CN108085287B - 一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组谷氨酸棒状杆菌，其能有效解决现有谷氨酸棒状杆菌外源蛋白表达量低的技术问题。该重组谷氨酸棒状杆菌中的肽聚糖内切酶基因mepA、细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和胞内蛋白酶基因clpC均被敲除，同时ABC转运体基因Ncgl0909过量表达。此外，本法还提供了该重组谷氨酸棒状杆菌的制备方法及其应用。

Description

一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用。

背景技术

谷氨酸棒状杆菌属于棒状杆菌属，为革兰氏阳性菌。普遍认为谷氨酸棒状杆菌无毒素、无致病性、不产芽孢，被公认是安全菌株（GRAS）。同时谷氨酸棒状杆菌具有生长快速，遗传背景清晰，具有良好的蛋白分泌系统等优点，过去50年里被广泛应用于氨基酸的生产，比如谷氨酸、赖氨酸等，还被应用于食品工业，动物饲料的生产。近些年来也被用于药用蛋白及前体的表达，是一种安全的医药蛋白表达宿主，具有很高的应用价值。

但在实际应用中发现，外源蛋白表达量不尽如人意，因此，有必要对谷氨酸棒状杆菌的宿主菌进行改造使其更有利于外源蛋白的表达。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种重组谷氨酸棒状杆菌，其能有效解决现有谷氨酸棒状杆菌外源蛋白表达量低的技术问题，此外，本法还提供了该重组谷氨酸棒状杆菌的制备方法及其应用。

其技术方案是这样的，一种重组谷氨酸棒状杆菌，所述重组谷氨酸棒状杆菌中的肽聚糖内切酶基因mepA、细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和胞内蛋白酶基因clpC均被敲除，同时ABC转运体基因Ncgl0909过量表达。

进一步的，重组前的谷氨酸棒状杆菌为C. glutamicum ATCC 13032。

上述重组谷氨酸棒状杆菌的制备方法，其特征在于：所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC的敲除采用crispr/cas9基因敲除技术，ABC转运体基因Ncgl0909的过量表达采用启动子替换技术。

进一步的，所述crispr/cas9基因敲除技术包括以下步骤：

（1）设计sgRNA，所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC对应的sgRNA的核苷酸分别如SEQ ID No.1、No.2和No.3所示；

（2）构建同源修复序列，所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC的同源修复序列分别如SEQ ID No.4、No.5和No.6所示；

（3）整合sgRNA和同源修复序列到载体pcas9allinone中，所述载体pcas9allinone的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，分别形成所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC敲除的载体pcas9allinone-mepA、pcas9allinone-porB和pcas9allinone-clpC；

（4）构建基因敲除载体，将上述载体pcas9allinone-mepA、pcas9allinone-porB和pcas9allinone-clpC逐个转入到所述谷氨酸棒状杆菌中，经过筛选得到重组菌株3。

进一步的，所述启动子替换技术包括以下步骤：

（1）设计sgRNA，所述启动子为tac启动子，tac启动子的sgRNA的核苷酸序列如 IDNo.7所示；

（2）构建同源修复序列，整合有tac启动子的同源修复序列如SEQ ID No.8所示；

（3） 整合sgRNA和同源修复序列到载体pcas9allinone中，形成载体pcas9allinone-0909；

（4）获得重组谷氨酸棒状杆菌，将载体pcas9allinone-0909转入重组菌株3中，筛选得到重组谷氨酸棒状杆菌。

上述重组谷氨酸棒状杆菌在外源蛋白表达中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：在对谷氨酸棒状杆菌进行改造中，并没有影响到菌株的生长速度，且能够显著提高外源蛋白的表达量；本发明提供的菌株可作为外源蛋白高效表达的宿主。

附图说明

图1为基因敲除载体构建示意图，图中geneRARM、geneLARM分别代表待敲除基因的上下游同源序列。

图2为基因过表达载体构建示意图，geneRARM、geneLARM分别代表Ncgl0909基因的上下游同源序列。

图3为基因改造后验证电泳图，其中，M: Marker DL10000; 1：mepA基因敲除验证；2：mepa基因野生型对照；3：porb基因敲除验证；4：porb基因野生型对照；5：clpc基因敲除验证；6：clpc基因野生型对照；7：Ncgl0909基因过表达验证；8：Ncgl0909基因野生型对照。

图4为改造后菌株表达GFP结果，其中，1：野生型菌株；2：表达EGFP的野生型菌株;3-4: 表达EGFP的重组菌株4；M: Marker 26610。

图5 改造后菌株表达BNP结果，其中，M: Marker 26610; 1：野生型菌株；2：野生型菌株表达BNP; 3：重组菌株表达BNP。

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方不局限于此。

下述实施例或应用例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例或应用例中所用的材料、试剂，基因合成等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例或应用例中所用大肠杆菌DH5α购买自TAKARA。

下述实施例或应用例中所用谷氨酸棒状杆菌C. glutamicum ATCC 13032购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。

下述实施例或应用例中所用载体骨架pXMJ19购自Addgene。

下述实施例或应用例中所用连接液solutionI购买自TaKaRa公司，货号 D6020A。

下述实施例或应用例中所用Gibson Assembly Master Mix溶液购买自NEB( NewEngland Biolabs)公司，货号E2611S。

下述实施例或应用例中大肠杆菌的培养使用LB培养基，培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，去离子水 1L。

下述实施例或应用例中谷氨酸棒状杆菌的培养使用LBB培养基，培养基配方为：胰蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，脑心浸液 10g、去离子水1L。

