO.10所示。另一个由OsUbiP、OsALSm1和OsUbiT组成的基因转化及保持系筛选元件表达盒Marker2UAU序列如序列SEQ ID NO.11所示。或EPSPS表达盒，其序列如序列SEQ ID NO.12所示，或Bar表达盒，其序列如序列SEQ ID NO.13所示。上述表达盒的作用是基因转化筛选抗性标记及筛选区分GAT保持系和不育系。

本发明的GAT载体中，所述(4)除草剂敏感元件表达盒由启动子、除草剂显性敏感元件及终止子依序可正常工作的相连，优选启动子为ZmUbi启动子，除草剂显性敏感元件为细胞色素P450基因CYP81A6的RNAi结构序列P450i，终止子为PinII终止子、NosT终止子。

优选地，由ZmUbiP、P450i和NosT组成的除草剂敏感元件表达盒Marker1序列如SEQID NO.14所示，或如SEQ ID NO.15所示(P450i-2)，或如SEQ ID NO.16所示(P450i-3)。该元件的作用是防止GAT元件漂移、GAT保持系混杂入其他材料及用于GAT不育系制种。

本发明的GAT载体中，所述(5)种子筛选元件表达盒由启动子、种皮显色基因及终止子依序可正常工作的相连，优选地，启动子为种子特异性启动子ZZ1启动子，种皮显色基因为深红色荧光蛋白FP635，红色荧光蛋白RFP或绿色荧光蛋白GFP，终止子为OS-T28终止子、NosT终止子。

优选地，由ZZ1P、FP635和NosT组成的种子筛选元件表达盒Marker3ZFN序列如SEQID NO.17所示。该元件的作用是筛选区分GAT保持系种子与GAT不育系或GAT杂交种。

本发明所述GAT载体，所述接头序列包括：多克隆位点MCSI，序列如SEQ ID NO.18所示；多克隆位点MCSII，序列如SEQ ID NO.19所示；多克隆位点MCSIII，序列如SEQ IDNO.20所示；多克隆位点MCSIV，序列如SEQ ID NO.21所示；或多克隆位点MCSV，序列如SEQID NO.22所示。

优选地，本发明所述终载体为pC0307，见图5，其序列如SEQ ID NO.23所示；或所述终载体为pC0308，见图6，其序列如SEQ ID NO.24所示，或所述终载体为pC0309，见图7，其序列如SEQ ID NO.25所示。

优选地，本发明所述GAT载体为pC0308-MMMuauCK5400(图3，核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示)，pC1300-MMCK载体见图1，pC0308-MMCK载体见(图2)。

本发明提供了上述GAT载体的构建方法，将五种功能元件表达盒通过接头序列连接构建于终载体中得到，所述五种功能元件表达盒分别为：

(1)植物雄性育性恢复基因元件表达盒，用于恢复隐性核不育突变体的雄性育性；该表达盒由启动子、雄性育性恢复基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；

(2)植物花粉败育基因元件表达盒，用于清除含GAT的花粉及保持GAT保持系的杂合状态或半合子状态；该表达盒由植物花粉特异启动子、败育基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；

(3)基因转化及保持系筛选元件表达盒，用于基因转化及GAT保持系除杂提纯；该表达盒由启动子、筛选标记基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；

(4)除草剂敏感元件表达盒，用于清除除草剂敏感的GAT保持系花粉及种子外逸及GAT不育系除杂提纯；该表达盒由启动子、除草剂显性敏感元件及终止子依序可正常工作的相连；

(5)种子筛选元件表达盒，用于种子机械分选；所述五种功能元件表达盒通过接头序列连接于终载体上构建得到GAT载体；该表达盒由启动子、种皮显色基因及终止子依序可正常工作的相连。

上述构建方法中，优选地，接头序列包括：多克隆位点MCSI，序列如SEQ ID NO.18所示；多克隆位点MCSII，序列如SEQ ID NO.19所示；多克隆位点MCSIII，序列如SEQ IDNO.20所示；多克隆位点MCSIV，序列如SEQ ID NO.21所示；或多克隆位点MCSV，序列如SEQID NO.22所示。

上述构建方法中，优选地，本发明所述终载体为pC0307，见图5，其序列如SEQ IDNO.23所示；或所述终载体为pC0308，见图6，其序列如SEQ ID NO.24所示，或所述终载体为pC0309，见图7，其序列如SEQ ID NO.25所示。

本发明提供了所述的遗传智能化育制种系统(GAT系统)或所述的GAT载体在植物杂交育种制种中的应用。

本发明提供了所述的遗传智能化育制种系统(GAT系统)或所述的GAT载体在生产非转基因杂交种中的应用。

本发明提供了所述的遗传智能化育制种系统(GAT系统)或所述的GAT载体在植物隐性核雄性不育系的规模化保持及规模化繁殖中的应用。

本发明提供了所述的遗传智能化育制种系统(GAT系统)或所述的GAT载体在生产优质高产广适高抗植物新品种中的应用。

本发明中，所述植物包括水稻、玉米、小麦、大麦、大豆、棉花、油菜、高粱、小米、燕麦、黑麦、青稞、辣椒、西瓜等。

进一步地，本发明提供了一种保持及繁殖植物隐性核雄性不育材料(GAT不育材料)的雄性不育性的方法，即保持其雄性不育基因处于隐性纯合状态的方法，具体如下：采用遗传智能化育制种系统GAT系统，向基因型为隐性纯合的GAT不育系中导入GAT载体，创制只含单拷贝GAT载体的GAT转化株，该GAT转化株的基因型为隐性纯合/GAT-。使GAT转化株授粉给GAT不育系，获得的种子基因型仍为隐性纯合状态，从而保持GAT不育系后代的雄性不育性。

具体地，以ms代表隐性核雄性不育突变基因，MS代表野生型基因，将GAT元件导入GAT不育材料(基因型为ms ms)，创制只含单拷贝GAT载体的GAT转化株(基因型为ms ms/GAT-)。因GAT载体中含恢复基因元件，故可恢复雄性育性，GAT转化株产生的花粉和雌配子均有两种类型：(ms GAT)和(ms-)，(ms GAT)类型花粉由于含有GAT载体中的花粉败育基因元件，会败育，因此只有(ms-)类型花粉存活。故GAT转化株授粉给GAT不育株，获得的种子基因型仍为隐性纯合状态(ms ms)，可保持GAT不育株后代的雄性不育性。由于GAT不育株与GAT转化株除GAT元件外遗传背景完全相同，故由此方法获得的GAT不育株所有基因型不变，表型也相同。

本发明提供了一种用于维持植物隐性核雄性不育株的保持系材料(GAT转化株或GAT保持系)的GAT元件呈杂合状态或半合子状态的方法，采用所述的遗传智能化育制种系统，向基因型为隐性纯合的GAT不育系中导入GAT载体，创制只含单拷贝GAT载体的GAT转化株，该GAT转化株的基因型为隐性纯合/GAT-。GAT转化株自交可获得两种基因型种子，一种为隐性纯合/--，是GAT不育株；另一种为隐性纯合/GAT-，是GAT不育株保持系材料，根据遗传定律，二者呈1：1分离，即GAT转化株自交后代中基因型为隐性纯合/GAT-的GAT座位保持杂合状态或半合子状态。

本发明提供一种用于筛选或区分GAT转化株自交种子的方法，所述GAT转化株是采用本发明所述的遗传智能化育制种系统，向基因型为隐性纯合的GAT不育系中导入GAT载体，创制只含单拷贝GAT载体的GAT转化株，该GAT转化株的基因型为隐性纯合/GAT-，GAT转化株自交结实的种子呈现1:1分离，其中50％为包含GAT载体的种子，基因型为隐性纯合/GAT-，在激发光下观察呈现荧光；50％为不包含GAT载体的种子，基因型为隐性纯合，在激发光下观察无荧光。

本发明提供了一种用于筛选或区分GAT转化株自交种子及植株的方法，所述GAT转化株是采用本发明所述的遗传智能化育制种系统(GAT系统)，向基因型为隐性纯合的GAT不育系中导入GAT载体，创制只含单拷贝GAT载体的GAT转化株，该GAT转化株的基因型为隐性纯合/GAT-，GAT转化株自交结实的种子呈现1:1分离，其中50％为包含GAT载体的种子及其植株，其基因型为隐性纯合/GAT-，具有对针对乙酰乳酸合酶或EPSPS或Bar基因的各类除草剂高抗性，包括但不限于双草醚、咪唑乙烟酸、灭草烟、草甘膦、草丁膦或草铵膦；50％为不包含GAT载体的种子，基因型为隐性纯合不具有此高抗性。

本发明提供了一种用于防止植物花粉漂移的方法，将本发明所述的GAT载体转入植物中，使得含GAT载体的植物材料在花粉成熟时，因其含有花粉败育基因元件，会特异性导致含GAT载体的花粉败育，而保证不含GAT载体的花粉正常发育散粉，从而降低含GAT载体的花粉外逸的概率。

本发明提供一种用于防止GAT种子或植株漂移或混杂的方法，使所述种子或植株中含有GAT载体，在种子时期通过包衣或在苗期至开花期施用特定浓度的除草剂，包括苯达松或苄嘧磺隆或烟嘧磺隆，可在特定时期杀死含GAT种子或植株的材料，从而防止GAT种子或植株混杂入其他普通材料中。

本发明提供一种利用植物隐性核雄性不育系生产不育系种子方法，采用所述的遗传智能化育制种系统，将GAT保持系与GAT不育系按一定比例混合播种，利用GAT保持系授粉给GAT不育系，授粉完成后，施用除草剂，包括苯达松或苄嘧磺隆或烟嘧磺隆，特异性的杀死GAT保持系，仅保留GAT不育系收获种子。

本发明提供一种提纯植物隐性核雄性不育系的方法，采用所述的遗传智能化育制种系统，GAT不育系通过种子包衣或在苗期至开花期施用特定浓度的除草剂，包括苯达松或苄嘧磺隆或烟嘧磺隆，可保证GAT不育系纯度。

本发明提供一种利用植物隐性核雄性不育系进行杂交制种方法，采用所述的遗传智能化育制种系统，利用GAT保持系自交生产GAT保持系种子和GAT不育系种子；利用GAT保持系授粉给GAT不育系生产GAT不育系种子；利用GAT不育系和常规材料杂交组配生产普通商业化杂交种。

本发明提供了一种利用植物隐性核雄性不育系进行杂交育种方法，采用遗传智能化育制种系统，利用GAT保持系与普通材料杂交选育，可通过常规回交选育，也可通过系谱法选育GAT保持系及不育系，选育过程辅以GAT各项分子标记、除草剂筛选、种子色选等加速选育。

本发明还提供了用于检测所述的GAT载体或含有GAT载体的转基因阳性植株的引物，所述引物为以下任一：

检测植物雄性育性恢复基因元件表达盒的引物序列如SEQ ID NO.26-27所示；或

检测植物花粉败育基因元件表达盒的引物序列如SEQ ID NO.28-29所示；或

检测基因转化及保持系筛选元件表达盒的分子引物如SEQ ID NO.30-31所示；或

检测除草剂敏感元件表达盒的引物序列如SEQ ID NO.32-33所示。

检测种子筛选元件表达盒的分子标记引物序列如序列SEQ ID NO.34-35所示。

本发明提供了一种检测或含有GAT载体的转基因阳性植株的方法。

若用SEQ ID NO.26-27作引物扩增，扩增产物用HaeIII酶切后电泳，最终产物中可能出现3种带型：86bp为野生型CYP704B2的带型，84bp为cyp704b2-3突变体的带型，66bp为GAT载体上植物雄性育性恢复基因元件表达盒的带型。如果出现84bp和66bp带型，而没有88bp带型，表明该植株为雄性不育突变体背景，且植物雄性育性恢复基因元件表达盒存在；

