CN112501197A - 一种利用水稻内源序列抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用 - Google Patents

一种利用水稻内源序列抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用水稻内源序列抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用，以及一种干扰植物HIS1基因表达的方法和获得除草剂显性敏感植物的方法。将本发明的RNAi植物表达载体转化水稻，能够成功抑制水稻基因HIS1的表达，并将水稻从对除草剂具有抗性转变为敏感，使得敏感植株可以通过施用除草剂的方式被清除，从而培育了一种对除草剂显性敏感的水稻。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。

Description

一种利用水稻内源序列抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载 体及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种利用水稻内源序列抑制HPPD抑制剂敏感型1基因(HIS1)的植物表达载体和其构建方法和应用。
背景技术
转基因技术在各种农作物领域的应用越来越广泛，转基因产品需要加以严格的控制和监管，防止转基因漂移污染其他品种甚至其他物种就显得尤为重要。因此，需要建立一种能够定向清除杂交种子或转基因植株的机制。培育获得除草剂敏感的不育系或恢复系是解决问题的有效手段之一。
β-三酮类除草剂(b-Triketone herbicides,bTHs)是4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂，广泛应用于农业，可有效地防除多种阔叶杂草和禾本科杂草。用于稻田中杂草控制的bTH双环磺草酮(benzobicyclon,BBC)，对于可以对抗其他类型除草剂(包括磺酰脲)的稻杂草有明显功效(Kraehmer,et al."Herbicides as Weed Control Agents:Stateof the Art:I.Weed Control Research and Safener Technology:The Path to ModernAgriculture."Plant Physiology(2014).)。因此，β-三酮类除草剂常用于清除稻田的大多数阔叶类杂草和禾本科杂草，而研究表明，水稻对BBC的抗性候选基因为HIS1(HPPD抑制剂敏感型1)。HIS1编码351个氨基酸的Fe(II)/2-酮戊二酸依赖型加氧酶蛋白，BBC敏感型品种的第Ⅳ外显子缺失28bp，造成功能缺失(Maeda,Hideo,et al."A rice gene that confersbroad-spectrum resistance to β-triketone herbicides."ence 365.6451(2019):393-396.)。若能培育出对β-三酮类除草剂显性敏感的水稻，将会在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够有效抑制HPPD抑制剂敏感型1基因(HIS1)表达的植物表达载体及其构建方法。
为达到以上目的，本发明提供了一种抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体，该载体含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。
其中，SEQ ID No.1所示的DNA片段为基于HIS1编码框的长度为243bp的正向DNA片段，SEQ ID No.3所示的DNA片段为基于HIS1编码框的长度为243bp的与SEQ ID No.1所示的DNA片段反向互补的DNA片段。SEQ ID No.2为来自水稻Zinc finger基因的内含子序列(Rice intron)。
SEQ ID No.1-3所示的DNA片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发卡结构表达盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构，SEQ ID No.2所示的DNA片段形成发卡的“环”，SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”。
其中，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子。
其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、Rubisco小亚基启动子、Cab启动子、CAMV 35S启动子或Actin启动子。优选的，当启动子为水稻或玉米的Ubi启动子时，能够取得非常强的干扰HIS1基因表达的效果。
所述终止子包括：NOS终止子，Ubi终止子等在植物中可以终止基因转录的DNA序列。优选的，所述终止子为NOS终止子。
所述RNAi植物表达载体还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子，CAMV 35S启动子或Actin启动子，优选的，当启动子为CAMV 35S启动子时，能够取得良好的驱动选择标记基因在植物中超量表达的效果。所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子，优选为NOS终止子。
所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、荧光标记基因(如荧光蛋白基因)、抗生素标记基因(可供筛选的抗生素标记如潮霉素、庆大霉素、卡那霉素基因)、除草剂筛选标记基因(如抗草甘膦基因、抗双草醚基因等)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因等)。特别优选的，所述标记基因为潮霉素基因。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述的RNAi植物表达载体是将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HIS1i-4。
特别优选的，所述的RNAi植物表达载体，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
其中，所述植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。
值得注意的是，用于RNAi植物表达载体构建的中间载体和具有选择标记基因的RNAi表达载体，工程菌、细胞、愈伤组织、转基因苗、种子等均属于本发明的保护范围。
本发明的另一个方面还提供了一种RNAi植物表达载体的构建方法，包括将SEQ IDNo.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体上。
本发明一个优选的实施例是将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HIS1i-4。
具体的，所述方法可以按照以下步骤进行：
(1)设计3对引物，分别扩增SEQ ID No.1-3所示的DNA片段其中相邻的两个片段上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与片段或载体相应连接位置重复，以便利用GibsonAssembly重组连接
HIS1i-4-F:ATCGGGGAAATTCGAGCTcGTAATGTGCAATGGCATCTTCAGGA(SEQ ID No.5)
HIS1i-4-Rv1:GAGATTTTCATCAGATCCTCAGGGAGTCGATGT(SEQ ID No.6)
HIS1i-4-F2:CTGAGGATCTGATGAAAATCTCGAAACAGCCGTGT(SEQ ID No.7)
HIS1i-4-Rv2:CTGAGGATCTGAGGTAAGTTACTACAAACCTTTTTGTATTTATGTTCC(SEQ IDNo.8)
HIS1i-4-F3:AGTAACTTACCTCAGATCCTCAGGGAGTCGATGT(SEQ ID No.9)
HIS1i-4-Rv:CTGCAGGTCGACTCTAGAGgatccGTAATGTGCAATGGCATCTTCAGGA(SEQ IDNo.10)
(2)RNAi植物表达载体的构建与转化
以水稻cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HIS1i-4基因片段1和3。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002835456970000031
Figure BDA0002835456970000041
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002835456970000042
