CN112458112A - 一种三酮类抗性基因的RNAi植物表达载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种三酮类抗性基因的RNAi植物表达载体及其应用，以及一种干扰植物HSL1(HIS1‑Like)表达的方法和获得除草剂显性敏感植物的方法。将本发明的RNAi植物表达载体转化水稻，能够成功抑制基因HSL1的表达，并将水稻从对除草剂具有抗性转变为敏感，可通过施用除草剂清除敏感植株，从而培育了一种对除草剂显性敏感的水稻。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有重要的应用价值。

Description

一种三酮类抗性基因的RNAi植物表达载体及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种三酮类抗性基因的RNAi植物干扰表达载体及其应用。
背景技术
转基因技术在各种农作物领域的应用越来越广泛。然而转基因产品自诞生之日起产生的争议，至今仍甚嚣尘上。因此，转基因产品需要加以严格的控制和监管，防止转基因漂移污染其他品种甚至其他物种就显得尤为重要。因此，需要建立一种能够定向清除杂交种子或转基因植株的机制。培育获得除草剂敏感的不育系是解决问题的有效手段之一。
β-三酮类除草剂(b-Triketone herbicides,bTHs)是4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂，广泛应用于农业，可有效地防除多种阔叶杂草和禾本科杂草。呋喃磺草酮(Tefuryltrione,TFT)属三酮类除草剂之一，可抑制植物生长中不可或缺的色素合成，通过根、茎、幼芽、叶吸收并迅速传导。HPPD是目前最重要的除草剂作用靶标之一。HPPD抑制剂类除草剂是通过抑制植物体内生育酚及质体醌合成，导致类胡萝卜素生物合成受阻，最终使植物体内叶绿素破坏，导致叶片发白，最终枯萎死亡。HPPD抑制剂类除草剂作用机理独特，与当前市场主流药剂不存在交互抗性，所以可有效解决当前抗性恶性杂草问题。呋喃磺草酮是我国目前水稻田已获登记的四个HPPD抑制剂中对水稻最安全的HPPD抑制剂类除草剂。呋喃磺草酮通过杂草根、茎、幼芽和叶片均可吸收，可同时防控禾本科杂草和阔莎草。
水稻中有6个HIS1-like基因(HSL),且高度保守。5个HSL(1/2/4/5/6)位于Chr6以基因簇的方式存在。HSL所编码蛋白具有双链β螺旋折叠，是Fe(II)/2-酮戊二酸依赖型加氧酶蛋白的典型结构特征。进化分析表明，植物中的HSL基因可能拥有相似的功能。而研究表明，水稻OsHSL1具有对呋喃磺草酮TFT等β-三酮类除草剂的抗性(Maeda,Hideo,et al."Arice gene that confers broad-spectrum resistance to β-triketone herbicides."ence 365.6451(2019):393-396.)。
因此，开发出一种能够有效显性抑制HSL1基因表达的技术手段，可为杂交水稻制种、培育转基因新品种、防止转基因逃逸等方面提供有效管控方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种三酮类抗性基因的RNAi植物表达载体及其构建方法：
为达到以上目的，本发明提供了一种抑制HSL1(HIS1-Like)基因表达的RNAi植物表达载体，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。
其中，SEQ ID No.1所示的DNA片段为基于HSL1编码框的长度为242bp的正向DNA片段，SEQ ID No.3所示的DNA片段为基于HSL1编码框的长度为242bp的与SEQ ID No.1所示的DNA片段反向互补的DNA片段。SEQ ID No.2为来自水稻Zinc finger基因的内含子序列(Rice intron)。
SEQ ID No.1至3所示的DNA片段按照从上游到下游的方向依次排列。该发夹表达盒可在转化的植物细胞中转录形成发卡式的二级结构，SEQ ID No.2所示的DNA片段形成发卡的“环”，SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”。
其中，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子。
其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV35S启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。优选的，当启动子为水稻或玉米的Ubi启动子时，能够取得非常强的干扰HSL1基因表达的效果。
所述终止子包括：NOS终止子，Ubi终止子等在植物中可以终止基因转录的DNA序列。优选的，所述终止子为NOS终止子。
所述RNAi植物表达载体还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子，CAMV 35S启动子或Actin启动子，优选的，当启动子为CAMV 35S启动子时，能够取得良好的驱动选择标记基因在植物中超量表达的效果。所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子，优选为NOS终止子。
所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、荧光标记基因(如荧光蛋白基因)、抗生素标记基因(可供筛选的抗生素标记如潮霉素、庆大霉素、卡那霉素基因)、除草剂筛选标记基因(如抗草甘膦基因、抗双草醚基因等)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因等)。特别优选的，所述标记基因为潮霉素基因。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述的RNAi植物表达载体是将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HSL1i-4。
特别优选的，所述的RNAi植物表达载体，具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
其中，所述植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。
值得注意的是，用于RNAi植物表达载体构建的中间载体和具有选择标记基因的RNAi表达载体，工程菌及包含HSL1i-4茎环结构的细胞、愈伤组织、植株、种子等均属于本发明的保护范围。
本发明的另一个方面还提供了一种RNAi植物表达载体的构建方法，所述方法包括：SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HSL1i-4。
具体的，所述方法可以按照以下步骤进行：
(1)设计3对引物，分别扩增SEQ ID No.1-3所示的DNA片段其中相邻的两个片段上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与片段或载体相应连接位置重复，以便利用GibsonAssembly重组连接。
HSL1i-4-F:ATCGGGGAAATTCGAGCTcGTATTGTGCAATGGCATCTTC
HSL1i-4-Rv1:GAGATTTTCACAGATCTTCAGGGAGTCGATG
HSL1i-4-F2:TGAAGATCTGTGAAAATCTCGAAACAGCCGTGT
HSL1i-4-Rv2:TGAAGATCTGGGTAAGTTACTACAAACCTTTTTGTATTTATGTTCC
HSL1i-4-F3:GTAACTTACCCAGATCTTCAGGGAGTCGATG
HSL1i-4-Rv:CTGCAGGTCGACTCTAGAGgatccGTATTGTGCAATGGCATCTTC
(2)RNAi植物表达载体的构建与转化
以水稻cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HSL1i-4基因片段1和3。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002832389120000041
Figure BDA0002832389120000051
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002832389120000052
以水稻DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HSL1i-4基因片段2。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002832389120000053
