CN111187787A - 一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents
一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111187787A CN111187787A CN202010056776.0A CN202010056776A CN111187787A CN 111187787 A CN111187787 A CN 111187787A CN 202010056776 A CN202010056776 A CN 202010056776A CN 111187787 A CN111187787 A CN 111187787A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vector
- gene
- target gene
- expression vector
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域，所述多功能植物表达载体为Pesnoo‑eYGFPur‑apply，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。由于目的基因上下游调控元件的添加，相较于普通的以CaMV 35S promoter启动子驱动的过表达载体而言，目的基因的表达会显著增强，同时由于目的基因和eYGFPuv融合表达，eYGFPuv的表达也显著增强；在进行亚细胞定位观察时，相较于普通的亚细胞定位载体而言，转化该载体的细胞中目的基因和eYGFPuv融合蛋白亮度更高，更便于观察定位结果；用此载体进行植物遗传转化，在进行阳性检测时，仅需用uv手电筒照射组织样品或植株样品，通过观察激发出来的绿色荧光的有无即可判断是否为阳性，极大地较少了转基因样品分子检测的工作量。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
在植物分子生物学及功能基因研究中，基因过表达和亚细胞定位技术应用广泛。通常，基因过表达研究需要在植物过表达空载体上插入目的基因序列构建重组的过表达质粒载体；亚细胞定位研究则需要在亚细胞定位空载体上插入目的基因序列构建重组的亚细胞定位质粒载体；过表达和亚细胞定位研究需要分别构建相应载体，费时费力费钱。
多功能载体的使用将大大减小载体构建的工作量，省事省力省钱，在植物亚细胞定位研究中，通常将目的基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因进行融合表达，来实现目的基因翻译的蛋白的定位。而实际应用中往往存在因为所用载体上GFP表达量偏低而导致亮度不够的原因而影响实验结果，急需一种能高效表达GFP融合蛋白的亚细胞定位载体。
植物转基因一般需要将转化细胞或组织经过一段时间的组织培养再生的过程才能形成转基因植株。这个过程短则两三个月，长则十几个月甚至一年。植物转基因整个过程涉及到许多组培样品和再生植株样品的分子检测，来检测样品是否为转基因阳性。目前一般采用设计特异性引物对样品基因组DNA进行PCR扩增检测目的条带的方法来进行转基因样品的阳性检测，这种检测方法需要大批量地提取基因组DNA、消耗大量PCR酶、并需要大量地制备琼脂糖凝胶及电泳操作，整个检测过程极其耗费人力物力和时间。急需一种更为快速简便的检测方法。
发明内容
针对上述现有的在植物亚细胞定位研究中，载体上GFP表达量偏低，植物转基因中对转基因样品进行检测时存在耗时长，耗费大量人力和物力的缺陷，本发明的目的是提供一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用，仅需一次构建，得到的重组质粒载体和转基因植株可同时用于过表达研究和亚细胞定位研究，同时得到的转基因植株或组织样品可非常方便快速地进行阳性检测。
本发明采用的技术方案如下：
一种多功能植物表达载体，所述多功能植物表达载体为Pesnoo-eYGFPur-apply，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本申请的技术方案中，由于目的基因上下游调控元件的添加，相较于普通的以CaMV 35S promoter启动子驱动的过表达载体而言，目的基因的表达会显著增强，同时由于目的基因和eYGFPuv融合表达，eYGFPuv的表达也显著增强；在进行亚细胞定位观察时，相较于普通的亚细胞定位载体而言，转化该载体的细胞中目的基因和eYGFPuv融合蛋白亮度更高，更便于观察定位结果；用此载体进行植物遗传转化，得到的转基因组织和植株会表达大量的目的基因和eYGFP融合蛋白，在进行阳性检测时，无需进行基因组DNA提取和PCR扩增，仅需用uv手电筒照射组织样品(如棉花、水稻等的愈伤组织)或植株样品(再生苗或者拟南芥T0代种子或T1代叶片)，通过观察激发出来的绿色荧光的有无即可判断是否为阳性，极大地较少了转基因样品分子检测的工作量。
一种多功能植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)将植物中通用组成型表达启动子CaMV 35S promoter(enhanced)、高效调控翻译的顺式作用元件COR47-5′UTR、紫外线UV可激发的eYGFPuv基因、高效调控表达的HSPT878终止子构建置于pCAMBIA2300植物表达载体的T-DNA区右边界上游；
(2)在COR47-5′UTR后插入了多克隆位点序列；
(3)将目的基因cds序列无缝构建到eYGFPuv基因上游；
(4)在eYGFPuv基因上游添加了6xGly序列，来连接和间隔目的基因cds序列和eYGFPuv基因。
优选的，步骤(1)中，紫外线UV可激发的eYGFPuv基因的最大激发波长为398nm，最大发射波波长为512nm。
更为优选的，步骤(3)中的目的基因cds序列是通过酶切酶连或同源重组的方法构建到载体上的多克隆点位置并与eYGFPuv基因融合表达。
更为优选的，步骤(3)中，酶切是利用KpnI和SbfI两个酶对载体进行双酶切，得到线性化载体用于目的基因通过同源重组的方法来实现无缝克隆。
一种多功能植物表达载体在受体植物转化、亚细胞定位或BIFC(双分子荧光互补)中的应用。
该载体的大小为10714bp，具有卡那抗性标记基因，在T-DNA区外的卡那抗性标记基因可赋予转化该载体的菌体以卡那抗性，T-DNA区内的卡那抗性标记基因可赋予转基因组织或植株以卡那抗性。
本申请的技术方案中对载体进行了适当的精简，以使载体大小更小，更利于其转化到大肠杆菌和农杆菌体内。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、基因过表达效果更明显：由于目的基因上下游调控元件的添加，相较于普通的以CaMV 35S promoter启动子驱动的过表达载体而言，目的基因的表达会显著增强；
2、亚细胞定位亮度更高，更容易观察：由于目的基因和eYGFP融合表达，eYGFP的表达也显著增强。在进行亚细胞定位观察时，相较于普通的亚细胞定位载体而言，转化该载体的细胞中目的基因和eYGFP融合蛋白亮度更高，更便于观察定位结果；