若用SEQ ID NO.28-29引物进行扩增，如果能扩增出914bp条带，表明植物花粉败育基因元件表达盒存在；

若用SEQ ID NO.30-31作为引物进行扩增，如果能扩增出831bp条带表明基因转化及保持系筛选元件表达盒存在；

若用SEQ ID NO.32-33作为引物进行扩增，如果能扩增出923bp条带，表明除草剂敏感元件表达盒存在。

若用SEQ ID NO.34-35作为引物进行扩增，如果能扩增出1412bp条带，表明种子筛选元件表达盒存在。

本发明提供了一种分选不同功能的植株和后代的方法，所述的GAT载体转入植株，利用GAT载体中的(3)基因转化及保持系筛选元件表达盒，(4)除草剂敏感元件表达盒，(5)种子筛选元件表达盒，基于化学除草剂正负双向选择与机械色选相结合，分选不同功能的植株和后代。

优选地，所述化学除草剂正负双向选择是同一种植株对一种除草剂表型抗性，对另一种除草剂表型敏感。

更优选地，化学除草剂正向选择除草剂是抗双草醚、咪唑乙烟酸、灭草烟、抗草甘膦、抗草丁膦或草铵膦，化学除草剂负向选择是对苯达松、苄嘧磺隆或烟嘧磺隆敏感。

更优选地，化学除草剂正向选择除草剂是抗双草醚、咪唑乙烟酸、灭草烟，化学除草剂负向选择是对苯达松、苄嘧磺隆敏感。

本发明构建了GAT载体，包括五种功能元件表达盒：植物雄性育性恢复基因元件表达盒，用于恢复隐性核不育突变体的雄性育性；植物花粉败育基因元件表达盒，用于清除含GAT的花粉及保持GAT保持系的杂合状态；化学除草剂正向选择表达盒，用于基因转化及GAT保持系除杂提纯；化学除草剂负向选择表达盒，用于清除除草剂敏感的GAT保持系花粉及种子外逸及GAT不育系除杂提纯；种子筛选元件表达盒，用于种子机械分选。在育种实践中，由于隐性核雄性不育材料是不育的，无法产生种子，长期保存很困难，若杂交保留的话，后代会出现育性性状分离，而在种子时期无法判定究竟哪些为可育种子，哪些为不育种子，导致保种、选种不准确，因此操作非常复杂，更不用说用于规模化生产，故至今仍未实现利用隐性核雄性不育的产业化利用。本申请将GAT载体导入GAT不育系(隐性核雄性不育系)创制GAT保持系，建立了可保持和繁育隐性核雄性不育系的遗传智能化育制种系统。利用该系统，在其后代中可通过种子色选及保持系筛选元件及除草剂敏感元件等的功能有机组合进行后续的GAT保持系及不育系除杂保纯，在种子时期、营养生长期及生殖生长期均可实现隐性核雄性不育种子/植株(GAT不育系)和可育种子/植株(GAT保持性)的分离，成功地解决了隐性核雄性不育的规模化繁殖与保持问题，创造性的实现了隐性核雄性不育的利用从而可实现商业化生产。本发明提供的GAT载体中的5个关键元件有机结合发挥作用并结合机械化、自动化加工可成功实现植物隐性核雄性不育系的商业化利用。本发明可应用于植物隐性核不育材料的杂交育种和杂交制种，从而获得优质高产广适高抗植物新品种及其种子，具有巨大的经济价值。

附图说明

图1为pC1300-MMCK载体示意图。

图2pC0308-MMCK载体示意图。

图3为pC0308-MMMuauCK5400载体示意图。

图4为转pC0308-MMMuauCK5400农杆菌菌落PCR检测结果图，1-12泳道为特异引物SEQ ID NO.32-33检测结果，其中1为阴性水对照，2为pC0308-MMMuauCK5400质粒对照，3-12为不同单菌落，M是D2000DNA Marker。

图5pC0307载体示意图。

图6pC0308载体示意图。

图7pC0309载体示意图。

图8pC1300载体示意图。

图9pUC57-Simple载体示意图。

图10为pC1300-Marker 2UAN载体示意图。

图11GAT载体菌落PCR检测1-12为特异引物序列10和11菌落PCR检测结果，其中1为阴性水对照，4为pC1300-MMCK、5-6为pC0308-MMCK、11-12为pC0308-MMMuauCK5400的不同单菌落；13-24为特异引物序列14和15的菌落PCR检测结果，23-24为pC0308-MMMuauCK5400的不同单菌落；M：D2000DNA Marker。

图12pC0308-MMMuauCK5400酶切验证结果图，ck为未酶切pC0308-MMMuauCK5400质粒；1号泳道为Hind III+BamH I双酶切；2号泳道为Hind III+Sma I双酶切；3号泳道为HindIII+Pst I双酶切；4号泳道为EcoR I酶切。最外侧泳道分别为M15000DNA Marker和M10000DNA Marker。

图13pC0308-MMMuauCK5400转基因植株PCR阳性检测结果图，检测引物序列如SEQID NO.32-33。M为D2000DNA Marker，第一个“-”为阴性对照水，第二个“-”为阴性对照野生型中花11，“+”为阳性对照pC0308-MMMuauCK5400质粒，1-18为转基因T0植株。

图14pC0308-MMMuauCK5400转基因植株PCR阳性检测结果图，检测引物序列如SEQID NO.34-35。M为D2000DNA Marker，第一个“-”为阴性对照水，第二个“-”为阴性对照野生型中花11，“+”为阳性对照pC0308-MMMuauCK5400质粒，1-20为转基因T0植株。

图15pC0308-MMMuauCK5400转基因T0植株的互补元件检测结果图，检测引物序列如SEQ ID NO.26-27。1为野生型中花11，2为cyp704b2-3纯合突变体，15-20为pC0308-MMMuauCK5400转基因植株。

图16为实施例4的部分GAT T0代转化株喷施双草醚结果。

图17为实施例4的部分GAT T0代转化株叶片分段喷施苯达松结果。

图18为GAT T0代转化株成熟花粉碘染结果，黑色为可育花粉；浅色为败育花粉。

图19GAT转化株(T0代)种子荧光鉴定结果图。

图20为GAT代表株系113-3中的荧光种子和非荧光种子分别发育成株后花粉育性及自交结实鉴定结果图。A和C来源于荧光种子发育成株的稻穗和花药，其中有一半花粉可育，碘染呈蓝色；另一半花粉不育，碘染不着色，稻穗可自交结实。B和D来源于非荧光种子发育成株的稻穗和花药，为无花粉类型，是cyp704b2隐性核雄性不育突变体的典型特征，稻穗自交不结实。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1 GAT载体构建与验证

一、GAT载体的构建

GAT载体采取以表达盒为单元的分段构建，单元拼合的策略。先在过渡载体pC1300(图8)和pUC57-Simple(图9)上构建表达盒并酶切和测序验证，然后将表达盒拼接到终载体上。载体构建的具体步骤如下：

1、合成MCS pC0307片段(SEQ ID NO.1)，用Sac II和Pme I连入pC1300后获得pC0307(图5)。

2、合成MCS pC0308片段(SEQ ID NO.2)，用Sac II和Sph I连入pC1300后获得pC0308(图6)。

3、合成MCS pC0309片段(SEQ ID NO.3)，用Sac II和Pme I连入pC1300后获得pC0309(图7)。

4、合成DNA片段NSPT-Construct V1.81-Marker 1，用Kpn I+Hind III双酶切连入pC1300，产生pC1300-Marker 1。NSPT-Construct V1.81-Marker 1的序列由Kpn I酶切位点ggtacc，MCSI(序列如SEQ ID NO.18所示)，除草剂敏感元件表达盒Marker 1(SEQ IDNO.14)，MCSII(SEQ ID NO.19)，间隔序列tgcagggacccttgccaac，和Hind III酶切位点aagctt顺次连接而成。其中MCSI的序列由Pst I、Srf I、Afe I、Xmn I酶切位点顺次连接组成。除草剂敏感元件表达盒Marker 1的序列由NosT终止子，细胞色素P450基因CYP81A6的一种RNAi茎环结构序列，ZmUbiP启动子顺次连接组成。细胞色素P450基因CYP81A6的一种RNAi茎环结构序列由一段CYP81A6编码区构成的反向茎序列、一个水稻内含子构成的环序列和与所述CYP81A6编码区互补的正向茎序列顺次连接而成。MCSII的序列由Hpa I、PshA I、BspE I、Pac I酶切位点顺次连接组成。

5、合成DNA片段NSPT-Construct V1.9-Marker 2，用EcoR I+Hind III双酶切连入pC1300，产生pC1300-Marker 2。NSPT-Construct V1.9-Marker 2的序列由EcoR I酶切位点gaattc，Pst I酶切位点ctgcag，间隔序列ggacccttgccaaca，多克隆位点MCSII(序列如SEQID NO.19所示)，基因转化及保持系筛选元件表达盒Marker2(SEQ ID NO.10)，MCSIII(SEQID NO.20)，间隔序列tgcagtcccaaggcttccg，和Hind III酶切位点aagctt顺次连接而成。其中MCSII的序列由Hpa I、PshA I、BspE I、Pac I酶切位点顺次连接组成，基因转化及保持系筛选元件表达盒Marker2的序列由NosT终止子，ALS基因编码区序列OsALSm1，ActinP启动子顺次连接组成，MCSIII的序列由BsrG I、Bae I、AsiS I、FspAI酶切位点顺次连接组成。

6、合成DNA片段NSPT-Construct V1.81-Complementation，用Sac I+Hind III双酶切连入pC1300，产生pC1300-Complementation。NSPT-Construct V1.81-Complementation的序列由Sac I酶切位点gagctc，Pst I酶切位点ctgcag，间隔序列tcccaaggcttccga，多克隆位点MCSIII(SEQ ID NO.18)，植物雄性育性恢复基因元件表达盒Complementation(SEQ ID NO.6)，MCSIV(SEQ ID NO.19)，间隔序列tgcagcctgttgccaggga，和Hind III酶切位点aagctt顺次连接而成。其中MCSIII的序列由BsrG I、Bae I、AsiS I、FspA I酶切位点顺次连接组成。植物雄性育性恢复基因元件表达盒Complementation由水稻OsCYP704B2基因起始密码子ATG上游1112bp序列，经过密码子优化的OsCYP704B2基因的编码区，OsCYP704B2基因终止密码子TGA下游274bp序列组成。MCSIV的序列由Swa I、BstBI、Mlu I、Rsr II酶切位点顺次连接组成。