获得PCR产物片段，回收后，分别命名为HSL1i-4-1(SEQ ID No.1所示序列)、HSL1i-4-2(SEQ ID No.2所示序列)及HSL1i-4-3(SEQ ID No.3所示序列)。用SacI+BamHI酶切植物双元转化载体pTCK303，将目的片段HSL1i-4-1、HSL1i-4-2及HSL1i-4-3直接连入经酶切的pTCK303质粒，获得载体pTCK303-HSL1i-4。
本发明还提供了一种本发明所述的RNAi植物表达载体在干扰植物HSL1(HIS1-Like)基因表达制备除草剂显性敏感植物中的应用。
本发明的RNAi植物表达载体可通过农杆菌介导遗传转化法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
优选的，所述应用包括将pTCK303-HSL1i-4导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织。所述愈伤组织可以为花药诱导的愈伤组织、成熟胚诱导的愈伤组织、幼胚诱导的愈伤组织、幼穗诱导的愈伤组织。
本发明的一个方面还提供了一种获得除草剂显性敏感植物的方法，包括将所述RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物HSL1(HIS1-Like)基因表达。
在本发明的一种实施方式中，所述获得除草剂显性敏感植物的方法包括：
(1)构建RNAi植物表达载体：将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HSL1i-4；
(2)转化：将pTCK303-HSL1i-4导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化获得除草剂显性敏感植物。
其中，所述RNAi植物表达载体pTCK303-HSL1i-4具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
其中，所述除草剂可以为β-三酮类除草剂，包括但不限于呋喃磺草酮。
所述植物为水稻，优选的，所述植物为转基因水稻株系。
本发明提供了所述RNAi植物表达载体在培育转基因新品种、杂交水稻制种或防止转基因逃逸中的应用。
本发明基于RNAi技术，通过筛选构建了一个针对水稻HSL1(HIS1-Like)基因的植物双元转基因载体，该载体可高效的抑制HSL1(HIS1-Like)基因，且其序列完全为水稻内源序列，可有效消除公众对于外源基因转基因引起的风险和担忧。将该载体转化水稻，成功抑制了HSL1基因的表达，并将水稻从对β-三酮类除草剂具有抗性转变为敏感，从而培育了一种对β-三酮类除草剂显性敏感的水稻。使得转基因植株可以通过施用除草剂的方式被清除。该水稻在培育转基因新品种，杂交水稻制种，防止转基因逃逸等方面具有非常重要的应用价值。
附图说明
图1为HSL1i-4-1、HSL1i-4-2和HSL1i-4-3 3个目的片段扩增回收电泳图。其中1-5泳道为HSL1i-4-1目的片段；7-11泳道为HSL1i-4-2目的片段；13-17泳道为HSL1i-4-3目的片段。
图2为pTCK303骨架载体酶切回收电泳图。其中CK为pTCK303骨架载体作为对照；1-6泳道为Sac I/BamH I双酶切pTCK303骨架载体。
图3为pTCK303-HSL1i-4载体经SacⅠ和BamHⅠ酶切的电泳图。图中CK为pTCK303-HSL1i-4单克隆重组质粒；泳道1-5分别为酶切的单克隆重组质粒(5为阳性单克隆)，M为marker，所切出的片段大小969bp，包括目的片段的正向、反向互补序列及水稻内含子序列。
图4为转基因株系潮霉素抗性基因PCR检测电泳图；泳道1，H2O；泳道2阴性对照(中花11非转基因植株)；泳道3，阳性对照(pTCK303-HSL1i-4质粒)；泳道4-24，转基因株系(其中泳道4、5、10-13为转基因阴性株系)；M，Marker。
图5为pTCK303-HSL1i-4转基因T0代三叶期幼苗叶片对21.5mg/L呋喃磺草酮溶液敏感度测试。箭头为野生型对照(ZH11非转基因植株)；整株枯萎死亡为高度敏感株系；叶片不规则失绿，发褐为中度敏感株系。
图6为对比例1中使用不同环序列替换SEQ ID No.2序列后，构建RNAi载体后转基因苗喷施1290mg/L以上浓度呋喃磺草酮14d结果。箭头所指为敏感株系。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1菌株、质粒的获得及PCR引物的合成
(1)菌株和质粒
作为骨架载体的植物双元转化载体pTCK303包含潮霉素抗性基因、玉米Ubi启动子及NOS终止子。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为DH5α；农杆菌(Agrobacterimtumefacieus)菌株为EHA105。
(2)PCR引物序列
设计3对引物，分别扩增SEQ ID No.1-3所示的DNA片段其中相邻的两个片段上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与片段或载体相应连接位置重复，以便利用GibsonAssembly重组连接。
HSL1i-4-F:ATCGGGGAAATTCGAGCTcGTATTGTGCAATGGCATCTTC
HSL1i-4-Rv1:GAGATTTTCACAGATCTTCAGGGAGTCGATG
HSL1i-4-F2:TGAAGATCTGTGAAAATCTCGAAACAGCCGTGT
HSL1i-4-Rv2:TGAAGATCTGGGTAAGTTACTACAAACCTTTTTGTATTTATGTTCC
HSL1i-4-F3:GTAACTTACCCAGATCTTCAGGGAGTCGATG
HSL1i-4-Rv:CTGCAGGTCGACTCTAGAGgatccGTATTGTGCAATGGCATCTTC
实施例2RNAi植物表达载体的构建与转化
(1)为了构建HSL1(HIS1-Like)基因的干扰载体，以水稻cDNA为模板，利用实施例1的引物进行PCR扩增HSL1i-4基因片段1和3。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002832389120000091
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环,72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002832389120000092
(2)以水稻DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增HSL1i-4基因片段2。扩增体系及程序如下：
程序：94℃预变性5-10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30-35个循环，72℃再延伸5min；16℃结束。
Figure BDA0002832389120000093
Figure BDA0002832389120000101
经琼脂糖凝胶电泳后，利用E.Z.N.A
Figure BDA0002832389120000102
Gel Extraction kit(Omega,下同)回收PCR产物片段，大小分别为242bp、478bp及242bp，分别命名为HSL1i-4-1、HSL1i-4-2及HSL1i-4-3(图1)。用Sac I+BamH I对载体质粒pTCK303进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后(图2)，利用E.Z.N.A
Figure BDA0002832389120000103
Gel Extraction kit(Omega,下同)回收14kb左右大小条带，得到pTCK303线性片段。
SacI+BamHI双酶切反应体系如下：
Figure BDA0002832389120000104
(3)2×Lightening Cloning Kit连接试剂盒
Figure BDA0002832389120000105
连接HSL1i-4-1、HSL1i-4-2及HSL1i-4-3三个片段到pTCK303载体上，连接体系如下：
Figure BDA0002832389120000106
连接程序：50℃30min。
连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，重组质粒经SacⅠ和BamHⅠ双酶切，目的片段大小符合预期(见图3)，并将重组子送测序验证正确，即以水稻Zinc finger基因内含子(Rice intron)为环，构建的HSL1i-4RNAi载体，将此载体命名为pTCK303-HSL1i-4。
实施例3农杆菌转化水稻及转基因植株鉴定
将pTCK303-HSL1i-3重组质粒导入农杆菌EHA105菌株，并转化粳稻中花11愈伤组织，经潮霉素抗性筛选，分化，生根获得再生转基因株系21株，通过PCR鉴定转基因植株中转入的潮霉素抗性基因，结果显示，PCR阳性植株15株(图4)，将阳性植株移栽至泥土中，成活13株。