下述实施例或应用例中谷氨酸棒状杆菌的转化子培养使用LBHIS培养基，培养基配方为：胰蛋白胨 5g、酵母提取物 2.5g、NaCl 5g、脑心浸液 18.5g、山梨醇 91g、去离子水1L。

实施例1

1、谷氨酸棒状杆菌三个基因敲除载体和一个基因过表达载体的构建

porb核苷酸序列如Gene ID: 1018962 所示，mepa核苷酸序列如Gene ID:1020444所示；clpc核苷酸序列如Gene ID: 1020624 所示；Ncgl0909 核苷酸序列如GeneID: 1018938所示。

以谷氨酸棒状杆菌C. glutamicum ATCC 13032基因组中相关基因为模板设计sgRNA。

其中，porb核苷酸序列、mepa核苷酸序列以及clpc核苷酸序列的Gene ID和C. glutamicum ATCC 13032的核苷酸序列均是已公开。

用于敲除的sgRNA 应该具有5′-（N₂₀）-NGG-3′结构，并位于基因序列中，设计mepa、prob、clpc相应的sgRNA，分别如序列SEQ ID No.1、No.2和No.3所示。依据sgRNA 合成两条寡核苷酸链，寡核苷酸退后成双链后，用连接酶连接到AjuI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体pcas9allinone中，载体pcas9allinone的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，其构建方法参见申请号为CN201710576441.X（公开号为CN107384951A，公开日期为2017年11月24日）的发明专利申请。寡核苷酸退火的具体操作为，两条寡核苷酸链摩尔比1:1，无菌水补齐到20μL，94℃ 5min，每分钟降温0.5℃，直到温度降为40℃。取2μL用于后续的连接。

以谷氨酸棒状杆菌C. glutamicum ATCC 13032基因组DNA为模板，利用引物mepALF mepALR 扩增mepA上游同源序列，利用mepARF mepARR 扩增mpeA基因下游同源序列，上游同源序列包含目的基因上游300bp的长度，下游同源序列包含目的基因下游300bp的长度，利用同源重组的方式重组上下游同源序列为同源修复序列。上游同源序列、下游同源序列和载体片段摩尔比1:1：1， Gibson Assembly Master Mix溶液 5μL，无菌水补齐到10μL ，50℃反应30min；同源修复序列的如SEQ ID No.4所示。热击转化E.coliDH5α感受态细胞；均匀涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为载体pcas9allinone-mepA，如图1所示。

同样的，分别扩增porB clpC 上下游同源序列，并融合上下游同源序列为同源修复序列序列如SEQ ID No.5 、No.6 所示，引物序列如下表所示。分别构建proB和clpC敲除质粒pcas9allinone-porB和pcas9allinone-clpC。

用于过表达的sgRNA 具有5′-（N20）-NGG-3′结构，并位于目的基因启动子区域。设计0909 sgRNA 序列，如SEQ ID No.7 所示。依据sgRNA 合成两条寡核苷酸链，寡核苷酸退后成双链后，用连接酶连接到AjuI酶切纯化后的CRISPR/Cas9敲除载体pcas9allinone中。

以谷氨酸棒状杆菌C. glutamicum ATCC 13032基因组为DNA为模板，利用0909LF0909LR 扩增Ncgl0909上游同源序列，利用引物0909RF 0909RR 扩增Ncgl0909下游同源序列，利用tacF tacR、以pXMJ19 质粒为模板扩增tac 启动子，利用同源重组技术融合0909上游序列tac启动子下游序列，构成0909 同源修复序列，如SEQ ID No.8 所示。

纯化后的同源修复序列和载体片段摩尔比1:1， Gibson Assembly Master Mix溶液 10μL，无菌水补齐到20μL ，50℃反应30min；热击转化E.coliDH5α感受态细胞；均匀涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h；挑选阳性克隆子，提取质粒即为Ncgl0909基因的过表达载体pcas9allinone-0909，如图2所示。

2、重组菌株的构建

重组菌1 mepA基因敲除

将载体pcas9allinone-mepA通过电转的方式转化到谷氨酸棒状杆菌C. glutamicum ATCC 13032中。取1μg DNA共转化谷氨酸棒状杆菌感受态，电击转化条件为1800v，50ms，恢复培养后涂布于含有氯霉素的IPTG LBHIS固体培养基，30℃培养36h在平板上筛选克隆子进行PCR及测序验证，验证正确的即为mepA敲除菌株，得到重组菌株1。验证结果如图4所示。

挑取mepa敲除菌株接种于5ml LBB 培养基中，37℃培养16h，划线于不含抗生素的lbb 平板，通过温敏复制子消去敲除质粒，用于下一步的敲除。

重组菌2 porB基因的敲除

操作方法同步骤1 区别在于出发菌株为上一步中得到的mepA敲除菌株。使用的载体为pcas9allinone-porB， 挑取平板上的单菌落用同源片段引物porBLF 和porBRR PCR验证获得目的菌株，同时把扩增出来的片段进行测序验证，最终根据基因型及测序结果挑选正确的菌株及porB基因敲除菌株，得到的重组菌株2。基因型验证结果如图3所示。

重组菌3 clpC基因的敲除

操作方法同步骤1， 区别在于出发菌株为上一步得到的mepA proB 敲除菌株。使用的载体为pcas9allinone-clpC。挑取平板上的克隆子用引物clpCLF clpCRR 验证，同时把扩增出来的片段进行测序验证。 最终根据基因型及测序结果挑选正确的菌株及clpC敲除菌株，得到的重组菌株3。基因型验证结果如图3所示。