7、合成DNA片段NSPT-Construct V1.81-Killer，用Nde I+EcoR V双酶切连入pUC57-Simple，产生pUC57-Simple-Killer。NSPT-Construct V1.81-Killer的序列由Nde I酶切位点catatg，间隔序列cagggacccttgccaaca，Nru I酶切位点tcgcga，Pac I酶切位点ttaattaa，Pst I酶切位点ctgcag，间隔序列cctgttgccagggaa，多克隆位点MCSIV(SEQ IDNO.21)，植物花粉败育基因元件表达盒Killer(SEQ ID NO.7)，间隔序列tcgacgcggccgatcccccgg，Stu I酶切位点aggcct，Sac I酶切位点gagctc，多克隆位点MCSV(SEQ ID NO.20)，间隔序列tggcactggccgtcgtttt，Hind III酶切位点aagctt，EcoR I酶切位点gaattc以及间隔序列ggcgcgccgggccca顺次连接而成。其中MCSIV的序列由Swa I、BstBI、Mlu I、Rsr II酶切位点顺次连接组成。植物花粉败育基因元件表达盒Killer由启动子PG47、Zm-AA1编码区和终止子IN2-1序列组成。MCSV的序列由Avr II、Pml I、SnaB I、Alo I酶切位点顺次连接组成。

8、用Pac I+Hind III酶切pC1300-Marker 1和pUC57-Simple-Killer，将表达盒Killer连入pC1300-Marker 1产生pC1300-Marker 1-Killer。

9、用BsrG I+Hind III酶切pC1300-Marker 2和pC1300-Complementation，将表达盒Complementation连入pC1300-Marker 2产生pC1300-Marker 2-Complementation。

10、用Pac I+Swa I酶切pC1300-Marker 1-Killer和pC1300-Marker 2-Complementation，将相连的两个表达盒Marker 2-Complementation连入pC1300-Marker1-Killer产生GAT载体pC1300-Marker 1-Marker 2-Complementation-Killer(pC1300-MMCK，图1)。

11、用Pst I+Hind III酶切pC1300-MMCK、pC0308、pC0309，将四个相连的表达盒Marker 1-Marker 2-Complementation-Killer连入pC0308产生GAT载体pC0308-MMCK(图2)。

12、合成DNA片段Killer 5400，用BstB I+Avr II双酶切连入pUC57-Simple-Killer，用表达盒Killer 5400替代Killer，产生pUC57-Simple-Killer 5400。Killer 5400片段由多克隆位点MCSIV(SEQ ID NO.21)，植物花粉败育基因元件表达盒Killer 5400(SEQID NO.8)，以及多克隆位点MCSV(SEQ ID NO.22)顺次连接而成。植物花粉败育基因元件表达盒Killer 5400包括PG47启动子、水稻α-淀粉酶基因OsAA(即5400)编码区以及NosT终止子等部分。

13、用Swa I+SnaB I双酶切pUC57-Simple-Killer 5400和pC0308-MMCK，回收表达盒Killer 5400和酶切产物pC0308-MMC，将Killer 5400连入pC0308-MMC产生pC0308-Marker 1-Marker 2-Complementation-Killer5400(pC0308-MMCK5400)。

14、合成DNA片段Marker 3ZFN，用Pst I+Xma I双酶切连入pC0308-MMCK5400，产生pC0308-Marker 3-Marker 1-Marker 2-Complementation-Killer5400(pC0308-MMMCK)。Marker 3ZFN片段的序列由Pst I酶切位点ctgcag，种子筛选元件表达盒Marker 3ZFN(SEQID NO.17)，间隔序列g，以及Xma I酶切位点cccggg顺次连接而成。种子筛选元件表达盒Marker 3ZFN顺次包括NosT终止子、深红色荧光蛋白FP635基因编码区，ZZ1P启动子。

15、扩增OsUbiP片段，用Nco I+BsrG I双酶切，连入pC1300-Marker 2，产生pC1300-Marker 2UAN，(图10)。用Pst I+Hind III双酶切pC1300-Marker 2UAN，回收片段1(图10上位置12-2474的序列)和片段2(图10上位置2474-4089的序列)。用PstI+Hind III双酶切pC0308，连入片段2，产生过渡载体1。用Pst I酶切过渡载体1，连入片段1。鉴定片段1和片段2的连接方向，使片段1和片段2连接后与原Marker 2UAN序列相同。所得载体即为pC0308-Marker 2UAN。将OsUbiT片段(SEQ ID NO.4)用BspE I+Kpn I双酶切连入pC0308-Marker 2UAN，产生一个新的基因转化及保持系筛选元件表达盒Marker 2UAU(SEQ IDNO.11)(即本申请的另一个基因转化及保持系筛选元件表达盒)，相应载体为pC0308-Marker 2UAU。Marker 2UAU表达盒包括OsUbiT终止子，ALS基因编码区序列OsALSm1，OsUbiP启动子。

16、用BspE I+BsrG I双酶切pC0308-Marker 2UAU，回收Marker 2UAU表达盒。用BspE I+BsrG I双酶切pC0308-MMMCK5400，回收较大片段，与Marker 2UAU连接产生GAT载体pC0308-Marker 3-Marker 1-Marker 2uau-Complementation-Killer5400(pC0308-MMMuauCK5400，图3，SEQ ID NO.5)。

二、GAT载体的验证

对上述构建好的pC0308-MMMuauCK5400载体进行酶切和测序验证。

分别取1μl上述质粒与50μl大肠杆菌感受态细胞混合，1.8KV电击转化，转化产物涂布于含有卡那霉素的LA培养板上，37℃培养16h左右，挑取单菌落，使用特异引物进行菌液PCR检测(图11)。特异引物序列如SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29及序列SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示。选择阳性单菌落接种含有卡那霉素的LB培养基进行扩大培养，37℃培养16h左右提取质粒。方法如下：

1：将混浊的菌液倒入2ml离心管中，瞬时离心30s，沉淀菌体。

2：倒掉上清液，加200μl Solution I，震荡悬浮菌液，室温1min。

3：加入300μl Solution II，快速颠倒数次，冰浴1min。

4：加入400μl Solution III，温和振荡，冰浴2min冷凝，瞬时离心30s。

5：吸上清，12000rpm离心2min，将上清转移至1.5ml EP管中，加入0.6倍体积异丙醇，冰浴2min。

6：瞬时离心1min，弃上清。

7：加入70％乙醇500μl漂洗沉淀2次，晾干。

8：加入50μl ddH2O(已加RNase A，浓度为1％)回融。

选择Hind III和BamH I、Hind III和Sma I、Hind III和Pst I和EcoR I对pC0308-MMMuauCK5400进行酶切验证。酶切体系为10×Buffer 1μl，质粒DNA 3μl，DNA限制性内切酶0.2μl，用ddH2O补足10μl。酶切条件为37℃孵育10-15min，然后70℃灭活5min。酶切产物在1％琼脂糖胶中电泳检测。

如图12所示，pC0308-MMMuauCK5400质粒大小为24124bp；Hind III和BamH I双酶切后1号泳道条带大小为3025bp+4887bp+6145bp+10067bp；Hind III和Sma I双酶切后2号泳道条带大小为8287bp+15837bp；Hind III和Pst I双酶切后3号泳道条带大小为6295bp+8309bp+9520bp；EcoR I进行单酶切后3号泳道条带大小为147bp+3934bp+4152bp+15891bp。酶切结果与预期完全相符。选择酶切正确的质粒测序，序列与预期完全相符。序列如SEQ IDNO.5所示。

实施例2农杆菌介导的GAT载体遗传转化水稻

1.GAT载体转化农杆菌及验证

取-80℃保存的农杆菌EHA105于含利福平(25μg/ml)+链霉素(50μg/ml)YEP平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于5ml含上述抗生素的YEP液体培养基中，220rpm，28℃振荡培养12-16hr。取2ml菌液转接于100ml含上述抗生素YEP液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600＝0.5。冰上预冷10min，4℃，5000rpm离心10min(冷冻离心机预冷到4℃)。无菌去离子水洗2次(每次10ml)，10％无菌甘油洗1次，4℃，5000rpm离心10min，菌体重悬于3ml10％无菌甘油中。取1μl实施例1中得到的测序正确的GAT质粒pC0308-MMMuauCK5400，分别加入50μl农杆菌感受态细胞中，1.8KV电击转化。涂布于含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上，28℃培养48h左右，挑取单菌落摇菌过夜。

使用特异性引物SEQ ID NO.32-33对pC0308-MMMuauCK5400转化的农杆菌单克隆进行菌落PCR验证(如图4)，可扩出923bp目的片段。挑选阳性克隆，摇菌36-48h，保存菌液用于侵染。

2.农杆菌介导遗传转化

诱导：将中花11(ZH11)背景且携带纯合隐性雄性不育基因Oscyp704b2-3的种子经次氯酸钠消毒后置于诱导培养基(N6+2.4-D 3mg/L+CH 0.6g/L+Pro0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L)上，28℃常温暗培养30-40d，得到诱导的愈伤后继代培养30-40d；

筛选：将实施例2得到的工程农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化法转化上述愈伤组织，共培养3d后，清洗5-6遍，转移至含双草醚抗性筛选培养基(N6+2.4-D 2mg/L+CH0.6g/L+Pro0.5g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+Cn 500mg/L+双草醚0.3-0.6μm/L或潮霉素50mg/L)上，30℃暗培养30-50d，筛选获得抗性愈伤；

分化：筛选获得的抗性愈伤转移至含双草醚抗性分化培养基(MS+KT 2mg/L+NAA0.5-2mg/L+山梨醇15-30g/L+蔗糖30g/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.1-0.3μm/L)上，分化25-30d获得阳性苗；

生根：经分化获得的阳性苗转移至含双草醚抗性生根培养基(1/2MS+蔗糖20g/L+多效唑0.3-1mg/L+Phytagel 3g/L+双草醚0.15-0.5μm/L)上，生根7-15d最后获得阳性转基因植株；

炼苗及移栽：将根系生长旺盛的转化株系开启瓶口封口膜，加无菌水覆盖培养基1-2cm厚，置于室温下与空气接触进行炼苗2-3d后，移栽至温室栽培。筛选共获得GAT转化株系共505株，转化材料移栽7-14天后，存活457株。移栽GAT转化株系的同时，移栽一定数量的2叶1心期ZH11作为对照。

实施例3 GAT T0代转化材料分子鉴定

在五叶期取实施例2中获得的转基因植株叶片用CTAB法提取基因组总DNA，抽提方法如下：

取2-4cm的叶片放入研钵，加入1.5％CTAB溶液800-900ul，进行研磨，然后将研磨后的液体转入1.5ml的离心管中，放在冰上或低温冰箱中待用；样品水浴65℃，30min，期间颠倒混匀数次；在通风橱中，用玻璃移液管加入氯仿与异戊醇溶液(氯仿：异戊醇＝24：1，即500ml氯仿加入异戊醇22ml，轻轻混匀)650ul，混匀后放在摇床上震荡30min或手摇10min左右，此时可看到明显分层；将摇好的样品进行8000-10000rpm离心8min；吸上清400ul左右，转入一新的离心管中，加入-20℃预冷的95％乙醇800ul，轻轻颠倒混匀，放入-20℃冰箱冷冻30min；取出-20℃冷冻的样品，12000rpm离心10min，去掉上清；加入75％的乙醇，静置1min左右，去掉上清，然后风干；加入200-300ul的灭菌水(ddH₂O)，溶解风干的样品DNA，待用。