3、转基因组织和植株阳性检测更方便快捷：用此载体进行植物遗传转化，得到的转基因组织和植株会表达大量的目的基因和eYGFP融合蛋白，在进行阳性检测时，无需进行基因组DNA提取和PCR扩增。仅需用uv手电筒照射组织样品(如棉花、水稻等的愈伤组织)或植株样品(再生苗或者拟南芥T0代种子或T1代叶片)，通过观察激发出来的绿色荧光的有无即可判断是否为阳性；
4、可以通过荧光亮度来粗略判断表达量高低，极大地较少了转基因样品分子检测的工作量；
5、使用uv进行转基因及表达检测，免除基因组DNA提取和PCR检测的繁杂工作。
附图说明
图1为本发明载体的结构示意图；
图2为本发明图1中LB到RB的放大图；
图3为转化本发明的载体后，外源基因表达量qPCR定量结果；
图4为本发明中uv手电筒照射后棉花阳性愈伤组织的图；
图5为本发明自然亮度环境中用uv手电筒照射后棉花阳性愈伤组织的图；
图6为转普通GFP载体的烟草叶片和转本发明载体烟草叶片在普通uv手电筒照射后的图；
图7为瞬时转化本发明载体的烟草在普通uv手电筒照射下的发光。
图8为本发明的载体在烟草叶片中进行亚细胞定位结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种多功能植物表达载体，所述多功能植物表达载体为Pesnoo-eYGFPur-apply，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
一种多功能植物表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)将植物中通用组成型表达启动子CaMV 35S promoter(enhanced)、高效调控翻译的顺式作用元件COR47-5′UTR、紫外线UV可激发的eYGFPuv基因、高效调控表达的HSPT878终止子构建置于pCAMBIA2300植物表达载体的T-DNA区右边界上游附近，紫外线UV可激发的eYGFPuv基因的最大激发波长为398nm，最大发射波波长为512nm；
(2)在COR47-5′UTR后插入了多克隆位点序列；
(3)将目的基因cds序列无缝构建到eYGFPuv基因上游，目的基因cds序列是通过酶切酶连或同源重组的方法构建到载体上的多克隆点位置并与eYGFPuv基因融合表达，酶切是利用KpnI和SbfI两个酶对载体进行双酶切，得到线性化载体用于目的基因通过同源重组的方法来实现无缝克隆；
(4)在eYGFPuv基因上游添加了6xGly序列，来连接和间隔目的基因cds序列和eYGFPuv基因。
试验例1
qPCR检测：参照图3，图3中pvalue＝0.000146144650621127，***表示差异极显著，由图3知，转化本申请载体后，外源基因的表达量经qPCR检测，表达量大幅度提高。
图3中WT是wild type，棉花野生型；Relative Expression指相对表达量。
试验例2
转基因阳性检测：参照图4-7，棉花的组织培养，通过手电筒照射，发亮(图中箭头所指)的即为愈伤组织块为阳性，挑取发光的阳性组织块可直接进行继代培养，缩短了检测时间，节省人力物力；由图6知，转本申请载体的叶片发光明显更亮，可以粗略估计其表达量更高；由图7知，瞬时转化本申请载体的烟草在普通uv手电筒照射下的发光，其中图4是在黑箱环境中照射。
试验例3
亚细胞定位：由图8知，说明本发明的载体可以具有亚细胞定位功能，应用于亚细胞定位时，发光强度高，效果好，易观察。
上述试验例各图中，箭头所指为发光的部位。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
如下为SEQ ID NO.1序列的序列表。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用
<130> AJ2058059
<141> 2020-01-17
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10714
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
catgccaacc acagggttcc cctcgggatc aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct 60
atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc agccgtcttc tgaaaacgac atgtcgcaca 120
agtcctaagt tacgcgacag gctgccgccc tgcccttttc ctggcgtttt cttgtcgcgt 180
gttttagtcg cataaagtag aatacttgcg actagaaccg gagacattac gccatgaaca 240
agagcgccgc cgctggcctg ctgggctatg cccgcgtcag caccgacgac caggacttga 300
ccaaccaacg ggccgaactg cacgcggccg gctgcaccaa gctgttttcc gagaagatca 360
ccggcaccag gcgcgaccgc ccggagctgg ccaggatgct tgaccaccta cgccctggcg 420
acgttgtgac agtgaccagg ctagaccgcc tggcccgcag cacccgcgac ctactggaca 480
ttgccgagcg catccaggag gccggcgcgg gcctgcgtag cctggcagag ccgtgggccg 540
acaccaccac gccggccggc cgcatggtgt tgaccgtgtt cgccggcatt gccgagttcg 600
agcgttccct aatcatcgac cgcacccgga gcgggcgcga ggccgccaag gcccgaggcg 660
tgaagtttgg cccccgccct accctcaccc cggcacagat cgcgcacgcc cgcgagctga 720
tcgaccagga aggccgcacc gtgaaagagg cggctgcact gcttggcgtg catcgctcga 780
ccctgtaccg cgcacttgag cgcagcgagg aagtgacgcc caccgaggcc aggcggcgcg 840
gtgccttccg tgaggacgca ttgaccgagg ccgacgccct ggcggccgcc gagaatgaac 900
gccaagagga acaagcatga aaccgcacca ggacggccag gacgaaccgt ttttcattac 960
cgaagagatc gaggcggaga tgatcgcggc cgggtacgtg ttcgagccgc ccgcgcacgt 1020
ctcaaccgtg cggctgcatg aaatcctggc cggtttgtct gatgccaagc tggcggcctg 1080
