CN103205458B - 一种适合单子叶植物转化的中间表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种适合单子叶植物转化的中间表达载体及其构建方法，属于植物遗传转化的中间表达载体及其构建方法。该中间表达载体为pCAM-UPN，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明中的中间表达载体本身不含报告基因，己经通过限制性内切酶将报告基因GUS插入载体，构建得到植物表达载体pCAM-UGN。农杆菌介导法将pCAM-UGN转入水稻，PCR鉴定后得到GUS基因插入阳性植株，组织化学染色结果表明载体所带GUS基因在水稻中正常表达。

Description

一种适合单子叶植物转化的中间表达载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种植物遗传转化的中间表达载体及其构建方法。

背景技术

我国粮食作物主要以小麦、水稻和玉米为主，而这三种作物都属于单子叶植物，其中小麦和水稻是重要口粮，玉米则是重要的粮食、饲料作物，同时也是制药、糖料、淀粉、油料、酒精工业等的主要原料。玉米的遗传转化研究具有广泛的应用和理论意义。目前应用的主流玉米遗传转化方法是基因枪转化法和农杆菌介导法，其中农杆菌转化方法因为有整合模式可能相对简单、外源基因表达传代可能相对稳定，操作简便、成本低，也可转移大片段DNA等优点而为玉米基因工程研究广泛利用。

农杆菌介导法在双子叶植物上的遗传方法已经十分完善，由于玉米属单子叶植物，而单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，因此使用合适的植物表达载体尤为重要。一个基因的正常表达需要有表达组件及启动子和终止子的调控。在载体中往往需要有一个多克隆位点插入表达组件中，这样方便外源基因插入到表达载体中而完成一个目的基因的表达载体的构建。另一方面基因工程中常用的CaMV35S启动子也在双子叶植物中表达效果好，在单子叶植物中通常使用Ubiquitin启动子，这在玉米、水稻等单子叶植物中已经得到了验证。

因此，针对玉米遗传转化应选用单子叶植物中表达效果好的启动子，构建成一种具有完整表达组件，可以插入目的基因，构建适用于除草剂筛选、无报告基因的中间表达载体，具有很大的实际应用价值。

发明内容

本发明提供一种适合单子叶植物遗传转化的标准化中间表达载体。

本发明所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体为pCAM-UPN，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明提供的含有玉米Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列的中间表达载体，是将Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列插入双元载体的多克隆位点构建得到；其中所述的双元载体为pCAMBIA3300；其中所述的多克隆位点为人工合成序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述的玉米Ubiquitin启动子为玉米Ubiquitin启动子+内含子序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述的终止子为NOS终止子，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明提供的适合单子叶植物遗传转化的标准化中间表达载体pCAM-UPN，其多克隆位点有5个限制性内切酶酶切位点，启动子上游和终止子下游分别有1个限制性内切酶酶切位点。

本发明提供了所述中间表达载体构建的应用，构建植物表达载体pCAM-UGN，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明提供了含有所述中间表达载体构建的植物表达载体pCAM-UGN的宿主细胞。(实施例中没有体现？已经有所表诉)

本发明提供了上述中间表达载体所构建的植物表达载体pCAM-UGN在基因转化中的应用。

本发明提供了上述中间表达载体所构建的植物表达载体pCAM-UGN在水稻和玉米遗传转化中的应用。

本发明还提供了中间表达载体pCAM-UPN的构建方法，包括下列步骤：

(1)克隆玉米Ubiquitin启动子Ubi-P，在启动子的上下游分别填加了Hind III和BamH I位点，用于扩增Ubi-pro的引物为：Ubi-P HinFw：5′CCCAAGCTTGGGGCATGCCTGCAGTGCAGCGTGAC3′和Ubi-P BamRev：5′CGCGGATCCGCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAA3′，将扩增得到的Ubi-P与pMD18-T simple载体连接，得到载体pMD18-UP；

(2)克隆Nos终止子Nos-T，在终止子的上下游分别填加了Sac I和EcoR I位点，用于扩增Nos-T的引物为：NosSacFw：5′CGAGCTCGGAATTTCCCCGATCGTTCA3′和Nos EcoRRev：5′CCGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT3′，将扩增得到的Nos-T与pMD18-T simple载体连接，得到载体pMD18-NT；

(3)人工合成多克隆位点，利用BamH I和Sac I位点插入pCAMBIA3300，得到载体pCAM-NP；

(4)将载体pMD18-UP和载体pCAM-NP的质粒分别用Hind III和BamH I双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到载体pCAM-UP；

(5)将载体pMD18-NT和载体pCAM-UP的质粒分别用Sac I和EcoR I双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到中间表达载体pCAM-UPN。

本发明提供的中间表达载体pCAM-UPN具有完整的由启动子-多克隆位点-终止子序列构成的表达组件，它可以完整独立地驱动插入基因的表达。在该载体的多克隆位点有5个限制性内切酶酶切位点，可以将外源基因直接插入此多克隆位点即可构建出植物表达载体；在启动子上游和终止子下游分别有1个限制性内切酶酶切位点。本发明提供的pCAM-UPN含有Bar基因作为筛选标记，编码草胺磷乙酰转移酶，转基因材料用除草剂Basta进行筛选，避免了转基因后代用抗生素筛选引起争议；本发明中的中间表达载体本身不含报告基因，已经通过限制性内切酶将报告基因GUS插入载体，构建得到植物表达载体pCAM-UGN。利用基因枪轰击法将pCAM-UGN转入玉米愈伤组织，组织化学染色结果表明载体所带的GUS基因在玉米中正常表达。农杆菌介导法将pCAM-UGN转入水稻，PCR鉴定后得到GUS基因插入阳性植株，组织化学染色结果表明载体所带GUS基因在水稻中正常表达。