使用特异引物SEQ ID NO.32-33(图13)和SEQ ID NO.34-35(图14)对pC0308-MMMuauCK5400的T0转基因植株的总DNA进行PCR阳性检测。选取能同时扩增出923bp和1412bp条带的植株备用。

取上述通过PCR阳性检测筛选到的pC0308-MMMuauCK5400的T0转基因阳性植株的DNA，先用特异引物SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27进行PCR扩增，然后用HaeIII酶切扩增产物，最后用6％的SDS-PAGE凝胶检测。如图15所示，选取只能显示出84bp和66bp条带的植株，用于后续表型鉴定。

特异引物SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27的扩增区域包含cyp704b2-3突变体变异位点，可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中观察出cyp704b2-3突变体背景植株存在2碱基缺失突变；引物扩增区域内还包含构建载体时在植物雄性育性恢复基因元件表达盒中CYP704B2的编码区(CDS第660位)引入的一个A→C的SNP。该SNP会引入一个HaeIII的酶切位点，使植物雄性育性恢复基因元件表达盒能被HaeIII酶切，而野生型CYP704B2是不能被HaeIII酶切的。用上述引物对扩增转GAT载体植株的DNA，并用HaeIII酶切后,可能有三种片段：86bp为水稻自身基因组的野生型基因型，84bp为cyp704b2-3突变体基因型，66bp为转化片段的基因型。用上述方法以对鉴定出遗传背景为cyp704b2-3纯合突变体，且含有GAT载体的植株。

实施例4 GAT T0代转化材料表型鉴定

1.除草剂筛选——双草醚抗性表型鉴定

为了检测GAT系统中筛选标记元件的工作效率，用10％双草醚乳液(日本农美利)配制600mg/L双草醚溶液，喷施实施例2中获得的457株GAT T0代和野生型对照ZH11 3-5叶期幼苗，喷施后连续观察。喷施后3天，对照ZH11出现叶片枯黄。喷施后7天，对照ZH11枯黄濒临死亡，GAT转化株系多数植株生长正常，部分出现黄化或生长受到抑制。喷施后14天，对照ZH11已完全死亡，但GAT转化株系呈现正常生长、生长受抑制及濒临死亡或不可逆死亡三种类型。其中正常生长株系为双草醚高抗株系，共有200株，表明在这些株系中筛选标记元件工作效率较高；生长受抑制株系为双草醚中抗株系，共有148株，在这些株系中筛选标记元件工作效率一般；不可逆死亡株系或濒临死亡株系为双草醚无抗或低抗株系，共有157株，在这些株系中筛选标记元件工作效率较差(图16)。本实验筛选获得双草醚抗性株系，用于后面保持系与不育系的筛选区分，以及保持系的除杂保纯。在这个过程中，可以看到，功能元件整合在一个载体上，功能元件越多，越不容易出现能达到所有功能元件对应表型都得到表现的转化事件，这也印证了本领域目前达成的共识，即：同一载体整合的元件越多，越难达到同时符合的性状，即功能元件越多，转化事件出现预期表型的几率就越低。然而在本发明构建的GAT系统中筛选标记元件工作效率过程中，发明人对每一个表型都进行了筛选，发现GAT转化株系变现为双草醚高抗株系的正常生长株系的几率为43.76％，这个成功率远远高于本领域目前三功能元件集合或四功能元件集合后的转化事件成功率。因为实际转基因事件中，单一性状表型的成功比例是30％-50％，理论而言，对于多功能元件集合的转化事件，所有元件都符合预期的概率应当是在30％的N次方-50％的N次方之间，N为功能元件的个数。

2.除草剂筛选——苯达松敏感表型鉴定

为了检测GAT系统中除草剂敏感元件的工作效率，在双草醚抗性表型鉴定完成后，用48％苯达松母液(常州精度生物科技有限公司)配制3g/L苯达松溶液，喷施上一双草醚喷施实验中存活的GAT T0代(348个株系)和野生型对照ZH11植株叶片划线区域，喷后连续观察。喷施后3d，部分GAT T0转化株系叶尖卷曲枯黄；喷施后7d-14d，有99个株系叶片出现不可逆枯萎，属于高度敏感株系，表明在这些株系中除草剂敏感元件工作效率较高；有67个株系前期叶片枯萎严重但逐渐恢复生长，属于中度敏感株系，在这些株系中除草剂敏感元件工作效率一般；还有182个株系喷施前后无明显变化，属于低敏或无表型株系，在这些株系中除草剂敏感元件工作效率较差(图17)。同时具有双草醚高抗和苯达松高敏的株系有49株。基于对上述双草醚抗性株系转化事件的类似分析，可知本实验证实了GAT系统中除草剂敏感元件的工作效率高，创制的GAT育制种系统能够被快速、准确地鉴定其对应的表型。

双草醚和苯达松除草剂喷施实验后观察这些GAT转化株和对照ZH11无明显的形态上的不同，继续生长至开花进行下一步实验。

3.花粉育性鉴定

为了鉴定恢复基因元件和花粉败育基因元件的工作效率，在GAT转化株开花时对花粉进行碘染以检测GAT转化株花粉育性。因GAT载体中含恢复基因元件，若恢复基因元件正常工作，可恢复雄性育性，产生的花粉有两种类型(ms/GAT)和(ms/-)，(ms/GAT)类型花粉由于含有GAT载体中的花粉败育基因元件，若其正常工作则该花粉会败育，因此只有(ms/-)类型花粉存活。因此，若GAT转化株仅含一个拷贝GAT载体，且恢复基因元件和花粉败育基因元件正常工作，则其花粉呈现可育花粉：败育花粉＝1:1分离。因此在碘染时约50％为蓝黑色可育花粉，50％为不染色的不育花粉。碘染镜检具体方法如下：

(1)配制碘化钾染色液(取2g KI溶于5-10mL蒸馏水中，然后加入1g I2(用适量的无水乙醇溶解)，待全部溶解后，再加蒸馏水定容至300mL。贮于棕色瓶中备用，使用时按碘化钾：去离子水＝1:1的比例稀释成碘染工作液)。

(2)花粉采集：取充分成熟将要散粉的花药，剥除颖壳，取出花药，置于载玻片上。

(3)镜检：取约70μl的碘染工作液滴于花药上，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察。凡被染成蓝黑色的花粉粒为可育花粉粒，呈浅黄色的为败育的花粉粒。

碘染镜检结果表明：中花11背景的cyp704b2-3突变体没有花粉(如图18的A)；对照ZH11，绝大部分花粉可染成蓝黑色，是雄性可育花粉(图18的B)，共有83个株系的GAT转化株约50％花粉可染成蓝黑色，表现为正常育性；约50％花粉不能染成蓝黑色，表现为败育花粉(如图18的C中GAT所示)，即可育花粉：败育花粉符合1:1的分离比例，表明在这些株系中恢复基因元件和花粉败育基因元件呈单拷贝存在且其工作效率较高，这是因为若GAT转化株仅含一个拷贝GAT载体，且恢复基因元件和花粉败育基因元件正常工作，则其花粉呈现可育花粉：败育花粉＝1:1分离，这是遗传学定律中的基因分离和自由组合规律。因此如果出现1:1分离的表型，则表明上述元件工作效率正常，符合预期。其余株系可育花粉：败育花粉不符合1:1的分离比，出现偏分离，表明在这些株系中恢复基因元件和花粉败育基因元件的工作效率较差或基因组中含多拷贝。

4.种子荧光鉴定

除草剂表型和花粉染色表型均优良的株系共有11株，见表1，其中有一个株系背景检测为野生型背景，舍弃，剩余10个株系自交结实收获T0代的种子(T1代)。按花粉育性鉴定结果，若GAT转化株仅含一个拷贝GAT载体，且恢复基因元件和花粉败育基因元件正常工作，其自交结实的种子也将呈现1:1分离，即其中50％为包含GAT载体的种子(基因型为ms ms/GAT-)在560-595nm激发光下观察呈现深红色荧光；50％为不包含GAT载体的种子(基因型为ms ms)在560-595nm激发光下观察无荧光。结果表明：对照ZH11种子无荧光(图19中WT)。而GAT转化株的部分种子呈现深红色荧光(图19中的GAT)。卡方分析表明，其中有6株GAT转化株的T0代种子符合荧光种子：无荧光种子＝1:1分离(表1所示)，表明在这些株系中种子筛选元件呈单拷贝存在且其工作效率较高。另有4株不符合1:1分离，呈现偏分离，且荧光较弱，表明在这些株系中种子筛选元件工作效率较差或基因组中含多拷贝。

表1 GAT转化株的T0代种子表型汇总

5.育性鉴定及隐性核雄性不育系与保持系的筛选分离

将步骤4中获得的优良株系的两种种子(荧光种子和非荧光种子)，分别发芽、移栽至成苗时期观测其育性，结果如图20所示。来自荧光种子的植株可自交结实，收获种子图20的A和C)；来自非荧光种子的植株表现为不育，无法自交结实(图20的B和D)。表明通过GAT系统成功实现了隐性核雄性不育材料(本实施例中含cyp704b2的隐性核雄性不育突变体)的繁殖以及隐性核雄性不育材料不育性的保持。

综上，通过实施例1-4的结果证明，本申请利用GAT系统成功实现了隐性核雄性不育材料的繁殖以及隐性核雄性不育材料不育性的保持。结合种子荧光色选系统及保持系筛选元件及除草剂敏感元件等的功能有机组合进行后续的GAT保持系及不育系除杂保纯，在种子时期、营养生长期及生殖生长期均可实现隐性核雄性不育种子/植株(GAT不育系)和可育种子/植株(GAT保持性)的分离，本申请成功地解决了隐性核雄性不育的规模化繁殖与保持问题，从而可成功实现隐性核雄性不育材料产业化。

实施例5 GAT不育系转育

cyp704b2-3是一种水稻CYP704B2基因突变体，其为水稻CYP704B2基因第794个碱基之后的GGG被1个T替换得到，该突变位点位于第3个外显子(公开于中国专利CN105002191B中)。用cyp704B2-3突变体与育性正常的受体，进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记进行cyp704b2-3基因和遗传背景选择，最终获得目标受体背景下带有纯合cyp704b2-3基因的隐性核不育系。下面以H28B为例，具体转育实施步骤如下：

1、以受体亲本，如H28B，为父本与gms1杂交获得F₁。

2、以F₁为母本与受体亲本，如H28B，回交获得BC₁F₁。

3、种植BC1F1，使用序列如SEQ ID NO.26-27的引物检测cyp704b2-3基因型。选择cyp704b2-3杂合基因型，即同时能扩增出86bp和84bp条带的植株。

4、使用一组基因型(例如100个，或200个等)在cyp704b2-3突变体和轮回亲本基因组之间存在多态性，且分布均匀的分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。

5、用步骤4中选出的植株与受体亲本，如H28B，回交获得BC₂F₁。

6、种植BC₂F₁，重复步骤3和步骤4，选出cyp704b2-3基因型杂合，遗传背景回复率高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC₂F₂。

7、种植BC₂F₂，重复步骤3和步骤4，选出cyp704b2-3基因型杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种BC₂F₃。BC₂F₃后代中分离的cyp704b2-3纯合基因型植株即cyp704b2-3隐性核不育系，BC₂F₃用于保存cyp704b2-3隐性核不育系种质资源。用字母G来命名隐性核不育系，例如本实施例中H28B的cyp704b2-3纯合隐性核不育系被命名为H28G。

