CN110835631B - 一种改造的sgRNA及其在提高碱基编辑效率中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高效的sgRNA及其在基因编辑中的应用。所述改造的sgRNA如式I所示：所述靶点序列转录的RNA‑改造的sgRNA骨架(式I)；所述改造的sgRNA骨架为在sgRNA骨架第14‑15位之间插入RNA片段甲，且在所述sgRNA骨架第18‑19位之间插入RNA片段乙后得到的RNA分子；所述RNA片段甲与所述RNA片段乙反向互补；所述RNA片段甲与所述RNA片段乙大小均为5nt；所述sgRNA骨架为序列9所示的RNA分子。通过实验证明：本发明的改造的sgRNA可显著提高胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的C·T碱基替换效率，最高可达81.8％。

Description

一种改造的sgRNA及其在提高碱基编辑效率中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改造的sgRNA及其在提高碱基编辑效率中的应用。

背景技术

CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9 protein-RNA复合物通过向导RNA(guide RNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNA break，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directed repair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertions or deletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。

2016年，David Liu和Akihiko Kondo两个实验室分别独立报道了两种不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，CBE)，分别使用了两种不同的胞苷脱氨酶rAPOBEC1(rat APOBEC1)和PmCDA1(activation-induced cytidine deaminase(AID)ortholog from sea lamprey)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶直接实现对单个胞嘧啶(Cytosine，C)碱基进行编辑，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了C替换为胸腺嘧啶(Thymine，T)的碱基编辑效率。具体为dead Cas9(dCas9)或the Cas9 nickase(Cas9n)连带着rAPOBEC1或PmCDA1通过sgRNA定位到靶点，rAPOBEC1或PmCDA1催化非配对的单链DNA上的C发生胞嘧啶脱氨反应变成尿嘧啶(Uracil，U)，通过DNA的修复使得U与腺嘌呤(Adenine，A)配对，又通过DNA复制，最终使得T与A配对，从而实现了C到T的转换。在所测试的编辑器中，SpCas9n(D10A)&rAPOBEC1/PmCDA1&UGI碱基编辑系统(其含有尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂(uracil DNA glycosylase inhibitor，UGI))的平均突变率较高，原因有二：一是UGI可以抑制尿嘧啶DNA糖化酶(uracil DNA glycosylase，UDG)催化清除DNA中U，二是SpCas9n(D10A)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patch BER(base-excision repair)修复机制，促使U:G错配更多的偏好性修复成U:A。为了提高工作效率，降低工作成本，C·T碱基替换效率的提高一直是动植物基因组碱基编辑系统的研究方向。

来源于金色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9(SaCas9)为SpCas9同源物，识别NNGRRT PAM，SaCas9变体SaKKH识别更为广泛的NNNRRT PAM，二者均被开发成有效的CBE，大大拓展了CBE在动物和植物基因组中的可编辑C的范围。目前尚无通过改造SaCas9相应的sgRNA(SaCas9 sgRNA)结构提高SaKKH相关的CBE的C·T碱基替换效率的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提高胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的C·T碱基替换效率。

为了实现上述目的，本发明提供了一种成套试剂，所述成套试剂包括sgRNA或与所述sgRNA相关的生物材料、Cas9核酸酶或与所述Cas9核酸酶相关的生物材料、胞嘧啶脱氨酶或与所述胞嘧啶脱氨酶相关的生物材料；

所述sgRNA靶向靶点序列；

所述sgRNA如式I所示：所述靶点序列转录的RNA-改造的sgRNA骨架(式I)；

所述改造的sgRNA骨架为在sgRNA骨架第14-15位之间插入RNA片段甲，且在所述sgRNA骨架第18-19位之间插入RNA片段乙后得到的RNA分子；

所述RNA片段甲与所述RNA片段乙反向互补；

所述RNA片段甲与所述RNA片段乙大小均为5nt；

所述sgRNA骨架为m1)或m2)或m3)：

m1)序列9所示的RNA分子；

m2)将m1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

m3)与m1)或m2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

上述成套试剂中，所述改造的sgRNA骨架为n1)或n2)或n3)：

n1)序列10所示的RNA分子；

n2)将n1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

n3)与n1)或n2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

上述成套试剂中，所述Cas9核酸酶可为SaKKHn或SaCas9或SaKKH-HF或SaCas9-HF等蛋白质。在本发明的一个具体实施例中，所述Cas9核酸酶具体为SaKKHn蛋白质。

所述SaKKHn蛋白质为E1)或E2)或E3)：

E1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

E2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

E3)在E1)或E2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

与所述SaKKHn蛋白质相关的生物材料为F1)至F5)中的任一种：

F1)编码所述SaKKHn蛋白质的核酸分子；

F2)含有F1)所述核酸分子的表达盒；

F3)含有F1)所述核酸分子的重组载体、或含有F2)所述表达盒的重组载体；

F4)含有F1)所述核酸分子的重组微生物、或含有F2)所述表达盒的重组微生物、或含有F3)所述重组载体的重组微生物；

F5)含有F1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有F2)所述表达盒的转基因细胞系。

上述成套试剂中，所述胞嘧啶脱氨酶可为human APOBEC3A、human AID、PmCDA1或rAPOBEC1等蛋白质。在本发明的一个具体实施例中，所述胞嘧啶脱氨酶具体为PmCDA1蛋白质。

所述PmCDA1蛋白质为G1)或G2)或G3)：

G1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

G2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

G3)在G1)或G2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

与所述PmCDA1蛋白质相关的生物材料为H1)至H5)中的任一种：

H1)编码所述PmCDA1蛋白质的核酸分子；

H2)含有H1)所述核酸分子的表达盒；

H3)含有H1)所述核酸分子的重组载体、或含有H2)所述表达盒的重组载体；

H4)含有H1)所述核酸分子的重组微生物、或含有H2)所述表达盒的重组微生物、或含有H3)所述重组载体的重组微生物；

H5)含有H1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有H2)所述表达盒的转基因细胞系。

上述成套试剂中，所述sgRNA可为tRNA-sgRNA；

所述tRNA-sgRNA如式I所示：tRNA-所述靶点序列转录的RNA-改造的sgRNA骨架(式I)；

所述tRNA为1)或2)或3)：

1)将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子；

2)将1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；

3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。

上述成套试剂还可包括UGI蛋白质或与所述UGI蛋白质相关的生物材料；

所述UGI蛋白质为I1)或I2)或I3)：

I1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；

I2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

I3)在I1)或I2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

与所述UGI蛋白质相关的生物材料为J1)至J5)中的任一种：

J1)编码所述UGI蛋白质的核酸分子；

J2)含有J1)所述核酸分子的表达盒；

J3)含有J1)所述核酸分子的重组载体、或含有J2)所述表达盒的重组载体；

J4)含有J1)所述核酸分子的重组微生物、或含有J2)所述表达盒的重组微生物、或含有J3)所述重组载体的重组微生物；

J5)含有J1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有J2)所述表达盒的转基因细胞系。

为了使E1)、G1)、I1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2或序列3或序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述E2)、G2)、I2)中的蛋白质，为与序列2或序列3或序列4所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述E2)、G2)、I2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述E2)、G2)、I2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1的第3013-6225位(编码序列2所示的蛋白质)、序列1的第6511-7134位(编码序列3所示的蛋白质)、序列1的第7156-7452位(编码序列4所示的蛋白质)所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连接上表所示的标签的编码序列得到。

进一步的，F1)所述核酸分子为f1)或f2)或f3)：

f1)序列表中序列1第3013-6225位所示的cDNA分子或DNA分子；

f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SaKKHn的cDNA分子或DNA分子；

f3)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SaKKHn的cDNA分子或DNA分子；

H1)所述核酸分子为h1)或h2)或h3)：

h1)序列表中序列1第6511-7134位所示的cDNA分子或DNA分子；

h2)与h1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PmCDA1的cDNA分子或DNA分子；

h3)在严格条件下与h1)或h2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PmCDA1的cDNA分子或DNA分子；

J1)所述核酸分子为j1)或j2)或j3)：

j1)序列表中序列1第7156-7452位所示的cDNA分子或DNA分子；

j2)与j1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述UGI的cDNA分子或DNA分子；

j3)在严格条件下与j1)或j2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述UGI的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述SaKKHn或所述PmCDA1或所述UGI的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的所述SaKKHn或所述PmCDA1或所述UGI的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述SaKKHn或所述PmCDA1或所述UGI且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2、3、4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

F2)所述的含有编码SaKKHn蛋白质的核酸分子的表达盒(SaKKHn基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SaKKHn蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动SaKKHn基因转录的启动子，还可包括终止SaKKHn基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的表达载体构建含有所述SaKKHn基因表达盒的重组载体。

H2)所述的含有编码PmCDA1蛋白质的核酸分子的表达盒(PmCDA1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PmCDA1蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动PmCDA1基因转录的启动子，还可包括终止PmCDA1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的表达载体构建含有所述PmCDA1基因表达盒的重组载体。

J2)所述的含有编码UGI蛋白质的核酸分子的表达盒(UGI基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达UGI蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动UGI基因转录的启动子，还可包括终止UGI基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用现有的表达载体构建含有所述UGI基因表达盒的重组载体。

所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明的具体实施例中，所述重组载体具体为SaKKHn-pBE+5bp-1重组表达载体、SaKKHn-pBE+5bp-2重组表达载体、SaKKHn-pBE+5bp-3重组表达载体、SaKKHn-pBE+5bp-4重组表达载体、SaKKHn-pBE+5bp-5重组表达载体或SaKKHn-pBE+5bp-6重组表达载体。

所述SaKKHn-pBE+5bp-1重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-1重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列均替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

所述SaKKHn-pBE+5bp-2重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-2重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列均替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

所述SaKKHn-pBE+5bp-3重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-3重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

所述SaKKHn-pBE+5bp-4重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-4重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

所述SaKKHn-pBE+5bp-5重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-5重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

所述SaKKHn-pBE+5bp-6重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-6重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，所述细菌可为农杆菌，如农杆菌EHA105。在本发明的具体实施例中，所述重组微生物具体为含有所述SaKKHn-pBE+5bp-1重组表达载体、所述SaKKHn-pBE+5bp-2重组表达载体、所述SaKKHn-pBE+5bp-3重组表达载体、所述SaKKHn-pBE+5bp-4重组表达载体、所述SaKKHn-pBE+5bp-5重组表达载体或所述SaKKHn-pBE+5bp-6重组表达载体的农杆菌EHA105。

所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

上述成套试剂具有如下用途：

X1)生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑；

X2)制备生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑的产品；

X3)提高生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑效率；

X4)制备提高生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑效率的产品。

上述成套试剂中的sgRNA或改造的sgRNA骨架也均属于本发明的保护范围。

为了实现上述目的，本发明还提供了上述成套试剂或sgRNA或改造的sgRNA骨架的新用途。

本发明提供了上述成套试剂或sgRNA或改造的sgRNA骨架的新用途在X1)-X4)中任一种中的应用：

X1)生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑；

X2)制备生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑的产品；

X3)提高生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑效率；

X4)制备提高生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑效率的产品。

为了实现上述目的，本发明最后提供了Y1)或Y2)所述的方法：

Y1)基因组靶点序列的编辑方法或提高生物体或生物细胞基因组靶点序列的编辑效率的方法，包括使生物体或生物细胞内表达上述sgRNA、上述Cas9核酸酶、上述胞嘧啶脱氨酶，实现基因组靶点序列的编辑；所述sgRNA靶向所述靶点序列；

Y2)生物突变体的制备方法，包括如下步骤：按照Y1)所述的方法对生物体的基因组进行编辑，获得生物突变体。

上述方法中，所述Y1)中，所述sgRNA为上述tRNA-sgRNA，转录所述tRNA-sgRNA的DNA分子转录后得到的tRNA-sgRNA为不成熟的RNA前体，该RNA前体中的tRNA会被两种酶(RNase P和RNase Z)切割掉后得到成熟的RNA。一个重组表达载体中有多少个靶点，就会得到多少个独立的成熟的RNA，每个成熟的RNA依次由所述靶点序列转录的RNA和所述sgRNA骨架组成，或依次由所述靶点序列转录的RNA、所述sgRNA骨架和所述tRNA残留的个别碱基组成。

上述方法中，所述Y1)还包括使生物体或生物细胞内表达UGI的步骤，所述UGI的个数可为1个或2个或多个。在本发明的具体实施例中，所述UGI的个数具体为1个。

进一步的，使生物体或生物细胞内表达上述sgRNA、上述Cas9核酸酶、上述胞嘧啶脱氨酶和上述UGI的方法为将所述Cas9核酸酶的编码基因、转录所述sgRNA的DNA分子、所述胞嘧啶脱氨酶的编码基因和所述UGI的编码基因导入生物体或生物细胞内。

更进一步的，所述Cas9核酸酶的编码基因、转录所述sgRNA的DNA分子、所述胞嘧啶脱氨酶的编码基因和所述UGI的编码基因通过重组表达载体导入生物体或生物细胞内。

所述Cas9核酸酶的编码基因、转录所述sgRNA的DNA分子、所述胞嘧啶脱氨酶的编码基因和所述UGI的编码基因可通过同一个重组表达载体导入生物体或生物细胞内，也可通过两个或者多个重组表达载体共同导入生物体或生物细胞内。

在本发明的具体实施例中，所述Cas9核酸酶的编码基因、转录所述sgRNA的DNA分子、所述胞嘧啶脱氨酶的编码基因和所述UGI的编码基因通过同一个重组表达载体导入生物体或生物细胞内。所述重组表达载体含有表达盒甲和表达盒乙；所述表达盒甲表达上述sgRNA，所述表达盒乙表达由上述Cas9核酸酶、上述胞嘧啶脱氨酶和上述UGI组成的融合蛋白。

所述重组表达载体具体为所述SaKKHn-pBE+5bp-1重组表达载体、所述SaKKHn-pBE+5bp-2重组表达载体、所述SaKKHn-pBE+5bp-3重组表达载体、所述SaKKHn-pBE+5bp-4重组表达载体、所述SaKKHn-pBE+5bp-5重组表达载体或所述SaKKHn-pBE+5bp-6重组表达载体。

上述成套试剂或应用或方法中，所述靶点序列的个数可为1个或2个或多个。所述靶点序列的PAM序列为NNNRRT。

上述成套试剂或应用或方法中，所述基因组靶点序列的编辑为将所述靶点序列中的C突变为T。所述C为所述靶点序列中任意位置的C。

上述成套试剂或应用或方法中，所述生物体为S1)或S2)或S3)或S4)：

S1)植物或动物；

S2)单子叶植物或双子叶植物；

S3)禾本科植物；

S4)水稻；

所述生物细胞为T1)或T2)或T3)或T4)：

T1)植物细胞或动物细胞；

T2)单子叶植物细胞或双子叶植物细胞；

T3)禾本科植物细胞；

T4)水稻细胞。

本发明提供了一种改造的sgRNA，其结构如式I所示：靶点序列转录的RNA-改造的sgRNA骨架(式I)；所述改造的sgRNA骨架为在sgRNA骨架第14-15位之间插入RNA片段甲，且在所述sgRNA骨架第18-19位之间插入RNA片段乙后得到的RNA分子；所述RNA片段甲与所述RNA片段乙反向互补；所述RNA片段甲与所述RNA片段乙大小均为5nt；所述sgRNA骨架为序列9所示的RNA分子。通过实验证明：本发明的改造的sgRNA可显著提高胞嘧啶碱基编辑器(CBE)的C·T碱基替换效率，最高可达81.8％。

附图说明

图1为未经改造的SaCas9 sgRNA结构及改造后的SaCas9 sgRNA结构。

图2为重组表达载体的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

引物对T1由引物T1-F：5’-ttcaaattctaatccccaatcc-3’和引物T1-R：5’-tcgtacctgtctgcaaccttg-3’组成，用于扩增靶点T1。

引物对T2由引物T2-F：5’-gctttagatgatttgttacatttcgc-3’和引物T2-R：5’-tgagttggtatggcaagaacaag-3’组成，用于扩增靶点T2。

引物对T3由引物T3-F：5’-aacacggtcaccaacttcatc-3’和引物T3-R：5’-acaacctggcttgctatatatgc-3’组成，用于扩增靶点T3。

引物对T4由引物T4-F：5’-tggatcggatatggacttctc-3’和引物T4-R：5’-gaaatgaacaatcacctgagatctttg-3’组成，用于扩增靶点T4和T7。

引物对T5由引物T5-F：5’-cgagctacctgaagaacaactacc-3’和引物T5-R：5’-cctcgattgcctgaaatttg-3’组成，用于扩增靶点T5。

引物对T6由引物T6-F：5’-tgcgagctcgacaacatcatg-3’和引物T6-R：5’-gacggcccatgtggaaacc-3’组成，用于扩增靶点T6。

引物对T8由引物T8-F：5’-gacgcccatagtcgaggtc-3’和引物T8-R：5’-ctctgctggatcaatgtcaatg-3’组成，用于扩增靶点T8。

以下实施例中，C·T碱基替换是指靶点序列中任何位置的C突变为T。

C·T碱基替换效率＝发生C·T碱基替换的阳性T0苗数/分析的总阳性T0苗数×100％。

日本晴水稻：参考文献：梁卫红,王高华,杜京尧,等.硝普钠及其光解产物对日本晴水稻幼苗生长和5种激素标记基因表达的影响[J].河南师范大学学报(自然版),2017(2):48-52.；公众可以从北京市农林科学院获得。

恢复培养基：含有200mg/L特美汀的N6固体培养基。

筛选培养基：含有50mg/L潮霉素的N6固体培养基。

分化培养基：含有2mg/L KT、0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。

生根培养基：含有0.2mg/L NAA、0.5g/L谷氨酸、0.5g/L脯氨酸的N6固体培养基。

实施例1、SaCas9 sgRNA中sgRNA骨架结构的改造

SaCas9 sgRNA结构如下：靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架。

对SaCas9 sgRNA结构中的sgRNA骨架结构进行改造，两种sgRNA骨架结构改造方式如图1所示。

Original表示未经改造的SaCas9 sgRNA结构，将未经改造的SaCas9 sgRNA记作Original sgRNA，将Original sgRNA中的sgRNA骨架记作Original sgRNA骨架，OriginalsgRNA骨架的RNA序列如下：GUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAU(序列9)；Original sgRNA骨架的DNA序列如下：GTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGAT。

O+5bp表示在未经改造的SaCas9 sgRNA结构基础上添加5对碱基后得到的SaCas9sgRNA结构，将该改造后的SaCas9 sgRNA记作+5bp sgRNA，将+5bp sgRNA中的sgRNA骨架记作+5bp sgRNA骨架，+5bp sgRNA骨架的RNA序列如下：GUUUUAGUACUCUGUAAUUGAAAAA UUACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAU(序列10，下划线所示的序列为增加的5对碱基)；+5bp sgRNA骨架的DNA序列如序列6所示。

O+8bp表示在未经改造的SaCas9 sgRNA结构基础上添加8对碱基后得到的SaCas9sgRNA结构，将该改造后的SaCas9 sgRNA记作+8bp sgRNA，将+8bp sgRNA中的sgRNA骨架记作+8bp sgRNA骨架，+8bp sgRNA骨架的RNA序列如下：GUUUUAGUACUCUGUAAUUUUAGAAAUAAAAUUACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAU(下划线所示的序列为增加的8对碱基)；+8bp sgRNA骨架的DNA序列如序列7所示。

实施例2、改造的SaCas9 sgRNA在提高SaKKHn&PmCDA1&UGI碱基编辑系统的C·T碱基替换效率中的应用

一、重组表达载体的构建

人工合成如下重组表达载体，各表达载体均为环状质粒：

两个含有Original sgRNA的重组表达载体：SaKKHn-pBE-1和SaKKHn-pBE-2；

两个含有+5bp sgRNA的重组表达载体：SaKKHn-pBE+5bp-1和SaKKHn-pBE+5bp-2；

两个含有+8bp sgRNA的重组表达载体：SaKKHn-pBE+8bp-1和SaKKHn-pBE+8bp-2。

SaKKHn-pBE-1重组表达载体的核苷酸序列为序列表中的序列1。其中，序列1的第131-467位为OsU3启动子的核苷酸序列，第474-550位和第648-724位均为tRNA的核苷酸序列，第551-647位和第725-821位分别为靶向OsWaxy基因的两个sgRNA的核苷酸序列，这两个sgRNA的共同sgRNA骨架(Original sgRNA骨架)的DNA序列为序列1的第571-647位或序列1的第745-821位，第996-1286位为OsU3终止子的核苷酸序列；序列1的第1293-3006位为OsUbq3启动子的核苷酸序列，第3013-6225位为SaKKHn蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列2所示的SaKKHn蛋白质；序列1的第6511-7134位为PmCDA1蛋白质的编码序列(不含有终止密码子)，编码序列3所示的PmCDA1蛋白质；序列1的第7156-7452位为UGI蛋白质的编码序列，编码序列4所示的UGI蛋白质；序列1的第7459-7653位为35S终止子的核苷酸序列；序列1的第7728-9720位为ZmUbi1启动子的核苷酸序列，第9727-10749位为潮霉素磷酸转移酶的编码序列，第10779-10994位为CaMV35S polyA的核苷酸序列。SaKKHn-pBE-1重组表达载体中的两个靶点分别为T1和T2，序列见表1。

SaKKHn-pBE-2重组表达载体的核苷酸序列为将序列1第474-995位替换为序列5，且保持其他序列不变后得到的序列。其中，序列5的第1-77位和第175-251位均为tRNA的核苷酸序列，第78-174位和第252-348位分别为靶向OsNRT1.1B基因和OsGRF4基因的两个sgRNA的核苷酸序列。第98-174位和第272-348位为Original sgRNA骨架的DNA序列。SaKKHn-pBE-2重组表达载体中的两个靶点分别为T3和T4，序列见表1。

SaKKHn-pBE+5bp-1重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-1重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列均替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

SaKKHn-pBE+5bp-2重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-2重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列均替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

SaKKHn-pBE+8bp-1重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-1重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列均替换为序列7所示的+8bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

SaKKHn-pBE+8bp-2重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-2重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列均替换为序列7所示的+8bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

各载体的靶点核苷酸序列及相应的PAM序列如表1所示。

表1

二、水稻阳性T0苗的获得

将步骤一获得的SaKKHn-pBE-1载体，SaKKHn-pBE-2载体，SaKKHn-pBE+5bp-1载体，SaKKHn-pBE+5bp-2载体，SaKKHn-pBE+8bp-1载体和SaKKHn-pBE+8bp-2载体分别按照如下步骤1-9进行操作：

1、将载体导入农杆菌EHA105(上海唯地生物技术有限公司的产品，CAT#:AC1010)，得到重组农杆菌。

2、采用培养基(含50μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的YEP培养基)培养重组农杆菌，28℃，150rpm震荡培养至OD₆₀₀为1.0-2.0，室温条件下，10000rpm离心1min，用侵染液(将N6液体培养基中的糖替换为葡萄糖和蔗糖，葡萄糖和蔗糖在侵染液中的浓度分别为10g/L和20g/L)重悬菌体并稀释至OD₆₀₀为0.2，得到农杆菌侵染液。