本发明提供的中间表达载体pCAM-UPN所构建的植物表达载体在玉米遗传转化中得到优于其他转化载体的结果。

附图说明

图1是本发明pCAM-UPN的载体图谱，载体骨架为pCAMBIA3300；

图2是植物表达载体pCAM-UGN的载体图谱，载体骨架为pCAMBIA3300；

图3是植物表达载体pCAM-UGN转化的玉米愈伤组织GUS染色图片；

图4A是植物表达载体pCAM-UGN在水稻中的表达，图中为用PCR检测T0代转基因水稻的PCR检测结果；+为质粒DNA对照，-为阴性对照，1-5为T0代转基因植株；

图4B是植物表达载体pCAM-UGN在水稻中的表达，图中为T0代转化植株的GUS染色结果，1-5为T0代转基因植株。

具体实施方式

本发明所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体为pCAM-UPN，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明提供的含有玉米Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列的中间表达载体，是将Ubiquitin启动子-多克隆位点-终止子序列插入双元载体的多克隆位点构建得到；其中所述的双元载体为pCAMBIA3300；其中所述的多克隆位点为人工合成序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述的玉米Ubiquitin启动子为玉米Ubiquitin启动子+内含子序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述的终止子为NOS终止子，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明提供的适合单子叶植物遗传转化的标准化中间表达载体pCAM-UPN，其多克隆位点有5个限制性内切酶酶切位点，启动子上游和终止子下游分别有1个限制性内切酶酶切位点。

本发明提供了所述中间表达载体构建的应用，构建植物表达载体pCAM-UGN，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

本发明提供了含有所述中间表达载体构建的植物表达载体pCAM-UGN的宿主细胞。

本发明提供了上述中间表达载体所构建的植物表达载体pCAM-UGN在基因转化中的应用。

本发明提供了上述中间表达载体所构建的植物表达载体pCAM-UGN在水稻和玉米遗传转化中的应用。

本发明还提供了中间表达载体pCAM-UPN的构建方法，包括：

(1)克隆玉米Ubiquitin启动子Ubi-P，在启动子的上下游分别填加了Hind III和BamH I位点，用于扩增Ubi-pro的引物为：Ubi-P HinFw：5′CCCAAGCTTGGGGCATGCCTGCAGTGCAGCGTGAC3′和Ubi-P BamRev：5′CGCGGATCCGCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAA3′，将扩增得到的Ubi-P与pMD18-T simple载体连接，得到载体pMD18-UP；

(2)克隆Nos终止子Nos-T，在终止子的上下游分别填加了Sac I和EcoR I位点，用于扩增Nos-T的引物为：Nos SacFw：5′CGAGCTCGGAATTTCCCCGATCGTTCA3′和Nos EcoRRev：5′CCGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT3′，将扩增得到的Nos-T与pMD18-T simple载体连接，得到载体pMD18-NT；

(3)人工合成多克隆位点，利用BamH I和Sac I位点插入pCAMBIA3300，得到载体pCAM-NP；

(4)将载体pMD18-UP和载体pCAM-NP的质粒分别用Hind III和BamH I双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到载体pCAM-UP；

(5)将载体pMD18-NT和载体pCAM-UP的质粒分别用Sac I和EcoR I双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到中间表达载体pCAM-UPN。

下面结合具体实施例对发明做进一步说明。

实验材料

质粒：pMD18-T simple(大连TaKaRa公司)，pCAMBIA3300(Cambia Labs)；

菌株：大肠杆菌Trans5α(北京全式金公司)，农杆菌EHA105(本实验室保存)；

下述实施例中所用的方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和基因工程所记载的方法。具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular cloning：A Laboratory Manual，3^rdedition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。各种试剂及内切酶：购自大连TaKaRa公司，上海捷瑞生物科技有限公司，基因合成由上海捷瑞生物科技有限公司完成，测序分析由华大基因完成。

实施例1

1.克隆载体pCAM-NP的构建

按照SEQ ID No.1设计序列有生物公司合成多克隆位点，此多克隆位点含有BamHI、Spe I、Sma I、Xma I和Sac I五个限制性内切酶酶切位点，将多克隆位点插入pCAMBIA3300(购自Cambia公司)，得到pCAM-NP。

2.载体pCAM-UP的构建

根据SEQ ID No.2命名为Ubi序列，设计Ubiquitin启动子引物，上下游引物分别插入Hind III和BamH I酶切位点：

Ubi-P HinFw：5′CCCAAGCTTGGG GCATGCCTGCAGTGCAGCGTGAC3′

Ubi-P BamRev：5′CGCGGATCCGCG GATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAA3′

用Ubi-P HinFw和Ubi-PBamRev引物，以质粒pAHC17为模板，进行PCR扩增，得到一个2000bp左右的片段，将此片段连入pMD18-T simple，合成载体pMD18-UP，测序分析无误后，利用Hind III和BamH I双酶切pMD18-UP得到插入片段，取pCAM-NP(由生物公司合成)用同样的酶切回收载体片段，用连接酶重组连接上述插入片段和载体片段，抽提质粒后测序插入无误后得到载体pCAM-UP。