以上仅以H28B作为转育实施例，但并不限于H28B，可以为任何水稻材料。

实施例6 GAT保持系转育

在实施例4中获得的GAT大载体的转基因植株中选择CYP704B2位点纯合突变，GAT转基因PCR阳性检测为阳性，每个GAT元件控制的表型都出现的植株作为GAT保持系转育的供体亲本。选择实施例6中获得的cyp704b2-3杂合型植株，例如H28G的杂合植株为受体亲本。将供体植株和受体植株进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记对cyp704b2-3基因，GAT元件和遗传背景进行选择，最终获得H28B背景下带有纯合cyp704b2-3基因和GAT元件的GAT保持系。具体实施步骤如下：

1、用供体亲本与cyp704b2-3杂合基因型受体亲本，如cyp704b2-3杂合型的H28G杂交获得F₁。

2、用F₁与cyp704b2-3杂合型受体亲本，如cyp704b2-3杂合型H28G回交，回交获得BC₁F₁。

3、种植BC1F1，使用序列如SEQ ID NO.26-27的引物对BC1F1植株的基因组DNA进行PCR扩增，然后用HaeIII酶切扩增产物，根据酶切产物的条带判断植株的基因型。选择带有84bp和66bp条带的植株，即带有cyp704b2-3基因和GAT转基因的植株。

4、使用一组基因型(例如100个，或200个等)在cyp704b2-3突变体和轮回亲本基因组之间存在多态性，且分布均匀的分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。

5、用步骤4中选出的植株与cyp704b2-3杂合型受体亲本，如cyp704b2-3杂合型H28G，回交获得BC₂F₁。

6、种植BC₂F₁，重复步骤3和步骤4，选出遗传背景回复率高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC₂F₂。

7、种植BC₂F₂，重复步骤3和步骤4，选出遗传背景纯合率最高的植株，收自交种BC₂F₃，即GAT保持系。用字母T来命名GAT保持系，例如本实施例中H28G的GAT保持系被命名为H28T。

以上仅以H28B作为转育实施例，但并不限于H28B，可以为任何水稻材料。

实施例7 GAT保持系生产

GAT保持系种子种植于法定转基因区域，自交结实收获种子，通过荧光种子分选机，筛选获得带深红色荧光的种子，即为GAT保持系种子，后续可用于GAT保持系自我繁殖或授粉给GAT不育系进行不育系制种。

实施例8 GAT保持系除杂保纯

GAT保持系播种，在苗期喷施30-90mg/m²的双草醚或50-100mg/L的灭草烟或185-750mg/L咪唑乙烟酸进行除杂保纯；在分蘖期至孕穗期喷施60-120mg/m²的双草醚或100-200mg/L的灭草烟或500-1500mg/L咪唑乙烟酸进行除杂保纯；在开花期喷施120-300mg/m²的双草醚或200-750mg/L的灭草烟或1000-3000mg/L咪唑乙烟酸进行除杂保纯；

喷施上述除草剂，不但可以杀死非GAT保持系材料，还有助于田间除草，对保持系生产及除杂保纯有重要作用，一举两得。

实施例9 GAT不育系生产(1)

GAT保持系种子种植于法定转基因区域，自交结实收获种子，通过荧光种子分选机，筛选获得无荧光的种子，即为GAT不育系种子，后续可作为母本用于与其他品种(父本)制种，也可用于再繁殖GAT不育系。

实施例10 GAT不育系生产(2)

从实施例10中获得的GAT不育系种子，与GAT保持系种子按混播或间播至法定转基因区域，待至开花期，GAT保持系会散粉给GAT不育系结实，散粉后喷施1-3g/m²的苯达松或500-3000mg/L苄嘧磺隆杀死GAT保持系，收获所有种子，并利用荧光种子分选机，筛选获得无荧光的种子，即为GAT不育系种子，后续可用于与其他品种作为父本制种，也可用于繁殖不育系。

实施例11 GAT不育系除杂保纯

GAT不育系播种，在苗期喷施0.1-1g/m²的苯达松或100-800mg/L苄嘧磺隆进行除杂保纯；在分蘖期至孕穗期喷施0.5-1.5g/m²的苯达松或500-2000mg/L苄嘧磺隆进行除杂保纯；在开花期喷施1-3g/m²的苯达松或500-3000mg/L苄嘧磺隆进行除杂保纯；

喷施上述除草剂，不但可以杀死GAT保持系材料，保持GAT不育系的纯度，保持GAT不育系的纯度，还有助于田间除草，一举两得。

实施例12 GAT杂交种生产

将实施例10、11中获得的GAT不育系，与父本杂交制种，授粉后收获不育系上结的种子，均为非转基因杂交种子。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种介导调控植物隐性核雄性不育系雄性育性的GAT载体及其应用

<130> KHP191114027.6

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 442

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgcggtgat cacaggcagc aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc taccctccgc 60

gagatcatcc gtgtttcaaa cccggcagct tagttgccgt tcttccgaat agcatcggta 120

acatgagcaa agtctgccgc cttacaacgg ctctcccgct gacgccgtcc cggactgatg 180

ggctgcctgt atcgagtggt gattttgtgc cgagctgccg gtcggggagc tgttggctgg 240

ctggtggcag gatatattgt ggtgtaaaca aattgacgct tagacaactt aataacacat 300

tgcggacgtt tttaatgtac tgcaggcccg ggcagcgctg aagaacttcc ctaggcacgt 360

gtacgtattt tttaccaggt gaactccaag tcctggaccc ttttttaagc ttagattgtc 420

gtttcccgcc ttcagtttaa ac 442

<210> 2

<211> 455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgcggtgat cacaggcagc aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc taccctccgc 60

gagatcatcc gtgtttcaaa cccggcagct tagttgccgt tcttccgaat agcatcggta 120

acatgagcaa agtctgccgc cttacaacgg ctctcccgct gacgccgtcc cggactgatg 180

ggctgcctgt atcgagtggt gattttgtgc cgagctgccg gtcggggagc tgttggctgg 240

ctggtggcag gatatattgt ggtgtaaaca ctgcaggccc gggcagcgct gaagaacttc 300

cctaggcacg tgtacgtatt ttttaccagg tgaactccaa gtcctggacc cttttttaag 360

cttgtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg gatatttaaa agggcgtgaa 420

aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgc 455

<210> 3

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgcggtgat cacaggcagc aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc taccctccgc 60

gagatcatcc gtgtttcaaa cccggcagct tagttgccgt tcttccgaat agcatcggta 120

acatgagcaa agtctgccgc cttacaacgg ctctcccgct gacgccgtcc cggactgatg 180

ggctgcctgt atcgagtggt gattttgtgc cgagctgccg gtcggggagc tgttggctgg 240

ctggtggcag gatatattgt ggtgtaaaca aattgacgct tagacaactt aataacacat 300

tgcggacgtt tttaatgtat gctccaccat gttggcaagc tgctctagcc aatacgcaaa 360

ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac 420

tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc 480

caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa 540

tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacctgcagg cccgggcagc gctgaagaac 600

ttccctaggc acgtgtacgt attttttacc aggtgaactc caagtcctgg accctttttt 660

aagcttagat tgtcgtttcc cgccttcagt ttaaac 696

<210> 4

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccggattaa ttaagacaaa tttgtttgtc agatcaaatt tttaagcaaa acataagaaa 60

cagcacaaaa gggtatagca gaagcaaaat ttggacacaa tgattaggga tcacttattc 120

attatagttc ttccatgctg ctctaccaca gcaaaacgtt tcagacacca tcaaaccaga 180

cttaaggata cacattacag gtaaatagta cacaatgaaa cgggacacga ccaaggacca 240

gaccagacaa ccatagctcc attggggaag acaaataggc agacttgtga accctagaac 300

agcagcagct ctatggctga ggacggtacc 330

<210> 5

<211> 24124

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgcaggatc tagtaacata gatgacaccg cgcgcgataa tttatcctag tttgcgcgct 60

atattttgtt ttctatcgcg tattaaatgt ataattgcgg gactctaatc ataaaaaccc 120

atctcataaa taacgtcatg cattacatgt taattattac atgcttaacg taattcaaca 180

gaaattatat gataatcatc gcaagaccgg caacaggatt caatcttaag aaactttatt 240

gccaaatgtt tgaacgatct cagctgtgcc ccagtttgct aggcaggtcg cagtacctgg 300

ccacagccat ctcgtgctgc tccacgtagg tctctttgtc ggcctccttg attctttcca 360

gtctcctgtc cacgaagtag aagccgggca tcttgaggtt cttagcgggt ttcttggatc 420

tgtatgtggt cttgagggag cagtgcaggt agcccccgcc cacgagcttc agggccatct 480

ggctatggcc tctcaggccg ctgtcagcgg ggtacagcat ctcggtgctg gcctcccagc 540

cgagtgtttt cttctgcatc acagggccgt tggatgggaa gttgaccccg ttgatcttga 600

cgttgtagat gaggcagccg ttctggaggc tggtgtcctg ggtagcggtc agcacgcccc 660

cgtcttcgta tgtggtgatc ctctcccatg tgaagccctc agggaaggac tgcttaaaga 720

agtcggggat gccctgggtg tggttgataa aggttttgct gccgtacatg aagctggtag 780

ccaggatgtc gaaggcgaag gggagagggc cgccctcgac caccttgatc ttcatggtct 840

gggtgccctc gtagggcttg ccttcgccct cggatgtgca cttgaagtgg tggtcgttca 900

cggtgccctc catgtagagt ttcatgtgca tgttctcggt gatcagcacg ctatcctcac 960

ccactgcgga agcgttgcat gcaacaatag caaggagagc aaatacgaaa atgatcttca 1020

tttttgtagg attctactac tatgcttcaa ctataatgtt tgaattgtgt gaaggatgag 1080

gagggttttc attatgcttg tctatttata gatgtttccc tatcggttgc tttagagtgt 1140

tagttttgct tgatgctata ttaggatcta agtgagtcat attatttgga tattctgtta 1200

ggtgcaccta aaaatgttct ttgatatcat catcaaagta acttttatgc ccatcatata 1260

tacatgatgg tgagcaaaaa aataatgaca tgactcatcg ctcactttat gtgtcaatgt 1320

gataaggatt gcaacttttg aaactaagtt tgttatgttt tgtaagctat tattttgata 1380

atgcactaca cgtggaactt tacgactgtg tgggtttatg ctctttgaat tatataattt 1440

cagtaagaaa aaaaattata gtatgttcaa tggttttcat tgttccatta atactcttgt 1500

gaaaacttgt ttgtgatacg aaataagtta atgcaataac ttttaaatta actttgcaga 1560

gctttacaat aactcaccaa cttactctaa ttgtggttgg ggattgattt aattcatact 1620

tttatagacc aaattgatat tgtgttgcta aataaaaatt atagtggtgt tgctacacct 1680

acacagacac agaaggaatc ctgatatcat cagctatcta ctgcttcctc cacatggact 1740

caagaagcag aagcaaaaaa gaagaaggca tttgctccaa caaagttttc cggtgaaagg 1800

caacacattg ttctgaactt cctggcatgt attatgtgaa tctagcaaat taaccaaaca 1860

ttgacacaat gcgacacctt gtaatgtagc cgtgccgaga attgtatatc tcacttacca 1920

ttgtatatca cacgtgccga gaataggaga ttgatttttg ccaaccaaaa cgctctaggc 1980

agaccaattg ggcgcccggg cagcgctgaa gaacttcccc gatctagtaa catagatgac 2040

accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt tgttttctat cgcgtattaa 2100