实施例4水稻β-三酮类除草剂呋喃磺草酮敏感与抗性转基因株系的获得
为了检测所设计干扰载体片段在转基因植株中的效果，用商品名为垦多(含18％呋喃磺草酮)除草剂母液(拜耳作物科学(中国)有限公司，批号PH8000076)配制10.75mg/L～860mg/L呋喃磺草酮溶液，喷施实施例3获得的pTCK303-HSL1i-4转基因T0代三叶期幼苗，喷后连续观察。
呋喃磺草酮21.5mg/L喷施HSL1i-4转基因13个株系；喷施后14d，有11个株系出现叶缘干枯，叶尖不规则失绿且发黄卷曲，属于高度敏感株系；有2个株系出现叶片枯黄发褐，属于中度敏感株系(图5)。
进一步低浓度呋喃磺草酮10.75mg/L喷施HSL1i-4转基因6个株系，喷施后14d，有2个株系出现叶片发白至枯萎，属于高度敏感株系；有2个株系出现叶片发白至叶尖枯黄，属于中敏感株系；有2个株系出现个别叶尖枯黄，属于低敏感或不敏感株系。
对比例1
为测试不同茎环对干扰效率的影响，将SEQ ID No.2内含子序列缩短至300bp后(见SEQ ID No.11)，构建载体并转化中花11获得转基因株系。
对上述转基因株系分别喷施浓度21.5mg/L～860mg/L呋喃磺草酮，结果发现转基因株系表现出较高的抗性，均存活无敏感株系。当对转基因株系喷施1290mg/L以上浓度呋喃磺草酮才有敏感表型，且敏感株系比例低，表明使用SEQ ID NO.11设计的OsHSL1i对HSL1基因的干扰效率较差。使用SEQ ID NO.11设计的OsHSL1i转基因株系T0代3-5叶期幼苗对1290mg/L以上浓度呋喃磺草酮14d测试结果见图6。
对比例2
进一步将SEQ ID No.2内含子序列缩短至240bp后(见SEQ ID NO.12)，构建载体并转化中花11获得转基因株系。对上述转基因株系分别喷施高浓度呋喃磺草酮，结果发现转基因株系也表现出较高的抗性，其结果与对比例1中类似，表明按照此方法设计茎环的OsHSL1i对HSL1基因的干扰效率较差。
除了上述2个对比例，本发明在研究过程中，针对OsHSL1基因内含子序列选择了全内含子序列、以及OsHSL1基因内含子序列中不同截短大小的序列期望与SEQ ID No.1和3所示的DNA片段形成发卡结构，但发现这些内含子序列所示的DNA片段无法形成发卡的“环”或所形成茎环结构效率很差，进而使得它们在替换本发明SEQ ID No.2所示序列后，不能使SEQ ID No.1和3所示的DNA片段互补形成发卡的“茎”最终被顺利在体内形成双链短RNA。这充分说明了，本发明SEQ ID No.2内含子序列与SEQ ID No.1和3所示的DNA片段形成发卡结构，构建得到的植物表达载体，能够很好地抑制HSL1基因，干扰效率高，使转基因植株表现出对β-三酮类除草剂表现出显著的敏感性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司
<120> 一种三酮类抗性基因的RNAi植物表达载体及其应用
<130> KHP201117375.7
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtattgtgca atggcatctt caggagccca gtgcacaggg tggtgacaaa cgccgagagg 60
gagaggatct cactggccat gttttacagt gtgaatgatg agaaagatat tgggccggcg 120
gctggtttgc tggatgagaa tcggcctgca agatacagga aagtgagcgt cggagagttc 180
agggctggga tcattggaaa attctctcga cgagagagat acatcgactc cctgaagatc 240
tg 242
<210> 2
<211> 478
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgaaaatctc gaaacagccg tgtcatagtc aatcattagg tgttatagga acaatcaaag 60
gttttttcaa gtgttaatct tcatactaat atatacagtg ggtactcttt atctactgcc 120
gtggaactgt catatttgat tatgaaattt tagctctaga aaatatttga tcatcaatgt 180
caagacttta tgaccttgca aaatacattt cctaattgag aacagggtaa aattatgaac 240
tatgcctctg aaccttcata cacaggcagc acattttttg ttgtaaaatt catcttaata 300
tcagcggaaa gactggacca gagaaagaaa aagttaagac aggcatatac tcttgatcct 360
ctaaaagaga tgaggcggta caatgatcaa ccatgaacat taaagtgata cgtggaacat 420
gagaacacaa ataattgtca ctggaacata aatacaaaaa ggtttgtagt aacttacc 478
<210> 3
<211> 242
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagatcttca gggagtcgat gtatctctct cgtcgagaga attttccaat gatcccagcc 60
ctgaactctc cgacgctcac tttcctgtat cttgcaggcc gattctcatc cagcaaacca 120
gccgccggcc caatatcttt ctcatcattc acactgtaaa acatggccag tgagatcctc 180
tccctctcgg cgtttgtcac caccctgtgc actgggctcc tgaagatgcc attgcacaat 240
ac 242
<210> 4
<211> 15032
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catggtagat ctgagggtaa atttctagtt tttctccttc attttcttgg ttaggaccct 60
tttctctttt tatttttttg agctttgatc tttctttaaa ctgatctatt ttttaattga 120
ttggttatgg tgtaaatatt acatagcttt aactgataat ctgattactt tatttcgtgt 180
gtctatgatg atgatgatag ttacagaacc gacgactcgt ccgtcctgta gaacgtgaaa 240
tcaaaaaact cgacggcctg tgggcattca gtctggatcg cgaaaactgt ggaattgatc 300
agcgttggtg ggaaagcgcg ttacaagaaa gccgggcaat tgctgtgcca ggcagtttta 360
acgatcagtt cgccgatgca gatattcgta attatgcggg caacgtctgg tatcagcgcg 420
aagtctttat accgaaaggt tgggcaggcc agcgtatcgt gctgcgtttc gatgcggtca 480
ctcattacgg caaagtgtgg gtcaataatc aggaagtgat ggagcatcag ggcggctata 540
cgccatttga agccgatgtc acgccgtatg ttattgccgg gaaaagtgta cgtatcaccg 600
tttgtgtgaa caacgaactg aactggcaga ctatcccgcc gggaatggtg attaccgacg 660
aaaacggcaa gaaaaagcag tcttacttcc atgatttctt taactatgcc ggaatccatc 720
gcagcgtaat gctctacacc acgccgaaca cctgggtgga cgatatcacc gtggtgacgc 780
atgtcgcgca agactgtaac cacgcgtctg ttgactggca ggtggtggcc aatggtgatg 840
tcagcgttga actgcgtgat gcggatcaac aggtggttgc aactggacaa ggcactagcg 900
ggactttgca agtggtgaat ccgcacctct ggcaaccggg tgaaggttat ctctatgaac 960
tgtgcgtcac agccaaaagc cagacagagt gtgatatcta cccgcttcgc gtcggcatcc 1020
ggtcagtggc agtgaagggc gaacagttcc tgattaacca caaaccgttc tactttactg 1080
gctttggtcg tcatgaagat gcggacttac gtggcaaagg attcgataac gtgctgatgg 1140
tgcacgacca cgcattaatg gactggattg gggccaactc ctaccgtacc tcgcattacc 1200
cttacgctga agagatgctc gactgggcag atgaacatgg catcgtggtg attgatgaaa 1260
ctgctgctgt cggctttaac ctctctttag gcattggttt cgaagcgggc aacaagccga 1320
aagaactgta cagcgaagag gcagtcaacg gggaaactca gcaagcgcac ttacaggcga 1380
ttaaagagct gatagcgcgt gacaaaaacc acccaagcgt ggtgatgtgg agtattgcca 1440
acgaaccgga tacccgtccg caagtgcacg ggaatatttc gccactggcg gaagcaacgc 1500
gtaaactcga cccgacgcgt ccgatcacct gcgtcaatgt aatgttctgc gacgctcaca 1560
ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc tgtgcctgaa ccgttattac ggatggtatg 1620
tccaaagcgg cgatttggaa acggcagaga aggtactgga aaaagaactt ctggcctggc 1680
aggagaaact gcatcagccg attatcatca ccgaatacgg cgtggatacg ttagccgggc 1740
tgcactcaat gtacaccgac atgtggagtg aagagtatca gtgtgcatgg ctggatatgt 1800
atcaccgcgt ctttgatcgc gtcagcgccg tcgtcggtga acaggtatgg aatttcgccg 1860
attttgcgac ctcgcaaggc atattgcgcg ttggcggtaa caagaaaggg atcttcactc 1920
gcgaccgcaa accgaagtcg gcggcttttc tgctgcaaaa acgctggact ggcatgaact 1980
tcggtgaaaa accgcagcag ggaggcaaac aagctagcca ccaccaccac caccacgtgt 2040
gaattacagg tgaccagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 2100
ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 2160
gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg 2220
attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac 2280
taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt aaactatcag 2340
tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg 2400
gatatttaaa agggcgtgaa aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc 2460
acagggttcc cctcgggatc aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct atagtgcagt 2520
cggcttctga cgttcagtgc agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca agtcctaagt 2580
tacgcgacag gctgccgccc tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt gttttagtcg 2640
cataaagtag aatacttgcg actagaaccg gagacattac gccatgaaca agagcgccgc 2700
cgctggcctg ctgggctatg cccgcgtcag caccgacgac caggacttga ccaaccaacg 2760
ggccgaactg cacgcggccg gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca ccggcaccag 2820
gcgcgaccgc ccggagctgg ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg acgttgtgac 2880
agtgaccagg ctagaccgcc tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca ttgccgagcg 2940
catccaggag gccggcgcgg gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg acaccaccac 3000
gccggccggc cgcatggtgt tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg agcgttccct 3060
aatcatcgac cgcacccgga gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg tgaagtttgg 3120
cccccgccct accctcaccc cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga tcgaccagga 3180
aggccgcacc gtgaaagagg cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga ccctgtaccg 3240
cgcacttgag cgcagcgagg aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg gtgccttccg 3300
tgaggacgca ttgaccgagg ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac gccaagagga 3360
acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac cgaagagatc 3420
gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt ctcaaccgtg 3480
cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg gccggccagc 3540
ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt tgagtaaaac 3600
agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca aatacgcaag 3660
gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc aagacgacca 3720
tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg ttagtcgatt 3780
ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa ccgctaaccg 3840
ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc cggcgcgact 3900
tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg atcaaggcag 3960
ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc accgccgacc 4020
tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa gcggcctttg 4080
tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag gcgctggccg 4140
ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac ccaggcactg 4200
ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc cgcgaggtcc 4260
aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta aagagaaaat 4320
gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca gcaaggctgc 4380
aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc agttgccggc 4440
ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca ttaccgagct 4500
gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa atgagtagat 4560
gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc accgacgccg 4620
tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc tgggttgtct 4680
gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga cggtcgcaaa 4740
ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga gaagttgaag 4800
gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg tgaatcgtgg 4860
caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc cggtgcgccg 4920
tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc gatgctctat 4980
gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg tctgtcgaag 5040
cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca cgtagaggtt 5100
tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact gatggcggtt 5160
tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa gcccggccgc 5220
gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga tggcggaaag 5280
cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt tgccatgcag 5340
cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga agccttgatt 5400
agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga gatcgagcta 5460
gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct gacggttcac 5520
cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct ggcacgccgc 5580
gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg cagtggcagc 5640
gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc aaatgacctg 5700
ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt catgcgctac 5760
cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca gatgctaggg 5820
caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga tagcacgtac 5880
attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa cccaaagccg 5940
tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa aggcgatttt 6000
tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc ctgtgcataa 6060
ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg gtcgctgcgc 6120
tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc aaaaatggct 6180
ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc actcgaccgc 6240
cggcgcccac atcaaggcac cctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 6300
acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 6360
agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc 6420
acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg 6480
agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 6540
aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 6600
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 6660
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 6720
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 6780
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 6840
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 6900
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 6960
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 7020
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 7080
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 7140
tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 7200
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 7260
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 7320
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 7380
attttggtca tgcattctag gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata atattttatt 7440
ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata ctgttcttcc 7500
ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt gtccgccctg 7560
ccgcttctcc caagatcaat aaagccactt actttgccat ctttcacaaa gatgttgctg 7620
tctcccaggt cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt ctttaaaaaa 7680
tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc gcaatccaca 7740
tcggccagat cgttattcag taagtaatcc aattcggcta agcggctgtc taagctattc 7800
gtatagggac aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc cgcatacagc 7860
tcgataatct tttcagggct ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag gacgccatcg 7920
gcctcactca tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt caaagtgcag gacctttgga 7980
acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac atcataggtg 8040
gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc tcccaccagc 8100
ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta tttttcgatc 8160
agttttttca attccggtga tattctcatt ttagccattt attatttcct tcctcttttc 8220
tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa gacgaactcc aattcactgt 8280
tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg ttttcaaagt 8340
tggcgtataa catagtatcg acggagccga ttttgaaacc gcggtgatca caggcagcaa 8400
cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt gtttcaaacc 8460
cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag tctgccgcct 8520
tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat cgagtggtga 8580
ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga tatattgtgg 8640
tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt taatgtactg 8700
aattaacgcc gaattaattc gggggatctg gattttagta ctggattttg gttttaggaa 8760
ttagaaattt tattgataga agtattttac aaatacaaat acatactaag ggtttcttat 8820
atgctcaaca catgagcgaa accctatagg aaccctaatt cccttatctg ggaactactc 8880
acacattatt atggagaaac tcgagcttgt cgatcgacag atccggtcgg catctactct 8940
atttctttgc cctcggacga gtgctggggc gtcggtttcc actatcggcg agtacttcta 9000
cacagccatc ggtccagacg gccgcgcttc tgcgggcgat ttgtgtacgc ccgacagtcc 9060
cggctccgga tcggacgatt gcgtcgcatc gaccctgcgc ccaagctgca tcatcgaaat 9120
tgccgtcaac caagctctga tagagttggt caagaccaat gcggagcata tacgcccgga 9180
gtcgtggcga tcctgcaagc tccggatgcc tccgctcgaa gtagcgcgtc tgctgctcca 9240
tacaagccaa ccacggcctc cagaagaaga tgttggcgac ctcgtattgg gaatccccga 9300
acatcgcctc gctccagtca atgaccgctg ttatgcggcc attgtccgtc aggacattgt 9360
tggagccgaa atccgcgtgc acgaggtgcc ggacttcggg gcagtcctcg gcccaaagca 9420
tcagctcatc gagagcctgc gcgacggacg cactgacggt gtcgtccatc acagtttgcc 9480
agtgatacac atggggatca gcaatcgcgc atatgaaatc acgccatgta gtgtattgac 9540
cgattccttg cggtccgaat gggccgaacc cgctcgtctg gctaagatcg gccgcagcga 9600
tcgcatccat agcctccgcg accggttgta gaacagcggg cagttcggtt tcaggcaggt 9660
cttgcaacgt gacaccctgt gcacggcggg agatgcaata ggtcaggctc tcgctaaact 9720
ccccaatgtc aagcacttcc ggaatcggga gcgcggccga tgcaaagtgc cgataaacat 9780
aacgatcttt gtagaaacca tcggcgcagc tatttacccg caggacatat ccacgccctc 9840
ctacatcgaa gctgaaagca cgagattctt cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga 9900
cgctgtcgaa cttttcgatc agaaacttct cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt 9960
tcatatctca ttgccccccc ggatctgcga aagctcgaga gagatagatt tgtagagaga 10020
gactggtgat ttcagcgtgt cctctccaaa tgaaatgaac ttccttatat agaggaaggt 10080
cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata tcacatcaat 10140
ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg 10200
ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg aacgatagcc tttcctttat 10260
cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac tgtccttttg atgaagtgac 10320
agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct 10380
caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt 10440
cgtgctccac catgttatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt 10500
ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg 10560
catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca tttgtaggtg ccaccttcct 10620
tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc 10680
ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag actgtatctt 10740
tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat gttggcaagc tgctctagcc 10800
aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag 10860
gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca 10920
ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag 10980
cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgaattcc ccgatctagt 11040
aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 11100
atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 11160
gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 11220
atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 11280
cgatcgggga aattcgagct cgtattgtgc aatggcatct tcaggagccc agtgcacagg 11340
gtggtgacaa acgccgagag ggagaggatc tcactggcca tgttttacag tgtgaatgat 11400
gagaaagata ttgggccggc ggctggtttg ctggatgaga atcggcctgc aagatacagg 11460
aaagtgagcg tcggagagtt cagggctggg atcattggaa aattctctcg acgagagaga 11520
tacatcgact ccctgaagat ctgtgaaaat ctcgaaacag ccgtgtcata gtcaatcatt 11580
aggtgttata ggaacaatca aaggtttttt caagtgttaa tcttcatact aatatataca 11640
gtgggtactc tttatctact gccgtggaac tgtcatattt gattatgaaa ttttagctct 11700
agaaaatatt tgatcatcaa tgtcaagact ttatgacctt gcaaaataca tttcctaatt 11760
gagaacaggg taaaattatg aactatgcct ctgaaccttc atacacaggc agcacatttt 11820
ttgttgtaaa attcatctta atatcagcgg aaagactgga ccagagaaag aaaaagttaa 11880
gacaggcata tactcttgat cctctaaaag agatgaggcg gtacaatgat caaccatgaa 11940
cattaaagtg atacgtggaa catgagaaca caaataattg tcactggaac ataaatacaa 12000
aaaggtttgt agtaacttac ccagatcttc agggagtcga tgtatctctc tcgtcgagag 12060
aattttccaa tgatcccagc cctgaactct ccgacgctca ctttcctgta tcttgcaggc 12120
cgattctcat ccagcaaacc agccgccggc ccaatatctt tctcatcatt cacactgtaa 12180
aacatggcca gtgagatcct ctccctctcg gcgtttgtca ccaccctgtg cactgggctc 12240
ctgaagatgc cattgcacaa tacggatcct ctagagtcga cctgcagaag taacaccaaa 12300
caacagggtg agcatcgaca aaagaaacag taccaagcaa ataaatagcg tatgaaggca 12360
gggctaaaaa aatccacata tagctgctgc atatgccatc atccaagtat atcaagatca 12420
aaataattat aaaacatact tgtttattat aatagatagg tactcaaggt tagagcatat 12480
gaatagatgc tgcatatgcc atcatgtata tgcatcagta aaacccacat caacatgtat 12540
acctatccta gatcgatatt tccatccatc ttaaactcgt aactatgaag atgtatgaca 12600
cacacataca gttccaaaat taataaatac accaggtagt ttgaaacagt attctactcc 12660
gatctagaac gaatgaacga ccgcccaacc acaccacatc atcacaacca agcgaacaaa 12720
aagcatctct gtatatgcat cagtaaaacc cgcatcaaca tgtataccta tcctagatcg 12780
atatttccat ccatcatctt caattcgtaa ctatgaatat gtatggcaca cacatacaga 12840
tccaaaatta ataaatccac caggtagttt gaaacagaat tctactccga tctagaacga 12900
ccgcccaacc agaccacatc atcacaacca agacaaaaaa aagcatgaaa agatgacccg 12960
acaaacaagt gcacggcata tattgaaata aaggaaaagg gcaaaccaaa ccctatgcaa 13020
cgaaacaaaa aaaatcatga aatcgatccc gtctgcggaa cggctagagc catcccagga 13080
ttccccaaag agaaacactg gcaagttagc aatcagaacg tgtctgacgt acaggtcgca 13140
tccgtgtacg aacgctagca gcacggatct aacacaaaca cggatctaac acaaacatga 13200
acagaagtag aactaccggg ccctaaccat ggaccggaac gccgatctag agaaggtaga 13260
gagggggggg gggggaggac gagcggcgta ccttgaagcg gaggtgccga cgggtggatt 13320
tgggggagat ctggttgtgt gtgtgtgcgc tccgaacaac acgaggttgg ggaaagaggg 13380
tgtggagggg gtgtctattt attacggcgg gcgaggaagg gaaagcgaag gagcggtggg 13440
aaaggaatcc cccgtagctg ccggtgccgt gagaggagga ggaggccgcc tgccgtgccg 13500
gctcacgtct gccgctccgc cacgcaattt ctggatgccg acagcggagc aagtccaacg 13560
gtggagcgga actctcgaga ggggtccaga ggcagcgaca gagatgccgt gccgtctgct 13620
tcgcttggcc cgacgcgacg ctgctggttc gctggttggt gtccgttaga ctcgtcgacg 13680
gcgtttaaca ggctggcatt atctactcga aacaagaaaa atgtttcctt agttttttta 13740
atttcttaaa gggtatttgt ttaattttta gtcactttat tttattctat tttatatcta 13800
aattattaaa taaaaaaact aaaatagagt tttagttttc ttaatttaga ggctaaaata 13860
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tggatgtact aataaaatgg atgaagtatt atataggtga agctatttgc aaaaaaaaag 13980
gagaacacat gcacactaaa aagataaaac tgtagagtcc tgttgtcaaa atactcaatt 14040