以水稻DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HIS1i-4基因片段2。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002835456970000043
获得PCR产物片段，回收后，分别命名为HIS1i-4-1(SEQ ID No.1所示序列)、HIS1i-4-2(SEQ ID No.2所示序列)及HIS1i-4-3(SEQ ID No.3所示序列)。用SacⅠ+BamHⅠ酶切植物双元转化载体pTCK303，将目的片段HIS1i-4-1、HIS1i-4-2及HIS1i-4-3直接连入经酶切的pTCK303质粒，获得载体pTCK303-HIS1i-4。
本发明还提供了一种本发明所述的RNAi植物表达载体在干扰植物HIS1基因表达、制备对β-三酮类除草剂显性敏感植物中的应用。
本发明的RNAi植物表达载体可通过农杆菌介导遗传转化法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
优选的，所述应用包括将pTCK303-HIS1i-4导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织。所述愈伤组织可以为花药诱导的愈伤组织、成熟胚诱导的愈伤组织、幼胚诱导的愈伤组织、幼穗诱导的愈伤组织。
本发明的一个方面还提供了一种获得对β-三酮类除草剂显性敏感植物的方法，包括将所述RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物HPPD抑制剂敏感型1基因HIS1表达。
在本发明的一种实施方式中，所述获得除草剂显性敏感植物的方法包括：
(1)构建RNAi植物表达载体：将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HIS1i-4；
(2)转化：将pTCK303-HIS1i-4导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化获得除草剂显性敏感植物。
其中，所述RNAi植物表达载体pTCK303-HIS1i-4具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
其中，所述除草剂可以为β-三酮类除草剂。所述植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。
本发明所述的β-三酮类除草剂包括但不限于甲基磺草酮、双环磺草酮。本发明的实施例中，验证发现筛选双环磺草酮敏感转基因株系的最低浓度为1000mg/L双环磺草酮，筛选甲基磺草酮敏感转基因株系的最低浓度为6mg/L甲基磺草酮。
本发明提供了所述RNAi植物表达载体在培育转基因新品种、杂交水稻制种或防止转基因逃逸中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明基于RNAi技术，通过筛选构建了一个针对水稻HIS1基因的植物双元转基因载体，该载体可高效的抑制HIS1基因，且其序列完全为水稻内源序列，可有效消除公众对于外源基因转基因引起的风险和担忧。将该载体转化水稻，成功抑制了HIS1基因的表达，并将水稻从对β-三酮类除草剂具有抗性转变为敏感，从而培育了一种对β-三酮类除草剂显性敏感的水稻。使得转基因植株可以通过施用除草剂的方式被清除。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有非常重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明3个DNA片段HIS1i-4-1、HIS1i-4-2及HIS1i-4-3的片段扩增回收电泳图；其中1-6泳道为HIS1i-4-1目的片段；7-12泳道为HIS1i-4-2目的片段；13-18泳道为HIS1i-4-3目的片段。
图2为本发明pTCK303骨架载体酶切回收电泳图；其中CK为pTCK303骨架载体作为对照；1-2泳道为Sac I/BamH I双酶切pTCK303骨架载体。
图3为本发明pTCK303-HIS1i-4载体经SacⅠ和BamHⅠ酶切的电泳图；图中CK为pTCK303-HIS1i-4单克隆重组质粒；泳道1-4分别为酶切的单克隆重组质粒，M为marker，所切出的片段大小964bp，包括目的片段的正向、反向互补序列及水稻内含子序列。
图4为本发明转基因株系潮霉素抗性基因PCR检测电泳图；泳道1，H2O；泳道2阴性对照(中花11非转基因植株)；泳道3，阳性对照(pTCK303-HIS1i-4质粒)；泳道4-24，转基因株系(其中泳道4、5、10、11、12、13、22为转基因阴性株系)；M，Marker。
图5为本发明pTCK303-HIS1i-4转基因T0代三叶期幼苗对2250mg/L双环磺草酮溶液敏感度测试14d；图中，WT为ZH11非转基因植株；整株枯萎为高度敏感株系；叶片发白，叶尖枯黄为中度敏感株系；无反应为抗性株系。
图6为本发明pTCK303-HIS1i-4转基因T0代三叶期幼苗叶片对15mg/L甲基磺草酮溶液敏感度测试14d；WT为ZH11非转基因植株，102-1及103-1为敏感株系。
图7为对比例1中将环序列替换为SEQ ID No.11所示序列后，构建RNAi载体后转基因苗喷施6000mg/L双环磺草酮14d结果；箭头所指为敏感株系。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1菌株、质粒的获得及PCR引物的合成
(1)菌株和质粒
作为骨架载体的植物双元转化载体pTCK303包含潮霉素抗性基因、玉米Ubi启动子及NOS终止子。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为DH5α；农杆菌(Agrobacterimtumefacieus)菌株为EHA105。
(2)PCR引物序列
设计3对引物，分别扩增SEQ ID No.1-3所示的DNA片段其中相邻的两个片段上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与片段或载体相应连接位置重复，以便利用GibsonAssembly重组连接。
设计得到的引物组合序列信息如下：
HIS1i-4-F:ATCGGGGAAATTCGAGCTcGTAATGTGCAATGGCATCTTCAGGA(SEQ ID No.5)
HIS1i-4-Rv1:GAGATTTTCATCAGATCCTCAGGGAGTCGATGT(SEQ ID No.6)
HIS1i-4-F2:CTGAGGATCTGATGAAAATCTCGAAACAGCCGTGT(SEQ ID No.7)
HIS1i-4-Rv2:CTGAGGATCTGAGGTAAGTTACTACAAACCTTTTTGTATTTATGTTCC(SEQ IDNo.8)
HIS1i-4-F3:AGTAACTTACCTCAGATCCTCAGGGAGTCGATGT(SEQ ID No.9)
HIS1i-4-Rv:CTGCAGGTCGACTCTAGAGgatccGTAATGTGCAATGGCATCTTCAGGA(SEQ IDNo.10)
实施例2 RNAi植物表达载体的构建与转化
(1)为了构建HPPD抑制剂敏感型1基因HIS1的干扰载体，以水稻cDNA为模板，利用实施例1的引物进行PCR扩增HIS1i-4基因片段1和3。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环，72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002835456970000071
Figure BDA0002835456970000081
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环，72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002835456970000082
(2)以水稻DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HIS1i-4基因片段2。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环，72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002835456970000083
(3)经琼脂糖凝胶电泳后，利用
Figure BDA0002835456970000084
Gel Extraction kit(Omega,下同)回收PCR产物片段，大小分别为243bp、478bp及243bp，分别命名为HIS1i-4-1、HIS1i-4-2及HIS1i-4-3见图1。用Sac I+BamH I对载体质粒pTCK303进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，利用
Figure BDA0002835456970000085
Gel Extraction kit(Omega,下同)回收14kb左右大小条带，得到pTCK303线性片段见图2。
SacI+BamHI双酶切反应体系如下：
Figure BDA0002835456970000091
(4)2x Lightening Cloning Kit连接试剂盒
Figure BDA0002835456970000092
连接HIS1i-4-1、HIS1i-4-2及HIS1i-4-3三个片段到pTCK303载体上，连接体系如下：
Figure BDA0002835456970000093
连接程序：50℃30min。
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，重组质粒经SacⅠ和BamHⅠ双酶切，目的片段大小符合预期，见图3，并将重组子送测序验证正确，即以水稻Zinc finger基因内含子(Rice intron)为环，构建的HIS1i-4RNAi载体，将此载体命名为pTCK303-HIS1i-4。
实施例3农杆菌转化水稻及转基因植株鉴定
将pTCK303-HIS1i-4重组质粒导入农杆菌EHA105菌株，并转化粳稻中花11愈伤组织，经潮霉素抗性筛选，分化，生根获得再生转基因株系21株，通过PCR鉴定转基因植株中转入的潮霉素抗性基因，结果显示，PCR阳性植株14株(图4)，将阳性植株移栽至泥土中，成活14株。
实施例4水稻β-三酮类除草剂双环磺草酮敏感与抗性转基因株系的获得
为了检测所设计干扰载体片段在转基因植株中的效果，用25％双环磺草酮母液(日本史迪士生物科学株式会社，批号2019050603)配制1000mg/L～4500mg/L双环磺草酮溶液，喷施实施例3获得的pTCK303-HIS1i-4转基因T0代三叶期幼苗，喷后连续观察。
双环磺草酮2250mg/L喷施HIS1i-4转基因10个株系，喷施后14d，有8个株系出现叶片整片发白至枯萎，属于高度敏感株系；有1个株系均出现叶片发白至叶尖枯黄，属于中敏感株系；有1个株系出现个别叶片发白，属于低敏感株系(图5)。
进一步使用低浓度双环磺草酮1000mg/L喷施HIS1i-4转基因5个株系，喷施后14d，有3个株系出现叶片发白至枯萎，属于高度敏感株系；有1个株系出现叶片发白至叶尖枯黄，属于中敏感株系；有1个株系出现个别叶尖枯黄，属于低敏感或不敏感株系。以上结果表明，我们成功获得了除草剂显性敏感的转基因材料。
实施例5水稻甲基磺草酮(硝磺草酮)敏感与抗性转基因株系的获得
为了检测所设计干扰载体片段在转基因植株中的效果，用甲基磺草酮母液(江苏丰山集团股份有限公司，批号20190119004)配制6mg/L～750mg/L甲基磺草酮溶液，喷施实施例3获得的pTCK303-HIS1i-4转基因T0代三叶期幼苗，喷后连续观察。
甲基磺草酮15mg/L喷施HIS1i-4转基因4个株系叶片，喷施后7d，HIS1i-4转基因T0代幼苗部分株系叶片叶尖微卷曲，叶片些许发白；喷施后14d，有2个株系出现叶片发白至枯黄，属于高度敏感株系(图6)；有2个株系喷施前后叶片反应不明显，属于抗性株系。
进一步使用低浓度甲基磺草酮溶液6mg/L喷施HIS1i-4转基因4个株系叶片，喷施后14d，有1个株系出现叶片发白至枯萎，属于高度敏感株系。
以上结果表明，我们成功获得了除草剂显性敏感的转基因材料。
对比例1
为测试不同茎环对干扰效率的影响，将SEQ ID No.2内含子序列缩短至300bp后(见SEQ ID No.11)，构建载体并转化中花11制备获得转基因株系。
对上述转基因株系分别喷施浓度2250mg/L-4500mg/L双环磺草酮，结果却发现转基因株系表现出较高的抗性。当对双环磺草酮喷施6000mg/L以上浓度才有敏感表型，且敏感株系比例低，表明按照此方法设计茎环的OsHIS1i对HIS1基因的干扰效率较差。此方法设计的OsHIS1i转基因株系T0代3-5叶期幼苗对6000mg/L双环磺草酮测试结果见图7。
对比例2
进一步将SEQ ID No.2内含子序列缩短至240bp后(见SEQ ID No.12)，构建载体并转化中花11制备获得转基因株系。对上述转基因株系分别喷施高浓度双环磺草酮，结果发现转基因株系也表现出较高的抗性，其结果与对比例1中类似，表明按照此方法设计茎环的OsHIS1i对HIS1基因的干扰效率较差。
除了上述2个对比例，本发明在研究过程中，针对OsHIS1基因内含子序列选择了全内含子序列、以及OsHIS1基因内含子序列中不同截短大小的序列期望与SEQ ID No.1和3所示的DNA片段形成发卡结构，但发现这些内含子序列所示的DNA片段无法形成发卡的“环”或所形成茎环结构效率很差，进而使得它们在替换本发明SEQ ID No.2所示序列后，不能使SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”最终被顺利在体内形成双链短RNA。这充分说明了，本发明SEQ ID No.2内含子序列与SEQ ID No.1和3所示的DNA片段形成发卡结构，构建得到的植物表达载体，能够很好地抑制HIS1基因，干扰效率高，使转基因植株表现出对β-三酮类除草剂表现出显著的敏感性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司
<120> 一种利用水稻内源序列抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用
<130> KHP201115213.6
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtaatgtgca atggcatctt caggagcccg gtgcacaggg tggtgacaaa cgccgagaag 60
gagaggatct ccctggccat gttatacagc gtgaacgatg agaaagacat tgagccggcg 120
gctggtttgc tggatgagaa tcggcctgca agatacagga aagtgagcgt cgaagagttc 180
agggccggga tctttggaaa attctctcga ggagagaggt acatcgactc cctgaggatc 240
tga 243
<210> 2
<211> 478
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgaaaatctc gaaacagccg tgtcatagtc aatcattagg tgttatagga acaatcaaag 60
gttttttcaa gtgttaatct tcatactaat atatacagtg ggtactcttt atctactgcc 120
gtggaactgt catatttgat tatgaaattt tagctctaga aaatatttga tcatcaatgt 180
caagacttta tgaccttgca aaatacattt cctaattgag aacagggtaa aattatgaac 240
tatgcctctg aaccttcata cacaggcagc acattttttg ttgtaaaatt catcttaata 300
tcagcggaaa gactggacca gagaaagaaa aagttaagac aggcatatac tcttgatcct 360
ctaaaagaga tgaggcggta caatgatcaa ccatgaacat taaagtgata cgtggaacat 420
gagaacacaa ataattgtca ctggaacata aatacaaaaa ggtttgtagt aacttacc 478
<210> 3
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcagatcctc agggagtcga tgtacctctc tcctcgagag aattttccaa agatcccggc 60
cctgaactct tcgacgctca ctttcctgta tcttgcaggc cgattctcat ccagcaaacc 120
agccgccggc tcaatgtctt tctcatcgtt cacgctgtat aacatggcca gggagatcct 180
ctccttctcg gcgtttgtca ccaccctgtg caccgggctc ctgaagatgc cattgcacat 240
tac 243
<210> 4
<211> 15034
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catggtagat ctgagggtaa atttctagtt tttctccttc attttcttgg ttaggaccct 60
tttctctttt tatttttttg agctttgatc tttctttaaa ctgatctatt ttttaattga 120
ttggttatgg tgtaaatatt acatagcttt aactgataat ctgattactt tatttcgtgt 180
gtctatgatg atgatgatag ttacagaacc gacgactcgt ccgtcctgta gaacgtgaaa 240
tcaaaaaact cgacggcctg tgggcattca gtctggatcg cgaaaactgt ggaattgatc 300
agcgttggtg ggaaagcgcg ttacaagaaa gccgggcaat tgctgtgcca ggcagtttta 360
acgatcagtt cgccgatgca gatattcgta attatgcggg caacgtctgg tatcagcgcg 420
aagtctttat accgaaaggt tgggcaggcc agcgtatcgt gctgcgtttc gatgcggtca 480
ctcattacgg caaagtgtgg gtcaataatc aggaagtgat ggagcatcag ggcggctata 540
cgccatttga agccgatgtc acgccgtatg ttattgccgg gaaaagtgta cgtatcaccg 600
tttgtgtgaa caacgaactg aactggcaga ctatcccgcc gggaatggtg attaccgacg 660
aaaacggcaa gaaaaagcag tcttacttcc atgatttctt taactatgcc ggaatccatc 720
gcagcgtaat gctctacacc acgccgaaca cctgggtgga cgatatcacc gtggtgacgc 780
atgtcgcgca agactgtaac cacgcgtctg ttgactggca ggtggtggcc aatggtgatg 840
tcagcgttga actgcgtgat gcggatcaac aggtggttgc aactggacaa ggcactagcg 900
ggactttgca agtggtgaat ccgcacctct ggcaaccggg tgaaggttat ctctatgaac 960
tgtgcgtcac agccaaaagc cagacagagt gtgatatcta cccgcttcgc gtcggcatcc 1020
ggtcagtggc agtgaagggc gaacagttcc tgattaacca caaaccgttc tactttactg 1080
gctttggtcg tcatgaagat gcggacttac gtggcaaagg attcgataac gtgctgatgg 1140
tgcacgacca cgcattaatg gactggattg gggccaactc ctaccgtacc tcgcattacc 1200
cttacgctga agagatgctc gactgggcag atgaacatgg catcgtggtg attgatgaaa 1260
ctgctgctgt cggctttaac ctctctttag gcattggttt cgaagcgggc aacaagccga 1320
aagaactgta cagcgaagag gcagtcaacg gggaaactca gcaagcgcac ttacaggcga 1380
ttaaagagct gatagcgcgt gacaaaaacc acccaagcgt ggtgatgtgg agtattgcca 1440
acgaaccgga tacccgtccg caagtgcacg ggaatatttc gccactggcg gaagcaacgc 1500
gtaaactcga cccgacgcgt ccgatcacct gcgtcaatgt aatgttctgc gacgctcaca 1560
ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc tgtgcctgaa ccgttattac ggatggtatg 1620
tccaaagcgg cgatttggaa acggcagaga aggtactgga aaaagaactt ctggcctggc 1680
aggagaaact gcatcagccg attatcatca ccgaatacgg cgtggatacg ttagccgggc 1740
tgcactcaat gtacaccgac atgtggagtg aagagtatca gtgtgcatgg ctggatatgt 1800
atcaccgcgt ctttgatcgc gtcagcgccg tcgtcggtga acaggtatgg aatttcgccg 1860
attttgcgac ctcgcaaggc atattgcgcg ttggcggtaa caagaaaggg atcttcactc 1920
gcgaccgcaa accgaagtcg gcggcttttc tgctgcaaaa acgctggact ggcatgaact 1980
tcggtgaaaa accgcagcag ggaggcaaac aagctagcca ccaccaccac caccacgtgt 2040
gaattacagg tgaccagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 2100
ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 2160
gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg 2220
attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac 2280
taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt aaactatcag 2340
tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg 2400
gatatttaaa agggcgtgaa aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc 2460
acagggttcc cctcgggatc aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct atagtgcagt 2520
cggcttctga cgttcagtgc agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca agtcctaagt 2580
tacgcgacag gctgccgccc tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt gttttagtcg 2640
cataaagtag aatacttgcg actagaaccg gagacattac gccatgaaca agagcgccgc 2700
cgctggcctg ctgggctatg cccgcgtcag caccgacgac caggacttga ccaaccaacg 2760
ggccgaactg cacgcggccg gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca ccggcaccag 2820
gcgcgaccgc ccggagctgg ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg acgttgtgac 2880
agtgaccagg ctagaccgcc tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca ttgccgagcg 2940
catccaggag gccggcgcgg gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg acaccaccac 3000
gccggccggc cgcatggtgt tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg agcgttccct 3060
aatcatcgac cgcacccgga gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg tgaagtttgg 3120
cccccgccct accctcaccc cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga tcgaccagga 3180
aggccgcacc gtgaaagagg cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga ccctgtaccg 3240
cgcacttgag cgcagcgagg aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg gtgccttccg 3300
tgaggacgca ttgaccgagg ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac gccaagagga 3360
acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc 3420
gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg 3480
cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc 3540
ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac 3600
agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag 3660
gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca 3720
tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt 3780
ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg 3840
ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact 3900
tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag 3960
ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc 4020
tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg 4080
tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg 4140
ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg 4200
ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc 4260
aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat 4320
gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc 4380
aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc 4440
ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct 4500
gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa atgagtagat 4560
gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc accgacgccg 4620
tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc tgggttgtct 4680
gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga cggtcgcaaa 4740
ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 4800
gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 4860
caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 4920
tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 4980
gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 5040
cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 5100
tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 5160
tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 5220
gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 5280
cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 5340
cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 5400
agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 5460
gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 5520
cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 5580
gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 5640
gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 5700
ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 5760
cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 5820
caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 5880
attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 5940
tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 6000
tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 6060
ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 6120
tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 6180
ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 6240
cggcgcccac atcaaggcac cctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 6300
acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 6360
agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc 6420
acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg 6480
agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 6540
aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 6600
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 6660
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 6720
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 6780
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 6840
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 6900
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 6960
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 7020
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 7080
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 7140
tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 7200
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 7260
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 7320
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 7380
attttggtca tgcattctag gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata atattttatt 7440
ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata ctgttcttcc 7500
ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt gtccgccctg 7560
ccgcttctcc caagatcaat aaagccactt actttgccat ctttcacaaa gatgttgctg 7620
tctcccaggt cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt ctttaaaaaa 7680
tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc gcaatccaca 7740
tcggccagat cgttattcag taagtaatcc aattcggcta agcggctgtc taagctattc 7800
gtatagggac aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc cgcatacagc 7860
tcgataatct tttcagggct ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag gacgccatcg 7920
gcctcactca tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt caaagtgcag gacctttgga 7980
acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac atcataggtg 8040
gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc tcccaccagc 8100
ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta tttttcgatc 8160
agttttttca attccggtga tattctcatt ttagccattt attatttcct tcctcttttc 8220
tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa gacgaactcc aattcactgt 8280
tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg ttttcaaagt 8340
tggcgtataa catagtatcg acggagccga ttttgaaacc gcggtgatca caggcagcaa 8400
cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt gtttcaaacc 8460
cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag tctgccgcct 8520
tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat cgagtggtga 8580
ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga tatattgtgg 8640
tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt taatgtactg 8700
aattaacgcc gaattaattc gggggatctg gattttagta ctggattttg gttttaggaa 8760
ttagaaattt tattgataga agtattttac aaatacaaat acatactaag ggtttcttat 8820
atgctcaaca catgagcgaa accctatagg aaccctaatt cccttatctg ggaactactc 8880
acacattatt atggagaaac tcgagcttgt cgatcgacag atccggtcgg catctactct 8940
atttctttgc cctcggacga gtgctggggc gtcggtttcc actatcggcg agtacttcta 9000
cacagccatc ggtccagacg gccgcgcttc tgcgggcgat ttgtgtacgc ccgacagtcc 9060
cggctccgga tcggacgatt gcgtcgcatc gaccctgcgc ccaagctgca tcatcgaaat 9120
tgccgtcaac caagctctga tagagttggt caagaccaat gcggagcata tacgcccgga 9180
gtcgtggcga tcctgcaagc tccggatgcc tccgctcgaa gtagcgcgtc tgctgctcca 9240
tacaagccaa ccacggcctc cagaagaaga tgttggcgac ctcgtattgg gaatccccga 9300
acatcgcctc gctccagtca atgaccgctg ttatgcggcc attgtccgtc aggacattgt 9360
tggagccgaa atccgcgtgc acgaggtgcc ggacttcggg gcagtcctcg gcccaaagca 9420
tcagctcatc gagagcctgc gcgacggacg cactgacggt gtcgtccatc acagtttgcc 9480
agtgatacac atggggatca gcaatcgcgc atatgaaatc acgccatgta gtgtattgac 9540
cgattccttg cggtccgaat gggccgaacc cgctcgtctg gctaagatcg gccgcagcga 9600
tcgcatccat agcctccgcg accggttgta gaacagcggg cagttcggtt tcaggcaggt 9660
cttgcaacgt gacaccctgt gcacggcggg agatgcaata ggtcaggctc tcgctaaact 9720
ccccaatgtc aagcacttcc ggaatcggga gcgcggccga tgcaaagtgc cgataaacat 9780
aacgatcttt gtagaaacca tcggcgcagc tatttacccg caggacatat ccacgccctc 9840
ctacatcgaa gctgaaagca cgagattctt cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga 9900
cgctgtcgaa cttttcgatc agaaacttct cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt 9960
tcatatctca ttgccccccc ggatctgcga aagctcgaga gagatagatt tgtagagaga 10020
gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac ttccttatat agaggaaggt 10080
cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata tcacatcaat 10140
ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg 10200
ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg aacgatagcc tttcctttat 10260
cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac tgtccttttg atgaagtgac 10320
agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct 10380
caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt 10440
cgtgctccac catgttatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt 10500
ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg 10560
catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca tttgtaggtg ccaccttcct 10620
tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc 10680
ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag actgtatctt 10740
tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat gttggcaagc tgctctagcc 10800
aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag 10860
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca 10920
ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag 10980
cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgaattcc ccgatctagt 11040
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 11100
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 11160
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 11220
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 11280
cgatcgggga aattcgagct cgtaatgtgc aatggcatct tcaggagccc ggtgcacagg 11340
gtggtgacaa acgccgagaa ggagaggatc tccctggcca tgttatacag cgtgaacgat 11400
gagaaagaca ttgagccggc ggctggtttg ctggatgaga atcggcctgc aagatacagg 11460
aaagtgagcg tcgaagagtt cagggccggg atctttggaa aattctctcg aggagagagg 11520
tacatcgact ccctgaggat ctgatgaaaa tctcgaaaca gccgtgtcat agtcaatcat 11580
taggtgttat aggaacaatc aaaggttttt tcaagtgtta atcttcatac taatatatac 11640
agtgggtact ctttatctac tgccgtggaa ctgtcatatt tgattatgaa attttagctc 11700
tagaaaatat ttgatcatca atgtcaagac tttatgacct tgcaaaatac atttcctaat 11760
tgagaacagg gtaaaattat gaactatgcc tctgaacctt catacacagg cagcacattt 11820
tttgttgtaa aattcatctt aatatcagcg gaaagactgg accagagaaa gaaaaagtta 11880
agacaggcat atactcttga tcctctaaaa gagatgaggc ggtacaatga tcaaccatga 11940
acattaaagt gatacgtgga acatgagaac acaaataatt gtcactggaa cataaataca 12000
aaaaggtttg tagtaactta cctcagatcc tcagggagtc gatgtacctc tctcctcgag 12060
agaattttcc aaagatcccg gccctgaact cttcgacgct cactttcctg tatcttgcag 12120
gccgattctc atccagcaaa ccagccgccg gctcaatgtc tttctcatcg ttcacgctgt 12180
ataacatggc cagggagatc ctctccttct cggcgtttgt caccaccctg tgcaccgggc 12240
tcctgaagat gccattgcac attacggatc ctctagagtc gacctgcaga agtaacacca 12300
aacaacaggg tgagcatcga caaaagaaac agtaccaagc aaataaatag cgtatgaagg 12360
cagggctaaa aaaatccaca tatagctgct gcatatgcca tcatccaagt atatcaagat 12420
caaaataatt ataaaacata cttgtttatt ataatagata ggtactcaag gttagagcat 12480
atgaatagat gctgcatatg ccatcatgta tatgcatcag taaaacccac atcaacatgt 12540
atacctatcc tagatcgata tttccatcca tcttaaactc gtaactatga agatgtatga 12600
cacacacata cagttccaaa attaataaat acaccaggta gtttgaaaca gtattctact 12660
ccgatctaga acgaatgaac gaccgcccaa ccacaccaca tcatcacaac caagcgaaca 12720
aaaagcatct ctgtatatgc atcagtaaaa cccgcatcaa catgtatacc tatcctagat 12780
cgatatttcc atccatcatc ttcaattcgt aactatgaat atgtatggca cacacataca 12840
gatccaaaat taataaatcc accaggtagt ttgaaacaga attctactcc gatctagaac 12900
gaccgcccaa ccagaccaca tcatcacaac caagacaaaa aaaagcatga aaagatgacc 12960
cgacaaacaa gtgcacggca tatattgaaa taaaggaaaa gggcaaacca aaccctatgc 13020
aacgaaacaa aaaaaatcat gaaatcgatc ccgtctgcgg aacggctaga gccatcccag 13080
gattccccaa agagaaacac tggcaagtta gcaatcagaa cgtgtctgac gtacaggtcg 13140
catccgtgta cgaacgctag cagcacggat ctaacacaaa cacggatcta acacaaacat 13200
gaacagaagt agaactaccg ggccctaacc atggaccgga acgccgatct agagaaggta 13260
gagagggggg gggggggagg acgagcggcg taccttgaag cggaggtgcc gacgggtgga 13320
tttgggggag atctggttgt gtgtgtgtgc gctccgaaca acacgaggtt ggggaaagag 13380
ggtgtggagg gggtgtctat ttattacggc gggcgaggaa gggaaagcga aggagcggtg 13440
ggaaaggaat cccccgtagc tgccggtgcc gtgagaggag gaggaggccg cctgccgtgc 13500
cggctcacgt ctgccgctcc gccacgcaat ttctggatgc cgacagcgga gcaagtccaa 13560
cggtggagcg gaactctcga gaggggtcca gaggcagcga cagagatgcc gtgccgtctg 13620
cttcgcttgg cccgacgcga cgctgctggt tcgctggttg gtgtccgtta gactcgtcga 13680
cggcgtttaa caggctggca ttatctactc gaaacaagaa aaatgtttcc ttagtttttt 13740
taatttctta aagggtattt gtttaatttt tagtcacttt attttattct attttatatc 13800
taaattatta aataaaaaaa ctaaaataga gttttagttt tcttaattta gaggctaaaa 13860
tagaataaaa tagatgtact aaaaaaatta gtctataaaa accattaacc ctaaacccta 13920
aatggatgta ctaataaaat ggatgaagta ttatataggt gaagctattt gcaaaaaaaa 13980
aggagaacac atgcacacta aaaagataaa actgtagagt cctgttgtca aaatactcaa 14040
ttgtccttta gaccatgtct aactgttcat ttatatgatt ctctaaaaca ctgatattat 14100
tgtagtacta tagattatat tattcgtaga gtaaagttta aatatatgta taaagataga 14160
taaactgcac ttcaaacaag tgtgacaaaa aaaatatgtg gtaatttttt ataacttaga 14220
catgcaatgc tcattatctc tagagagggg cacgaccggg tcacgctgca caagcttggc 14280
actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg 14340
ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg 14400
cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatgctag agcagcttga gcttggatca 14460
gattgtcgtt tcccgccttc agtttagctt catggagtca aagattcaaa tagaggacct 14520
aacagaactc gccgtaaaga ctggcgaaca gttcatacag agtctcttac gactcaatga 14580
caagaagaaa atcttcgtca acatggtgga gcacgacaca cttgtctact ccaaaaatat 14640
caaagataca gtctcagaag accaaagggc aattgagact tttcaacaaa gggtaatatc 14700
cggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac tttattgtga agatagtgga 14760
aaaggaaggt ggctcctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcca tcgttgaaga 14820
tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa 14880
agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgatatct ccactgacgt 14940
aagggatgac gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc 15000
atttcatttg gagagaacac gggggactct tgac 15034
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcggggaaa ttcgagctcg taatgtgcaa tggcatcttc agga 44
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagattttca tcagatcctc agggagtcga tgt 33
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgaggatct gatgaaaatc tcgaaacagc cgtgt 35
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgaggatct gaggtaagtt actacaaacc tttttgtatt tatgttcc 48
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtaacttac ctcagatcct cagggagtcg atgt 34
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgcaggtcg actctagagg atccgtaatg tgcaatggca tcttcagga 49
<210> 11
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgaaaatctc gaaacagccg tgtcatagtc aatcattagg tgttatagga acaatcaaag 60
gttttttcaa gtgttaatct tcatactaat atatacagtg ggtactcttt atctactgcc 120
gtggaactgt catatttgat tatgaaattt tagctctaga aaatatttga tcatcaatgt 180
caagacttta tgaccttgca aaatacattt cctaattgag aacagggtaa aattatgaac 240
tatgcctctg aaccttcata cacaggcagc acattttttg ttgtaaaatt catcttaata 300
<210> 12
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgaaaatctc gaaacagccg tgtcatagtc aatcattagg tgttatagga acaatcaaag 60
gttttttcaa gtgttaatct tcatactaat atatacagtg ggtactcttt atctactgcc 120
gtggaactgt catatttgat tatgaaattt tagctctaga aaatatttga tcatcaatgt 180
caagacttta tgaccttgca aaatacattt cctaattgag aacagggtaa aattatgaac 240

Claims (10)

1.一种抑制HPPD抑制剂敏感型1基因表达的RNAi植物表达载体，其特征在于，含有发卡结构表达盒；所述发卡结构表达盒含有SEQ ID NO.1-3所示DNA序列形成的发卡结构。
2.根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，所述发卡结构表达盒的启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、Rubisco小亚基启动子、Cab启动子、CAMV 35S启动子或Actin启动子中的一种；优选地，启动子为水稻或玉米的Ubi启动子。
3.根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV 35S启动子，或Actin启动子；所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因、荧光标记基因、抗生素标记基因、除草剂筛选标记基因或抗化学试剂标记基因，所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子。
4.根据权利要求1-3中任一所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
5.含有权利要求1-4任一所述的RNAi植物表达载体的生物材料，所述生物材料为工程菌、细胞、愈伤组织、植株、种子。
6.根据权利要求1-4任一所述的RNAi植物表达载体的构建方法，包括将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体上。
7.一种干扰植物HPPD抑制剂敏感型1基因HIS1表达的方法，其特征在于，使用权利要求1-4任一所述的RNAi植物表达载体转化植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括：
(1)构建RNAi植物表达载体：将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HIS1i-4；
(2)转化：将pTCK303-HIS1i-4导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化获得β-三酮类除草剂显性敏感植物。
9.权利要求1-4中任一所述的RNAi植物表达载体在干扰植物HIS1基因表达、制备β-三酮类除草剂显性敏感植物中的应用。
10.权利要求1-4任一所述的RNAi植物表达载体在培育转基因新品种、杂交水稻制种或防止转基因逃逸中的应用。
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