atgtataatt gcgggactct aatcataaaa acccatctca taaataacgt catgcattac 2160

atgttaatta ttacatgctt aacgtaattc aacagaaatt atatgataat catcgcaaga 2220

ccggcaacag gattcaatct taagaaacca cctgcaagtg acttcctcag caggcctact 2280

agttttattg ccaaatgttt gaacgatcgg ggaaattcca gtgcaccaga gtcacagaaa 2340

cacatcacac attcgtgagc tcagcttagc catggataac gcctacatta ttgccattct 2400

ctctgtagct atcctcttct tgctccacta ctacctcctc ggccgcggca atggcggggc 2460

ggcgcggctg ccgccgggtc caccggccgt cccgatcctg ggacacctcc acctcgtcaa 2520

gaagccgatg cacgccacca tgtcccgcct cgccgagcgg tacgggccgg tgttctcgct 2580

gcgcctcggg tcgcggcgcg ccgtggtggt gtcgtcgccg gggtgcgcca gggagtgctt 2640

caccgagcac gacgtgacct tcgcgaaccg gcccaggttc gagtcgcagc tgctggtctc 2700

gttcaacggc gccgcgctcg ccacggcgag ctacggcgcg cactggcgca acctccgccg 2760

gatcgtcgcc gtgcagctgc tctccgcgca ccgcgtcggc ctcatgtctg aaaatctcga 2820

aacagccgtg tcatagtcaa tcattaggtg ttataggaac aatcaaaggt tttttcaagt 2880

gttaatcttc atactaatat atacagtggg tactctttat ctactgccgt ggaactgtca 2940

tatttgatta tgaaatttta gctctagaaa atatttgatc atcaatgtca agactttatg 3000

accttgcaaa atacatttcc taattgagaa cagggtaaaa ttatgaacta tgcctctgaa 3060

ccttcataca caggcagcac attttttgtt gtaaaattca tcttaatatc agcggaaaga 3120

ctggaccaga gaaagaaaaa gttaagacag gcatatactc ttgatcctct aaaagagatg 3180

aggcggtaca atgatcaacc atgaacatta aagtgatacg tggaacatga gaacacaaat 3240

aattgtcact ggaacataaa tacaaaaagg tttgtagtaa cttaccgaca tgaggccgac 3300

gcggtgcgcg gagagcagct gcacggcgac gatccggcgg aggttgcgcc agtgcgcgcc 3360

gtagctcgcc gtggcgagcg cggcgccgtt gaacgagacc agcagctgcg actcgaacct 3420

gggccggttc gcgaaggtca cgtcgtgctc ggtgaagcac tccctggcgc accccggcga 3480

cgacaccacc acggcgcgcc gcgacccgag gcgcagcgag aacaccggcc cgtaccgctc 3540

ggcgaggcgg gacatggtgg cgtgcatcgg cttcttgacg aggtggaggt gtcccaggat 3600

cgggacggcc ggtggacccg gcggcagccg cgccgccccg ccattgccgc ggccgaggag 3660

gtagtagtgg agcaagaaga ggatagctac agagagaatg gcaataatgt aggcgttatc 3720

catggctaag ctgagctcac gaatgtgtga tgtgtttctg tgactctggt gcactgggat 3780

cccctgaggg gtcaccgact tcaggtcaag taacaccaaa caacagggtg agcatcgaca 3840

aaagaaacag taccaagcaa ataaatagcg tatgaaggca gggctaaaaa aatccacata 3900

tagctgctgc atatgccatc atccaagtat atcaagatca aaataattat aaaacatact 3960

tgtttattat aatagatagg tactcaaggt tagagcatat gaatagatgc tgcatatgcc 4020

atcatgtata tgcatcagta aaacccacat caacatgtat acctatccta gatcgatatt 4080

tccatccatc ttaaactcgt aactatgaag atgtatgaca cacacataca gttccaaaat 4140

taataaatac accaggtagt ttgaaacagt attctactcc gatctagaac gaatgaacga 4200

ccgcccaacc acaccacatc atcacaacca agcgaacaaa aagcatctct gtatatgcat 4260

cagtaaaacc cgcatcaaca tgtataccta tcctagatcg atatttccat ccatcatctt 4320

caattcgtaa ctatgaatat gtatggcaca cacatacaga tccaaaatta ataaatccac 4380

caggtagttt gaaacagaat tctactccga tctagaacga ccgcccaacc agaccacatc 4440

atcacaacca agacaaaaaa aagcatgaaa agatgacccg acaaacaagt gcacggcata 4500

tattgaaata aaggaaaagg gcaaaccaaa ccctatgcaa cgaaacaaaa aaaatcatga 4560

aatcgatccc gtctgcggaa cggctagagc catcccagga ttccccaaag agaaacactg 4620

gcaagttagc aatcagaacg tgtctgacgt acaggtcgca tccgtgtacg aacgctagca 4680

gcacggatct aacacaaaca cggatctaac acaaacatga acagaagtag aactaccggg 4740

ccctaaccat ggaccggaac gccgatctag agaaggtaga gagggggggg gggggaggac 4800

gagcggcgta ccttgaagcg gaggtgccga cgggtggatt tgggggagat ctggttgtgt 4860

gtgtgtgcgc tccgaacaac acgaggttgg ggaaagaggg tgtggagggg gtgtctattt 4920

attacggcgg gcgaggaagg gaaagcgaag gagcggtggg aaaggaatcc cccgtagctg 4980

ccggtgccgt gagaggagga ggaggccgcc tgccgtgccg gctcacgtct gccgctccgc 5040

cacgcaattt ctggatgccg acagcggagc aagtccaacg gtggagcgga actctcgaga 5100

ggggtccaga ggcagcgaca gagatgccgt gccgtctgct tcgcttggcc cgacgcgacg 5160

ctgctggttc gctggttggt gtccgttaga ctcgtcgacg gcgtttaaca ggctggcatt 5220

atctactcga aacaagaaaa atgtttcctt agttttttta atttcttaaa gggtatttgt 5280

ttaattttta gtcactttat tttattctat tttatatcta aattattaaa taaaaaaact 5340

aaaatagagt tttagttttc ttaatttaga ggctaaaata gaataaaata gatgtactaa 5400

aaaaattagt ctataaaaac cattaaccct aaaccctaaa tggatgtact aataaaatgg 5460

atgaagtatt atataggtga agctatttgc aaaaaaaaag gagaacacat gcacactaaa 5520

aagataaaac tgtagagtcc tgttgtcaaa atactcaatt gtcctttaga ccatgtctaa 5580

ctgttcattt atatgattct ctaaaacact gatattattg tagtactata gattatatta 5640

ttcgtagagt aaagtttaaa tatatgtata aagatagata aactgcactt caaacaagtg 5700

tgacaaaaaa aatatgtggt aattttttat aacttagaca tgcaatgctc attatctcta 5760

gagaggggca cgaccgggtc acgctgcacg ttaacgacac ctgtctccgg attaattaag 5820

acaaatttgt ttgtcagatc aaatttttaa gcaaaacata agaaacagca caaaagggta 5880

tagcagaagc aaaatttgga cacaatgatt agggatcact tattcattat agttcttcca 5940

tgctgctcta ccacagcaaa acgtttcaga caccatcaaa ccagacttaa ggatacacat 6000

tacaggtaaa tagtacacaa tgaaacggga cacgaccaag gaccagacca gacaaccata 6060

gctccattgg ggaagacaaa taggcagact tgtgaaccct agaacagcag cagctctatg 6120

gctgaggacg gtacctctag aggcgcgccc actttgtgag gcctttaata cacagtcctg 6180

ccatcaccat ccaggatcat gtccttgaat gcgcccccaa ttgggatcat aggcagcaca 6240

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ttagcaatag tcacaaaatc tggatatatc tcgctctcac attccgggtt gcccaagtat 6420

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ataccagtca gctcaacaaa ccagcgcaat tcgtcaccag atgcagagca gccaccaccg 7260

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tcttaagcta ccaaaattaa taaagttgtg atggctatgg tatattttgg tagtgaatta 9480

tattgatttg gtatatatta gaatcaatcc aaccacaaca caaccaaaaa tacctgaagc 9540

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attaaatttg tttggtgcta tataagaaac ataatatctt cgtcccatag gtgtcttccc 9780

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aatcatcagg tcgactgtac acagtctttc accaggacgg ttgtatcggt tcagcagtcg 9900

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atactaggta actaaataaa caatcaatca agagtatcaa aacatttaaa tttcgaaacg 13260

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cgcaccgtga aagaggcggc tgcactgctt ggcgtgcatc gctcgaccct gtaccgcgca 18720

cttgagcgca gcgaggaagt gacgcccacc gaggccaggc ggcgcggtgc cttccgtgag 18780

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cgccggcaca accgttcttg aatcagaacc cgagggcgac gctgcccgcg aggtccaggc 19740

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ttggccagcc tggcagacac gccagccatg aagcgggtca actttcagtt gccggcggag 19920

gatcacacca agctgaagat gtacgcggta cgccaaggca agaccattac cgagctgcta 19980

tctgaataca tcgcgcagct accagagtaa atgagcaaat gaataaatga gtagatgaat 20040

tttagcggct aaaggaggcg gcatggaaaa tcaagaacaa ccaggcaccg acgccgtgga 20100

atgccccatg tgtggaggaa cgggcggttg gccaggcgta agcggctggg ttgtctgccg 20160

gccctgcaat ggcactggaa cccccaagcc cgaggaatcg gcgtgacggt cgcaaaccat 20220

ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg 20280

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cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga 20400

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attggatgta ccgcgagatc acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg 21000

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cctaaaactc tttaaaactt attaaaactc ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt 21540

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<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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atcttaagct accaaaatta ataaagttgt gatggctatg gtatattttg gtagtgaatt 3660

atattgattt ggtatatatt agaatcaatc caaccacaac acaaccaaaa atacctgaag 3720

ctcaatattg atggtgcttt tcgactatct agcaaatgtg gtgaatgggg ctttataatt 3780

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acaatgatca accatgaaca ttaaagtgat acgtggaaca tgagaacaca aataattgtc 1200

actggaacat aaatacaaaa aggtttgtag taacttaccg gcctgcacat ggcctccaac 1260

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<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gatctagtaa catagatgac accgcgcgcg ataatttatc ctagtttgcg cgctatattt 60

tgttttctat cgcgtattaa atgtataatt gcgggactct aatcataaaa acccatctca 120

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tgtttgaacg atctcagctg tgccccagtt tgctaggcag gtcgcagtac ctggccacag 300

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tgtccacgaa gtagaagccg ggcatcttga ggttcttagc gggtttcttg gatctgtatg 420