3.载体pCAM-UPN的构建

根据用SEQ ID No.3命名为Nos序列，设计NOS终止子引物，上下游引物分别插入Sac I和EcoR I酶切位点：

Nos SacFw：5′CGAGCTCGGAATTTCCCCGATCGTTCA3′

Nos EcoRRev：5′CCGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT3′

用Nos SacFw和Nos EcoRRev引物，以pBI121为模板，进行PCR扩增，得到一个270bp左右的片段，将扩增得到的片段与pMD18-T simple载体连接，得到载体pMD18-NT，测序验证无误后，利用Sac I和EcoR I双酶切pMD18-NT得到插入片段，取pCAM-UP(上一步构建载体)用同样的酶切回收载体大片段，用连接酶重组连接上述插入片段和载体片段，抽提质粒后测序插入无误后，得到中间表达载体pCAM-UPN(图1)。

实施例2：

1.植物表达载体pCAM-UGN的构建

2.为了研究并验证本发明载体pCAM-UPN的实用性及稳定性，以GUS报告基因为目的基因连接到载体的BamHI和SacI酶切位点，构建成植物表达载体pCAM-UGN。

具体步骤如下：

(1)GUS基因的克隆

根据NCBI网站数据库提供的序列信息，设计Gus基因的PCR引物，上下游分别插入BamH I和Sac I位点：

GUS BamFw：5′CGGGATCCCGATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCA3′

GUS SacRev：5′CGAGCTCGTCCCTGCTGCGGTTTTTCACCGAAG3′

以质粒pCAMBIA3301(购自Cambia公司)为模板，利用上述PCR引物通过PCR扩增得到GUS基因序列。GUS基因PCR产物回收后连接于pMD18-T simple载体，测序无误后得到pMD18-GUS。

(2)植物表达载体pCAM-UGN的构建及测序

将pMD18-GUS和中间表达载体pCAM-UPN的质粒分别用BamH I和Sac I酶切，分别回收GUS目的基因和载体片段，用连接酶连接目的基因和载体片段，抽提重组质粒后测序确定插入无误，得到植物表达载体pCAM-UGN(图2)，序列如SEQ ID No.5所示。

实施例3：

1.表达载体pCAM-UGN在玉米愈伤组织中的表达研究

(1)基因枪法轰击玉米愈伤组织

采用基因枪介导法将插入序列导入受体植株幼胚脱分化获得的愈伤组织细胞，经除草剂草铵膦筛选后获得转基因植株。具体方法为：

1)收获授粉后9-12天的幼穗，除掉苞叶，灭菌后用无菌水洗涤，剥取大小在1.5-2.0mm的幼胚，将幼胚接种于愈伤组织诱导与继代培养基，28℃，暗培养2周。以后每2周继代一次，直到形成稳定的II型愈伤组织。

2).将带有质粒pCAM-UGN的大肠杆菌DH5α在附加抗生素的LB培养基中37℃震荡培养，使细菌处于对数生长期，提取质粒，调整质粒浓度在1.0μg/μl，-20℃保存待用。洗涤直径0.6μm的金粉，-20℃保存待用。

3).将稳定的II型愈伤组织转移到高渗培养基，愈伤组织紧密地摆放在培养基中心，形成一个直径约为3.5cm左右的圆形，高渗处理4-6h后，制备金弹进行基因枪轰击。

4).基因枪轰击后的愈伤组织在高渗培养基中继续培养20h，然后转移到诱导与继代培养基恢复培养1周，再转入带有一定浓度的除草剂草铵膦的筛选培养基中进行筛选培养，每2周更换一次培养基，直到筛选出抗性愈伤组织。

(2)表达载体pCAM-UGN在玉米愈伤组织中的组织化学染色

GUS染色：

1)将基因枪轰击后培养48h的抗性愈伤材料浸入0.4％甲醛溶液中，室温下45min

2).用0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗植物组织3遍

3).将玉米材料浸入底物工作液中，37℃孵育过夜

4).75％乙醇浸泡1天，以脱去背景颜色

5).观察玉米材料蓝色斑点，统计、照相(图3)，说明植物表达载体pCAM-UGN表达的GUS蛋白在玉米愈伤组织(植物宿主材料)中成功表达。同时说明pCAM-UPN中间表达载体构建的表达载体可以正常行驶功能，可应用于玉米宿主材料的转化研究。(染色液成分：0.5mg/ml X-Gluc+100mM磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)+0.1％TritonX-100+0.5mM K3Fe(CN)6+0.5mM K4Fe(CN)6+10mM EDTA)

实施例4：表达载体pCAM-UGN在水稻中的表达研究

(1)表达载体pCAM-UGN转化农杆菌EHA105

向50ul农杆菌EHA105感受态细胞中加入1ug pCAM-UGN质粒DNA，冰浴30min；放入液氮中1min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；取出离心管，加入0.5ml YEP培养基，28℃，220rpm振荡培养3-5hr；取出菌液涂于含有相应抗生素的YEP平板上，在28℃培养箱中倒置培养2天，直到菌落出现。

(2)重组农杆菌鉴定

挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃振荡培养过夜。碱裂解法提取质粒DNA并酶切鉴定。

(3)转化水稻

采用根瘤农杆菌介导法将插入序列导入水稻的胚性愈伤组织(植物宿主细胞)，经除草剂PPT筛选后获得转基因植株。具体方法为：

1)取成熟水稻种子，外壳碾去，70％酒精浸泡5min，然后在0.1％的氯化汞溶液中消毒，用无菌水洗涤2-3次，放入诱导培养基中，26℃暗培养。21-28天后将从盾片诱导的愈伤组织转入继代培养基中，2周继代1次，将得到的胚性愈伤组织作为农杆菌转化的受体。

2)将带有pCAM-UGN的根瘤农杆菌EHA105在附加抗生素的YEP培养基中28℃震荡培养，使细菌处于对数生长期。然后在3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS改良液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。