gccggccagc ttggccgctg aagaaaccga gcgccgccgt ctaaaaaggt gatgtgtatt 1140
tgagtaaaac agcttgcgtc atgcggtcgc tgcgtatatg atgcgatgag taaataaaca 1200
aatacgcaag gggaacgcat gaaggttatc gctgtactta accagaaagg cgggtcaggc 1260
aagacgacca tcgcaaccca tctagcccgc gccctgcaac tcgccggggc cgatgttctg 1320
ttagtcgatt ccgatcccca gggcagtgcc cgcgattggg cggccgtgcg ggaagatcaa 1380
ccgctaaccg ttgtcggcat cgaccgcccg acgattgacc gcgacgtgaa ggccatcggc 1440
cggcgcgact tcgtagtgat cgacggagcg ccccaggcgg cggacttggc tgtgtccgcg 1500
atcaaggcag ccgacttcgt gctgattccg gtgcagccaa gcccttacga catatgggcc 1560
accgccgacc tggtggagct ggttaagcag cgcattgagg tcacggatgg aaggctacaa 1620
gcggcctttg tcgtgtcgcg ggcgatcaaa ggcacgcgca tcggcggtga ggttgccgag 1680
gcgctggccg ggtacgagct gcccattctt gagtcccgta tcacgcagcg cgtgagctac 1740
ccaggcactg ccgccgccgg cacaaccgtt cttgaatcag aacccgaggg cgacgctgcc 1800
cgcgaggtcc aggcgctggc cgctgaaatt aaatcaaaac tcatttgagt taatgaggta 1860
aagagaaaat gagcaaaagc acaaacacgc taagtgccgg ccgtccgagc gcacgcagca 1920
gcaaggctgc aacgttggcc agcctggcag acacgccagc catgaagcgg gtcaactttc 1980
agttgccggc ggaggatcac accaagctga agatgtacgc ggtacgccaa ggcaagacca 2040
ttaccgagct gctatctgaa tacatcgcgc agctaccaga gtaaatgagc aaatgaataa 2100
atgagtagat gaattttagc ggctaaagga ggcggcatgg aaaatcaaga acaaccaggc 2160
accgacgccg tggaatgccc catgtgtgga ggaacgggcg gttggccagg cgtaagcggc 2220
tgggttgtct gccggccctg caatggcact ggaaccccca agcccgagga atcggcgtga 2280
cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga 2340
gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg 2400
tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc 2460
cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc 2520
gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg 2580
tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca 2640
cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact 2700
gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa 2760
gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga 2820
tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt 2880
tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga 2940
agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga 3000
gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct 3060
gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct 3120
ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg 3180
cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc 3240
aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt 3300
catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca 3360
gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga 3420
tagcacgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa 3480
cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa 3540
aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc 3600
ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg 3660
gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc 3720
aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc 3780
actcgaccgc cggcgcccac atcaaggcac cctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 3840
aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg 3900
ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca 3960
tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca 4020
gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 4080
ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 4140
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 4200
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 4260
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 4320
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 4380
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4440
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 4500
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 4560
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 4620
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 4680
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 4740
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 4800
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 4860
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 4920
acgttaaggg attttggtca tgcattctag gtactaaaac aattcatcca gtaaaatata 4980
atattttatt ttctcccaat caggcttgat ccccagtaag tcaaaaaata gctcgacata 5040
ctgttcttcc ccgatatcct ccctgatcga ccggacgcag aaggcaatgt cataccactt 5100
gtccgccctg ccgcttctcc caagatcaat aaagccactt actttgccat ctttcacaaa 5160
gatgttgctg tctcccaggt cgccgtggga aaagacaagt tcctcttcgg gcttttccgt 5220
ctttaaaaaa tcatacagct cgcgcggatc tttaaatgga gtgtcttctt cccagttttc 5280
gcaatccaca tcggccagat cgttattcag taagtaatcc aattcggcta agcggctgtc 5340
taagctattc gtatagggac aatccgatat gtcgatggag tgaaagagcc tgatgcactc 5400
cgcatacagc tcgataatct tttcagggct ttgttcatct tcatactctt ccgagcaaag 5460
gacgccatcg gcctcactca tgagcagatt gctccagcca tcatgccgtt caaagtgcag 5520
gacctttgga acaggcagct ttccttccag ccatagcatc atgtcctttt cccgttccac 5580
atcataggtg gtccctttat accggctgtc cgtcattttt aaatataggt tttcattttc 5640
tcccaccagc ttatatacct tagcaggaga cattccttcc gtatctttta cgcagcggta 5700
tttttcgatc agttttttca attccggtga tattctcatt ttagccattt attatttcct 5760
tcctcttttc tacagtattt aaagataccc caagaagcta attataacaa gacgaactcc 5820
aattcactgt tccttgcatt ctaaaacctt aaataccaga aaacagcttt ttcaaagttg 5880
ttttcaaagt tggcgtataa catagtatcg acggagccga ttttgaaacc gcggtgatca 5940
caggcagcaa cgctctgtca tcgttacaat caacatgcta ccctccgcga gatcatccgt 6000
gtttcaaacc cggcagctta gttgccgttc ttccgaatag catcggtaac atgagcaaag 6060
tctgccgcct tacaacggct ctcccgctga cgccgtcccg gactgatggg ctgcctgtat 6120
cgagtggtga ttttgtgccg agctgccggt cggggagctg ttggctggct ggtggcagga 6180
tatattgtgg tgtaaacaaa ttgacgctta gacaacttaa taacacattg cggacgtttt 6240
taatgtactg aattaacgcc gaattaattc gggggatctg gattttagta ctggattttg 6300
gttttaggaa ttagaaattt tattgataga agtattttac aaatacaaat acatactaag 6360
ggtttcttat atgctcaaca catgagcgaa accctatagg aaccctaatt cccttatctg 6420
ggaactactc acacattatt atggagaaac tcgagcttgt cgatcgactc tagctagagg 6480
atcgatccga accccagagt cccgctcaga agaactcgtc aagaaggcga tagaaggcga 6540
tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt aaagcacgag gaagcggtca gcccattcgc 6600
cgccaagctc ttcagcaata tcacgggtag ccaacgctat gtcctgatag cggtccgcca 6660
