KR101834286B1

KR101834286B1 - 다중 유전자 발현 조절능이 있는 크리스퍼 간섭을 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환용 키트

Info

Publication number: KR101834286B1
Application number: KR1020160038662A
Authority: KR
Inventors: 우한민; 신효정; 엄영순; 이선미; 공경택
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2016-03-30
Publication date: 2018-03-06
Also published as: KR20170112103A

Abstract

본 명세서에는, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 작동하는 크리스퍼 간섭을 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환용 키트가 개시된다. 일 측면에서, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환용 키트는, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 동시에 여러 개의 타겟 유전자의 발현을 억제 할 수 있다. 특히 세포 성장에 중요한 역할을 하는 유전자의 유전자 변형을 만드는 일은 거의 불가능한데, 본 발명의 키트를 이용하여 여러 유전자를 동시에 쉽게 억제 할 수 있다. 또한, 다양한 조합의 타겟 유전자의 발현 억제를 통해, 타겟 물질 생산을 위해 가장 최적화된 유전자 조합을 효율적으로 찾을 수 있다.

Description

다중 유전자 발현 조절능이 있는 크리스퍼 간섭을 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환용 키트 {Kit having capacity of regulating expression of multigene for transformation of Corynebacterium glutamicum using CRISPR interference}

본 명세서에는, 크리스퍼 간섭을 이용하고, 복수개의 타겟 유전자의 발현을 조절할 수 있는, 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환용 키트가 개시된다.

현재 바이오산업에서 고부가 산물을 생산하기 위해 산업 미생물을 대사공학적으로 조작하여 야생형이 생산하지 못하는 산물을 효율적으로 생산하는 기술이 널리 이용되고 있다. 이러한 기술의 핵심은 타겟 물질을 효율적 및 경제적으로 생산해야 한다는 것이다. 이 때 사용되는 대사공학적 방법으로는 플라스미드 또는 지놈상에 이형 유전자를 삽입하거나 특정 유전자의 돌연변이를 만드는 기술들이 있다. 특히 최근에는, CRISPR을 이용하여 표적 유전자의 삽입 또는 돌연변이를 빠르게 얻어 낼 수 있는 기술이 각광받고 있다.

CRISPR은 Cas9과 sgRNA을 이용하여 target site에 유전자 삽입 및 변형을 쉽고 빠르게 만들어 낼 수 있는 기술이다. 한편, CRISPR는 타겟 위치가 아닌 자리에 돌연변이를 일으킬 가능성이 있다. 최근에는 더 진보된 기술로 CRISPRi가 사용되고 있다. CIRSPRi는 Cas9의 효소활성을 결핍시킨 dCas9을 이용하여 타겟 위치에 유전자 억제를 유도할 수 있는 시스템이다. 이 기술의 장점은 돌연변이를 만들지 않고도 표적 위치의 유전자 발현을 억제할 수 있다는 것이다. 즉, 유전자 변형을 일으키지 않고도 유전자 조절이 가능하다는 것이 CRISPRi의 장점이다.

Dusch N, Puhler A, Kalinowski J (1999) Expression of the Corynebacterium glutamicum panD gene encoding l-aspartate-alpha-decarboxylase leads to pantothenate overproduction in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 65(4):1530-1539

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 정확하게 다양한 타겟 유전자의 발현을 억제하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 작동하는 크리스퍼 간섭 시스템을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은, 일 측면에서, 생물학적으로 불활성화된 Cas(dCas)을 코딩하는 유전자의 서열을 포함하는 제1 벡터; 및 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 발현을 억제하려는 타겟 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 코딩하는 유전자의 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 형질전환용 키트를 제공한다.