gtcctttaga ccatgtctaa ctgttcattt atatgattct ctaaaacact gatattattg 14100
tagtactata gattatatta ttcgtagagt aaagtttaaa tatatgtata aagatagata 14160
aactgcactt caaacaagtg tgacaaaaaa aatatgtggt aattttttat aacttagaca 14220
tgcaatgctc attatctcta gagaggggca cgaccgggtc acgctgcaca agcttggcac 14280
tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc 14340
ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc 14400
cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgctagag cagcttgagc ttggatcaga 14460
ttgtcgtttc ccgccttcag tttagcttca tggagtcaaa gattcaaata gaggacctaa 14520
cagaactcgc cgtaaagact ggcgaacagt tcatacagag tctcttacga ctcaatgaca 14580
agaagaaaat cttcgtcaac atggtggagc acgacacact tgtctactcc aaaaatatca 14640
aagatacagt ctcagaagac caaagggcaa ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 14700
gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 14760
aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 14820
cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 14880
aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 14940
gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 15000
ttcatttgga gagaacacgg gggactcttg ac 15032
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcggggaaa ttcgagctcg tattgtgcaa tggcatcttc 40
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagattttca cagatcttca gggagtcgat g 31
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgaagatctg tgaaaatctc gaaacagccg tgt 33
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgaagatctg ggtaagttac tacaaacctt tttgtattta tgttcc 46
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtaacttacc cagatcttca gggagtcgat g 31
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgcaggtcg actctagagg atccgtattg tgcaatggca tcttc 45
<210> 11
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgaaaatctc gaaacagccg tgtcatagtc aatcattagg tgttatagga acaatcaaag 60
gttttttcaa gtgttaatct tcatactaat atatacagtg ggtactcttt atctactgcc 120
gtggaactgt catatttgat tatgaaattt tagctctaga aaatatttga tcatcaatgt 180
caagacttta tgaccttgca aaatacattt cctaattgag aacagggtaa aattatgaac 240
tatgcctctg aaccttcata cacaggcagc acattttttg ttgtaaaatt catcttaata 300
<210> 12
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgaaaatctc gaaacagccg tgtcatagtc aatcattagg tgttatagga acaatcaaag 60
gttttttcaa gtgttaatct tcatactaat atatacagtg ggtactcttt atctactgcc 120
gtggaactgt catatttgat tatgaaattt tagctctaga aaatatttga tcatcaatgt 180
caagacttta tgaccttgca aaatacattt cctaattgag aacagggtaa aattatgaac 240

Claims (10)

1.一种三酮类抗性基因的RNAi植物表达载体，其特征在于，含有发卡结构表达盒，其中所述发卡结构表达盒含有由SEQ ID No.1-3所示的DNA片段所形成的发卡结构。
2.根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，所述发卡结构表达盒还包括位于发卡结构上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及，位于发卡结构下游的终止子，
其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV 35S启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。
3.根据权利要求1所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，还包括选择标记表达盒，所述选择标记表达盒含有启动子、标记基因和终止子，其中所述启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV 35S启动子，或Actin启动子；所述标记基因为可产生颜色变化的酶的基因、荧光标记基因、抗生素标记基因、除草剂筛选标记基因或抗化学试剂标记基因，所述终止子为NOS终止子或Ubi终止子。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的RNAi植物表达载体，其特征在于，具有SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列。
5.含有权利要求1-4任一所述的RNAi植物表达载体的生物材料，所述生物材料为工程菌、包含HSL1i-4茎环结构的细胞、愈伤组织、植株、种子。
6.一种RNAi植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括：将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HSL1i-4。
7.权利要求1-4中任意一项所述的RNAi植物表达载体在干扰植物HSL1基因表达制备除草剂显性敏感植物中的应用，其特征在于，包括将pTCK303-HSL1i-4导入农杆菌EHA105菌株，并转化植物愈伤组织。
8.一种干扰植物HSL1基因表达的方法，其特征在于，包括将权利要求1-4中任意一项所述的RNAi植物表达载体转化植物，干扰植物HSL1基因表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括：
(1)构建RNAi植物表达载体：将SEQ ID No.1-3所示的DNA片段用overlapping方法连接到植物双元转化载体pTCK303的SacⅠ和BamHⅠ位点间，得到RNAi植物表达载体pTCK303-HSL1i-4；
(2)转化：将pTCK303-HSL1i-4导入农杆菌EHA105菌株，并转化愈伤组织，将转化后的愈伤组织进行诱导分化获得β-三酮类除草剂显性敏感植物。
10.权利要求1-4中任意一项所述的RNAi植物表达载体在培育转基因新品种、杂交水稻制种或防止转基因逃逸中的应用。
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