cacccagccg gccacagtcg atgaatccag aaaagcggcc attttccacc atgatattcg 6720
gcaagcaggc atcgccatgt gtcacgacga gatcctcgcc gtcgggcatg cgcgccttga 6780
gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc cctgatgctc ttcgtccaga tcatcctgat 6840
cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg ctcgctcgat gcgatgtttc gcttggtggt 6900
cgaatgggca ggtagccgga tcaagcgtat gcagccgccg cattgcatca gccatgatgg 6960
atactttctc ggcaggagca aggtgagatg acaggagatc ctgccccggc acttcgccca 7020
atagcagcca gtcccttccc gcttcagtga caacgtcgag cacagctgcg caaggaacgc 7080
ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg cctcgtcctg gagttcattc agggcaccgg 7140
acaggtcggt cttgacaaaa agaaccgggc gcccctgcgc tgacagccgg aacacggcgg 7200
catcagagca gccgattgtc tgttgtgccc agtcatagcc gaatagcctc tccacccaag 7260
cggccggaga acctgcgtgc aatccatctt gttcaatccc catggtcgat cgacagatct 7320
gcgaaagctc gagagagata gatttgtaga gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc 7380
caaatgaaat gaacttcctt atatagagga aggtcttgcg aaggatagtg ggattgtgcg 7440
tcatccctta cgtcagtgga gatatcacat caatccactt gctttgaaga cgtggttgga 7500
acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg accactgtcg 7560
gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt gtaggtgcca 7620
ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg 7680
aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact 7740
gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct ccaccatgtt atcacatcaa 7800
tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt 7860
gggggtccat ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt gaacgatagc ctttccttta 7920
tcgcaatgat ggcatttgta ggtgccacct tccttttcta ctgtcctttt gatgaagtga 7980
cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg tttcccgata ttaccctttg ttgaaaagtc 8040
tcaatagccc tttggtcttc tgagactgta tctttgatat tcttggagta gacgagagtg 8100
tcgtgctcca ccatgcgtaa aacgacggcc agtaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 8160
ttagagctca tcgtcgactg agacttttca acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg 8220
attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca gtagaaaagg aaggtggcac 8280
ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct ctgccgacag 8340
tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 8400
cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga taacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta 8460
ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca 8520
aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcaa 8580
aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc 8640
tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag 8700
catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat 8760
ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc ttcctctata 8820
taaggaagtt catttcattt ggagaggaca cgctgagaat tccaaacatt actcattcac 8880
aaaaccatct taaagcaact acacaagtct tgaaattttc tcatattttc tatttactat 8940
ataaactttt aatcaaatca agattaaagg tacccggggt ttaaactcta gattaattaa 9000
acgcgtcctg caggtggcgg agggggtggc atgacaacct tcaaaatcga gtcccggatc 9060
cacggcaacc tcaacgggga gaagttcgag ttggttggag gtggagtagg tgaggagggt 9120