일 측면에서, 본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 형질 전환용 키트는, 코리네박테리움 글루타미쿰에서 동시에 여러 개의 타겟 유전자의 발현을 억제 할 수 있다. 특히 세포 성장에 중요한 역할을 하는 유전자의 유전자 변형을 만드는 일은 거의 불가능한데, 본 발명의 키트를 이용하여 여러 유전자를 동시에 쉽게 억제 할 수 있다. 또한, 다양한 조합의 타겟 유전자의 발현 억제를 통해, 타겟 물질 생산을 위해 가장 최적화된 유전자 조합을 효율적으로 찾을 수 있다.

도 1a는, 본 발명의 제1 벡터의 구조를 보이는 도이다.
도 1b는, 본 발명의 제2벡터의 구조를 보이는 도이다.
도 2a와 도 2b는, 제1 벡터인 pCoryne-dCas9와 제2벡터인 pCoryne-gRNA-pyc 발현시 표적 유전자인 pyc 유전자의 발현 여부를 확인한 도이다. 도 2a에서, WT는 야생형 균주를 의미하고, △pyc는 genomic DNA인 pyc 유전자가 돌연변이된 균주이고, pBbEB2c, pZ8-0은, dCas9 및 gRNA가 모두 삽입되지 않은 제1 벡터 및 제2벡터로 형질전환된 균주를 의미하며, dCas9, pZ8-0은, dCas9 삽인된 제1 벡터와 pyc의 gRNA가 삽입되지 않은 균주를 의미하고, pBbEB2c, sgRNA-pyc-R은 dCas9가 삽입되지 않은 제1 벡터와 pyc의 gRNA가 삽입된 제2벡터로 형질전환된 균주를 의미하고, dCas9, sgRNA-gltAR은, dCas9가 삽입된 제1 벡터와 glt의 gRNA가 삽입된 제2벡터로 형질전환된 균주를 의미한다.
도 3a와 도 3b는, 제1 벡터인 pCoryne-dCas9와 제2벡터인 pCoryne-gRNA-gltA 발현시 표적 유전자인 gltA 유전자의 발현 여부를 확인한 도이다. 도 3a에서, WT는 야생형 균주를 의미하고, pBbEB2c, pZ8-0은, dCas9 및 gRNA가 모두 삽입되지 않은 제1 벡터 및 제2벡터로 형질전환된 균주를 의미하며, dCas9, pZ8-0은, dCas9 삽인된 제1 벡터와 gltA의 gRNA가 삽입되지 않은 균주를 의미하고, pBbEB2c, sgRNA- gltAR은 dCas9가 삽입되지 않은 제1 벡터와 gltA의 gRNA가 삽입된 제2벡터로 형질전환된 균주를 의미하고, dCas9, sgRNA-gltAR은, Cas9가 삽입된 제1 벡터와 gltA의 gRNA가 삽입된 제2벡터로 형질전환된 균주를 의미한다.
도 4는, 제1 벡터인 pCoryne-dCas9와 제2벡터인 pCoryne-gRNA-gltA의 발현시 표적 유전자인 pyc 유전자와 gltA 유전자의 발현 여부를 확인한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 일 측면에서, 생물학적으로 불활성화된 Cas9(dCas9)을 코딩하는 유전자의 서열을 포함하는 제1 벡터 및 코리네박테리움 글루타미쿰에서의 발현을 억제하려는 타겟 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 코딩하는 유전자의 서열을 포함하는 제2벡터를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 형질전환용 키트이다.

본 명세서에서 Cas란, CRISPR(Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats) 연관된 단백질을 의미한다.

일 구현예에서, 상기 dCas는 dCas9를 포함할 수 있다.

상기 제1 벡터는, lacI 리프레서 및 tetR 리프레서로 구성된 군으로부터 선택된 리프레서; trc 프로모터, tetA 프로모터 및 LacUV5 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터; 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래의 복제 개시점 pBL1; 이콜라이(E. coli)의 복제 개시점인 ColEI; 및 제한효소 부위인 BglII 부위 및 BamHI 부위를 포함할 수 있다.

일 측면에서, 상기 벡터는, 클로람페니콜 저항성 리포터 유전자를 더 포함 할 수 있다.

예컨대, 상기 클로람페니콜 저항성 리포터 유전자는 주형 벡터인 pBbE1c-RFP (Lee TS, Krupa RA, Zhang F, Hajimorad M, Holtz WJ, Prasad N, Lee SK, Keasling JD (2011b) BglBrick vectors and datasheets: a synthetic biology platform for gene expression. J Biol Eng 5:12)에서 유래한 것일 수 있다.

또 다른 측면에서, 상기 벡터는, 제한효소 부위인 EcoRI, BglII 부위, BamHI 및 XholI 부위를 더 포함할 수 있다.

상기와 같은 측면에서, 상기 BglII 부위 및 BamHI 부위는 dCas를 코딩하는 유전자 양측에 위치할 수 있다.

상기와 같은 측면에서, 상기 dCas9을 코딩하는 유전자의 서열은, 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 제2 벡터는, 타겟 유전자에 대한 가이드 RNA(gRNA)를 코딩하는 서열의 삽입 부위; 제한효소 부위인 EcoRI 및 BamHI; 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 복제 개시점인 pMW1519; 및 이콜라이(E. coli) 유래의 복제 개시점인 p15A를 포함할 수 있다.

제2 벡터는, 제한효소 부위인 EcoRI 및 BamHI을 이용하여 제1 gRNA gRNA를 삽입하고, 제2 gRNA는, 제2 gRNA를 BglII와 BamHI으로 자르고, 제1 gRNA가 삽입되어 있는 벡터는 BamHI으로 잘라서 삽입할 수 있다. 즉, 제2 벡터는 bglbrick site를 응용한 것이므로, 여러 개의 gRNA를 삽입할 수 있다. 한편, 제1 gRNA, 제2 gRNA의 제1 및 제2는 gRNA의 삽입되는 순서를 의미하기 위한 것이며, 삽입되는 gRNA의 개수를 한정하는 것은 아니다. 일 구현예에서, 제2벡터의 주형이 되는 벡터는 pZ8-1일 수 있고, pZ8-1의 프로모터 부위를 제거한 것을 사용할 수 있다.

일 측면에서, 상기 제2벡터는 하나 이상의, 타겟 유전자에 특이적으로 결합하는 gRNA를 코딩하는 유전자의 서열을 포함할 수 있다. 예컨대, 제2벡터는 Biobrick site를 이용하여 복수개의 sgRNA를 포함할 수 있다.

상기와 같은 측면에서, 상키 키트를 사용하면, 동시에 2 이상의 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 즉, 제2 벡터에는 2종 이상의 타겟 유전자에 대한 gRNA를 코딩하는 서열이 포함될 수 있고, 이들이 모두 작동하여, 동시에 2종 이상의 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 타겟 유전자는, 피루베이트로부터 옥살로아세테이트를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자 및 옥살로아세테이트로 및 아세틸조효소 A로부터 시트레이트(citrate)를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자 중 하나 이상일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 옥살로아세테이트를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자는 pyc 유전자일 수 있다. 또한, 상기 옥살로아세테이트로 및 아세틸조효소 A로부터 시트레이트를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자는 gltA 유전자일 수 있다.

상기 피루베이트로부터 옥살로아세테이트를 생산하는 효소는, 피루베이트 카르복실라아제이고, 상기 옥살로아세테이트로 및 아세틸조효소 A로부터 시트레이트를 생산하는 효소는 시트레이트 합성효소일 수 있다.

타겟 유전자는 pyc 유전자, gltA 유전자 외에도 벡터가 삽입된 균주에서 발현을 조절하고자 하는 모든 유전자를 포함하는 개념이다.

일 구현예에서, 상기 피루베이트로부터 옥살로아세테이트를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자를 타겟으로 하는 gRNA는 서열번호 2의 서열을 포함하고, 상기 옥살로아세테이트로 및 아세틸조효소 A로부터 시트레이트를 생산하는 효소를 코딩하는 유전자를 타겟으로 하는 gRNA는 서열번호 3의 서열을 포함할 수 있다.

상기와 같은 측면에서, 상기 제1 벡터는 서열번호 4의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 4에서, 6 번째 서열부터 712번째 서열은 pTrc 프로모터, 740번째 서열부터 4846번째 서열은 dCas9, 5144번째 서열부터 7698번째 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 복제 개시점 BL1, 7881번째 서열부터 8563번째 서열은 E.coli 유래 복제 개시점 colE1이고 8690번째 서열부터 9349번째 서열은 클로람페니콜 저항성 리포터 유전자이다.

일 구현예에서, 상기 제2벡터는 서열번호 5 내지 8 중 하나의 서열을 포함하는 것일 수 있다. 서열번호 5는, 타겟 유전자에 대한 gRNA를 코딩하는 서열을 포함하지 않은 제2 벡터 자체의 서열에 관한 것이고, 서열번호 6는, pyc 유전자를 타겟으로 하는 gRNA를 코딩하는 서열을 포함하는 것이고, 서열번호 7은, gltA 유전자를 타겟으로 하는 gRNA를 코딩하는 서열을 포함하는 것이고, 서열번호 8은, pyc 유전자 및 gltA 유전자를 타겟으로 하는 gRNA를 코딩하는 서열 모두를 포함하는 것이다. 서열번호 5에서 87부터 92는, EcoRI site이고, 97부터 103는 BamHI site이고, 2163 부터 3584는, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 복제 개시점 pHM1519이고, 4583 부터 5398는, 카나마이신 저항성 리포터 유전자이고, 5723부터 6552는, E. coli 유래의 복제 개시점인 p15A이다. 서열번호 6에서 87부터 613는, pyc 유전자를 타겟으로 하는 gRNA를 코딩하는 서열이고, 2674부터 4095는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 복제 개시점 pHM1519이고, 5094부터 5909는, 카나마이신 저항성 리포터 유전자이고 6234부터 7063는, E. coli 유래 복제 개시점 p15A이다. 서열번호 7에서 87부터 613는, gltA 유전자를 타겟으로 하는 gRNA를 코딩하는 서열이고, 2674부터 4095는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 복제 개시점 pHM1519이고, 5094부터 5909는, 카나마이신 저항성 리포터 유전자이고, 6234부터 7063는, E. coli 유래 복제 개시점 p15A이다. 서열번호 8에서 87부터 606는, pyc 유전자를 타겟으로 하는 gRNA를 코딩하는 서열이고, 609부터 1099는, gltA 유전자에 대한 gRNA이고, 3187부터 4608는, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 복제 개시점 pHM1519이고, 5607부터 6422는, 카나마이신 저항성 리포터 유전자이고, 6747부터 7576는, E.coli 유래 복제 개시점 p15A이다.

이하, 실시예를 통하여, 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 타겟 유전자 발현 억제를 위한 플라스미드의 설계 및 sgRNA 제작

CRISPRi(CRISPR interference)에서 필요한 제1 벡터(pCoryne-dCas)와 제2벡터(pCoryne-gRNA)을 제작하였다.

pCoryne-dCas는 기존에 개발된 pBbEB2c (한국 특허 출원번호 제10-2014-0146255호)에 dCas9을 삽입하여 제작하였다. dCas9는 pdCas9-bacteria(Addgene plasmid#44249)을 사용하였다. pBbEB2c과 dCas9을 bglII와 XhoI으로 잘라준 뒤 라이게션을 수행하여 pCoryne-dCas9(도1)을 만들었다.

pCoryne-gRNA은 pZ8-1(Dusch N, Puhler A, Kalinowski J (1999) Expression of the Corynebacterium glutamicum panD gene encoding l-aspartate-alpha-decarboxylase leads to pantothenate overproduction in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 65(4):1530-1539)에서 프로모터 부분을 제거하고 여러 개의 gRNA 유닛이 발현할 수 있도록 제작하였다. sgRNA 유닛은 각각의 gRNA에 대한 프로모터, sgRNA, 터미네이터를 포함한다. pZ8-1를 주형으로 하여 프로모터를 제외한 부분을 PCR하여 선형화된 산물(linearized product)을 만든 뒤, 제한효소 처리 후 라이게이션을 통해 만들었다. pyc와 gltA의 타겟 서열을 각각의 유전자의 프로모터 부분에 위치하고 PAM 서열 뒤에 존재하는 비주형의 서열로 선정하여 sgRNA을 디자인하였다. 구체적으로, 먼저 pgRNA 플라스미드를 주형으로 하여 PCR을 통해 선형의 형태의 산물을 얻었다. 이것을 speI으로 제한효소 처리를 한 후 라이게이션하여 다시 플라스미드 형태로 pgRNA-pyc, pgRNA-gltA을 만들어 주었다. 그 다음 EcoRI와 BamHI을 사용하여 pyc과 glt를 타겟으로 하는 gRNA 각각을 pCoryne-gRNA(타겟 유전자에 대한 gRNA가 삽입되지 않은 제2벡터)에 넣어주었다. 이렇게 하여 pCoryne-gRNA-pyc(pyc 유전자를 타겟으로 하는 gRNA가 삽입된 제2벡터), pCoryne-gRNA-gltA(gltA 유전자를 타겟으로 하는 gRNA가 삽입된 제2벡터)가 만들어졌다. pCoryne-gRNA-pyc에 BamHI 제한효소처리를 하고 pgRNA-gltAR에 bglII와 BamHI으로 제한효소처리를 한 후 라이게이션하여 pCoryne-gRNA-pyc-gltA(pyc 및 gltA 유전자를 타겟으로 하는 gRNA가 삽입된 제2벡터)을 제작하였다. 이 방법에 의해 여러 개의 sgRNA를 포함하는 pCoryne-gRNA를 만들 수 있다.

[실시예 2] pyc 유전자의 발현 억제 여부 확인

실시예 1에서 만들어진 제1 벡터(pCoryne-dCas9)와 제2벡터(pCoryne-gRNA-pyc)를 코리네박테리움 글루타미쿰에 형질전환하였다. 그 후, 균주를 BHIS 배지에 30, 200rpm, 밤샘 배양 한 후, 2% glucose가 첨가된 CgXII 배지에서 약 OD 1.0으로 시작하여 30, 밤샘 배양하였다(도2). 100nM aTc를 이용하여 4시간 째 인덕션하여 6시간째에 샘플을 얻었다. 이 샘플로부터 RNA extraction을 하여 cDNA를 만들었고 RT-PCR 실험을 하였다. RT-PCR에서 사용한 프라이머의 서열은 표 1에 정리하였다.

pyc-RT-forward(서열번호 9)	TAAAAGCGCTGAAGGCCAGA
pyc-RT-reverse(서열번호 10)	TCTTCAGTCACGGTGTGCTC

그 결과, 야생형 균주, dCas9과 sgRNA가 둘 다 없거나 각각 하나씩만 있는 균주는 471bp 자리에 진한 밴드를 보이지만, dCas9과 sgRNA-pyc가 모두 발현된 균주는 희미한 밴드를 보였다(도2b). 즉, CRISPRi system이 작동하여 pyc의 mRNA 전사가 확실히 억제되는 결과를 확인할 수 있었다.

[실시예 3] gltA 유전자의 발현 억제 여부 확인

실시예1에서 만들어진 pCoryne-dCas9와 pCoryne-gRNA-gltA 두 개의 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰에 형질전환하였다.

이 균주를 BHIS 배지에 30, 200rpm, 밤샘 배양 한 후, 2% glucose가 첨가된 CgXII 배지에서 약 OD 1.0으로 시작하여 30에서 밤샘 배양하였다. 100nM aTc를 이용하여 4시간째 인덕션하여 6시간째에 샘플을 얻었다. 이 샘플로부터 RNA extraction을 하여 cDNA를 만들었고 RT-PCR 실험을 하였다. RT-PCR에서 사용한 프라이머의 서열은 아래 표에 정리하였다.

gltA-RT-forward(서열번호 11)	CCAATGGCAACCTTGGCTTC
gltA-RT-reverse(서열번호 12)	ACAAACATGTTGGCCTGTGC

그 결과, 야생형 균주, dCas9과 sgRNA가 둘 다 없거나 각각 하나씩만 있는 균주는 362bp 자리에 진한 밴드를 보이지만, dCas9과 sgRNA-pyc가 모두 발현된 균주는 희미한 밴드를 보였다(도3b). 즉, CRISPRi system이 작동하여 gltA의 mRNA 전사가 확실히 억제되는 결과를 확인할 수 있었다.

[실시예 4] pyc 및 gltA 유전자의 발현 억제

실시예1에서 만들어진 pCoryne-dCas9와 pCoryne-gRNA-pyc-gltA 두 개의 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰에 형질전환하였다.

이 균주를 BHIS 배지에 30, 200rpm으로 밤샘 배양 한 후, 1% glucose와 1% citrate가 첨가된 CgXII배지에서 약 OD 1.0으로 시작하여 6시간 키운 후 샘플링 하였다. 100nM aTc를 이용하여 4시간 째에 인덕션하였다.

이 샘플로부터 RNA extraction을 하여 cDNA를 만들었고 pyc와 gltA에 대해서 각각 RT-PCR 실험을 하였다. RT-PCR에서 사용한 primer는 실시예 2,3에서 사용한 것과 같다.

그 결과 야생형 균주, dCas9과 gRNA-pyc-gltA가 둘 다 없거나 각각 하나씩만 있는 균주는 pyc의 471bp 자리와 gltA의 362bp자리에 진한 밴드를 보이지만, dCas9과 gRNA-pyc-gltA가 모두 발현된 균주는 희미한 밴드를 보였다. 즉, CRISPRi system이 작동하여 pyc와 gltA 두 개의 유전자에 대한 mRNA 전사가 동시에 억제되는 결과를 확인할 수 있었다(도 4).

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Kit for transformation of Corynebacterium glutamicum using CRISPR interference <130> 16P152IND <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dCas9 coding gene <400> 1 atggataaga aatactcaat aggcttagct atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60 atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120 cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180 gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240 tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300 cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360 aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420 aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480 atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540 gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600 attaacgcaa gtggagtaga 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tcccaaagat cttcaaagcc actgccgcga ctgccttcgc gaagccttgc cccgcggaaa 4860 tttcctccac cgagttcgtg cacaccccta tgccaagctt ctttcaccct aaattcgaga 4920 gattggattc ttaccgtgga aattcttcgc aaaaatcgtc ccctgatcgc ccttgcgacg 4980 ttggcgtcgg tgccgctggt tgcgcttggc ttgaccgact tgatcctccg gcgttcagcc 5040 tgtgccacag ccgacaggat ggtgaccacc atttgcccca tatcaccgtc ggtactgatc 5100 ccgtcgtcaa taaaccgaac cgctacaccc tgagcatcaa actcttttat cagttggatc 5160 atgtcggcgt gtcgcggcca agacggtcga gcttcttcac cagaatgaca tcaccttcct 5220 ccaccttcat cctcagcaaa tccagccctt cccgatctgt tgaactgccg gatgccttgt 5280 cggtaaagat gcggttagct tttacccctg catctttgag cgctgaggtc tgcctcgtga 5340 agaaggtgtt gctgactcat accaggcctg aatcgcccca tcatccagcc agaaagtgag 5400 ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt tgaacttttg 5460 ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct tcaactcagc 5520 aaaagttcga tttattcaac aaagccgccg tcccgtcaag tcagcgtaat gctctgccag 5580 tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc 5640 aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa 5700 ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt 5760 ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca 5820 agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag cttatgcatt 5880 tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca 5940 accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg atcgctgtta 6000 aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc cagcgcatca 6060 gcaatatttt cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt tttcccgggg 6120 atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga 6180 agaggcataa attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac atcattggca 6240 acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc atacaatcga 6300 tagattgtcg cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc atataaatca 6360 gcatccatgt tggaatttaa tcgcggcctc gagcaagacg tttcccgttg aatatggctc 6420 ataacacccc ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt ttattgttca tgatgatata 6480 tttttatctt gtgcaatgta acatcagaga ttttgagaca caacgtggct ttgttgaata 6540 aatcgaactt ttgctgagtt gaaggatcag atcacgcatc ttcccgacaa cgcagaccgt 6600 tccgtggcaa agcaaaagtt caaaatcacc aactggtcca cctacaacaa agctctcatc 6660 aaccgtggct ccctcacttt ctggctggat gatggggcga ttcaggcctg gtatgagtca 6720 gcaacacctt cttcacgagg cagacctcag cgctagcgga gtgtatactg gcttactatg 6780 ttggcactga tgagggtgtc agtgaagtgc ttcatgtggc aggagaaaaa aggctgcacc 6840 ggtgcgtcag cagaatatgt gatacaggat atattccgct tcctcgctca ctgactcgct 6900 acgctcggtc gttcgactgc ggcgagcgga aatggcttac gaacggggcg gagatttcct 6960 ggaagatgcc aggaagatac ttaacaggga agtgagaggg ccgcggcaaa gccgtttttc 7020 cataggctcc gcccccctga caagcatcac gaaatctgac gctcaaatca gtggtggcga 7080 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gcggctccct cgtgcgctct 7140 cctgttcctg cctttcggtt taccggtgtc attccgctgt tatggccgcg tttgtctcat 7200 tccacgcctg acactcagtt ccgggtaggc agttcgctcc aagctggact gtatgcacga 7260 accccccgtt cagtccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 7320 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Claims

균주의 형질전환용 키트로서,
상기 균주는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)이고,
상기 키트는,
생물학적으로 불활성화된 Cas(dCas)을 코딩하는 유전자의 서열을 포함하는 제1 벡터; 및
코리네박테리움 글루타미쿰에서의 발현을 억제하려는 타겟 유전자의 가이드 RNA(gRNA)를 코딩하는 유전자의 서열을 포함하는 제2 벡터를 포함하고,
상기 제1 벡터는
상기 dCas를 코딩하는 유전자의 서열인 서열번호 1의 서열 및;
lacI 리프레서 및 tetR 리프레서로 구성된 군으로부터 선택된 리프레서;
trc 프로모터, tetA 프로모터 및 LacUV5 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터;
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래의 복제 개시점 pBL1;
이콜라이(E. coli)의 복제 개시점인 ColEI; 및
제한효소 부위인 BglII 부위 및 BamHI 부위를 포함하고,
상기 제2 벡터는,
타겟 유전자에 대한 가이드 RNA(gRNA)를 코딩하는 서열인 서열번호 2의 서열 및 서열번호 3의 서열을 순서대로 삽입하는 삽입 부위;
제한효소 부위인 EcoRI 및 BamHI;
코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 복제 개시점인 pHM1519; 및
이콜라이(E. coli) 유래의 복제 개시점인 p15A를 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환용 키트.
삭제
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제1항에 있어서,
상기 BglII 부위 및 BamHI 부위는 dCas를 코딩하는 유전자 양측에 위치하는 것인, 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환용 키트.
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제1항에 있어서,
상기 제1 벡터는 서열번호 4의 서열을 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환용 키트.
제1항에 있어서,
상기 제2 벡터는 서열번호 8의 서열을 포함하는, 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질전환용 키트.