重组菌4 0909 基因的过表达

操作方法同步骤1，区别在于出发菌株为上一步的到的mepA proB clpC 敲除菌株，使用的载体为pcas9allinone-0909。敲除平板上的克隆子用引物0909LF 0909RR 验证，同时把扩增出来的片段测序验证。通过基因型及测序结果确定正确的菌株即为Ncgl0909基因的过表达菌株，得到重组菌株4，即所需重组谷氨酸棒状杆菌。基因型验证记过如图3所示。

其中，肽聚糖内切酶基因mepA敲除后该位置的序列如SEQ ID No.11所示，细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB敲除后该位置的序列如SEQ ID No.10所示，胞内蛋白酶基因clpC敲除后该位置的序列如SEQ ID No.12所示，同时ABC转运体基因Ncgl0909增设tac启动子后该位置的序列如SEQ ID No.13所示。

应用例1

1、GFP在最终菌株中的表达

在商用载体pXMJ19基础上，在多克隆位点插入GFP基因构建gfp表达载体p19-egfp。以质粒p19-egfp为表达质粒，用电转的方法转入菌株4。将阳性谷氨酸棒状杆菌接种于5ml LBB 培养基中， 30 °C、230 r/min 培养过夜，1%接种量接种于另一含50ML培养基中，相同条件下培养24 h。

样品收集后用PBS 缓冲液洗2 次，PBS重悬并将OD600 调到0.5 左右，分两管。一管使用多功能酶标仪Synergy H4 测定荧光强度。激发波长为488 nm，发射波长为507 nm.同时测量od600吸光度。利用荧光纸比吸光度为单位od荧光强度。

另一管超声破碎后12000rpm离心取上清，利用SDS-PAGE检测，结果如图4所示，实验结果表明GFP在重组菌中的表达量要高于野生型。

应用例2

2、脑钠肽（BNP）是一种肽类激素，它具有排钠利尿、舒张血管以及抗肾素的作用.血液中此种肽的检测被广泛用于鉴定心衰患者和检测心衰的严重程度。具有很高的应用价值。

以质粒pXMJ19为基础，在多克隆位点插入BNP基因构建BNP表达载体 pXMJ19-BNP。以质粒pXMJ19-BNP为表达质粒。用电转的方法转入菌株4. 将阳性谷氨酸棒状杆菌接种于5ml LBB 培养基中， 30 °C、230 r/min 培养过夜，1%接种量接种于另一含50ML培养基中，相同条件下培养24 h。

样品收集后用PBS 缓冲液洗2 次，PBS重悬并将OD600 调到0.5 左右，冰上超声破碎。破碎也离心收集上清。用SDS-PAGE及多功能酶标仪Synergy H4 测定BNP表达量。

结果如图5所示，实验结果表明BNP在重组菌中的表达量要高于野生型。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种重组谷氨酸棒状杆菌、其制备方法及其应用

<130> 2017

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 人工序列（artificial sequence）

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ggaggatagg tttgcgaagt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 人工序列（artificial sequence）

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tccatggaat cccaggttag cggggatcat tgcaccatgc gacaccccta gcacggcgtg 180

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 人工序列（artificial sequence）

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atccactggt agaagctttg atgatctaca tcacaaattt acaatgtgtg gtgagttatt 180

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

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ttatatggtt tggtgtttag ctaattccaa gccgagctga aaaagtctgg aagttttgcc 240

caataagggc gttaaagtgg gtgaaagcga atttagaaat aaagaattaa ggggagagac 300

tagcaacctt ttgaaaaagg gcccgcactt taggaaaatc ctaacgtgcg ggcccttttt 360

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<213> Artificial

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<223> 人工序列（artificial sequence）

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

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actacccaga cccgcaatgg ccctacatgt atcactgcca catgctctac cacgaggatc 120

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aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg 300

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 60

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 120

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ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 300

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gccgcttcca ctttttcccg cgttttcgca gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg 2580

gaaacggtct gataagagac accggcatac tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc 2640

acattcacca ccctgaattg actctcttcc gggcgctatc atgccatacc gcgaaaggtt 2700

ttgcaccatt cgatggtgtc aacgtaaatg ccgcttcgcc ttcgcgcgcg aattgcaagc 2760

tgatccgggc ttatcgactg cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc agccatcgga 2820

agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc tcaaggcgca 2880

ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca aatattctga 2940

aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac 3000

aatttcacac aggaaacaga attaattaag cttaaaggag gacaactaat ggataaaaag 3060

tattccattg gcctggacat cggcaccaat tctgtgggtt gggcagtcat caccgacgaa 3120

tacaaggtcc catccaagaa gttcaaggtg ctcggtaata ccgatcgcca ctctatcaag 3180

aaaaacctga tcggcgccct gctcttcgac tccggcgaaa ccgcagaagc aacccgtctc 3240

aagcgtaccg cacgtcgccg ctacacccgc cgtaagaatc gcatctgcta cctccaggaa 3300

atcttctcta atgagatggc aaaggtggat gactcctttt tccaccgcct cgaagagtcc 3360

ttcctggtgg aagaggacaa gaaacacgag cgccatccta tcttcggcaa tattgtcgat 3420

gaagtcgcat atcatgaaaa atacccaacc atttaccatc tccgtaaaaa actcgtcgat 3480

tccaccgata aggcagatct ccgcctgatc tatctggcac tggcccacat gatcaagttt 3540

cgtggccact tcctgatcga aggtgacctc aatccagaca attccgacgt ggacaagctg 3600

ttcatccagc tggtgcaaac ctacaaccag ctctttgagg aaaacccaat caacgcatct 3660

ggcgtcgacg caaaagccat cctgtccgcc cgtctctcca agtctcgtcg cctcgaaaac 3720

ctcattgccc agctccctgg cgagaagaaa aacggtctgt tcggcaatct gatcgccctg 3780

tctctgggtc tgaccccaaa tttcaaatcc aactttgatc tcgcagaaga tgccaagctg 3840

cagctctcta aggacaccta cgatgatgac ctggataacc tcctcgccca gatcggcgac 3900

cagtacgccg atctcttcct cgcagccaag aacctctctg acgcaattct gctgtccgac 3960

atcctgcgcg tgaacaccga aatcactaag gcaccactct ctgcctccat gattaagcgc 4020

tacgacgagc atcatcagga tctcactctc ctcaaagccc tggtccgcca gcagctccca 4080

gagaagtaca aggaaatctt tttcgaccaa tccaaaaacg gctacgcagg ttacatcgat 4140

ggcggcgcct ctcaggaaga gttttacaaa ttcattaagc caatcctcga aaagatggac 4200

ggcaccgagg aactgctggt gaaactcaac cgtgaagatc tcctgcgcaa acagcgcacc 4260

ttcgacaacg gttccattcc tcaccagatc cacctgggcg aactgcacgc aatcctccgc 4320

cgtcaagagg acttctaccc attcctgaag gacaaccgtg aaaagatcga aaagattctc 4380

accttccgca tcccttacta cgtgggtcct ctcgcccgtg gcaattcccg cttcgcctgg 4440

atgactcgca aatctgaaga gaccatcacc ccttggaact ttgaggaagt cgtcgataaa 4500

ggcgcctctg cccaatcctt catcgagcgc atgaccaact tcgacaagaa cctcccaaac 4560

gagaaagtgc tgcctaagca ttccctcctg tacgagtact ttactgtcta caatgagctg 4620

actaaggtga agtatgtcac tgaaggcatg cgtaagccag cctttctctc cggcgagcag 4680

aaaaaggcaa tcgtcgacct cctgtttaaa accaaccgca aagtgactgt gaaacagctc 4740

aaggaagatt actttaaaaa aatcgaatgc ttcgattctg tggaaatctc cggcgtggag 4800

gatcgtttca acgcctccct gggtacctat cacgacctcc tgaagattat caaggacaaa 4860

gattttctgg ataacgagga aaacgaggac attctcgagg acattgtgct gaccctgacc 4920

ctcttcgagg accgcgagat gatcgaggag cgcctgaaga cctatgccca cctctttgac 4980

gacaaggtca tgaagcaact caagcgccgc cgctataccg gttggggccg tctctcccgt 5040

aagctcatca atggtatccg cgacaagcaa tccggcaaga ctatcctgga ctttctgaag 5100

tctgacggct tcgccaaccg caattttatg caactgatcc acgacgattc cctgaccttc 5160

aaagaggaca tccagaaagc ccaagtgtcc ggtcaaggcg actccctgca cgaacacatc 5220

gccaatctgg caggttcccc agcaatcaag aagggcatcc tgcagaccgt caaggtggtg 5280

gacgaactcg tcaaagtgat gggtcgccac aaaccagaaa acatcgtcat cgagatggcc 5340

cgtgagaacc agaccaccca gaaaggccag aaaaactccc gtgagcgcat gaagcgcatt 5400

gaagaaggca ttaaagagct cggctctcag atcctgaaag agcatcctgt cgagaacacc 5460

caactgcaga atgagaagct gtatctgtat tatctccaga acggccgcga catgtacgtc 5520

gaccaggaac tggacatcaa ccgtctctct gattacgatg tggaccatat cgtccctcag 5580

tctttcctga aagacgactc tattgacaac aaagtcctca cccgctccga caagaaccgc 5640

ggcaagtccg ataacgtgcc atccgaggag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcgc 5700