cgcctcgaga ttgagatgaa gactaaagat aaaccactgg cattctctcc cttcctgctg 9180
accacttgca tgggttacgg gttctaccac ttcgccagct tcccaaaggg gattaagaac 9240
atctatcttc atgctgcaac gaacggaggt tacaccaaca ccaggaagga gatctatgaa 9300
gacggcggca tcttggaggt caacttccgt tacacttacg agttcaacaa gatcatcggt 9360
gacgtcgagt gcattggaca tggattccca agtcagagtc cgatcttcaa ggacacgatc 9420
gtgaagagtt gtcccacggt ggacctgatg ttgccaatgt ccgggaacat catcgccagc 9480
tcctacgctt acgccttcca actgaaggac ggctctttct acacggcaga agtcaagaac 9540
aacatagact tcaagaatcc aatccacgag tccttctcga agtcagggcc catgttcacc 9600
cacagacgtg tcgaggagac tctcaccaag gagaaccttg ccatagtgga gtaccagcag 9660
gttttcaaca gcgccccaag agacatgtag atatgaagat gaagatgaaa tatttggtgt 9720
gtcaaataaa aagcttgtgt gcttaagttt gtgttttttt cttggcttgt tgtgttatga 9780
atttgtggct ttttctaata ttaaatgaat gtaagatctc attataatga ataaacaaat 9840
gtttctataa tccattgtga atgttttgtt ggatctcttc tgcagcatat aactactgta 9900
tgtgctatgg tatggactat ggaatatgat taaagataag atgggctcat agagtaaaac 9960
gaggcgaggg acctataaac ctcccttcat catgctattt catgatctat tttataaaat 10020
aaagatgtag aaaaaagtaa gcgtaataac cgcaaaacaa atgatttaaa acatggcaca 10080
taatgaggag attaagttcg gtttacgttt attttagtac taattgtaac gtgagactac 10140
gtatcgggaa tcgcctaatt aaagcattaa tgcgaacctg attagattca ccgaccctcc 10200
tatcgtgtcg acctttctgt ttcttagaat tttttggtag tctatgtact aataatgtca 10260
gcttcgtatt tatttcataa gcaatttgca tttgcaattt gttttttact tttattttta 10320
ttgtattgtg gaatgtggac tcgtaccaac atgaagttat ataccaccaa aaaaattaca 10380
gttagtcaaa agattcacga gtgagagcta cttatgattg tcttttacgt atatgtctaa 10440
ttgtctattt gctcaataat ctttgtactt tcttttgtcg ttgataaaat cacaaagttc 10500
caaaagtaat cgaatgattt gcttttaaga aaagaagagc tcaataattc aacatatatc 10560
tgtacacaac tagtgtcata gctgtttcct gagtaaacta tcagtgtttg acaggatata 10620
ttggcgggta aacctaagag aaaagagcgt ttattagaat aacggatatt taaaagggcg 10680
tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta tgtg 10714
Claims (6)
1.一种多功能植物表达载体，其特征在于：所述多功能植物表达载体为Pesnoo-eYGFPur-apply，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的多功能植物表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将植物中通用组成型表达启动子CaMV 35S promoter、高效调控翻译的顺式作用元件COR47-5＇UTR、紫外线UV可激发的eYGFPuv基因、高效调控表达的HSPT878终止子构建置于pCAMBIA2300植物表达载体的T-DNA区右边界上游；
(2)在COR47-5′UTR后插入了多克隆位点序列；
(3)将目的基因cds序列无缝构建到eYGFPuv基因上游；
(4)在eYGFPuv基因上游添加了6xGly序列，来连接和间隔目的基因cds序列和eYGFPuv基因。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，紫外线UV可激发的eYGFPuv基因的最大激发波长为398nm，最大发射波波长为512nm。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中的目的基因cds序列是通过酶切酶连或同源重组的方法构建到载体上的多克隆点位置并与eYGFPuv基因融合表达。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，酶切是利用KpnI和SbfI两个酶对载体进行双酶切，得到线性化载体用于目的基因通过同源重组的方法来实现无缝克隆。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的多功能植物表达载体在受体植物转化、亚细胞定位或BIFC中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010056776.0A CN111187787A (zh) | 2020-01-17 | 2020-01-17 | 一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010056776.0A CN111187787A (zh) | 2020-01-17 | 2020-01-17 | 一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111187787A true CN111187787A (zh) | 2020-05-22 |
Family