3)把菌液倒在培养皿中，将挑好的胚性愈伤组织浸泡在菌液中5分钟。然后将浸染后的胚性愈伤组织用无菌滤纸吸干，转入N6选择培养基(含有5mg/ml PPT)中于26℃暗培养20天后，继代1次。将新长出的抗性愈伤转移到N6预分化培养基上，26℃、60uE/(m2.s)强度、12h可持续光照。待小苗长到约1cm时放入含有1/2MS盐的生根培养基中，待长出3-4条根长度为1.5cm时，转入温室。

4)移栽成活的转化植株长出3片叶后，将转基因水稻植株和未转化植株的叶片用含600mg/L PPT的BASTA除草剂溶液涂布，3-4天后观察叶片颜色变化，半月后筛选出存活植株定植到田间。

5)抗除草剂植株生长到5-6叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。

(4)T0转基因植株的PCR检测

提取除草剂5株抗性植株叶片基因组DNA，经PCR检测，有4株呈阳性(如图4，A)。说明pCAM-UGN植物表达载体能够成功整合到植物基因组中。

(5)T0代转基因植株的组织化学染色

GUS染色：

1)将转基因水稻叶片浸入0.4％甲醛溶液中，室温下45min

2).用0.1M pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗植物组织3遍

3).将玉米材料浸入底物工作液中，37℃孵育过夜

4).75％乙醇浸泡1天，以脱去背景颜色

5).观察水稻材料蓝色斑点，统计、照相(图4，B)，说明pCAM-UGN表达的GUS蛋白在转基因水稻中可以稳定表达。同时说明pCAM-UPN中间表达载体构建的植物表达载体可以正常行驶功能，可应用于单子叶植物宿主材料的转化研究。

(染色液成分：0.5mg/ml X-Gluc+100mM磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)+0.1％TritonX-100+0.5mM K3Fe(CN)6+0.5mM K4Fe(CN)6+10mM EDTA)

实施例5：利用中间表达载体构建得到表达载体pCAM-UTN与p7U-UTN载体转化率比较

本实施例中设计到的概念定义：转化事件，由一个幼胚获得的所有抗性愈伤均称为一个转化事件；转化率是转化事件数和侵染幼胚数的比值；

利用本发明提供的中间表达载体pCAM-UPN，利用酶切重组法，在载体的多克隆位点插入不同的目的基因(Target gene)，构建了不同的植物表达载体pCAM-UT_(？)N，分别命名为pCAM-UT_(GS1)N，pCAM-UT_(AAP1)N，pCAM-UT_(Dof1)N，pCAM-UT_(GA2ox)N，对照载体p7U-UT_(Old)N；

表达载体转化农杆菌，方法同实施例3；

侵染筛选基本流程：菌体活化，工程菌制备，幼胚剥取，农杆菌侵染幼胚HiII，(幼胚带菌)共培养，幼胚恢复培养(无除草剂，带抗生素抑菌)，筛选培养(带除草剂和抗生素)直到不再出抗性愈伤，计算转化率，各载体所得转化率不同(见表1)，总体看来利用pCAM-UPN构建的植物表达载体转化率普遍高于p7U所得载体，高出水平在4-30倍不等，证明了本发明所提供的中间表达载体的实用性和实效性。

转化率％＝转化事件数/侵染幼胚数×100％

表1：pCAM-UTN载体与p7U-UTN载体的转化率比较

在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属本发明有求保护的范围。

序列表

<110>吉林省农业科学院

<120>一种适合单子叶植物转化的中间表达载体及其构建方法

<130>haody-201301

<160>5

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

ggatccaaca gccccgggaa cagcactagt aacagcgagc tc                       42

<210>2

<211>2020

<212>DNA

<213>玉米

<400>2

gcatgcctgc agtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca   60

tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt  120

tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta  180

caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac  240

aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc  300

cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca  360

tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc  420

tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt  480

tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat  540

taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc  600

cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga  660

agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt tccgctccac  720

cgttggactt gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc  780

cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcaccgg cagctacggg ggattccttt  840

cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca  900

ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga gcgcacacac acacaaccag atctccccca  960

aatccacccg tcggcacctc cgcttcaagg tacgccgctc gtcctccccc cccccccctc 1020

tctaccttct ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg cccggtagtt ctacttctgt 1080

tcatgtttgt gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc tgctagcgtt cgtacacgga 1140

tgcgacctgt acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct ctttggggaa 1200

tcctgggatg gctctagccg ttccgcagac gggatcgatt tcatgatttt ttttgtttcg 1260

ttgcataggg tttggtttgc ccttttcctt tatttcaata tatgccgtgc acttgtttgt 1320

cgggtcatct tttcatgctt ttttttgtct tggttgtgat gatgtggtct ggttgggcgg 1380

tcgttctaga tcggagtaga attaattctg tttcaaacta cctggtggat ttattaattt 1440

tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg atggatggaa 1500

atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat atacagagat 1560

gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc attcgttcta 1620

gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg gaactgtatg 1680

tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gatctaggat 1740

aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata tgcagcatct 1800

attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg ttttataatt 1860

attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg gattttttta 1920

gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga tgctcaccct 1980

gttgtttggt gttacttctg caggtcgact ctagaggatc                       2020

<210>3

<211>265

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc  60

cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 120

catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 180

catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc 240

ggtgtcatct atgttactag atcgg                                       265

<210>4

<211>10705

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

catgccaacc acagggttcc cctcgggatc aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct   60

atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca  120

agtcctaagt tacgcgacag gctgccgccc tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt  180

gttttagtcg cataaagtag aatacttgcg actagaaccg gagacattac gccatgaaca  240

agagcgccgc cgctggcctg ctgggctatg cccgcgtcag caccgacgac caggacttga  300

ccaaccaacg ggccgaactg cacgcggccg gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca  360

ccggcaccag gcgcgaccgc ccggagctgg ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg  420

acgttgtgac agtgaccagg ctagaccgcc tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca  480

ttgccgagcg catccaggag gccggcgcgg gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg  540

acaccaccac gccggccggc cgcatggtgt tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg  600

agcgttccct aatcatcgac cgcacccgga gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg  660

tgaagtttgg cccccgccct accctcaccc cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga  720

tcgaccagga aggccgcacc gtgaaagagg cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga  780

ccctgtaccg cgcacttgag cgcagcgagg aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg  840

gtgccttccg tgaggacgca ttgaccgagg ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac  900

gccaagagga acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac  960

cgaagagatc gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt 1020

ctcaaccgtg cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg 1080

gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt 1140

tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca 1200

aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc 1260

aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg 1320

ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa 1380

ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc 1440

cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg 1500

atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc 1560

accgccgacc tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa 1620

gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag 1680

gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac 1740

ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc 1800

cgcgaggtcc aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta 1860

aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca 1920

gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc 1980

agttgccggc ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca 2040

ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa 2100

atgagtagat gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc 2160

accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc 2220

tgggttgtct gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga 2280

cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga 2340

gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg 2400

tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc 2460

cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc 2520

gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg 2580

tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca 2640

cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact 2700

gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa 2760

gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga 2820

tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt 2880

tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga 2940

agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga 3000

gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct 3060

gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct 3120

ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg 3180

cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc 3240

aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt 3300

catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca 3360

gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga 3420

tagcacgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa 3480

cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa 3540

aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc 3600

ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg 3660

gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc 3720

aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc 3780

actcgaccgc cggcgcccac atcaaggcac cctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 3840

aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg 3900

ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca 3960

tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca 4020

gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 4080

ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 4140

gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 4200

ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 4260

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 4320

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 4380

tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4440

ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 4500

ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 4560

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 4620

actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 4680

gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 4740

tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 4800

caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 4860

atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 4920

acgttaaggg attttggtca tgcattctag gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata 4980

atattttatt ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata 5040

ctgttcttcc ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt 5100

gtccgccctg ccgcttctcc caagatcaat aaagccactt actttgccat ctttcacaaa 5160

gatgttgctg tctcccaggt cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt 5220

ctttaaaaaa tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc 5280

gcaatccaca tcggccagat cgttattcag taagtaatcc aattcggcta agcggctgtc 5340

taagctattc gtatagggac aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc 5400

cgcatacagc tcgataatct tttcagggct ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag 5460

gacgccatcg gcctcactca tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt caaagtgcag 5520

gacctttgga acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac 5580

atcataggtg gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc 5640

tcccaccagc ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta 5700

tttttcgatc agttttttca attccggtga tattctcatt ttagccattt attatttcct 5760

tcctcttttc tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa gacgaactcc 5820

aattcactgt tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg 5880

ttttcaaagt tggcgtataa catagtatcg acggagccga ttttgaaacc gcggtgatca 5940

caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt 6000

gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag 6060

tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat 6120

cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga 6180

tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt 6240

taatgtactg aattaacgcc gaattaattc gggggatctg gattttagta ctggattttg 6300

gttttaggaa ttagaaattt tattgataga agtattttac aaatacaaat acatactaag 6360

ggtttcttat atgctcaaca catgagcgaa accctatagg aaccctaatt cccttatctg 6420

ggaactactc acacattatt atggagaaac tcgagtcaaa tctcggtgac gggcaggacc 6480

ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga aacccacgtc atgccagttc 6540

ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc 6600

atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt 6660

gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 6720

cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 6780

gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag 6840

cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg 6900

aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg tgcagaccgc cggcatgtcc 6960

gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg ggctcatggt agactcgaga 7020

gagatagatt tgtagagaga gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac 7080

ttccttatat agaggaaggt cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc 7140

agtggagata tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc 7200

cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg 7260

aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac 7320

tgtccttttg atgaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat 7380

taccctttgt tgaaaagtct caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt 7440

cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac catgttatca catcaatcca cttgctttga 7500

agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt 7560

gggaccactg tcggcagagg catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca 7620

tttgtaggtg ccaccttcct tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca 7680

atggaatccg aggaggtttc ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg 7740

gtcttctgag actgtatctt tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat 7800

gttggcaagc tgctctagcc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 7860

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 7920

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 7980

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 8040

tacgaattcc cgatctagta acatagatga caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc 8100

gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat tgcgggactc taatcataaa 8160

aacccatctc ataaataacg tcatgcatta catgttaatt attacatgct taacgtaatt 8220

caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact 8280

ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa attcgagctc gctgttacta gtgctgttcc 8340