cagctgctca acgccaagct gatcactcag cgcaagttcg ataacctgac caaggccgaa 5760

cgtggtggtc tctccgagct cgacaaggca ggctttatca agcgccaact cgtggagact 5820

cgccaaatca ctaaacacgt cgcccagatc ctcgactccc gcatgaatac caagtacgat 5880

gaaaatgaca agctcatccg cgaagtgaaa gtcattaccc tgaagtccaa actggtctct 5940

gactttcgca aggatttcca gttctacaag gtccgcgaga ttaataacta tcatcatgca 6000

cacgatgcat acctcaacgc agtcgtgggt accgcactga tcaagaagta ccctaaactg 6060

gagtccgagt tcgtctatgg cgactacaag gtgtacgacg tccgcaaaat gattgccaag 6120

tccgagcagg agatcggcaa agcaactgcc aaatatttct tttactccaa catcatgaac 6180

ttcttcaaga ccgaaatcac cctcgccaac ggtgaaatcc gcaaacgtcc actcatcgag 6240

actaatggtg aaaccggcga gatcgtctgg gacaagggcc gtgacttcgc aaccgtccgc 6300

aaggtcctct ccatgccaca ggtcaacatc gtgaaaaaga ccgaggtgca aaccggcggc 6360

ttctccaagg agtctatcct gcctaaacgc aattccgata agctcattgc acgcaaaaag 6420

gactgggacc ctaaaaaata cggcggtttc gactccccaa ctgtcgcata ttctgtgctc 6480

gtggtcgcca aagtggaaaa gggcaaatcc aaaaagctca agtccgtcaa ggaactcctg 6540

ggtatcacca tcatggaacg ctcctccttt gagaagaacc ctatcgattt cctcgaagca 6600

aaaggttaca aggaggtgaa gaaagatctg atcatcaagc tccctaaata ctccctcttc 6660

gagctcgaga acggccgcaa gcgtatgctg gcctccgcag gtgaactgca aaaaggtaac 6720

gagctggcac tcccatccaa gtatgtcaac tttctctacc tggcctccca ctacgaaaag 6780

ctgaaaggtt ccccagaaga caacgagcag aaacagctgt tcgtggagca gcacaagcac 6840

tacctggacg aaatcatcga gcagatctcc gagttctcta aacgcgtcat tctggccgat 6900

gccaacctcg ataaagtgct ctccgcctac aataagcatc gtgataagcc aatccgtgag 6960

caggcagaga acatcattca cctgttcact ctcaccaacc tgggtgcacc agccgccttt 7020

aagtacttcg acaccaccat cgaccgcaag cgctatacct ccactaagga ggtgctcgat 7080

gcaaccctga tccaccagtc tatcaccggc ctctacgaga ctcgcatcga tctctcccag 7140

ctgggtggcg actaagaatt cagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc 7200

tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca 7260

gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg 7320

atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga 7380

aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 7440

ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg 7500

tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg 7560

acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcagc 7620

gaattgatct ggtttgacag cttatcatcg actgcacggt gcaccaatgc ttctggcgtc 7680

aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg 7740

tcgctcaagg cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct 7800

ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggaa 7860

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagaccatg ggatcctaca atggaaatac 7920

agattgggga tgagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc 7980

aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttgcggc cgcgcatgca agcttggctg 8040

ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg 8100

tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc 8160

gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt 8220

agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt 8280

ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt 8340

tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca 8400

ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc 8460

tatttaaatt tcgaatacgt acttaagggt ctacgtctga tgctttgaat cggacggact 8520

tgccgatctt gtatgcggtg atttttccct cgtttgccca ctttttaatg gtggccgggg 8580

tgagagctac gcgggcggcg acctgctgcg ctgtgatcca atattcgggg tcgttcactg 8640

gttccccttt ctgatttctg gcatagaaga acccccgtga actgtgtggt tccgggggtt 8700

gctgattttt gcgagacttc tcgcgcaatt ccctagctta ggtgaaaaca ccatgaaaca 8760

ctagggaaac acccatgaaa cacccattag ggcagtaggg cggcttcttc gtctagggct 8820

tgcatttggg cggtgatctg gtctttagcg tgtgaaagtg tgtcgtaggt ggcgtgctca 8880

atgcactcga acgtcacgtc atttaccggg tcacggtggg caaagagaac tagtgggtta 8940

gacattgttt tcctcgttgt cggtggtggt gagcttttct agccgctcgg taaacgcggc 9000

gatcatgaac tcttggaggt tttcaccgtt ctgcatgcct gcgcgcttca tgtcctcacg 9060

tagtgccaaa ggaacgcgtg cggtgaccac gacgggctta gcctttgcct gcgcttctag 9120

tgcttcgatg gtggcttgtg cctgcgcttg ctgcgcctgt agtgcctgtt gagcttcttg 9180

tagttgctgt tctagctgtg ccttggttgc catgctttaa gactctagta gctttcctgc 9240

gatatgtcat gcgcatgcgt agcaaacatt gtcctgcaac tcattcatta tgtgcagtgc 9300

tcctgttact agtcgtacat actcatattt acctagtctg catgcagtgc atgcacatgc 9360

agtcatgtcg tgctaatgtg taaaacatgt acatgcagat tgctgggggt gcagggggcg 9420

gagccaccct gtccatgcgg ggtgtggggc ttgccccgcc ggtacagaca gtgagcaccg 9480

gggcacctag tcgcggatac cccccctagg tatcggacac gtaaccctcc catgtcgatg 9540

caaatcttta acattgagta cgggtaagct ggcacgcata gccaagctag gcggccacca 9600

aacaccacta aaaattaata gtccctagac aagacaaacc cccgtgcgag ctaccaactc 9660

atatgcacgg gggccacata acccgaaggg gtttcaattg acaaccatag cactagctaa 9720

gacaacgggc acaacacccg cacaaactcg cactgcgcaa ccccgcacaa catcgggtct 9780

aggtaacact gaaatagaag tgaacacctc taaggaaccg caggtcaatg agggttctaa 9840

ggtcactcgc gctagggcgt ggcgtaggca aaacgtcatg tacaagatca ccaatagtaa 9900

ggctctggcg gggtgccata ggtggcgcag ggacgaagct gttgcggtgt cctggtcgtc 9960

taacggtgct tcgcagtttg agggtctgca aaactctcac tctcgctggg ggtcatctct 10020

ggctgaattg gaagtcatgg gcgaacgccg cattgagctg gctattgcta ctaagaatca 10080

cttggcggcg ggtggcgcgc tcatgatgtt tgtgggcact gttcgacaca accgctcaca 10140

gtcatttgcg caggttgaag cgggtattaa gactgcgtac tcttcgatgg tgaaaacatc 10200

tcagtggaag aaagaacgtg cacggtacgg ggtggagcac acctatagtg actatgaggt 10260

cacagactct tgggcgaacg gttggcactt gcaccgcaac atgctgttgt tcttggatcg 10320

tccactgtct gacgatgaac tcaaggcgtt tgaggattcc atgttttccc gctggtctgc 10380

tggtgtggtt aaggccggta tggacgcgcc actgcgtgag cacggggtca aacttgatca 10440

ggtgtctacc tggggtggag acgctgcgaa aatggcaacc tacctcgcta agggcatgtc 10500

tcaggaactg actggctccg ctactaaaac cgcgtctaag gggtcgtaca cgccgtttca 10560

gatgttggat atgttggccg atcaaagcga cgccggcgag gatatggacg ctgttttggt 10620

ggctcggtgg cgtgagtatg aggttggttc taaaaacctg cgttcgtcct ggtcacgtgg 10680

ggctaagcgt gctttgggca ttgattacat agacgctgat gtacgtcgtg aaatggaaga 10740

agaactgtac aagctcgccg gtctggaagc accggaacgg gtcgaatcaa cccgcgttgc 10800

tgttgctttg gtgaagcccg atgattggaa actgattcag tctgatttcg cggttaggca 10860

gtacgttcta gattgcgtgg ataaggctaa ggacgtggcc gctgcgcaac gtgtcgctaa 10920

tgaggtgctg gcaagtctgg gtgtggattc caccccgtgc atgatcgtta tggatgatgt 10980

ggacttggac gcggttctgc ctactcatgg ggacgctact aagcgtgatc tgaatgcggc 11040

ggtgttcgcg ggtaatgagc agactattct tcgcacccac taaaagcggc ataaaccccg 11100

ttcgatattt tgtgcgatga atttatggtc aatgtcgcgg gggcaaacta tgatgggtct 11160

tgttgttgac aatgaagctt cccgggtcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 11220

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 11280

aaaaa 11285

<210> 10

<211> 1976

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

ggagtggaca agtcacgatc gttggaacac aacaggtttg cggcactcaa tgctgcgtca 60

tcaatttggt tggggtccgc taccccatca ccgtttgcat ccaatcccat aagtcgccac 120

gtttccggaa tgaactgcat gggacctacc gcgcgatcat attcagtatc gccatctaat 180

tccccaccat cagtgtcggg aatttccgca aaccccggtg aaccatcaag tggaacgccg 240

atgattggag gggttgcaac tccattttca tccagggaac tgcccccgaa cattttgccg 300

ttgtaggtac cgtgacgggt ttccacctgg ccgatacctg ccaaggtatt ccaccccaga 360

ttgcagccag gccacgcagt actcgcgatg agctctgcgt ttccataagc cgcaatcgct 420

tgagcggaca caccagtatc ttgagcaatt ggttccgccc aaaaacgcaa atggttggat 480

gtgcgtccat ctgcctctgt atcaatttgc ggaacttcta caccacgcgc cggcggaaca 540

tcttcaggga tttgctggag ttggcgaata ggtgccgttc catccatgaa gctgagcgcc 600

catccaacaa atgagatcac catgatgacg gccaaaaccg aaccgcatcc aaatcccatt 660

gcttttctaa cccctgaact catgggggtc gatgttaccg gctcgtttta gaactctcgc 720

attggctaga aaaacctgat tacttcacgc ctctttaagt aaaaaatcct gtgtctttct 780

aaccaaaaga cccaaaaaga cacgctaaat cagcctccta tgcaattagt agagcattca 840

catacaccgt gccaagacct gatttccacg actgaaactt cattaaatcc actggtagaa 900

gctttgatga tctacatcac aaatttacaa tgtgtggtga gttattcata ttacccaagg 960

acttaaacct taaaaggagc cctaaaaatc aaggttcggg ggtaacccca aaaatcactt 1020

aagtcacaac agtcacataa atcacttcag taacgtatga ttttggactg ttgtggcttt 1080

tgccatattt atttcatttc catctcagtg atctcttaag gaaacccatg aagaaactac 1140

gtttcgccac catcgctgcc gctaccgttg ccctgactgc gagccttacc ccctcagctt 1200

ccgcacagga tttcaaccaa atcatcgaca actttgattg cggcatcctt cagaccgcta 1260

tctacaccac cggcctggct cacgagaact ccactcgctc agagctcgcc gctaatctgc 1320

gcaactccgc agctgtcggc caactagact tcccattgaa tatcgcggct accggctact 1380

ccgagcgcat cgctaaccgc gcactgacct gcggaatcgt gaaggaagat ccacaggact 1440

tcctctccca gctgcagctt ctgtcctcta acctatcttc ttccttcttc actgcttagt 1500

ttctcttggg cttttccttg agcccacagc cgctgctgct cgtcggtgtc cacaattccg 1560

gtagagccgt cgaacaggta cggcgaacga gattgcatct tggctacgaa actcgccgcc 1620

acgtcaaaaa tgtcgaatcg accctgacgg gcggcgattt ctgcatgaaa aagcacctgc 1680

agcaaaacat cccccagttc gcttttcatg tgctcatcat cgccaccatg aatcgcttca 1740

ataaactcct gcgattcttc ttccagatac ggaatcaaac tctcatgggt ttgcgtgcgt 1800

tcccactcgc cgcggcccac ggccgcccgc atgacgccga cggcctcatg caaagggttg 1860

aggggcgcgt cgataagcag cgtgctttgc ggttttgcga tgataaacca ggaggcgctt 1920

gtcgacgtct tgatccccca tttttcaata tcaaatggaa aatcgggatc gataga 1976

<210> 11

<211> 2010

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人供序列（artificial sequence）

<400> 11

ccttcaatac aagggatgca tccttatatg agtccgccag ctttgagagc acctctgccc 60

tacccaaacc cacagcaaaa ccagggccgt ccacgtttcg cttcggctcc ccaatcacga 120

tccccacgat cacgcttggc tgcaccgatg ccagcacccg cactccggcg cgctgagtcc 180

acttctggat ctgtgtttca gctttcgcat gatcaggtga ggtggctgcc aatgctctta 240

gaggagtgtc ggcgggaacg tcatacatcg cagcacccca taaaagctct gacagttcag 300

agccttccga gaccgctttg ccgatccatt ctgaccttcg caccgaatcg gcgatcgccg 360

tggcgacctc gtgatcgcgg tacacccttg tggcacgcgt agaaaaggca tcattgaccg 420

cccacatcag tgtggaccag cgcagcattc tgccgggatc aatattgtat tccgggccca 480

actgcaccaa atgctccaga atttccccca gagacatccg aaaaccgtgc agcacacttc 540

ccagcggcac attttgcgct atacgttcgt cggcaagcct taaagcctca ggcaagtcct 600

cggcctttgg ctcggtgccc gcgttaatca cgcgaataat caaggccgta ttgcgtatcg 660

acgactccct gatcggcccc gcgtcaacga gctcatagcc cgggatcgta gcgagcaact 720

ttgcggcggt gccctccgca atatccggcg catcggcatc caaacgtgcg agcaattctt 780

gccaccgttc ggcatgcaca tccgctaccg aaccatccga cgtgacggaa ctaacattct 840

ccatggaatc ccaggttagc ggggatcatt gcaccatgcg acacccctag cacggcgtgt 900

ttggtagcac gaaaacttgt acaggggtgg ggttaccccc taaggtggtc acaacttgat 960

aacggactgg ttaataaatg gccaatctga ccattttaac ctccataaaa aggattctcg 1020

cgctagccgt tcgtgggata cgggtgaaat aaaagaaact gcaggtcatc ttagttgatg 1080

acctgcagtt tctgtttgtg cgcctggaga gacttgaact ctcacgtcct aggacactgg 1140

aacctaaatc cagcgcgtct gccaattccg ccacaagcgc ttaatgcggg ttttactata 1200

catggtgtag tcccaaatta actaatgcgg gtgaccaact gcaccgtaaa aaaaattcgc 1260

ttatcgtaaa tcagcaggta gaataacact ctatgagcga gccagggcca tccggggtta 1320

aagaaaagaa gaaagtaaag gcaagtcaca ttgtctttct tctcatttgt tttatcgcag 1380

cctgcgcgtt ggcgtggtgg cagtggtcaa gattccagtc cgggtctgga actttccaaa 1440

accttggcta tgccttccag tggcctctta tcggagcatt ctttgtttat gcctaccgca 1500

agtatttgca gtatgagaat gagtccattg agttagaaaa catggaagcc aaaatgatgg 1560

cggagcaagg caaaacacca gttgcgcaat cagagcagga agatagcttc gttcagctct 1620

ctcaccgtcc gagcctggtg gaagatgaca gcgtcaagga aatcgacgaa tccttcctgc 1680

cgtctcgccc gacgatggat gtggaagagt tcaacaggtt gaatgatccg catgcacgga 1740

gacgtcgaaa agcataaacc tggaactttt ccgggcccgc gcccgactgc tttgctgaag 1800

ccctatcccg ctattttatt tttgaaggaa gagttgcgtg tctaccacca ccccaatcca 1860

ccctgagcgc aagaaacgcg ttcgtcaggc cctcaccatg ttctccatcg ctgcgtgggt 1920

gactggtgtg tttttgctgg cgctggtggc ggagatgatc atgaagtaca taattggcat 1980

ggatcttcct gagtgggcac gattcgttcc 2010

<210> 12

<211> 2044

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 12

ccgtgtgctg tgtcgacgac tagaacgtcg gcgccggcgt cgagaagcgt tttggtgcgt 60

ccttcgatgt cgccgttgat gccgatggcg gcgccgactc gcaggcggcc gttggcgtcg 120

atagccggct tgtacatggt ggcgcgcagg gcgccggtgc gggtgaggat gccgcggagt 180

gagccgtcag ccgcgacgac gggggcgagt ttgcggctgt gttcgtggag gattccgaag 240

gcgtcttcgg gggaaatatc ctcaggcagc gtcaataggg aggtggacat gagggtgccc 300

acctgagtga agttgtctgc gccttcgagg tccttgtcgg tgacgatgcc gaccggctga 360

tcgccctcca aaacaatggc tgcaccgtgc gcacgcttgt ggatcaagtt gcgtgcataa 420

cccacggtgt ggtgcggttt tacggtaatt ggggtatcaa aaaccaggtc cgctttcttc 480

acattcgcga tagtctctgc agcaatatcg gcgggcacat cctgcggaag aatcgccatg 540

ccaccgcggc gcgcaatggt ctcagccatg cgtcggccag caacagcagt catgtttgcc 600

acaacgagcg ggatggttgt tccagttccg tcattggtgc gcagatccac ggacatgcgg 660

gagcctacgt cagaacgcga aggcaccata aacacatcgg aatatgtcag ctcatagggc 720

ggattggaat tgttaagaaa acgcatgggt ctcctagttg attaatcagt tatccctgaa 780

cacggcaagg gtacctcaat tgctctttcc accaccttcc tgctgcttta ctactgcttt 840

tcgacgcccc aacccggtgt tcgctacagg cgtacagggc ctttcaggcc tcaaaaacta 900

gccctgaaca gggcttatat ggtttggtgt ttagctaatt ccaagccgag ctgaaaaagt 960

ctggaagttt tgcccaataa gggcgttaaa gtgggtgaaa gcgaatttag aaataaagaa 1020

ttaaggggag agaccaacct tttgaaaaag ggcccgcact ttaggaaaat cctaacgtgc 1080

gggccctttt ttaatgctca gggaggggat tctggctact gacttcagga tcagtgcatt 1140

ccggtgccgg gcccatcgtt cgggattttg aagattttgg gcatgcgtgt ttggtcgagc 1200

tcaaattatg cccttgagtc ctaaaagtca tacttcccca gaagagcttt taagaggttt 1260

tcggatcttt gtgtatgcaa atacccattc gaaaaactcg gaggtcttaa atgggctata 1320

agcgcgccag gcgggattta attgaattaa tgccaggtca gagagttaaa ggtgatgatt 1380

ctcataaggc tataaacaat gtagttaggt tacactaatg gtgtccggtt gtgaatagtg 1440

cagcggacgg ggttccgctg cggaggaggt catcatgtca tttgttaaca tcacggctct 1500

tacgttccct gcaggggctg aaaaagaaat cgaacaacgc ttcgcggctc gtaagaaggc 1560

tgtagatacg gccaaaggat tccaagaatt tgagttgttg cgtccacaat ttggtgagga 1620

tcgctacttc gtagttactc gttgggattc ccgcgaagac tatcaagcat ggtcggatgc 1680

ccgccctgcc ggtaaccatg ctgatgatga acaacgtggc atgagcgtgg aagttcttgg 1740

tttcgatgtg gttcctttgg aaggctaaaa gtccttggcg tggcatagtc acacctagat 1800

cttgacggag gtttttgaag taacgcaagt tcagaggttt ggatttgatg acacgaaacc 1860

tctgaatagc cctgtttgcc aatgagcgct tctggataaa cagccagctc cgcaaccttg 1920

tagttgcgga gctggctgtt ttgaactgtt tagtaggaac tagctagaac caaatgagct 1980

gccacttggt ttaggagccg gttgtggatg atccttgtca tcgtccttag gctcgtcaat 2040

gggg 2044

<210> 13

<211> 1165

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

aacctgacgt catcgatgcc actgaacgca ccttcatcat gaacaccttc tccatcaacg 60

atctacagat ggacatgcag cgcgttgacg tggtgattga ccatgaccag ccagaagtgt 120

ggattgtcac caacgacaac tccgactggc cccacaactt ccatgtccac gacgcccggt 180

ttaaggtgct gaaatttgaa ggcaccgacg tagagctctt caacgacggc tggaaagaca 240

ccgtcggcct gccaccggga gcaaccgcaa ctttagccgt ggaatttggc cactacccag 300

acccgcaatg gccctacatg tatcactgcc acatgctcta ccacgaggat caaggcatga 360

tggggcagtt cgtcatcgtg gagccaggcg acgagccggc ggcggtgctg gggtcgggca 420

cgggctccag cattgactcc gccggcggac atgcgcacta gttctggcgt caggcagcca 480

tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag 540

gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat 600

tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg 660

ataacaattt cacacaggaa acagaattaa tatgacaacg acaccagcaa tcgacgtaac 720

agacctcgtg agaacctacg gcgactacac cgcagtcaag ggcctgaatt tccatgtaca 780

gcgcggtgaa gtatttggtc tgctcggcac caacggggcc ggcaaaacct ccaccttgga 840

agtcatcgaa ggactttccg cacccagctc cggcaccgtg cgcatctccg ggcttgaccc 900

cgttgccgac cgcgcgatcc tgcgccccga gctcggcatc atgctgcaat caggcggcct 960

gccatcacag ctcaccgtcg ccgaaaccat ggacatgtgg cacggcacct gcacgtatcc 1020

gcgcgccatt aaagatgtgc ttgccgacgt cgacctccta caccgcgaaa acgtcaaggt 1080

cggcgcgctt tccggaggcg aacaacgacg ccttgatttg gcctgcgcac tgcttggcga 1140

cccctcaatt ttgttcctcg acgaa 1165

Claims (1)

1.一种重组谷氨酸棒状杆菌在外源蛋白表达中的应用，其特征在于：所述外源蛋白为脑钠肽；

重组后的谷氨酸棒状杆菌中的肽聚糖内切酶基因mepA、细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和胞内蛋白酶基因clpC均被敲除，同时ABC转运体基因Ncgl0909过量表达；

重组前的谷氨酸棒状杆菌为C. glutamicum ATCC 13032；

所述重组谷氨酸棒状杆菌的制备方法包括，所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC的敲除采用crispr/cas9基因敲除技术，ABC转运体基因Ncgl0909的过量表达采用启动子替换技术；

所述crispr/cas9基因敲除技术包括以下步骤：

S1、设计sgRNA，所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC对应的sgRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示；

S2、构建同源修复序列，所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC的同源修复序列分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；

S3、整合步骤S1获得的sgRNA和步骤S2获得的同源修复序列到载体pcas9allinone中，所述载体pcas9allinone的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，分别形成所述肽聚糖内切酶基因mepA、所述细胞膜表面阴离子通道蛋白基因porB和所述胞内蛋白酶基因clpC的敲除载体pcas9allinone-mepA、pcas9allinone-porB和pcas9allinone-clpC；

S4、构建基因敲除载体，将上述载体pcas9allinone-mepA、pcas9allinone-porB和pcas9allinone-clpC逐个转入到所述重组前的谷氨酸棒状杆菌中，经过筛选得到含有基因敲除载体的重组菌株；

所述启动子替换技术包括以下步骤：

S1’、设计sgRNA， sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，sgRNA位于目的基因启动子区域；

S2’、构建同源修复序列，整合有tac启动子的同源修复序列如SEQ ID No.8所示；

S3’、 整合步骤S1’获得的sgRNA和步骤S2’获得的同源修复序列到载体pcas9allinone中，形成载体pcas9allinone-0909；

S4’、获得重组谷氨酸棒状杆菌，将载体pcas9allinone-0909转入步骤S4获得的含有基因敲除载体的重组菌株中，筛选得到重组谷氨酸棒状杆菌。

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