3、水稻品种日本晴成熟种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(v/v)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于N6固体培养基上，28℃暗培养4-6周，得到水稻愈伤。

4、完成步骤3后，将水稻愈伤浸泡置于农杆菌侵染液甲(农杆菌侵染液甲为向农杆菌侵染液中加入乙酰丁香酮得到的液体，乙酰丁香酮的添加量满足乙酰丁香酮与农杆菌侵染液的体积比为25μl：50ml)中浸泡10min，然后，放在铺有两层灭菌滤纸的培养皿(内含约200ml不含农杆菌的侵染液)上，21℃暗培养1天。

5、取步骤4得到的水稻愈伤放入恢复培养基上，25-28℃暗培养3天。

6、取步骤5得到的水稻愈伤，置于筛选培养基上，28℃暗培养2周。

7、取步骤6得到的水稻愈伤，再次置于筛选培养基上，28℃暗培养2周，得到水稻抗性愈伤。

8、取步骤7得到的水稻抗性愈伤放入分化培养基上，25℃光照培养1个月左右，将分化出来的小苗移至生根培养基上，25℃光照培养2周，获取水稻T0苗。

9、提取水稻T0苗的基因组DNA并以其作为模板，采用引物F(5’-attatgtagcttgtgcgtttcg-3’)和引物R(5’-ctccacctcattgacattatgc-3’)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；将该PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有约898bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗为水稻阳性T0苗；如果PCR扩增产物中不含有约898bp的DNA片段，则相应的水稻T0苗不为水稻阳性T0苗。

三、结果分析

1、每载体分别取步骤二所获得的水稻阳性T0苗的基因组DNA作为模板，对于T1靶点，采用引物对T1进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于T2靶点，采用引物对T2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于T3靶点，采用引物对T3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于T4靶点，采用引物对T4进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。测序结果只针对各靶点区进行分析。分别统计T1、T2、T3和T4的发生C·T碱基替换的阳性T0苗数，计算得出C·T碱基替换效率，结果见表2。

结果表明，对所有四个靶点，与使用Original sgRNA的SaKKHn&PmCDA1&UGI碱基编辑系统相比，使用+5bp sgRNA的SaKKHn&PmCDA1&UGI碱基编辑系统均能够提高C·T碱基替换效率。而使用+8bp sgRNA的SaKKHn&PmCDA1&UGI碱基编辑系统则表现不稳定，对T2、T3和T4靶点均不同程度的提高了C·T碱基替换效率，但对T1靶点却一定程度的降低了C·T碱基替换效率。整体增效水平上，使用+5bp sgRNA的SaKKHn&PmCDA1&UGI碱基编辑系统实现C·T碱基替换的效率优于+8bp sgRNA的SaKKHn&PmCDA1&UGI碱基编辑系统。

表2

实施例3、+5bp sgRNA在提高SaKKHn&PmCDA1&UGI碱基编辑系统的C·T碱基替换效率中的应用

一、重组表达载体的构建

人工合成如下重组表达载体，各表达载体均为环状质粒：

四个含有Original sgRNA的重组表达载体：SaKKHn-pBE-3、SaKKHn-pBE-4、SaKKHn-pBE-5和SaKKHn-pBE-6；

四个含有+5bp sgRNA的重组表达载体：SaKKHn-pBE+5bp-3、SaKKHn-pBE+5bp-4、SaKKHn-pBE+5bp-5和SaKKHn-pBE+5bp-6。

SaKKHn-pBE-3重组表达载体的核苷酸序列为将序列1第474-995位替换为序列8，且保持其他序列不变后得到的序列。其中，序列8的第1-77位为tRNA的核苷酸序列，第78-174位为靶向OsWaxy基因的sgRNA的核苷酸序列，第98-174位为Original sgRNA骨架的DNA序列。SaKKHn-pBE-3重组表达载体中的靶点为T5，序列见表3。

SaKKHn-pBE-4重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-3重组表达载体序列中的T5靶点序列替换为T6靶点序列，且保持其他序列不变后得到的序列。T6靶点序列见表3。

SaKKHn-pBE-5重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-3重组表达载体序列中的T5靶点序列替换为T7靶点序列，且保持其他序列不变后得到的序列。T7靶点序列见表3。

SaKKHn-pBE-6重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-3重组表达载体序列中的T5靶点序列替换为T8靶点序列，且保持其他序列不变后得到的序列。T8靶点序列见表3。

SaKKHn-pBE+5bp-3重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-3重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

SaKKHn-pBE+5bp-4重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-4重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

SaKKHn-pBE+5bp-5重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-5重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

SaKKHn-pBE+5bp-6重组表达载体的核苷酸序列为将SaKKHn-pBE-6重组表达载体序列中Original sgRNA骨架的DNA序列替换为序列6所示的+5bp sgRNA骨架的DNA序列，且保持其他序列不变后得到的序列。

各载体的靶点核苷酸序列及相应的PAM序列如表3所示。

表3

靶点名称	靶标基因	靶点序列(5′-3′)	PAM	重组表达载体名称
					T5	OsWaxy	tcctcggcgtagtacgggct	CACGGT	SaKKHn-pBE-3；SaKKHn-pBE+5bp-3
T6	OsWaxy	tatccgggcaaggtgagggc	CGTGGT	SaKKHn-pBE-4；SaKKHn-pBE+5bp-4
					T7	OsGRF4	acgccggcaccgccctggct	CTGGGT	SaKKHn-pBE-5；SaKKHn-pBE+5bp-5
T8	OsALS	cccaagcatgcgcagggaca	ACGGGT	SaKKHn-pBE-6；SaKKHn-pBE+5bp-6

二、水稻阳性T0苗的获得

将步骤一构建的SaKKHn-pBE-3载体，SaKKHn-pBE-4载体，SaKKHn-pBE-5载体，SaKKHn-pBE-6载体，SaKKHn-pBE+5bp-3载体，SaKKHn-pBE+5bp-4载体，SaKKHn-pBE+5bp-5载体和SaKKHn-pBE+5bp-6载体分别按照实施例2中步骤二的1-9进行操作，得到水稻阳性T0苗。

三、结果分析

1、每载体分别取步骤二所获得的水稻阳性T0苗的基因组DNA作为模板，对于T5靶点，采用引物对T5进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于T6靶点，采用引物对T6进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于T7靶点，采用引物对T4进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对于T8靶点，采用引物对T8进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

2、将步骤1得到的PCR扩增产物进行Sanger测序及分析。测序结果只针对各靶点区进行分析。分别统计T5、T6、T7和T8的发生C·T碱基替换的阳性T0苗数，计算得出C·T碱基替换效率，结果见表4。

结果表明，对所有五个靶点，与使用Original sgRNA的SaKKHn&PmCDA1&UGI碱基编辑系统相比，使用+5bp sgRNA的SaKKHn&PmCDA1&UGI碱基编辑系统均能够提高C·T碱基替换效率。

表4

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种改造的sgRNA及其在提高碱基编辑效率中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17400

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggtggcagga tatattgtgg tgtaaacatg gcactagcct caccgtcttc gcagacgagg 60

ccgctaagtc gcagctacgc tctcaacggc actgactagg tagtttaaac gtgcacttaa 120

ttaaggtacc gaagcaactt aaagttatca ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg 180

tgcagtcagg gaccatagca caagacaggc gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg 240

gaagccggga acactgggta cgttggaaac cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt 300

aggagaaaag catttcgtag tgggccatga agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg 360

ccggcccatt acgcaattgg acgacaacaa agactagtat tagtaccacc tcggctatcc 420

acatagatca aagctgattt aaaagagttg tgcagatgat ccgtggcgga tccaacaaag 480

caccagtggt ctagtggtag aatagtaccc tgccacggta cagacccggg ttcgattccc 540

ggctggtgca catccaatgc gatgatcaag gttttagtac tctggaaaca gaatctacta 600

aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagataac aaagcaccag 660

tggtctagtg gtagaatagt accctgccac ggtacagacc cgggttcgat tcccggctgg 720

tgcaaatcac cagtggaagc taaggtttta gtactctgga aacagaatct actaaaacaa 780

ggcaaaatgc cgtgtttatc tcgtcaactt gttggcgaga taacaaagca ccagtggtct 840

agtggtagaa tagtaccctg ccacggtaca gacccgggtt cgattcccgg ctggtgcaac 900

cggatttgaa cgatggacgt tttagtactc tggaaacaga atctactaaa acaaggcaaa 960

atgccgtgtt tatctcgtca acttgttggc gagatttttt tttttcgttt tgcattgagt 1020

tttctccgtc gcatgtttgc agttttattt tccgttttgc attgaaattt ctccgtctca 1080

tgtttgcagc gtgttcaaaa agtacgcagc tgtatttcac ttatttacgg cgccacattt 1140

tcatgccgtt tgtgccaact atcccgagct agtgaataca gcttggcttc acacaacact 1200

ggtgacccgc tgacctgctc gtacctcgta ccgtcgtacg gcacagcatt tggaattaaa 1260

gggtgtgatc gatactgctt gctgctaagc ttacaaattc gggtcaaggc ggaagccagc 1320

gcgccacccc acgtcagcaa atacggaggc gcggggttga cggcgtcacc cggtcctaac 1380

ggcgaccaac aaaccagcca gaagaaatta cagtaaaaaa aaagtaaatt gcactttgat 1440

ccacctttta ttacctaagt ctcaatttgg atcaccctta aacctatctt ttcaatttgg 1500

gccgggttgt ggtttggact accatgaaca acttttcgtc atgtctaact tccctttcag 1560

caaacatatg aaccatatat agaggagatc ggccgtatac tagagctgat gtgtttaagg 1620

tcgttgattg cacgagaaaa aaaaatccaa atcgcaacaa tagcaaattt atctggttca 1680

aagtgaaaag atatgtttaa aggtagtcca aagtaaaact tatagataat aaaatgtggt 1740

ccaaagcgta attcactcaa aaaaaatcaa cgagacgtgt accaaacgga gacaaacggc 1800

atcttctcga aatttcccaa ccgctcgctc gcccgcctcg tcttcccgga aaccgcggtg 1860

gtttcagcgt ggcggattct ccaagcagac ggagacgtca cggcacggga ctcctcccac 1920

cacccaaccg ccataaatac cagccccctc atctcctctc ctcgcatcag ctccaccccc 1980

gaaaaatttc tccccaatct cgcgaggctc tcgtcgtcga atcgaatcct ctcgcgtcct 2040

caaggtacgc tgcttctcct ctcctcgctt cgtttcgatt cgatttcgga cgggtgaggt 2100

tgttttgttg ctagatccga ttggtggtta gggttgtcga tgtgattatc gtgagatgtt 2160

taggggttgt agatctgatg gttgtgattt gggcacggtt ggttcgatag gtggaatcgt 2220

ggttaggttt tgggattgga tgttggttct gatgattggg gggaattttt acggttagat 2280

gaattgttgg atgattcgat tggggaaatc ggtgtagatc tgttggggaa ttgtggaact 2340

agtcatgcct gagtgattgg tgcgatttgt agcgtgttcc atcttgtagg ccttgttgcg 2400

agcatgttca gatctactgt tccgctcttg attgagttat tggtgccatg ggttggtgca 2460

aacacaggct ttaatatgtt atatctgttt tgtgtttgat gtagatctgt agggtagttc 2520

ttcttagaca tggttcaatt atgtagcttg tgcgtttcga tttgatttca tatgttcaca 2580

gattagataa tgatgaactc ttttaattaa ttgtcaatgg taaataggaa gtcttgtcgc 2640

tatatctgtc ataatgatct catgttacta tctgccagta atttatgcta agaactatat 2700

tagaatatca tgttacaatc tgtagtaata tcatgttaca atctgtagtt catctatata 2760

atctattgtg gtaatttctt tttactatct gtgtgaagat tattgccact agttcattct 2820

acttatttct gaagttcagg atacgtgtgc tgttactacc tatctgaata catgtgtgat 2880

gtgcctgtta ctatcttttt gaatacatgt atgttctgtt ggaatatgtt tgctgtttga 2940

tccgttgttg tgtccttaat cttgtgctag ttcttaccct atctgtttgg tgattatttc 3000

ttgcagtacg taatggctcc taagaagaag cggaaggttg gcatccacgg tgtcccggcg 3060

gcaaagagaa actacatcct gggtctggcc atcggtatta catcggtggg ctacggcatc 3120

atcgactacg agacaaggga tgtcatcgat gccggcgtcc ggctcttcaa ggaggccaac 3180

gtggagaata acgagggcag gcgctccaag cgcggcgcgc ggaggctgaa gcgcaggcgg 3240

aggcatcgca tccagcgggt gaagaagctc ctcttcgact acaatctgct cacggatcat 3300

tccgagctgt ctggcatcaa cccatacgag gcgcgggtga agggcctgtc ccagaagctc 3360

tcggaggagg agttctcggc ggccctgctg catctcgcga agaggcgcgg cgtgcataat 3420

gtcaatgagg tggaggagga taccggcaat gagctgtcaa ccaaggagca gatcagcagg 3480

aactccaagg cgctggagga gaagtatgtg gcggagctcc agctcgagag gctgaagaag 3540

gatggcgagg tccggggctc catcaatagg ttcaagacat cggactacgt gaaggaggcc 3600

aagcagctcc tgaaggtgca gaaggcgtac caccagctgg accagagctt catcgacacc 3660

tacatcgatc tgctcgagac acgccggacg tactacgagg gcccgggcga gggctcaccg 3720

ttcggctgga aggacatcaa ggagtggtac gagatgctga tgggccactg cacctacttc 3780

cctgaggagc tgaggagcgt gaagtacgcg tacaatgcgg acctctacaa cgccctgaac 3840

gacctcaata acctcgtgat cacgcgcgac gagaatgaga agctcgagta ctacgagaag 3900

ttccagatca tcgagaacgt gttcaagcag aagaagaagc cgaccctcaa gcagatcgcc 3960

aaggagatcc tcgtcaatga ggaggacatc aagggctaca gggtgacctc gaccggcaag 4020

ccagagttca ccaacctgaa ggtctaccac gacatcaagg atatcaccgc ccgcaaggag 4080

atcatcgaga atgcggagct cctggatcag atcgcgaaga tcctcaccat ctaccagtcc 4140

agcgaggaca tccaggagga gctcacgaac ctgaatagcg agctgaccca ggaggagatc 4200

gagcagatct ccaacctcaa gggctacacc ggcacgcaca atctgagcct caaggcgatc 4260

aatctcatcc tcgatgagct ctggcataca aatgataacc agatcgccat cttcaatcgc 4320

ctcaagctgg tcccaaagaa ggtcgatctg tcgcagcaga aggagatccc aacgacactg 4380

gtcgatgact tcatcctctc acctgtcgtg aagaggtcgt tcatccagtc gatcaaggtc 4440

atcaatgcga tcatcaagaa gtacggcctc cctaatgata tcatcatcga gctggcccgc 4500

gagaagaatt caaaggacgc gcagaagatg atcaacgaga tgcagaagag gaatcggcag 4560

acaaacgagc gcatcgagga gatcatccgc acaaccggca aggagaatgc caagtacctg 4620

atcgagaaga tcaagctgca tgacatgcag gagggcaagt gcctctactc actggaggcc 4680

atcccactcg aggacctgct gaataaccca ttcaattacg aggtcgacca tatcatcccg 4740

cgctccgtgt cgttcgacaa ttccttcaat aacaaggtcc tcgtcaagca ggaggagaac 4800

tccaagaagg gcaatcgcac cccgttccag tacctgtcct cttcggacag caagatctct 4860

tacgagacat tcaagaagca catcctcaac ctggccaagg gcaagggccg gatctccaag 4920

accaagaagg agtacctcct ggaggagagg gatatcaacc ggttcagcgt gcagaaggac 4980

ttcatcaatc gcaacctggt cgatacccgg tacgccacca ggggcctcat gaacctgctc 5040

cggtcctact tccgggtgaa caatctcgac gtgaaggtca agagcatcaa cggcggcttc 5100

acctcgttcc tcaggcggaa gtggaagttc aagaaggagc ggaacaaggg ctacaagcac 5160

catgccgagg acgccctcat catcgcgaac gcggacttca tcttcaagga gtggaagaag 5220

ctcgataagg cgaagaaggt catggagaac cagatgttcg aggagaagca ggccgagtcg 5280

atgccagaga tcgagacaga gcaggagtac aaggagatct tcatcacccc gcaccagatc 5340

aagcacatca aggacttcaa ggactacaag tactcccatc gggtcgataa gaagccaaat 5400

cggaagctca tcaatgatac cctctactcg acacgcaagg atgacaaggg caacaccctg 5460

atcgtcaata acctcaatgg cctctacgac aaggataacg acaagctgaa gaagctcatc 5520

aacaagagcc cagagaagct cctcatgtac caccacgatc cgcagacata ccagaagctc 5580

aagctgatca tggagcagta cggcgacgag aagaacccac tctacaagta ctacgaggag 5640

acaggcaact acctgaccaa gtactccaag aaggacaatg gcccagtgat caagaagatc 5700

aagtactacg gcaataagct gaacgcccac ctcgatatca cggacgatta ccctaacagc 5760

cggaataagg tggtcaagct gtccctcaag ccgtaccgct tcgacgtcta cctggataac 5820

ggcgtctaca agttcgtgac agtcaagaat ctcgacgtca tcaagaagga gaactactac 5880

gaggtcaatt ctaagtgcta cgaggaggcc aagaagctca agaagatcag caaccaggcc 5940

gagttcatcg ccagcttcta caagaacgat ctgatcaaga tcaacggcga gctctacagg 6000

gtcatcggcg tgaacaatga cctgctcaat aggatcgagg tgaacatgat cgacatcacc 6060

taccgcgagt acctcgagaa catgaacgat aagcggcctc cacacatcat caagacaatc 6120

gcctctaaga cccagtccat caagaagtac tccacggata tcctcggcaa cctctacgag 6180

gtgaagtcaa agaagcaccc gcagatcatc aagaagggct cggctggagg aggaggcacg 6240

ggaggaggag gctccgccga gtatgtgcgc gcgctcttcg acttcaacgg caatgacgag 6300

gaggatctcc ctttcaagaa gggcgacatc ctccgcatcc gcgataagcc ggaggagcag 6360

tggtggaacg cagaggactc cgagggcaag cggggcatga tcctggtgcc atacgtcgag 6420

aagtacagcg gcgattacaa ggaccacgat ggcgactaca aggatcatga catcgattac 6480

aaggacgatg acgataagtc cggcgtcgac atgacggacg cggagtatgt gcgcatccac 6540

gagaagctcg atatctacac cttcaagaag cagttcttca acaataagaa gtcggtgtcc 6600

catcggtgct acgtcctctt cgagctgaag cgcaggggag agcgccgcgc ctgcttctgg 6660

ggctacgcgg tgaataagcc gcagtcaggc acagagcgcg gcatccacgc cgagatcttc 6720

tcgatccgga aggtcgagga gtacctccgc gacaacccag gccagttcac gatcaattgg 6780

tactccagct ggtccccttg cgcagattgc gcagagaaga tcctcgagtg gtacaaccag 6840

gagctgaggg gcaatggcca taccctcaag atctgggcct gcaagctgta ctacgagaag 6900

aacgcgagga atcagatcgg cctctggaac ctgcgggata atggcgtggg cctcaacgtg 6960

atggtgtccg agcactacca gtgctgccgc aagatcttca tccagtcctc ccacaatcag 7020

ctgaacgaga ataggtggct cgaaaagacc ctgaagcgcg ccgagaagtg gaggagcgag 7080

ctgtctatca tgatccaggt caagatcctg cacaccacaa agtcaccggc ggtgggcggc 7140

ggcggcagcg aattctccgg cggcagcacg aacctcagcg acatcatcga gaaggagaca 7200

ggcaagcagc tcgtgatcca ggagtctatc ctcatgctgc ctgaggaggt ggaggaggtc 7260

atcggcaaca agccggagtc cgatatcctc gtgcacaccg cctacgacga gtcgacagat 7320

gagaatgtca tgctcctgac ctccgacgca ccagagtaca agccatgggc gctcgtgatc 7380

caggattcca acggcgagaa taagatcaag atgctgtctg gcggctcccc gaagaagaag 7440

cgcaaggtct agactagtct gaaatcacca gtctctctct acaaatctat ctctctctat 7500

aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg aattagggtt cttatagggt ttcgctcatg 7560

tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata 7620

aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag tggggcgccc gacctgtact cgcgaaggtt 7680

aacttacaga gagtgtccgg gcgcgcctgg tggatcgtcc gcctaggctg cagtgcagcg 7740

tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc atgtctaagt tataaaaaat 7800

taccacatat tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt ttatctatct ttatacatat 7860

atttaaactt tactctacga ataatataat ctatagtact acaataatat cagtgtttta 7920

gagaatcata taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga caattgagta ttttgacaac 7980

aggactctac agttttatct ttttagtgtg catgtgttct cctttttttt tgcaaatagc 8040

ttcacctata taatacttca tccattttat tagtacatcc atttagggtt tagggttaat 8100

ggtttttata gactaatttt tttagtacat ctattttatt ctattttagc ctctaaatta 8160

agaaaactaa aactctattt tagttttttt atttaataat ttagatataa aatagaataa 8220

aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa ttaaaaaaac taaggaaaca 8280

tttttcttgt ttcgagtaga taatgccagc ctgttaaacg ccgtcgacga gtctaacgga 8340

caccaaccag cgaaccagca gcgtcgcgtc gggccaagcg aagcagacgg cacggcatct 8400

ctgtcgctgc ctctggaccc ctctcgagag ttccgctcca ccgttggact tgctccgctg 8460

tcggcatcca gaaattgcgt ggcggagcgg cagacgtgag ccggcacggc aggcggcctc 8520

ctcctcctct cacggcaccg gcagctacgg gggattcctt tcccaccgct ccttcgcttt 8580

cccttcctcg cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac accctctttc cccaacctcg 8640

tgttgttcgg agcgcacaca cacacaacca gatctccccc aaatccaccc gtcggcacct 8700

ccgcttcaag gtacgccgct cgtcctcccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg 8760

cgttccggtc catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc 8820

gtgtttgtgt tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac 8880

acgttctgat tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc 8940

gttccgcaga cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg 9000

cccttttcct ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct 9060

tttttttgtc ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag 9120

aattctgttt caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata 9180

catattcata gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac 9240

atgttgatgc gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga 9300

tgatgtggtg tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca 9360

aactacctgg tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt 9420

tacgagttta agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt 9480

ttactgatgc atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt 9540

acctatctat tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga tatacttgga 9600

tgatggcata tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta 9660

tttgcttggt actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag 9720

gagctcatga aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct gatcgaaaag 9780

ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg tgctttcagc 9840

ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga tggtttctac 9900

aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc ggaagtgctt 9960

gacattgggg agtttagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgttc acagggtgtc 10020

acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tacaaccggt cgcggaggct 10080

atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc attcggaccg 10140

caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc tgatccccat 10200

gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc gcaggctctc 10260

gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt gcacgcggat 10320

ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat tgactggagc 10380

gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg gaggccgtgg 10440

ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga gcttgcagga 10500

tcgccacgac tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta tcagagcttg 10560

gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc aatcgtccga 10620

tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc cgtctggacc 10680

gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac tcgtccgagg 10740

gcaaagaaat agagtagatg ccgaccggga tctgtcgatc gacaagctcg agtttctcca 10800

taataatgtg tgagtagttc ccagataagg gaattagggt tcctataggg tttcgctcat 10860

gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat 10920

aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca gtactaaaat ccagatcccc cgaattaatt 10980

cggcgttaat tcagcctgca ggacgcgttt aattaagtgc acgcggccgc ctacttagtc 11040

aagagcctcg cacgcgactg tcacgcggcc aggatcgcct cgtgagcctc gcaatctgta 11100

cctagtgttt aaactatcag tgtttgacag gatatattgg cgggtaaacc taagagaaaa 11160

gagcgtttat tagaataacg gatatttaaa agggcgtgaa aaggtttatc cgttcgtcca 11220

tttgtatgtg catgccaacc acagggttcc cctcgggatc aaagtacttt gatccaaccc 11280

ctccgctgct atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc agccgtcttc tgaaaacgac 11340

atgtcgcaca agtcctaagt tacgcgacag gctgccgccc tgcccttttc ctggcgtttt 11400

cttgtcgcgt gttttagtcg cataaagtag aatacttgcg actagaaccg gagacattac 11460

gccatgaaca agagcgccgc cgctggcctg ctgggctatg cccgcgtcag caccgacgac 11520

caggacttga ccaaccaacg ggccgaactg cacgcggccg gctgcaccaa gctgttttcc 11580

gagaagatca ccggcaccag gcgcgaccgc ccggagctgg ccaggatgct tgaccaccta 11640

cgccctggcg acgttgtgac agtgaccagg ctagaccgcc tggcccgcag cacccgcgac 11700

ctactggaca ttgccgagcg catccaggag gccggcgcgg gcctgcgtag cctggcagag 11760

ccgtgggccg acaccaccac gccggccggc cgcatggtgt tgaccgtgtt cgccggcatt 11820

gccgagttcg agcgttccct aatcatcgac cgcacccgga gcgggcgcga ggccgccaag 11880

gcccgaggcg tgaagtttgg cccccgccct accctcaccc cggcacagat cgcgcacgcc 11940

cgcgagctga tcgaccagga aggccgcacc gtgaaagagg cggctgcact gcttggcgtg 12000

catcgctcga ccctgtaccg cgcacttgag cgcagcgagg aagtgacgcc caccgaggcc 12060

aggcggcgcg gtgccttccg tgaggacgca ttgaccgagg ccgacgccct ggcggccgcc 12120

gagaatgaac gccaagagga acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt 12180

ttttcattac cgaagagatc gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc 12240

ccgcgcacgt ctcaaccgtg cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc 12300

tggcggcctg gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt 12360

gatgtgtatt tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag 12420

taaataaaca aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg 12480

cgggtcaggc aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc 12540

cgatgttctg ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg 12600

ggaagatcaa ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa 12660

ggccatcggc cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc 12720

tgtgtccgcg atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga 12780

catatgggcc accgccgacc tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg 12840

aaggctacaa gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga 12900

ggttgccgag gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg 12960

cgtgagctac ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg 13020

cgacgctgcc cgcgaggtcc aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt 13080

taatgaggta aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc 13140

gcacgcagca gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg 13200

gtcaactttc agttgccggc ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa 13260

ggcaagacca ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc 13320

aaatgaataa atgagtagat gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga 13380

acaaccaggc accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg 13440

cgtaagcggc tgggttgtct gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga 13500

atcggcgtga cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg 13560

acctggtgga gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag 13620

cacgccccgg tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac 13680

cgccggcagc cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt 13740

ttttcgttcc gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg 13800

ccgttttccg tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc 13860

cagacgggca cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg 13920

acctggtact gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga 13980

agggagacaa gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc 14040

ggcgagccga tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca 14100

ccacgcacgt tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat 14160

ccgagggtga agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg 14220

agtacatcga gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc 14280

cggacgtgct gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc 14340

tctaccgcct ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga 14400

tctacgaacg cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc 14460

tgatcgggtc aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc 14520

cgatcctagt catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat 14580

gtacggagca gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct 14640

ttcctgtgga tagcacgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt 14700

acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa 14760

aagagaaaaa aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa 14820

cccgcctggc ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc 14880

ctacccttcg gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg 14940

ctggccgctc aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg 15000

cgccgtcgcc actcgaccgc cggcgcccac atcaaggcac cctgcctcgc gcgtttcggt 15060

gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa 15120

gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg 15180

ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg 15240

catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg 15300

taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 15360

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 15420

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 15480

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 15540

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 15600

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 15660

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 15720

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 15780

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 15840

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 15900

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg 15960

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 16020

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 16080

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 16140

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgcattctag gtactaaaac aattcatcca 16200

gtaaaatata atattttatt ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata 16260

gctcgacata ctgttcttcc ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt 16320

cataccactt gtccgccctg ccgcttctcc caagatcaat aaagccactt actttgccat 16380

ctttcacaaa gatgttgctg tctcccaggt cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg 16440

gcttttccgt ctttaaaaaa tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt 16500

cccagttttc gcaatccaca tcggccagat cgttattcag taagtaatcc aattcggcta 16560

agcggctgtc taagctattc gtatagggac aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc 16620

tgatgcactc cgcatacagc tcgataatct tttcagggct ttgttcatct tcatactctt 16680

ccgagcaaag gacgccatcg gcctcactca tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt 16740

caaagtgcag gacctttgga acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt 16800

cccgttccac atcataggtg gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt 16860

tttcattttc tcccaccagc ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta 16920

cgcagcggta tttttcgatc agttttttca attccggtga tattctcatt ttagccattt 16980

attatttcct tcctcttttc tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa 17040

gacgaactcc aattcactgt tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt 17100

ttcaaagttg ttttcaaagt tggcgtataa catagtatcg acggagccga ttttgaaacc 17160

gcggtgatca caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga 17220

gatcatccgt gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac 17280

atgagcaaag tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg 17340

ctgcctgtat cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct 17400

<210> 2

<211> 1071

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly Val Pro Ala

1 5 10 15

Ala Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Ala Ile Gly Ile Thr Ser Val

20 25 30

Gly Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly

35 40 45

Val Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg

50 55 60

Ser Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile

65 70 75 80

Gln Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His

85 90 95

Ser Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu

100 105 110

Ser Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu

115 120 125

Ala Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr

130 135 140

Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala

145 150 155 160

Leu Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys

165 170 175

Asp Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr

180 185 190

Val Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln

195 200 205

Leu Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg

210 215 220

Arg Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys

225 230 235 240

Asp Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe

245 250 255

Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr

260 265 270

Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn

275 280 285

Glu Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe

290 295 300

Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu

305 310 315 320

Val Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys

325 330 335

Pro Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr

340 345 350

Ala Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala

355 360 365

Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu

370 375 380

Thr Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser

385 390 395 400

Asn Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile

405 410 415

Asn Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala

420 425 430

Ile Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln

435 440 445

Gln Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro

450 455 460

Val Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile

465 470 475 480

Ile Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg

485 490 495

Glu Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys

500 505 510

Arg Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr

515 520 525

Gly Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp

530 535 540

Met Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu

545 550 555 560

Asp Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro

565 570 575

Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys

580 585 590

Gln Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu

595 600 605

Ser Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile

610 615 620

Leu Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu

625 630 635 640

Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp

645 650 655

Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu

660 665 670

Met Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys

675 680 685

Val Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp

690 695 700

Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp

705 710 715 720

Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys

725 730 735

Leu Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys

740 745 750

Gln Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu

755 760 765

Ile Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp

770 775 780

Tyr Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Lys Leu Ile

785 790 795 800

Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu

805 810 815

Ile Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu

820 825 830

Lys Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His

835 840 845

Asp Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly

850 855 860

Asp Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr

865 870 875 880

Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile

885 890 895

Lys Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp

900 905 910

Tyr Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr

915 920 925

Arg Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val

930 935 940

Lys Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser

945 950 955 960

Lys Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala

965 970 975

Glu Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly

980 985 990

Glu Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile

995 1000 1005

Glu Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr Arg Glu Tyr Leu Glu Asn Met

1010 1015 1020

Asn Asp Lys Arg Pro Pro His Ile Ile Lys Thr Ile Ala Ser Lys Thr

1025 1030 1035 1040

Gln Ser Ile Lys Lys Tyr Ser Thr Asp Ile Leu Gly Asn Leu Tyr Glu

1045 1050 1055

Val Lys Ser Lys Lys His Pro Gln Ile Ile Lys Lys Gly Ser Ala

1060 1065 1070

<210> 3

<211> 208

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Thr Asp Ala Glu Tyr Val Arg Ile His Glu Lys Leu Asp Ile Tyr

1 5 10 15

Thr Phe Lys Lys Gln Phe Phe Asn Asn Lys Lys Ser Val Ser His Arg

20 25 30

Cys Tyr Val Leu Phe Glu Leu Lys Arg Arg Gly Glu Arg Arg Ala Cys

35 40 45

Phe Trp Gly Tyr Ala Val Asn Lys Pro Gln Ser Gly Thr Glu Arg Gly

50 55 60

Ile His Ala Glu Ile Phe Ser Ile Arg Lys Val Glu Glu Tyr Leu Arg

65 70 75 80

Asp Asn Pro Gly Gln Phe Thr Ile Asn Trp Tyr Ser Ser Trp Ser Pro

85 90 95

Cys Ala Asp Cys Ala Glu Lys Ile Leu Glu Trp Tyr Asn Gln Glu Leu

100 105 110

Arg Gly Asn Gly His Thr Leu Lys Ile Trp Ala Cys Lys Leu Tyr Tyr

115 120 125

Glu Lys Asn Ala Arg Asn Gln Ile Gly Leu Trp Asn Leu Arg Asp Asn

130 135 140

Gly Val Gly Leu Asn Val Met Val Ser Glu His Tyr Gln Cys Cys Arg

145 150 155 160

Lys Ile Phe Ile Gln Ser Ser His Asn Gln Leu Asn Glu Asn Arg Trp

165 170 175

Leu Glu Lys Thr Leu Lys Arg Ala Glu Lys Trp Arg Ser Glu Leu Ser

180 185 190

Ile Met Ile Gln Val Lys Ile Leu His Thr Thr Lys Ser Pro Ala Val

195 200 205

<210> 4

<211> 98

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Ser Gly Gly Ser Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly

1 5 10 15

Lys Gln Leu Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val

20 25 30

Glu Glu Val Ile Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr

35 40 45

Ala Tyr Asp Glu Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp

50 55 60

Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly

65 70 75 80

Glu Asn Lys Ile Lys Met Leu Ser Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg

85 90 95

Lys Val

<210> 5

<211> 522

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60

gattcccggc tggtgcagat gccacacagc aaggagtgtt ttagtactct ggaaacagaa 120

tctactaaaa caaggcaaaa tgccgtgttt atctcgtcaa cttgttggcg agataacaaa 180

gcaccagtgg tctagtggta gaatagtacc ctgccacggt acagacccgg gttcgattcc 240

cggctggtgc acagaaccga caacagatga ggttttagta ctctggaaac agaatctact 300

aaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagataa caaagcacca 360

gtggtctagt ggtagaatag taccctgcca cggtacagac ccgggttcga ttcccggctg 420

gtgcaccagc tcatttggct cggcggtttt agtactctgg aaacagaatc tactaaaaca 480

aggcaaaatg ccgtgtttat ctcgtcaact tgttggcgag at 522

<210> 6

<211> 87

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gttttagtac tctgtaattg aaaaattaca gaatctacta aaacaaggca aaatgccgtg 60

tttatctcgt caacttgttg gcgagat 87

<210> 7

<211> 93

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

gttttagtac tctgtaattt tagaaataaa attacagaat ctactaaaac aaggcaaaat 60

gccgtgttta tctcgtcaac ttgttggcga gat 93

<210> 8

<211> 174

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60

gattcccggc tggtgcatcc tcggcgtagt acgggctgtt ttagtactct ggaaacagaa 120

tctactaaaa caaggcaaaa tgccgtgttt atctcgtcaa cttgttggcg agat 174

<210> 9

<211> 77

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca aaaugccgug uuuaucucgu 60

caacuuguug gcgagau 77

<210> 10

<211> 87

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

guuuuaguac ucuguaauug aaaaauuaca gaaucuacua aaacaaggca aaaugccgug 60

uuuaucucgu caacuuguug gcgagau 87

Claims (13)

1.成套试剂，其包括sgRNA、Cas9核酸酶或与所述Cas9核酸酶相关的生物材料、胞嘧啶脱氨酶或与所述胞嘧啶脱氨酶相关的生物材料和UGI蛋白质或与所述UGI蛋白质相关的生物材料；

所述sgRNA靶向靶点序列；

所述sgRNA如式I所示：所述靶点序列转录的RNA-改造的sgRNA骨架；

所述改造的sgRNA骨架为在sgRNA骨架第14-15位之间插入RNA片段甲，且在所述sgRNA骨架第18-19位之间插入RNA片段乙后得到的RNA分子；

所述RNA片段甲与所述RNA片段乙反向互补；

所述RNA片段甲与所述RNA片段乙大小均为5nt；

所述sgRNA骨架为序列9所示的RNA分子；

所述Cas9核酸酶为氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；与所述Cas9核酸酶相关的生物材料为编码所述Cas9核酸酶的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物；

所述胞嘧啶脱氨酶为氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；与所述胞嘧啶脱氨酶相关的生物材料为编码所述胞嘧啶脱氨酶的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物；

所述UGI蛋白质为氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；与所述UGI蛋白质相关的生物材料为编码所述UGI蛋白质的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述改造的sgRNA骨架为序列10所示的RNA分子。

3.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述sgRNA为tRNA-sgRNA；

所述tRNA-sgRNA如式Ⅱ所示：tRNA-所述靶点序列转录的RNA-改造的sgRNA骨架；

所述tRNA为将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子。

4.权利要求1-3任一所述的成套试剂在X1）-X4）中任一种中的应用：

X1）植物或植物细胞基因组靶点序列的编辑；

X2）制备植物或植物细胞基因组靶点序列的编辑的产品；

X3）提高植物或植物细胞基因组靶点序列的编辑效率；

X4）制备提高植物或植物细胞基因组靶点序列的编辑效率的产品。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述基因组靶点序列的编辑为将所述靶点序列中的C突变为T。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述植物细胞为单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为禾本科植物；所述植物细胞为禾本科植物细胞。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为水稻；所述植物细胞为水稻细胞。

9.Y1）或Y2）所述的方法：

Y1）植物或植物细胞基因组靶点序列的编辑方法或提高植物或植物细胞基因组靶点序列的编辑效率的方法，包括使植物或植物细胞内表达权利要求1-3中任一所述的sgRNA、权利要求1-3中任一所述的Cas9核酸酶、权利要求1-3中任一所述的胞嘧啶脱氨酶和权利要求1-3中任一所述的UGI蛋白质，实现基因组靶点序列的编辑；所述sgRNA靶向所述靶点序列；

Y2）植物突变体的制备方法，包括如下步骤：按照Y1）所述的方法对植物的基因组进行编辑，获得植物突变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述基因组靶点序列的编辑为将所述靶点序列中的C突变为T。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述植物细胞为单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为禾本科植物；所述植物细胞为禾本科植物细胞。

13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻；所述植物细胞为水稻细胞。

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