cggggctgtt ggatcctcta gagtcgacct gcagaagtaa caccaaacaa cagggtgagc 8400

atcgacaaaa gaaacagtac caagcaaata aatagcgtat gaaggcaggg ctaaaaaaat 8460

ccacatatag ctgctgcata tgccatcatc caagtatatc aagatcaaaa taattataaa 8520

acatacttgt ttattataat agataggtac tcaaggttag agcatatgaa tagatgctgc 8580

atatgccatc atgtatatgc atcagtaaaa cccacatcaa catgtatacc tatcctagat 8640

cgatatttcc atccatctta aactcgtaac tatgaagatg tatgacacac acatacagtt 8700

ccaaaattaa taaatacacc aggtagtttg aaacagtatt ctactccgat ctagaacgaa 8760

tgaacgaccg cccaaccaca ccacatcatc acaaccaagc gaacaaaaag catctctgta 8820

tatgcatcag taaaacccgc atcaacatgt atacctatcc tagatcgata tttccatcca 8880

tcatcttcaa ttcgtaacta tgaatatgta tggcacacac atacagatcc aaaattaata 8940

aatccaccag gtagtttgaa acagaattaa ttctactccg atctagaacg accgcccaac 9000

cagaccacat catcacaacc aagacaaaaa aaagcatgaa aagatgaccc gacaaacaag  9060

tgcacggcat atattgaaat aaaggaaaag ggcaaaccaa accctatgca acgaaacaaa  9120

aaaaatcatg aaatcgatcc cgtctgcgga acggctagag ccatcccagg attccccaaa  9180

gagaaacact ggcaagttag caatcagaac gtgtctgacg tacaggtcgc atccgtgtac  9240

gaacgctagc agcacggatc taacacaaac acggatctaa cacaaacatg aacagaagta  9300

gaactaccgg gccctaacca tggaccggaa cgccgatcta gagaaggtag agaggggggg  9360

ggggggagga cgagcggcgt accttgaagc ggaggtgccg acgggtggat ttgggggaga  9420

tctggttgtg tgtgtgtgcg ctccgaacaa cacgaggttg gggaaagagg gtgtggaggg  9480

ggtgtctatt tattacggcg ggcgaggaag ggaaagcgaa ggagcggtgg gaaaggaatc  9540

ccccgtagct gccggtgccg tgagaggagg aggaggccgc ctgccgtgcc ggctcacgtc  9600

tgccgctccg ccacgcaatt tctggatgcc gacagcggag caagtccaac ggtggagcgg  9660

aactctcgag aggggtccag aggcagcgac agagatgccg tgccgtctgc ttcgcttggc  9720

ccgacgcgac gctgctggtt cgctggttgg tgtccgttag actcgtcgac ggcgtttaac  9780

aggctggcat tatctactcg aaacaagaaa aatgtttcct tagttttttt aatttcttaa  9840

agggtatttg tttaattttt agtcacttta ttttattcta ttttatatct aaattattaa  9900

ataaaaaaac taaaatagag ttttagtttt cttaatttag aggctaaaat agaataaaat  9960

agatgtacta aaaaaattag tctataaaaa ccattaaccc taaaccctaa atggatgtac 10020

taataaaatg gatgaagtat tatataggtg aagctatttg caaaaaaaaa ggagaacaca 10080

tgcacactaa aaagataaaa ctgtagagtc ctgttgtcaa aatactcaat tgtcctttag 10140

accatgtcta actgttcatt tatatgattc tctaaaacac tgatattatt gtagtactat 10200

agattatatt attcgtagag taaagtttaa atatatgtat aaagatagat aaactgcact 10260

tcaaacaagt gtgacaaaaa aaatatgtgg taatttttta taacttagac atgcaatgct 10320

cattatctct agagaggggc acgaccgggt cacgctgcac tgcaggcatg caagcttggc 10380

actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 10440

ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 10500

cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgctag agcagcttga gcttggatca 10560

gattgtcgtt tcccgccttc agtttaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt 10620

aaacctaaga gaaaagagcg tttattagaa taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt 10680

ttatccgttc gtccatttgt atgtg                                       10705

<210>5

<211>12474

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

catgccaacc acagggttcc cctcgggatc aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct   60

atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca  120

agtcctaagt tacgcgacag gctgccgccc tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt  180

gttttagtcg cataaagtag aatacttgcg actagaaccg gagacattac gccatgaaca  240

agagcgccgc cgctggcctg ctgggctatg cccgcgtcag caccgacgac caggacttga  300

ccaaccaacg ggccgaactg cacgcggccg gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca  360

ccggcaccag gcgcgaccgc ccggagctgg ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg  420

acgttgtgac agtgaccagg ctagaccgcc tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca  480

ttgccgagcg catccaggag gccggcgcgg gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg  540

acaccaccac gccggccggc cgcatggtgt tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg  600

agcgttccct aatcatcgac cgcacccgga gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg  660

tgaagtttgg cccccgccct accctcaccc cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga  720

tcgaccagga aggccgcacc gtgaaagagg cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga  780

ccctgtaccg cgcacttgag cgcagcgagg aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg  840

gtgccttccg tgaggacgca ttgaccgagg ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac  900

gccaagagga acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac  960

cgaagagatc gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt 1020

ctcaaccgtg cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg 1080

gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt 1140

tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca 1200

aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc 1260

aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg 1320

ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa 1380

ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc 1440

cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg 1500

atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc 1560

accgccgacc tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa 1620

gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag 1680

gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac 1740

ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc 1800

cgcgaggtcc aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta 1860

aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca 1920

gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc 1980

agttgccggc ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca 2040

ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa 2100

atgagtagat gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc 2160

accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc 2220

tgggttgtct gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga 2280

cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga 2340

gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg 2400

tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc 2460

cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc 2520

gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg 2580

tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca 2640

cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact 2700

gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa 2760

gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga 2820

tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt 2880

tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga 2940

agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga 3000

gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct 3060

gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct 3120

ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg 3180

cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc 3240

aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt 3300

catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca 3360

gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga 3420

tagcacgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa 3480

cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa 3540

aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc 3600

ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg 3660

gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc 3720

aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc 3780

actcgaccgc cggcgcccac atcaaggcac cctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 3840

aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg 3900

ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca 3960

tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca 4020

gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 4080

ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 4140

gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 4200

ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 4260

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 4320

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 4380

tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4440

ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 4500

ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 4560

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 4620

actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 4680

gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 4740

tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 4800

caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 4860

atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 4920

acgttaaggg attttggtca tgcattctag gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata 4980

atattttatt ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata 5040

ctgttcttcc ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt 5100

gtccgccctg ccgcttctcc caagatcaat aaagccactt actttgccat ctttcacaaa 5160

gatgttgctg tctcccaggt cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt 5220

ctttaaaaaa tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc 5280

gcaatccaca tcggccagat cgttattcag taagtaatcc aattcggcta agcggctgtc 5340

taagctattc gtatagggac aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc 5400

cgcatacagc tcgataatct tttcagggct ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag 5460

gacgccatcg gcctcactca tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt caaagtgcag 5520

gacctttgga acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac 5580

atcataggtg gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc 5640

tcccaccagc ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta 5700

tttttcgatc agttttttca attccggtga tattctcatt ttagccattt attatttcct 5760

tcctcttttc tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa gacgaactcc 5820

aattcactgt tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg 5880

ttttcaaagt tggcgtataa catagtatcg acggagccga ttttgaaacc gcggtgatca 5940

caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt 6000

gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag 6060

tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat 6120

cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga 6180

tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt 6240

taatgtactg aattaacgcc gaattaattc gggggatctg gattttagta ctggattttg 6300

gttttaggaa ttagaaattt tattgataga agtattttac aaatacaaat acatactaag 6360

ggtttcttat atgctcaaca catgagcgaa accctatagg aaccctaatt cccttatctg 6420

ggaactactc acacattatt atggagaaac tcgagtcaaa tctcggtgac gggcaggacc 6480

ggacggggcg gtaccggcag gctgaagtcc agctgccaga aacccacgtc atgccagttc 6540

ccgtgcttga agccggccgc ccgcagcatg ccgcgggggg catatccgag cgcctcgtgc 6600

atgcgcacgc tcgggtcgtt gggcagcccg atgacagcga ccacgctctt gaagccctgt 6660

gcctccaggg acttcagcag gtgggtgtag agcgtggagc ccagtcccgt ccgctggtgg 6720

cggggggaga cgtacacggt cgactcggcc gtccagtcgt aggcgttgcg tgccttccag 6780

gggcccgcgt aggcgatgcc ggcgacctcg ccgtccacct cggcgacgag ccagggatag 6840

cgctcccgca gacggacgag gtcgtccgtc cactcctgcg gttcctgcgg ctcggtacgg 6900

aagttgaccg tgcttgtctc gatgtagtgg ttgacgatgg tgcagaccgc cggcatgtcc 6960

gcctcggtgg cacggcggat gtcggccggg cgtcgttctg ggctcatggt agactcgaga 7020

gagatagatt tgtagagaga gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac 7080

ttccttatat agaggaaggt cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc 7140

agtggagata tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc 7200

cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg 7260

aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac 7320

tgtccttttg atgaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat 7380

taccctttgt tgaaaagtct caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt 7440

cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac catgttatca catcaatcca cttgctttga 7500

agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt 7560

gggaccactg tcggcagagg catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca 7620

tttgtaggtg ccaccttcct tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca 7680

atggaatccg aggaggtttc ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg 7740

gtcttctgag actgtatctt tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat 7800

gttggcaagc tgctctagcc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 7860

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 7920

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 7980

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 8040

tacgaattcc cgatctagta acatagatga caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc 8100

gcgctatatt ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat tgcgggactc taatcataaa 8160

aacccatctc ataaataacg tcatgcatta catgttaatt attacatgct taacgtaatt 8220

caacagaaat tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact 8280

ttattgccaa atgtttgaac gatcggggaa attcgagctc gatgttacgt cctgtagaaa 8340

ccccaacccg tgaaatcaaa aaactcgacg gcctgtgggc attcagtctg gatcgcgaaa 8400

actgtggaat tgatcagcgt tggtgggaaa gcgcgttaca agaaagccgg gcaattgctg 8460

tgccaggcag ttttaacgat cagttcgccg atgcagatat tcgtaattat gcgggcaacg  8520

tctggtatca gcgcgaagtc tttataccga aaggttgggc aggccagcgt atcgtgctgc  8580

gtttcgatgc ggtcactcat tacggcaaag tgtgggtcaa taatcaggaa gtgatggagc  8640

atcagggcgg ctatacgcca tttgaagccg atgtcacgcc gtatgttatt gccgggaaaa  8700

gtgtacgtat caccgtttgt gtgaacaacg aactgaactg gcagactatc ccgccgggaa  8760

tggtgattac cgacgaaaac ggcaagaaaa agcagtctta cttccatgat ttctttaact  8820

atgccggaat ccatcgcagc gtaatgctct acaccacgcc gaacacctgg gtggacgata  8880

tcaccgtggt gacgcatgtc gcgcaagact gtaaccacgc gtctgttgac tggcaggtgg  8940

tggccaatgg tgatgtcagc gttgaactgc gtgatgcgga tcaacaggtg gttgcaactg  9000

gacaaggcac tagcgggact ttgcaagtgg tgaatccgca cctctggcaa ccgggtgaag  9060

gttatctcta tgaactgtgc gtcacagcca aaagccagag agtgtgatat ctacccgctt  9120

cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg  9180

ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat  9240

aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt  9300

acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg  9360

gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg  9420

ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg  9480

cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg  9540

tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca  9600

ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg  9660

ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt  9720

tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa  9780

gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg  9840

gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt  9900

gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag  9960

gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag 10020

aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg aagtcggcgg cttttctgct gcaaaaacgc 10080

tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg cagcagggag gatcctctag agtcgacctg 10140

cagaagtaac accaaacaac agggtgagca tcgacaaaag aaacagtacc aagcaaataa 10200

atagcgtatg aaggcagggc taaaaaaatc cacatatagc tgctgcatat gccatcatcc 10260

aagtatatca agatcaaaat aattataaaa catacttgtt tattataata gataggtact 10320

caaggttaga gcatatgaat agatgctgca tatgccatca tgtatatgca tcagtaaaac 10380

ccacatcaac atgtatacct atcctagatc gatatttcca tccatcttaa actcgtaact 10440

atgaagatgt atgacacaca catacagttc caaaattaat aaatacacca ggtagtttga 10500

aacagtattc tactccgatc tagaacgaat gaacgaccgc ccaaccacac cacatcatca 10560

caaccaagcg aacaaaaagc atctctgtat atgcatcagt aaaacccgca tcaacatgta 10620

tacctatcct agatcgatat ttccatccat catcttcaat tcgtaactat gaatatgtat 10680

ggcacacaca tacagatcca aaattaataa atccaccagg tagtttgaaa cagaattaat 10740

tctactccga tctagaacga ccgcccaacc agaccacatc atcacaacca agacaaaaaa 10800

aagcatgaaa agatgacccg acaaacaagt gcacggcata tattgaaata aaggaaaagg 10860

gcaaaccaaa ccctatgcaa cgaaacaaaa aaaatcatga aatcgatccc gtctgcggaa 10920

cggctagagc catcccagga ttccccaaag agaaacactg gcaagttagc aatcagaacg 10980

tgtctgacgt acaggtcgca tccgtgtacg aacgctagca gcacggatct aacacaaaca 11040

cggatctaac acaaacatga acagaagtag aactaccggg ccctaaccat ggaccggaac 11100

gccgatctag agaaggtaga gagggggggg gggggaggac gagcggcgta ccttgaagcg 11160

gaggtgccga cgggtggatt tgggggagat ctggttgtgt gtgtgtgcgc tccgaacaac 11220

acgaggttgg ggaaagaggg tgtggagggg gtgtctattt attacggcgg gcgaggaagg 11280

gaaagcgaag gagcggtggg aaaggaatcc cccgtagctg ccggtgccgt gagaggagga 11340

ggaggccgcc tgccgtgccg gctcacgtct gccgctccgc cacgcaattt ctggatgccg 11400

acagcggagc aagtccaacg gtggagcgga actctcgaga ggggtccaga ggcagcgaca 11460

gagatgccgt gccgtctgct tcgcttggcc cgacgcgacg ctgctggttc gctggttggt 11520

gtccgttaga ctcgtcgacg gcgtttaaca ggctggcatt atctactcga aacaagaaaa 11580

atgtttcctt agttttttta atttcttaaa gggtatttgt ttaattttta gtcactttat 11640

tttattctat tttatatcta aattattaaa taaaaaaact aaaatagagt tttagttttc 11700

ttaatttaga ggctaaaata gaataaaata gatgtactaa aaaaattagt ctataaaaac 11760

cattaaccct aaaccctaaa tggatgtact aataaaatgg atgaagtatt atataggtga 11820

agctatttgc aaaaaaaaag gagaacacat gcacactaaa aagataaaac tgtagagtcc 11880

tgttgtcaaa atactcaatt gtcctttaga ccatgtctaa ctgttcattt atatgattct 11940

ctaaaacact gatattattg tagtactata gattatatta ttcgtagagt aaagtttaaa 12000

tatatgtata aagatagata aactgcactt caaacaagtg tgacaaaaaa aatatgtggt 12060

aattttttat aacttagaca tgcaatgctc attatctcta gagaggggca cgaccgggtc 12120

acgctgcact gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 12180

gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 12240

cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 12300

gaatgctaga gcagcttgag cttggatcag attgtcgttt cccgccttca gtttaaacta 12360

tcagtgtttg acaggatata ttggcgggta aacctaagag aaaagagcgt ttattagaat 12420

aacggatatt taaaagggcg tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta tgtg       12474

Claims (4)

1.一种适合单子叶植物转化的中间表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.如权利要求1所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体的构建方法，包括下列步骤：

（1）克隆玉米Ubiquitin启动子Ubi-P，在启动子的上下游分别填加了Hind III和BamH I位点，用于扩增Ubi-P的引物为：Ubi-P HinFw:5'CCCAAGCTTGGGGCATGCCTGCAGTGCAGCGTGAC3'和Ubi-P BamRev:5'CGCGGATCCGCGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAA3'，以质粒pAHC17为模板，将扩增得到的Ubi-P与pMD18-T simple载体连接，得到载体pMD18-UP；

（2）克隆Nos终止子Nos-T，在终止子的上下游分别填加了Sac I和EcoR I位点，用于扩增Nos-T的引物为：Nos SacFw:5'CGAGCTCGGAATTTCCCCGATCGTTCA3'和Nos EcoRRev:5'CCGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT3'，以pBI121为模板，将扩增得到的Nos-T与pMD18-T simple载体连接，得到载体pMD18-NT；

（3）人工合成多克隆位点，利用BamH I和Sac I位点插入pCAMBIA3300，得到载体pCAM-NP；

（4）将载体pMD18-UP和载体pCAM-NP的质粒分别用Hind III和BamH I双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到载体pCAM-UP；

（5）将载体pMD18-NT和载体pCAM-UP的质粒分别用Sac I和EcoR I双酶切，回收目的片段和载体片段进行连接，得到中间表达载体pCAM-UPN。

3.如权利要求1所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体在基因转化中的应用。

4.如权利要求1所述的适合单子叶植物转化的中间表达载体在水稻和玉米遗传转化中的应用。