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cctaaaaatg ttctttgata tcatcatcaa agtaactttt atgcccatca tatatacatg 1260

atggtgagca aaaaaataat gacatgactc atcgctcact ttatgtgtca atgtgataag 1320

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gaaaaaaaat tatagtatgt tcaatggttt tcattgttcc attaatactc ttgtgaaaac 1500

ttgtttgtga tacgaaataa gttaatgcaa taacttttaa attaactttg cagagcttta 1560

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<400> 18

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<211> 30

<212> DNA

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<400> 21

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<212> DNA

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

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aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca 2100

gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc 2160

agttgccggc ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca 2220

ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa 2280

atgagtagat gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc 2340

accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc 2400

tgggttgtct gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga 2460

cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga 2520

gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg 2580

tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc 2640

cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc 2700

gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg 2760

tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca 2820

cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact 2880

gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa 2940

gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga 3000

tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt 3060

tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga 3120

agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga 3180

gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct 3240

gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct 3300

ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg 3360

cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc 3420

aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt 3480

catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca 3540

gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga 3600

tagcacgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa 3660

cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa 3720

aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc 3780

ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg 3840

gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc 3900

aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc 3960

actcgaccgc cggcgcccac atcaaggcac cctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 4020

aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg 4080

ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca 4140

tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca 4200

gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 4260

ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 4320

gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 4380

ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 4440

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 4500

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 4560

tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4620

ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 4680

ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 4740

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 4800

actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 4860

gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 4920

tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 4980

caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 5040

atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 5100

acgttaaggg attttggtca tgcattctag gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata 5160

atattttatt ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata 5220

ctgttcttcc ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt 5280

gtccgccctg ccgcttctcc caagatcaat aaagccactt actttgccat ctttcacaaa 5340

gatgttgctg tctcccaggt cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt 5400

ctttaaaaaa tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc 5460

gcaatccaca tcggccagat cgttattcag taagtaatcc aattcggcta agcggctgtc 5520

taagctattc gtatagggac aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc 5580

cgcatacagc tcgataatct tttcagggct ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag 5640

gacgccatcg gcctcactca tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt caaagtgcag 5700

gacctttgga acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac 5760

atcataggtg gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc 5820

tcccaccagc ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta 5880

tttttcgatc agttttttca attccggtga tattctcatt ttagccattt attatttcct 5940

tcctcttttc tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa gacgaactcc 6000

aattcactgt tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg 6060

ttttcaaagt tggcgtataa catagtatcg acggagccga ttttgaaacc gcggtgatca 6120

caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt 6180

gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag 6240

tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat 6300

cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga 6360

tatattgtgg tgtaaaca 6378

<210> 25

<211> 6740

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctgcaggccc gggcagcgct gaagaacttc cctaggcacg tgtacgtatt ttttaccagg 60

tgaactccaa gtcctggacc cttttttaag cttagattgt cgtttcccgc cttcagttta 120

aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt 180

agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc 240

atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg atccaacccc tccgctgcta 300

tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct gaaaacgaca tgtcgcacaa 360

gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg 420

ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg agacattacg ccatgaacaa 480

gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc ccgcgtcagc accgacgacc aggacttgac 540

caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg ctgcaccaag ctgttttccg agaagatcac 600

cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt gaccacctac gccctggcga 660

cgttgtgaca gtgaccaggc tagaccgcct ggcccgcagc acccgcgacc tactggacat 720

tgccgagcgc atccaggagg ccggcgcggg cctgcgtagc ctggcagagc cgtgggccga 780

caccaccacg ccggccggcc gcatggtgtt gaccgtgttc gccggcattg ccgagttcga 840

gcgttcccta atcatcgacc gcacccggag cgggcgcgag gccgccaagg cccgaggcgt 900

gaagtttggc ccccgcccta ccctcacccc ggcacagatc gcgcacgccc gcgagctgat 960

cgaccaggaa ggccgcaccg tgaaagaggc ggctgcactg cttggcgtgc atcgctcgac 1020

cctgtaccgc gcacttgagc gcagcgagga agtgacgccc accgaggcca ggcggcgcgg 1080

tgccttccgt gaggacgcat tgaccgaggc cgacgccctg gcggccgccg agaatgaacg 1140

ccaagaggaa caagcatgaa accgcaccag gacggccagg acgaaccgtt tttcattacc 1200

gaagagatcg aggcggagat gatcgcggcc gggtacgtgt tcgagccgcc cgcgcacgtc 1260

tcaaccgtgc ggctgcatga aatcctggcc ggtttgtctg atgccaagct ggcggcctgg 1320

ccggccagct tggccgctga agaaaccgag cgccgccgtc taaaaaggtg atgtgtattt 1380

gagtaaaaca gcttgcgtca tgcggtcgct gcgtatatga tgcgatgagt aaataaacaa 1440

atacgcaagg ggaacgcatg aaggttatcg ctgtacttaa ccagaaaggc gggtcaggca 1500

agacgaccat cgcaacccat ctagcccgcg ccctgcaact cgccggggcc gatgttctgt 1560

tagtcgattc cgatccccag ggcagtgccc gcgattgggc ggccgtgcgg gaagatcaac 1620

cgctaaccgt tgtcggcatc gaccgcccga cgattgaccg cgacgtgaag gccatcggcc 1680

ggcgcgactt cgtagtgatc gacggagcgc cccaggcggc ggacttggct gtgtccgcga 1740

tcaaggcagc cgacttcgtg ctgattccgg tgcagccaag cccttacgac atatgggcca 1800

ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc gcattgaggt cacggatgga aggctacaag 1860

cggcctttgt cgtgtcgcgg gcgatcaaag gcacgcgcat cggcggtgag gttgccgagg 1920

cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc 1980

caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc 2040

gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa 2100

agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag 2160

caaggctgca acgttggcca gcctggcaga cacgccagcc atgaagcggg tcaactttca 2220

gttgccggcg gaggatcaca ccaagctgaa gatgtacgcg gtacgccaag gcaagaccat 2280

taccgagctg ctatctgaat acatcgcgca gctaccagag taaatgagca aatgaataaa 2340

tgagtagatg aattttagcg gctaaaggag gcggcatgga aaatcaagaa caaccaggca 2400

ccgacgccgt ggaatgcccc atgtgtggag gaacgggcgg ttggccaggc gtaagcggct 2460

gggttgtctg ccggccctgc aatggcactg gaacccccaa gcccgaggaa tcggcgtgac 2520

ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc tgggtgatga cctggtggag 2580

aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg aggcagaagc acgccccggt 2640

gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat cccggcaacc gccggcagcc 2700

ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc aaccagattt tttcgttccg 2760

atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca tggacgtggc cgttttccgt 2820

ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct acgagcttcc agacgggcac 2880

gtagaggttt ccgcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt gggattacga cctggtactg 2940

atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc gggaagggaa gggagacaag 3000

cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca agttctgccg gcgagccgat 3060

ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc ggttaaacac cacgcacgtt 3120

gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg tgacggtatc cgagggtgaa 3180

gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg ggcggccgga gtacatcgag 3240

atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag gcaagaaccc ggacgtgctg 3300

acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg gccgttttct ctaccgcctg 3360

gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt tcaagacgat ctacgaacgc 3420

agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg tgcgcaagct gatcgggtca 3480

aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc aggctggccc gatcctagtc 3540

atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg gttcctaatg tacggagcag 3600

atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa aaggtctctt tcctgtggat 3660

agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc ggaacccgta cattgggaac 3720

ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga ctgatataaa agagaaaaaa 3780

ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa ctcttaaaac ccgcctggcc 3840

tgtgcataac tgtctggcca gcgcacagcc gaagagctgc aaaaagcgcc tacccttcgg 3900

tcgctgcgct ccctacgccc cgccgcttcg cgtcggccta tcgcggccgc tggccgctca 3960

aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg gacaagccgc gccgtcgcca 4020

ctcgaccgcc ggcgcccaca tcaaggcacc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 4080

aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 4140

gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat 4200

gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag 4260

attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 4320

taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 4380

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 4440

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 4500

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 4560

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 4620

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 4680

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 4740

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 4800

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 4860

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 4920

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 4980

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 5040

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 5100

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 5160

cgttaaggga ttttggtcat gcattctagg tactaaaaca attcatccag taaaatataa 5220

tattttattt tctcccaatc aggcttgatc cccagtaagt caaaaaatag ctcgacatac 5280

tgttcttccc cgatatcctc cctgatcgac cggacgcaga aggcaatgtc ataccacttg 5340

tccgccctgc cgcttctccc aagatcaata aagccactta ctttgccatc tttcacaaag 5400

atgttgctgt ctcccaggtc gccgtgggaa aagacaagtt cctcttcggg cttttccgtc 5460

tttaaaaaat catacagctc gcgcggatct ttaaatggag tgtcttcttc ccagttttcg 5520

caatccacat cggccagatc gttattcagt aagtaatcca attcggctaa gcggctgtct 5580

aagctattcg tatagggaca atccgatatg tcgatggagt gaaagagcct gatgcactcc 5640

gcatacagct cgataatctt ttcagggctt tgttcatctt catactcttc cgagcaaagg 5700

acgccatcgg cctcactcat gagcagattg ctccagccat catgccgttc aaagtgcagg 5760

acctttggaa caggcagctt tccttccagc catagcatca tgtccttttc ccgttccaca 5820

tcataggtgg tccctttata ccggctgtcc gtcattttta aatataggtt ttcattttct 5880

cccaccagct tatatacctt agcaggagac attccttccg tatcttttac gcagcggtat 5940

ttttcgatca gttttttcaa ttccggtgat attctcattt tagccattta ttatttcctt 6000

cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 6060

attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 6120

tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 6180

aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 6240

tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 6300

ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 6360

gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 6420

atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 6480

aatgtatgct ccaccatgtt ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg 6540

cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 6600

gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 6660

ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 6720

acagctatga ccatgattac 6740

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aggtcgggtt tggggtt 17

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gatgttggca gcgtcgaa 18

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ccaaacttgt tgagtatgtc tt 22

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cgatgcttta ttcgtgtct 19

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gtgtccgtta gactcgtcg 19

<210> 31

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ttggtcgtgt cccgttt 17

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gtgggtactc tttatctact gc 22

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccctgttgtt tggtgttac 19

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gcctccttga ttctttcc 18

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

cttctgcttc ttgagtccat 20

Claims (22)

1.一种介导调控植物隐性核雄性不育系雄性育性的载体，称为GAT载体，该载体由五种功能元件表达盒通过接头序列连接构建于终载体上得到，所述物种功能元件表达盒分别为：

(1)植物雄性育性恢复基因元件表达盒，用于恢复隐性核不育突变体的雄性育性；

(2)植物花粉败育基因元件表达盒，用于清除含GAT的花粉及保持GAT保持系的杂合状态或半合子状态；

(3)基因转化及保持系筛选元件表达盒，用于基因转化及GAT保持系除杂提纯；

(4)除草剂敏感元件表达盒，用于清除除草剂敏感的GAT保持系花粉及种子外逸及GAT不育系除杂提纯；

(5)种子筛选元件表达盒，用于种子机械分选；所述五种功能元件表达盒通过接头序列连接构建得到GAT系统载体；

所述(1)植物雄性育性恢复基因元件表达盒由启动子、雄性育性恢复基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；

所述雄性育性恢复基因为MS1、MS2、MS3、MS5、MS7、MS8、MS9、MS10、MS11、MS12、MS13、MS14、MS17、MS20、MS22、MS23、MS24、MS25、OsCYP704B2、MS27、MS28、MS29、MS30、MS31、MS32、MS33、MS34、MS36、MS37、MS38、MS43、MS45、MS48、MS50、或OsCYP704B2基因的野生型基因，启动子和终止子分别为其各自基因的启动子和终止子，优选OsCYP704B2基因；最优选所述(1)植物雄性育性恢复基因元件表达盒的序列如SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述(2)植物花粉败育基因元件表达盒由植物花粉特异启动子、信号肽及败育基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；优选启动子为玉米PG47启动子、水稻PCHF15、OsPC32启动子，优选败育基因为水稻α-淀粉酶基因OsAA、玉米α-淀粉酶基因Zm-AA1、大麦α-淀粉酶基因HvAA1、小米α-淀粉酶基因SiAA、细胞分裂素氧化酶，半胱氨酸蛋白酶，赤霉素氧化酶，终止子为玉米IN2-1或NosT终止子；

优选步骤(2)植物花粉败育基因元件表达盒的序列如SEQ ID NO.7所示，或如SEQ IDNO.8所示，或如SEQ ID NO.9所示。

3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述(3)基因转化及保持系筛选元件表达盒由启动子、筛选标记基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；优选启动子为Actin启动子或OsUbi启动子的任一个，优选筛选标记基因编码区为OsALSm1、OsALSm2、OsALSm3序列、草甘膦抗性基因EPSPSm序列、草甘膦N-乙酰转移酶序列或草丁膦抗性基因Bar序列中的任一个；终止子为OsUbiT终止子、或NosT终止子；

所述基因转化及保持系筛选元件表达盒的序列优选如SEQ ID NO.10所示；或如SEQIDNO.11所示，或如SEQ ID NO.12所示，或如SEQ ID NO.13所示。

4.如权利要求1-3任一所述的载体，其特征在于，所述(4)除草剂敏感元件表达盒由启动子、除草剂显性敏感元件及终止子依序可正常工作的相连，优选启动子为ZmUbi启动子，除草剂显性敏感元件为细胞色素P450基因CYP81A6的RNAi结构序列P450i，终止子为PinII终止子、NosT终止子；

所述(4)除草剂敏感元件表达盒优选为P450i-1、P450i-2或P450i-3，其序列分别如SEQID NO.14，SEQ ID NO.15，SEQ ID NO.16所示。

5.如权利要求1-4任一所述的载体，其特征在于，所述(5)种子筛选元件表达盒由启动子、种皮显色基因及终止子依序可正常工作的相连，优选地，启动子为种子特异性启动子ZZ1启动子，种皮显色基因为深红色荧光蛋白FP635，红色荧光蛋白RFP或绿色荧光蛋白GFP，终止子为OS-T28终止子、NosT终止子；

所述种子筛选元件表达盒序列优选如SEQ ID NO.17所示。

6.如权利要求1-5任一所述的载体，其特征在于，所述接头序列包括：多克隆位点MCSI，序列如SEQ ID NO.18所示；多克隆位点MCSII，序列如SEQ ID NO.19所示；多克隆位点MCSIII，序列如SEQ ID NO.20所示；多克隆位点MCSIV，序列如SEQ ID NO.21所示；或多克隆位点MCSV，序列如SEQ ID NO.22所示；或

所述终载体为pC0307，其序列如SEQ ID NO.23所示，或所述终载体为pC0308，其序列如SEQ ID NO.24所示，或所述终载体为pC0309，其序列如SEQ ID NO.25所示。

7.如权利要求1-6任一所述的载体，其特征在于，所述GAT载体为pC0308-MMMuauCK5400；其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

8.权利要求1-7任一所述载体的构建方法，其特征在于，将五种功能元件表达盒通过接头序列连接构建于终载体中得到，所述五种功能元件表达盒分别为：

(1)植物雄性育性恢复基因元件表达盒，用于恢复隐性核不育突变体的雄性育性；该表达盒由启动子、雄性育性恢复基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；

(2)植物花粉败育基因元件表达盒，用于清除含GAT的花粉及保持GAT保持系的杂合状态或半合子状态；该表达盒由植物花粉特异启动子、败育基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；

(3)基因转化及保持系筛选元件表达盒，用于基因转化及GAT保持系除杂提纯；该表达盒由启动子、筛选标记基因编码区及终止子依序可正常工作的相连；

(4)除草剂敏感元件表达盒，用于清除除草剂敏感的GAT保持系花粉及种子外逸及GAT不育系除杂提纯；该表达盒由启动子、除草剂显性敏感元件及终止子依序可正常工作的相连；

(5)种子筛选元件表达盒，用于种子机械分选；所述五种功能元件表达盒通过接头序列连接构建得到GAT系统载体；该表达盒由启动子、种皮显色基因及终止子依序可正常工作的相连。

9.一种用于农作物杂交育种制种的遗传智能化育制种系统，称为GAT系统，其特征在于，含有植物隐性核雄性不育系，即GAT不育系，隐性核雄性不育保持系，即GAT保持系，和普通恢复系三个系别；其中的GAT保持系中含有权利要求1-7任一所述的载体。

10.如权利要求9所述的遗传智能化育制种系统，其特征在于，权利要求1-7任一所述的载体以单拷贝形式存在于GAT保持系基因组中；或

所述GAT不育系为单隐性细胞核基因控制的不育系，当基因位点为隐性纯合状态时表现为雄性不育；杂合状态及显性纯合状态表现为雄性可育。

11.权利要求1-7任一所述的载体或权利要求9-10任一所述的遗传智能化育制种系统在植物杂交育种制种中的应用、在生产非转基因杂交种中的应用、或在植物隐性核雄性不育系的规模化保持及规模化繁殖中的应用。

12.一种用于保持植物隐性核雄性不育株的纯合隐性状态的方法，其特征在于：采用权利要求9-10任一所述的遗传智能化育制种系统，向基因型为隐性纯合的GAT不育系中导入GAT载体，创制只含单拷贝GAT载体的GAT转化株，该GAT转化株的基因型为隐性纯合/GAT-，使GAT转化株授粉给GAT不育系，获得的种子基因型仍为隐性纯合状态，从而保持GAT不育系后代的雄性不育性，并成功繁殖GAT不育系。

13.一种用于保持植物隐性核雄性不育株的杂合状态或半合子状态的方法，其特征在于：采用权利要求9-10任一所述的遗传智能化育制种系统，向基因型为隐性纯合的GAT不育系中导入GAT载体，创制只含单拷贝GAT载体的GAT转化株或GAT保持系，该GAT转化株或GAT保持系的基因型为隐性纯合/GAT-；GAT转化株或GAT保持系自交繁殖，产生两种基因型种子，一种为隐性纯合/GAT-，为GAT保持系；一种为隐性纯合/--，为GAT不育株；根据遗传定律，二者呈1：1分离，即GAT转化株或GAT保持系自交后代中基因型为隐性纯合/GAT-的GAT座位仍保持杂合状态或半合子状态。

14.一种用于筛选或区分GAT转化株自交种子及植株的方法，所述GAT转化株是采用权利要求9-10任一所述的遗传智能化育制种系统，向基因型为隐性纯合的GAT不育系中导入GAT载体，创制只含单拷贝GAT载体的GAT转化株，该GAT转化株的基因型为隐性纯合/GAT-，其特征在于：GAT转化株自交结实的种子呈现1:1分离，其中50％为包含GAT载体的种子及其植株，其基因型为隐性纯合/GAT-，具有对针对乙酰乳酸合酶或EPSPS或Bar基因的各类除草剂高抗性，包括但不限于双草醚、咪唑乙烟酸、灭草烟、草甘膦、草丁膦或草铵膦；50％为不包含GAT载体的种子，基因型为隐性纯合，不含GAT元件，不具有此高抗性。

15.一种用于防止GAT植物花粉漂移的方法，其特征在于：将权利要求1-7任一所述的载体转入植物中，使得含GAT载体的植物材料在花粉成熟时，因其含有花粉败育基因元件，会特异性导致含GAT载体的花粉败育，而保证不含GAT载体的花粉正常发育散粉，从而降低含GAT载体的花粉外逸的概率。

16.一种用于防止GAT种子或植株漂移或混杂的方法，其特征在于：使所述种子或植株中含有权利要求1-7任一所述的载体，在种子时期通过包衣或在苗期至开花期施用特定浓度的除草剂，包括苯达松或苄嘧磺隆或烟嘧磺隆，可在特定时期杀死含GAT种子或植株的材料，从而防止GAT种子或植株混杂入其他普通材料中。

17.一种利用植物隐性核雄性不育系生产不育系种子方法，其特征在于：采用权利要求9-10任一所述的遗传智能化育制种系统，将GAT保持系与GAT不育系按一定比例混合播种，利用GAT保持系授粉给GAT不育系，授粉完成后，施用除草剂，包括苯达松或苄嘧磺隆或烟嘧磺隆，特异性的杀死GAT保持系，仅保留GAT不育系收获种子。

18.一种提纯植物隐性核雄性不育系的方法，其特征在于：采用权利要求9-10任一所述的遗传智能化育制种系统，GAT不育系通过种子包衣或在苗期至开花期施用特定浓度的除草剂，包括苯达松或苄嘧磺隆或烟嘧磺隆，可保证GAT不育系纯度。

19.一种利用植物隐性核雄性不育系进行杂交制种方法，其特征在于：采用权利要求9-10任一所述的遗传智能化育制种系统，利用GAT保持系自交生产GAT保持系种子和GAT不育系种子；利用GAT保持系授粉给GAT不育系生产GAT不育系种子；利用GAT不育系和常规材料杂交组配生产普通商业化杂交种。

20.一种利用植物隐性核雄性不育系进行杂交育种方法，其特征在于：采用权利要求9-10任一所述的遗传智能化育制种系统，利用GAT保持系与普通材料杂交选育，可通过常规回交选育，也可通过系谱法选育GAT保持系及不育系，选育过程辅以GAT各项分子标记、除草剂筛选、种子色选等加速选育。

21.一种利用权利要求9-10任一所述的遗传智能化育制种系统制备不含GAT元件的商业化杂交种的方法，其特征在于：利用GAT保持系与常规材料A杂交，获得F1杂种，后续可通过自交获得F2，在F2代中辅以GAT分子标记、除草剂筛选、种子色选等选育包含纯合隐性核不育位点及GAT元件的材料，通过连续自交获得高世代稳定材料，从中获得新的GAT保持系和GAT不育系，新选育的GAT不育系可以和普通恢复系杂交组配选育普通商业化杂交种，该杂交种不含GAT元件，为常规商业化杂交种。

22.一种分选不同功能的植株和后代的方法，其特征在于，将权利要求1-7任一所述的载体转入植株，利用GAT载体中的(3)基因转化及保持系筛选元件表达盒，(4)除草剂敏感元件表达盒，(5)种子筛选元件表达盒，基于化学除草剂正负双向选择与机械色选相结合，分选不同功能的植株和后代；

所述化学除草剂正负双向选择是同一种植株对一种除草剂表现抗性，对另一种除草剂表现敏感；

优选地，化学除草剂正向选择除草剂是抗双草醚、咪唑乙烟酸、灭草烟，抗草甘膦、抗草丁膦或草铵膦，化学除草剂负向选择是对苯达松、苄嘧磺隆或烟嘧磺隆敏感；

机械色选是通过种子的不同荧光进行筛选分离含GAT载体的种子或不含GAT载体的种子。

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