ID=70704051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010056776.0A Pending CN111187787A (zh) | 2020-01-17 | 2020-01-17 | 一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111187787A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113355353A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-09-07 | 郑州大学 | 四组分bsmv超表达棉花基因载体的应用及构建方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20190183060A1 (en) * | 2016-09-06 | 2019-06-20 | Nec Solution Innovators, Ltd. | Glowing plant |
-
2020
- 2020-01-17 CN CN202010056776.0A patent/CN111187787A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20190183060A1 (en) * | 2016-09-06 | 2019-06-20 | Nec Solution Innovators, Ltd. | Glowing plant |
| CN110062577A (zh) * | 2016-09-06 | 2019-07-26 | 日本电气方案创新株式会社 | 发光植物 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DONG POH CHIN ET AL.: "Generation of brilliant green fluorescent petunia plants by using a new and potent fluorescent protein transgene", 《SCIENTIFIC REPORTS》 * |
| GUOLIANG YUAN ET AL.: "Expanding the application of a UV-visible reporter for transient gene expression and stable transformation in plants", 《HORTICULTURE RESEARCH》 * |
| SHIHANG FAN ET AL.: "Synthesis and characteristic of a novel green fluorescent protein eYGFPuv", 《OIL CROP SCIENCE》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113355353A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-09-07 | 郑州大学 | 四组分bsmv超表达棉花基因载体的应用及构建方法 |
| CN113355353B (zh) * | 2021-06-04 | 2023-03-10 | 郑州大学 | 四组分bsmv超表达棉花基因载体的应用及构建方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108707621B (zh) | 一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法 | |
| CN108342409B (zh) | 一种植物RNAi表达载体及其构建方法和应用 | |
| CN103205458B (zh) | 一种适合单子叶植物转化的中间表达载体及其构建方法 | |
| CN108085287B (zh) | 一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用 | |
| CN111187787A (zh) | 一种多功能植物表达载体及其构建方法和应用 | |
| CN112778405B (zh) | 一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN110564739B (zh) | 杨树PtMYB158基因及其在创制杨树新种质材料中的应用 | |
| CN109206496B (zh) | 蛋白质GhFLS1在调控植物耐热性中的应用 | |
| CN110408646B (zh) | 一种植物遗传转化筛选载体及其应用 | |
| CN110835631B (zh) | 一种改造的sgRNA及其在提高碱基编辑效率中的应用 | |
| CN110835630B (zh) | 一种高效的sgRNA及其在基因编辑中的应用 | |
| CN113121662B (zh) | 棉花GhBZR3蛋白及其编码基因在调节植物生长发育中的应用 | |
| CN111154797B (zh) | 一种基因枪介导的玉米骨干自交系的遗传转化方法 | |
| CN110923263B (zh) | 水稻β-淀粉酶BA1及其编码基因与应用 | |
| CN101985631B (zh) | 一种棒状杆菌启动子探测载体及其构建方法和应用 | |
| CN109321594B (zh) | 一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法 | |
| CN115584354A (zh) | 一种简便快捷的植物表达t载体及其应用 | |
| CN112575028A (zh) | 一种抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用 | |
| CN112458112A (zh) | 一种三酮类抗性基因的RNAi植物表达载体及其应用 | |
| CN112501197A (zh) | 一种利用水稻内源序列抑制HIS1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用 | |
| CN112575027A (zh) | 一种抑制hsl1基因的植物表达载体及其应用 | |
| CN111269298B (zh) | 蛋白质GhCCoAOMT7在调控植物耐热性中的应用 | |
| CN112458111A (zh) | 一种利用水稻内源序列抑制HSL1基因表达的RNAi植物表达载体及其应用 | |
| CN109694402B (zh) | 植物木质素合成相关蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN112458113A (zh) | 一种植物转基因显性抑制载体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |